JPH0552462B2

JPH0552462B2 -

Info

Publication number: JPH0552462B2
Application number: JP58251657A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Ishida; Morimasa Hayashi
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1983-12-28
Filing date: 1983-12-28
Publication date: 1993-08-05
Also published as: JPS60142250A

Description

[Detailed description of the invention]

(イ) 産業上の利用分野本発明は、第１級或は第２級のアミノ基を有す
る化合物の分析装置に関し、特に、第１級或は第
２級のアミノ基を有するアミノ酸、ポリアミン、
インドールアミン、イミダゾールアミン及びアミ
ノ配糖体系抗生物質の分析装置に関する。また、本発明は、有機化学、生化学、食品、医
薬品、医療機器等の産業分野における、生体試料
についてのアミノ酸、インドールアミン、イミダ
ゾールアミン及びアミノ配糖体系抗生物質の自動
分析に適したプレラベル法による第１級或は第２
級のアミノ基を有する化合物、その中でも特に、
アミノ酸及びその誘導体用の分析装置に関する。 (ロ) 従来技術第１級のアミノ基を有する化合物、中でもアミ
ノ酸及びその誘導体についての分析には、螢光法
が多用されているが、一般に、ポストラベル法が
採用されている。しかし、ポストラベル法では、例えば、アミノ
酸は、イオン交換樹脂を使用して分離された後、
反応コイルに導かれて、螢光試薬、例えば、オル
トフタルアルデヒド或はフルオレツサミン等と反
応して、該アミノ酸を螢光性誘導体化して検出す
るために、分離されたアミノ酸が、反応試薬によ
つて希釈されて、そのバンドが広がり、得られる
クロマトグラムは分離性が低くなり、しかも、反
応コイルでの反応を充分に行うにも、分離後の拡
散を防止する関係上、反応コイルを充分に長くす
ることができず、反応が充分に行われない傾向が
あり、その精度も充分ではない。さらに、検出直
前に、螢光試薬をポンプで供給するために、脈動
が生じて、ノイズを生じ易く、問題であつた。また、ポストラベル法における分離カラムで分
離後の拡散を避けるために、マニアルでプレラベ
ル化して分離カラムに導入する方法があるが、プ
レラベル化の反応操作を正確に一定の条件下でし
かも一定の時間内に行うことは容易でなく、自動
化が望まれていた。そこで、試料と螢光試薬を反応コイルに流して
反応させ、その生成物を分離カラムに流して自動
化する方法がとられた。しかし、この分析装置は、オートインジエクタ
を使用するものであるが、吸引部から分離カラム
までの距離が長くなり、分離カラム入口での試料
バンドの広がりが大きくなるのが避けられないと
ころ、しかも、試料の量が多くなればなる程、吸
引段階で、既に、バンドは大きく広がる傾向を有
し、問題であつた。さらに、この方法では、分離
カラムには、螢光試薬に導入されるため、分析成
分は希釈される結果となり好ましくなく、加え
て、分離される条件と反応条件が類似する必要が
あり、条件設定にも問題があつた。 (ハ) 目的本発明は、これら従来法における問題点を、プ
レラベル化した化合物を分離カラムに導入する前
に、螢光試薬と分離することによつて、解消する
ものであつて、自動化に適したプレラベル法によ
る第１級或は第２級アミノ基を有する化合物、特
にアミノ酸の分析装置を提供するものである。 (ニ) 構成本発明は、ラベル化試薬供給装置、第１級或は
第２級のアミノ基を有する化合物を含有する試薬
用試料導入装置、複数の入口、接続口及び出口を
備える流路切換えバルブ、プレカラム並びに液体
クロマトグラフイ分離カラムを具備する液体クロ
マトグラフイによる第１級或は第２級のアミノ基
を有する化合物の分析装置において、ラベル化試
薬供給装置のラベル化試薬供給路と第１級或は第
２級のアミノ基を有する化合物を含有する試料用
試料導入装置の試料導入路とを接続する流路は反
応コイルの入口に接続し、該反応コイルの出口は
