JPH05509402A - 分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 分析装置 本発明は、センサー、特に、バイオセンサーと呼ばれるセンサー、すなわち、生 物原の試料中の抗原及び抗体のような生物学的に活性な種を分析するための装置 に関する。特に、本発明は、共鳴減衰または妨げられた内部全反射（ｆｒｕｓｔ ｒａｔｅｄ　ｔｏｔａｌ　１ｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）の原理に 基づくバイオセンサーに関する。

近年、溶液中の生化学的分析物の自動検出に用いられる装置が多く提案されてい る。一般に、そうした装置（バイオセンサー）は、共鳴場の工ヴアネッセント領 域に位置する感受性の被覆層を含んでいる。分析物の検出には、通常、例えば表 面プラズモン共鳴のような光学的手法を利用し、その層と分析物との相互作用に 起因する被覆層の厚み及び／又は屈折率の変化に基づいている。

これは、例えば共鳴の角度位置の変化を引き起こす。

他の光学的バイオセンサーは光線が伝播する導波路を含む。この装置の光学特性 は、導波路の表面で生じる変化によって影響される。光学的バイオセンサーの一 形態はワラストレイテッドトータルリフ１ツクジヨン（ＦＴＲ：　ｆｒｕｓｔｒ ａｔｅｄ　ｔｏｔａｌ　ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ　）に基づいている。

このフラストレイテッドトータルリフレクションの原理はよく知られており、こ の手法は例えば、Ｂｏｓａｃｃｈｉと０ｅｈｒｌｅにより記載されている（Ａｐ ｐｌｉｅｄ　０ｐｔｉｃｓ、（１９８２）、２１゜２１６７−２１７３）。免疫 試験に利用されるＦＴＲ装置は、欧州特許出願第２２０５２３６Ａ号に記載され ており、これは、一方の側が試験下の試料に結合され、他方の側がスペーサー層 に結合された空洞層を含んでいる。スペーサー層は基板上に設置されている。基 板とスペーサー層との界面は、単色光で全反射が起こるように照射され、関連す る工ヴアネッセント領域はスペーサー層に浸透している。スペーサー層の厚みが 適当で、入射平行波ベクトルが共鳴モードの伝搬定数の一つに整合すれば、全反 射は妨げられ、放射は空洞層に入り込む。この空洞層は、スペーサー層よりも高 い屈折率を持ち且つ入射放射線の波長で透明な材料で構成されなければならない 。

ごく最近、空洞層が比較的高い屈折率材料、代表的には無機酸化物の薄膜である ＦＴＲバイオセンサーが記載されている（例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９０１０ ６５０３参照のこと）。

、この種の装置においては、共鳴の発生は反射した放射の位相の変化として検出 され得る。位相の変化の測定は、比較的複雑な操作であり且つその基体または介 在する光学部品の複屈折を変化させることによって容易に影響を受ける。これは 安価なプラスチック光学素子を使用できなくする。その代わりに、例えば、出力 強度を検出することによって測定可能な装置が利用できるならば、それが望まし い。

ユニに、我々はそれを実行できるＦＴＨに基づくバイオセンサー装置を作製した 。

本発明に従えば、 ａ）屈折率ｎ３の透過性誘電材料の空洞層と、ｂ）屈折率ｎ１の誘電基板と、 Ｃ）空洞層と基板との間に挿入された、屈折率ｎ２の誘電スペーサー層と、 を含む光学構造体を含み、該光学構造体が入射放射線により照射され、内部反射 が基板とスペーサー層との間の界面で起こり得るセンサーにおいて、 空洞層またはスペーサー層が入射放射線の波長の放射線を吸収することを特徴と する上記センサーを特徴とする。

本発明に従うセンサは、共鳴が、反射した放射強度の減少として検出され得る点 に主な利点がある。かかる強度の低下は位相変化の検出に必要な装置に比べて精 巧な検出装置を必要としない。また、比較的安価なプラスチック製光学部品を使 用し得る。これは、一層簡単な計器を用い得、付随する経費を節減できることを 意味する。