流路切換えバルブの第１の入口に接続し、該流路
切換えバルブの第１の接続口は該プレカラムの入
口に接続し、該プレカラムの出口は流路切換えバ
ルブの第２の接続口に接続し、流路切換えバルブ
の第１の出口は液体クロマトグラフ分離カラムの
入口に接続し、分離用移動相供給装置の分離用移
動相供給路は流路切換えバルブの第２の入口に接
続しており、流路切換えバルブの第１の接続形態
において、該プレカラムの入口は流路切換えバル
ブを介して該反応コイルの出口に接続し、また該
プレカラムの出口は流路切換えバルブを介して系
外に接続し、流路切換えバルブの第２の接続形態
において、分離用移動相供給装置の分離用移動相
供給路は流路切換えバルブを介してプレカラムの
出口に接続し、プレカラムの出口は流路切換えバ
ルブを介して流体クロマトグラフイ分離カラムの
入口に接続することを特徴とする液体クロマトグ
ラフイによる第１級或は第２級のアミノ基を有す
る化合物の分析装置にある。本発明において、液体クロマトグラフイは、液
体クロマトグラフイ、高速液体クロマトグラフイ
及び超高速液体クロマトグラフイを意味する。本発明において、プレラベル化試薬としては、
視外・可視吸光ラベル試薬、螢光ラベル化試薬、
¹⁴C又は³Hでラベル化された放射試薬等がある。螢光試薬としては、オルトーフタルアルデヒ
ド、フルオレサミン、１−ジメチルアミノ−ナフ
タレン５−スルホニルクロライド（DNS−Cl）、
７−クロロ−４−ニトロベンゾフラザン（NBD
−Cl）等があるが、オルト−フタルアルデヒドは
水溶性であるために好ましい。放射試薬として
は、¹⁴C又は³Hでラベル化されたDNS−Clがある。螢光試薬として、水溶性のオルト−フタルアル
デヒドを使用する場合は、Ｎ−アセチルシステイ
ン或は２−メルカプトエタノールを含有させ、ホ
ウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウムで、PH９ないし
11の緩衝剤を有する溶液を使用する。２−メルカ
プトエタノールは安定性が悪いため、Ｎ−アセチ
ル−システインを使用するとよい。この螢光試薬を例えばプレラベル化したアミノ
酸と分離する溶媒としては、クエン酸、リン酸等
の中から選んで、中性の緩衝溶液、例えばリン酸
緩衝液、クエン酸緩衝液等とするのがよい。この
中性緩衝溶液に、少量のアセトニトリルを含有さ
せることもできる。第２級のアミン基を有するア
ミノ酸分析の場合には、アスコルビン酸を添加し
たものを使用する。２級のアミノ基を有する化合物、特にアミノ
酸、例えば、プロリン、ヒドロキシプロリンを分
析する場合は、次亜塩素酸試薬を導入する流路を
形成する。このようにすると、２級アミンも螢光
ラベル化が可能となる。第１級或は第２級アミン基を有する化合物のプ
レラベル誘導体、特に、第１級或は第２級アミノ
基を有するアミノ酸のプレラベル誘導体を、オル
ト−フタルアルデヒド試薬と分離するプレカラム
としては、耐アルカリ性にすぐれた樹脂性の逆相
クロマト用カラム、例えば、オクタデシルシリル
化したものを固定相としたカラム（ODSカラム）
が使用される。プレカラムの両端に形成される流路切換えバル
ブは、別個に配設することもできるが、例えば、
六方バルブにより、両流路の切換えを同時に行う
ことができるようにするのが、構造が簡単になる
ので好ましい。 (ホ) 実施例第１図は、本発明の第１級のアミノ基を有する
化合物の分析装置の一実施例、特に、アミノ酸分
析に適用した一例を示す流路図である。第２図
は、本発明の第１級及び第２級のアミノ基を有す
る化合物の分析装置の一実施例の中プレラベル化
工程までを示す流路図である。以下、これらの図面を参照して本発明を詳細に
説明するが、本発明は、これらの説明に限定され
るものではなく、種々の態様をとりうることはい
うまでもない。第１図において、螢光試薬として、Ｎ−アセチ
ルシステインを含有するＯ−フタルアルデヒド試
薬が使用され、その溶媒として、弱塩基性緩衝溶
液が使用されている。Ｏ−フタルアルデヒド試薬容器１及び中性緩衝
液容器２は、管路により、三方弁３を経てポンプ
４に連通している。ポンプ４からの流路は、分岐
して、一方は、試料導入装置５に、そして、他方
はバイパス流路６に連通する。試料導入装置５及
びバイパス流路６からの流路は合して、反応コイ