空洞層またはスペーサー層は、得られる強度の低減を検出することができる程に 十分に強く吸収する必要がある。一方、吸収は共鳴のかなりの広がりを起こす程 に太きくずへきでない。

空洞層及びスペーサー層に用いられ得る吸収材料の例は、スペーサー履用として 、金属、例えば、銀、または吸収の強いあるいは吸収の強い種でドープされた誘 電性材料である。後者の例は、弗化遷移金属、例えば、ＣｕＦ２またはＮ　ｉ　 Ｆ　２でドープされた弗化マグネシウム層である。空洞層としては、吸収の強い あるいは吸収の強い種でドープされた誘電性材料である。例えば、適当な吸収種 、例えば、ＣａＯでドープされた二酸化チタンまたは二酸化ジルコニウムである 。

空洞層あるいはスペーサー層のいずれかが非吸収性である場合には、ドーパント なしで上記の誘電材料から形成し得る。

吸収種は入射放射線の波長を参照して選ばなければならないことは明らかである 。有機材料、例えば、有機顔料を使用することによって一層融通性を増すであろ う。

さらに、変形例として、吸収材料を、基体、スペーサー層及び空洞層のサンドイ ッチ構造中の追加の薄層としてもよい。

使用において、基体とスペーサー層との間の界面に、内部反射が生じるように光 照射する。本文中において、「光」とは、可視光だけでなく、この範囲を超える そしてこの範囲未満、たとえば、紫外線及び赤外線をも含み得る。

空洞層中での誘導されたモードの共鳴伝播は、与えられた波長に関して、励起放 射の特定の入射角度で起こる。

それ故、二つの基本的な測定方法、すなわち、固定波長で入射角を走査すること または入射光の固定角度で波長を走査することが可能である。単色光放射を用い る前者の方法は、レーザ光源の使用を可能にし、光学規準の問題を簡単にし、分 散効果を回避することができ、それによって、結果の分析を単純化することがで きる。

共鳴効果の角度位置は、バイオセンサー装置の種々のパラメータ、例えば、種々 の層の屈折率及び厚さに依存する。一般に、空洞層の屈折率ｎ２及び基体の屈折 率ｎ１が共にスペーサー層の屈折率ｎ２を超えることが必要である。共鳴を達成 するためには少なくとも１つのモードが空洞層中に存在していなければならない ので、空洞層は、所定の最低限の厚みを超えていなければならない。

空洞層は、誘電材料の薄膜であることが好ましい。空洞層に好適な材料には、二 酸化ジルコニウム、二酸化チタン、酸化アルミニウム及び酸化タンタルが含まれ る。

空洞層は、知られた方法により調整され得る。例えば真空蒸着法、スパッタリン グ法、化学気相法又は内部拡散（ｉｎ−ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）が挙げられる。

誘電スペーサー層は、空洞層及び基体の両方よりも低い屈折率を有していなけれ ばならない。このスペーサー層には、例えば、フッ化マグネシウムの蒸着層又は スノくツタ層が含まれる。この場合、注入形赤外線レーザーを光源として使用す ることができる。この様な光源からの光は、典型的には、約８００ｎｍの波長を 有する。他の好適な材料にはフッ化リチウム及び二酸化ケイ素が挙げられるａ前 記の蒸着及びスパッタリング法とは別に、スペーサー層はゾルゲル法により基板 上に堆積させる又は基体との化学反応によって形成してもよい。

ゾルゲル法はスペーサー層が二酸化ケイ素の場合に、特に好ましい。

基体の屈折率（ｎｌ）はスペーサー層の屈折率（ｎ２）よりも大きくなければな らないが、基板の厚みは、一般に重要ではない。

対照的に、空洞層の厚みは、結合角の適当な範囲内で共鳴が起こるように選ばれ なければならない。スペーサー層は、一般に数百ｎｍ程度の厚みを存し、例えば 、約２００〜２０００　ｎｍ、より好ましくは５００〜１５００ｎｍ。