ル７に接続する。反応コイル７の出口は六方バル
ブ８の入口孔９に連通し、同じく孔１０は管路２
０により、ODSカラム（オクタデシルシリル化
したもの）のプレカラム１５の一方の口に連通
し、プレカラム１５の他方の口は、管路２１によ
り、六方バルブ８の孔１３に連通する。分離用の
移動相は、アセトニトリルを含有する中性緩衝液
であり、アセトニトリルを除いて、容器２の中性
緩衝液と同一の溶液を使用する。必要に応じて、
グラジエント装置を付属し、アセトニリル濃度を
経時的に変化させることもできる。この分離用の
移動相容器１９はポンプ１８から、管路２３によ
り、六方バルブ８の孔１２に接続している。六方
バルブ８の孔１１は、管路２２を経てODSカラ
ムの分離カラムに連通し、分離カラム１６の出口
は検出器１７に連通する。この実施例の装置によるアミノ酸分析の手順を
以下説明する。三方弁３及び六方バルブ８は、いずれも実線側
の流路に接続している。まず、ポンプ４の作動により、Ｏ−フタルアル
デヒド試薬容器１から、Ｏ−フタルアルデヒド試
薬を反応コイル７、管路２０、プレカラム１５、
管路２１へ送り、一方、ポンプ１８の作動により
分離用移動相容器１９から分離用移動相を管路２
３から六方バルブ８を経由して分離カラム１６に
流れる。試料を試料導入装置５に導入する。試料中のア
ミノ酸は、反応コイル７中で、Ｏ−フタルアルデ
ヒドと反応して、プレラベル化され、プレカラム
１５に捕集される。充分に反応させた後、三方弁
３を点線側の、流路に切換えて、中性緩衝液容器
２から中性緩衝液を反応コイル７からプレカラム
１５及び管路２１を経由して、六方バルブ８の出
口孔１４に流して、反応カラム７に残留するプレ
ラベル化したアミノ酸誘導体をプレカラム１５に
送り、捕集すると共に、Ｏ−フタルアルデヒド試
薬をプレカラム１５から駆逐する。Ｏ−フタルアルデヒドとＮ−アセチルシステイ
ンが、プレカラム１５から駆逐されたところで、
六方バルブ８を点線の流路に切換えて、アセトニ
トリルを含有する中性緩衝液を、ポンプ１８、管
路２３、六方バルブの孔１２、孔１３及び管路２
１を経由して、プレカラム１５に流し、プレカラ
ム１５中のプレラベル化されたアミノ酸誘導体を
管路２、六方バルブ８の孔１０，１１及び管路２
２を経由して、分離カラム１６に送る。プレラベル化されたアミノ酸誘導体は、夫々、
分離カラム中で、クロマトグラフイ分離され、螢
光検出器１７で検出される。一般に、試料が多くなればなる程、試料導入過
程での試料バンドの巾は大きく広がるが、本実施
例の装置においては、プレカラム１５に一旦プレ
ラベル化して捕集されるので、そのような試料バ
ンドの広がりは解消される。しかも、プレカラム
１５から分離カラム１６に分離用移動相によつて
送られ、分離後、直ちに検出されるので、分離後
の拡散を避けることができるので、バンドの広が
りによる分離度の低下が起こらない。第２図において、次亜塩素酸ナトリウム試薬容
器２６は、ポンプ２９から試料導入装置３０に接
続する。この試料導入装置３０は反応コイル３２
に連通する。Ｏ−フタルアルデヒド試薬容器２４
及び中性緩衝容器２５は、三方弁２７、ポンプ２
８を介して反応コイル３３に接続している。２級のアミノ基を有するアミノ酸についての分
析手順を以下説明する。三方弁２７は実線の流路に接続している。次亜塩素酸試薬容器２６から、ポンプ２９を作
動させて、次亜塩素酸試薬を反応コイル３２に送
る。試料を試料導入装置３０から導入し反応コイ
ル３２で次亜塩素酸と反応させて、第２級アミノ基を第
１級アミノ基に変化させる。一方、Ｏ−フタルアルデヒド試薬を、ポンプ２
８を作動させて容器２４から反応コイル３３に送
り、反応コイル３２で生成した第１級アミノ基を
有するアミノ酸と反応させ、該アミノ酸のプレラ
ベル化誘導体を生成させる。アミノ酸のプレラベル化反応が終了したところ
で、三方弁２７を点線の流路に切換えて、アスコ
ルビン酸を含有する中性緩衝液を容器２５から反
応コイル３３に送り、以下第１図と同様に操作し
てアミノ酸の分析を行う。第１図の装置の使用したアミノ酸分析の例を次
に示す。プレカラムとして、SWF−2600（内径4.0mm、
長さ30mm）［セキスイフアインケミカル社製］を
使用し、分離カラムとして、Shim−Pack CLC