例えば１１０００ｎである。空洞層は、一般に数十ｎｍの厚みを育し、１０〜２ ００ｎｍ、より好ましくは３３０−１５０ｎ、例えば１１００ｎである。

特に、空洞層は、３０〜１５０ｎｍの厚みを有すると共に二酸化ジルコニウム、 二酸化チタン、酸化タンタル及び酸化アルミニウムから選ばれる材料を含み、そ して、スペーサー層は、５００〜１５００ｎｍの厚みを有すると共にフッ化マグ ネシウム、フッ化リチウム及び二酸化ケイ素から選ばれる材料を含むのが好まし い。これらの材料は、スペーサー層の屈折率が空洞層の屈折率より小さくなるよ うに選択される。

空洞層及びスペーサー層に好適な材料は、それぞれ、酸化タンタル及び二酸化ケ イ素である。もちろん、この場合には空洞層またはスペーサー層は吸収ドーパン トを含む。

入射光源として任意の簡便な放射源を使用することができるが、単色放射源を使 用することが好ましく、最も都合のよい放射源はレーザーである。レーザーの選 択は、なかんづく、すでに挙げてきたいくつかの例の種々の層に用いた材料に依 存し、そしてもちろん空洞層またはスペーサー層が吸収する波長に依存する。

角度の走査は、連続的でも同時でもよく、即ち、平行光線の入射角を変えたり、 又は、欧州特許出願第０，３０５．１０９Ａ号に（表面プラズモン共鳴との関係 で）記載されているような扇形光線を用いて所定の角度範囲にわたって同時放射 することにより行ってもよい。前者の場合、ある範囲の角度にわたって機械的に 走査される単一チャンネル検出器を用いることができる。後者の場合、ある範囲 の角度が一時に照射されるので、一般に角度分解能を有するマルチチャンネル検 出器を用いることが必要であろう。

共鳴時に、入射光はＦＴＲにより空洞層内に結合し、空洞層に沿って所定距離を 伝搬し、そして外部へ出ていく（これもＦＴＲによる）。伝搬距離は種々の装置 パラメーターに依存するが、一般に、１又は２ｍｍ程度である。

共鳴時に空洞層内に結合した光は、吸収空洞層またはスペーサー層によって吸収 され得、反射光の強度の変化をもたらす。

本発明に従うセンサーの好ましい具体例において、空洞層またはスペーサー層は 蛍光物質（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を含む。これは、輻射された蛍光の強度の 増加として共鳴が検出されることを可能にする。

蛍光物質は励起放射の波長に依存して選択される（その逆も成り立つ）ことが明 らかであるけれども、広範囲の蛍光物質を用いうる。

この場合、最初の配置において、入射角度をある範囲の角度で走査すると、内部 反射が起こる。しかしながら、適当な入射角にて、共鳴が起こり、そして入射放 射からエネルギーが空洞層に結合される。この層に結合した放射の伝播は輻射さ れた蛍光強度の増大をもたらす。輻射された蛍光は、光学構造体の上方（この場 合、試験下において試料中での吸収、散乱等による妨害が存在し得るけれども） 、光学構造体の下方（もし、光学構造体が適当な形状を有するならば、例えば、 ドーププリズムの形であるなら）、または反射光線中（検出器が十分大きくまた は検出器が入射光線に対しである角度で走査されることを条件にして）に位置す る検出器により測定され得る。いずれにしても、適当なフィルターを備えて励起 光と輻射した蛍光を分離しなければならない。

第２の配置において、輻射され蛍光のほどよい部分は、ガイド層内にトラップさ れて、装置パラメータ（各層の屈折率及び厚さ）、蛍光の波長及び固定化した化 学物質の厚さに依存しである角度で規準されたビームとして出ていく。この場合 、蛍光は、ウェッジ型ビーム、すなわちある角度範囲で一時に照射されることに よって励起されることができる。検出器は、蛍光波長に対して敏感であり且つ十 分な感度を有することを条件として、マルチ型またはシングルチャンネル型の走 査装置にし得る。

空洞層は、一般に、分析物上に固定化される生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓ）、例えば、試験下で分析物に対して特異的な結合相手を有することによって 感知される。固定化された生化学物質は当業者によく知られた方法によって誘電 空洞層に共有的に結合され得る。しかしながら、一般に、固定化を促進するため に、誘電層は誘導化または活性化される。表面の誘導化または活性化は、分析物 用に固定化された種の反応性又は親和性に認められる程の影響を及ぼさずに、固 定化される種への結合部位を提供するようになされる。

例えば、誘電層は、知られた方法でシランを基質とするカップリング化合物と反 応され得る。好適なかかる試薬は、例えば、アセトン中、約２％（重量／体積） の末端アミノ−アルキルトリメトキシシラン、例えば、３−アミノプロピル化合 物である。この試薬を用いる固定化の技術の詳細は、Ｗｅｅｔａｌｌによって記 載されている（例えば、米国特許第３６５２７６１号及び「固定化されたｐ（Ｅ ｄ）、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７４年、１．９１ 〜２１２頁）。そこには他のシリル化合物並びにカルボキシル、アミノ及び他の 反応基が種々の無機材料に共有的に結合し得る方法についても記載されている。

アミノシラン試薬との反応後、空洞層上で固定化されたアミノ末端は、グルタル アルデヒド（例えば、ｐＨ７の２％溶液）と反応され得、過剰の試薬が除去され 、次いで固定化されたアルデヒド基により活性化された表面は固定化されるべき 種の溶液で処理される。

生体分子を誘電表面に結合する別の方法は、エポキシシラン試薬、特に、例えば 、Ｈｅｒｍａｎらにより記載されたように、トルエン中で約２％（容積／容積） の濃度のグリシジルオキシプロピルトリメトキシシランを７０℃で約２時間処理 することである（Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ｓｃｉ　（ｔ９８１年）１９（９ ）、　４７０−４７６頁）。この方法において、エポキシシリル化した空洞層は 固定化されるべき種と直接反応することができるので、アルデヒド試薬を使用す る必要はない。

種をポリマー性の表面をに固定化する方法もまたよく知られており、空洞層がポ リマー性であるときには当業者はこれらの方法の適用性を認識するであろう。例 えば、結合はポリマーの官能基の水素との適当なラジカル置換の形にし得る。

以下に図面を参照して、本発明をより詳細に説明するが、それらは本発明の例示 にすぎない。

図１は、本発明に従うバイオセンサーの概要図（任意スケール）である。

図２は、入射角に対する反射光強度の依存性を示す。

図３は、第２の具体例に関する入射角に対する輻射した蛍光強度の依存性を示す 。

最初に図１を参照して、バイオセンサーは、基部領域上に、弗化銅がドープされ た弗化マグネシウムの第１の被覆２及び二酸化チタンの第２のコーチティング３ が被覆されたガラスプリズム１を含む。プリズム１並びに被覆１及び２は、共に 、共鳴光学構造体を構成し、第１のコーチティング２はスペーサー層としてそし て第２の被覆３は空洞層として作用する。第１の被覆２は約１１０００ｎの厚さ を有し、第２の被覆３は約１１００ｎの厚さを有する。

別の具体例において、第１及び第２の被覆２，３は７それぞれ、 ａ）金属及び二酸化チタン、あるいは、ｂ）弗化マグネシウム及び二酸化チタン を含む。

第２の被覆３上に固定化されたものは固定化された生化学物質の層４てあり、そ れは試験下にて分析物用の特異的な結合相手として働く。

プリズム１の基部と第１の被覆２との間の界面は、扇型の単色光ビームで照射さ れて、内部反射が起こり、反射光の強度はフォトダイオードアレイまたは電荷結 合装置のような検出器（図示しない）によって測定される。

図２は、入射角の関数として反射した信号強度の依存性を示す。共鳴時に、反射 強度の鋭いくぼみがある。点線は固定化した化学物質４がそれらの特異的な結合 相手、すなわち検出されるべき分析物に結合した後の結果を示す。図２かられか るように、共鳴位置はシフトしている。

この効果は、試験された試料中の分析物の存在を定量的に及び／または定性的に 示すものとして用いられる。

別の具体例において、第１及び第２の被覆２及び３は、それぞれ、 ａ）蛍光物質でドープされた弗化マグネシウム、及び二酸化チタン、あるいは ｂ）ドープされていない弗化マグネシウム及び蛍光物質でドープされた二酸化チ タン を含む。

この場合、プリズムｌの基部と第１の被覆２との間の界面が、一定範囲の角度を 連続的に走査される光ビームにより照射される。内部反射が起こり、輻射された 蛍光強度が測定される（図１に示した矢の方向）。

図３は、入射角の関数として、輻射された蛍光強度の依存性を示す。共鳴時に、 輻射された蛍光強度の鋭いくぼみがある。点線は固定化された化学物質４がそれ らの特異的な結合相手（分析物）に結合した後の対応する結果を示す。

角度 要　約　書 センサー、特に、フラストレーテッドトータルリフレクションの原理に基づく共 鳴光学バイオセンサーは、ａ）屈折率ｎ３の透過性誘電材料の空洞層（３）と、 ｂ）屈折率ｎ１の誘電基体（１）と、Ｃ）空洞層（３）と基体（１）との間に挿 入された、屈折率ｎ２の誘電スペーサー層（２）とを含む光学構造体を含む。光 学構造体は、入射放射線により照射され得、内部反射が基体（１）とスペーサー 層（２）と間の界面で起こるように配置される。このセンサーは空洞層（３）ま たはスペーサー層（２）が入射放射線の波長の放射を吸収することを特徴とする 。空洞層（３）またはスペーサー層（２）は放射線を吸収するかあるいは吸収種 、最も好ましくは蛍光物質がドープされた材料を含む。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）°１ １、特許出願の表示 ＰＣＴ／Ｃ；Ｂ　９１１０１１６１ 、発明の名称 分析装置 ５、特許出願人 住　所　イギリス国　サフォーク　アイビー１１キユーエイチイブスウイツチ　 プリンセス　ストリート　ファイソンハウス　（番地なし） 名　称　ファイソンズ　ビーエルシー 国　籍　イギリス国 ４、代理人 住　所　〒１６０　東京都新宿区新宿四丁目３番１７号１９９３年　７月１３日 ６、添付書類の目録 補正書の翻訳文　１通 ユニに、我々はそれを実行できるＦＴＰに基づくバイオセンサー装置を作製した 。

本発明に従えば、 ａ）屈折率ｎ、の誘電材料の空洞層と、ｂ）屈折率ｎｌの誘電基体と、 Ｃ）空洞層と基体の間に挿入された、屈折率ｎ２の誘電スペーサー層と、 を含み、ｎ、とｎ、は共にｎ２より大きく、空洞層は少なくとも一つの共鳴モー ドを支持するのに十分な厚さであり、且つ入射放射線により照射され得、内部反 射が基体ｌとスペーサー層２と間の界面で起こるように配置された光学構造体を 含むセンサーにおいて、空洞層３またはスペーサー層２が入射放射線の波長の放 射を吸収することを特徴とする上記センサーが提供される。

本発明に従うセンサは、共鳴が、反射した放射強度の減少として検出され得る点 に主な利点がある。かかる強度の低下は位相変化の検出に必要な装置に比べて精 巧な検出装置を必要としない。また、比較的安価なプラスチック製光学部品を使 用し得る。これは、一層簡単な計器を用い得、付随する経費を節減できることを 意味する。

請求の範囲 １．ａ）屈折率ｎ、の誘電材料の空洞層３と、ｂ）屈折率ｎ＋の誘電基体ｌと、 Ｃ）空洞層３と基体１の間に挿入された、屈折率ｎ２の誘電スペーサー層と、 を含み、ｎ、とｎ、は共にｎ２より大きく、空洞層３は少なくとも一つの共鳴モ ードを支持するのに十分な厚さであり、且つ入射放射線により照射され得、内部 反射が基体１とスペーサー層２と間の界面で起こるように配置された光学構造体 を含むセンサーにおいて、空洞層３またはスペーサー層２が入射放射線の波長の 放射線を吸収することを特徴とする上記センサー。

２、スペーサー層２が、強く吸収するあるいは強い吸収種でドープされた金属ま たは誘電材料を含む請求項１のセンサー。

３、空洞層３が、強く吸収するかあるいは強い吸収種でドープされた誘電材料を 含む請求項１のセンサー。

４、空洞層３が誘電材料の薄層である前記請求項のいずれか一項のセンサー。

国際調査報告 １ｍｅ＋ｗｌ＋、ｍ１Ａ）％１ｃｍ１ｅ＋＋１１ａ、ＰＣ丁／ＧＢ９１１０１１ ６１国際調査報告 に工／ＧＢ　９１１０１１６１

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）屈折率ｎ３の透過性誘電材料の空洞層３と、ｂ）屈折率ｎ１の誘電基体 １と、 ｃ）空洞層３と基体１の間に挿入された、屈折率ｎ２の誘電スペーサー層と、 を含み、入射放射線により照射され得、内部反射が基体１とスペーサー層２と間 の界面で起こるように配置された光学構造体を含むセンサーにおいて、空洞層３ またはスペーサー層２が入射放射線の波長の放射を吸収することを特徴とする上 記センサー。
2. ２．スペーサー層が、強く吸収するかあるいは強い吸収種でドープされた金属ま たは誘電材料を含む請求項１のセンサー。
3. ３．空洞層３が、強く吸収するかあるいは強い吸収種でドープされた誘電材料を 含む請求項１のセンサー。
4. ４．空洞層３が誘電材料の薄層である前記請求項のいずれか一項のセンサー。
5. ５．スペーサー層が２００〜２０００ｎｍの厚さを有し且つ空洞層３が１０〜２ ００ｎｍの厚さを有する請求項４のセンサー。
6. ６．空洞層３が３０〜１５０ｎｍの厚さを有し、二酸化ジルコニウム、二酸化チ タン、酸化タンタル及び酸化アルミニウムから選ばれる材料を含み、且つスペー サー層２は５００〜１５００ｎｍの厚さを有し、弗化マグネシウム、弗化リチウ ム及び二酸化珪素から選ばれる材料を含み、スペーサー層２の屈折率が、空洞層 ３の屈折率よりも低くなり、スペーサー層２または空洞層３が吸収ドーパントを 含むように材料が選択される請求項５のセンサー。
7. ７．吸収材料が、基体、スペーサー層及び空洞層のサンドイッチ構造体中の追加 の薄層の形である請求項２または３のセンサー。
8. ８．スペーサー層２または空洞層３は蛍光物資を含む前記請求項のいずれか一項 のセンサー。
9. ９．さらに、基体１とスペーサー層２との間の界面に内部反射が起こるように照 射するための手段と、光学構造体から輻射された放射線を検出する手段とを含む 前記請求項のいずれか一項のセンサー。
10. １０．基体−スペーサー層界面がある角度範囲で同時に照射される請求項９のセ ンサー。
11. １１．基体−スペーサー層界面がある角度範囲で連続的に照射される請求項９の センサー。