−ODS（内径6.0mm、長さ150mm）［島津製作所社
製］を使用して、生体試料中のフエニルアラニ
ン、チロシン、ヒスチジン、１−メチルヒスチジ
ン、３−メチルヒスチジン等のアミノ酸の分析を
行つた。使用したOPA試薬としては、0.1％Ｎ−アセチ
ルシステインを含有し、0.1Mホウ酸カリウム溶
液でPH9.2とした0.1％OPA溶液を用いた。また、洗浄用溶液としては、PH７の10ｍＭリン
酸カリウム溶液を使用し、分離用移動相として
は、PHの10ｍＭリン酸カリウム溶液とアセトニト
リルの混合溶液を使用した。この分離移動相は、
グラジエント装置を使用して、最初アセトニトリ
ル５％の混合溶液を用い、漸次アセトニトリルの
濃度を高めて、最終において、アセトニトリル50
％の混合液とした。温度は40℃とし、いずれの溶液も流量1.0ml／
分で送液された。その結果、フエニルアラニン、チロシン、ヒス
チジン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒス
チジン等のアミノ酸について分析結果は良好であ
つた。 (ヘ) 効果本発明は、逆相クロマトグラフイ用のODSカ
ラムをプレカラムに使用して、螢光試薬等で、第
１級或は第２級のアミノ基を有する化合物のプレ
カラム化した誘導体を、該カラムに一旦捕集し
て、余剰の螢光試薬を、該プレラベル化した誘導
体から分離除去して、該プレラベル化した誘導体
を濃縮することができるので、従来のプレラベル
法における試料導入の際のバンドの広がりが解消
される。しかも、プレカラムにおけるこのような第１級
或は第２級のアミノ基を有する化合物のプレラベ
ル化した誘導体の濃縮機能に応じて、反応コイル
の長さを長くすることができるので、プレラベル
化の反応を同一条件下で機械的に行うことができ
る。したがつて、従来の、ポストラベル法及びプ
レラベル法に比較して、手軽に実施をすることが
でき、しかも、バルブ操作で、例えば、アミノ酸
分析を簡単に、かつ、高い精度で行うことができ
るので、自動化に適するといえる。しかも、本発明は、従来のポストカラム法等で
困難であつた第２級アミノ基を有する化合物の分
析が容易に行うことができるものである。また、本発明のプレラベル法は、分析対象成分
が限定されれば、高速液体クロマトグラフイ分析
の自動化はもとより、超高速クロマトグラフイ分
析の自動化も容易となる。以上のように、本発明は、従来のアミノ基を有
する化合物、特に、アミノ酸の分析装置と比較し
て、優れた点が多く、その影響は大きい。 (a) Field of Industrial Application The present invention relates to an apparatus for analyzing compounds having a primary or secondary amino group, and in particular, an apparatus for analyzing compounds having a primary or secondary amino group, polyamines,
This invention relates to an analyzer for indoleamines, imidazoleamines, and aminoglycoside antibiotics. Furthermore, the present invention provides a pre-labeling method suitable for automatic analysis of amino acids, indoleamines, imidazole amines, and aminoglycoside antibiotics in biological samples in industrial fields such as organic chemistry, biochemistry, food, pharmaceuticals, and medical devices. 1st class or 2nd class
Compounds having an amino group of
This invention relates to an analytical device for amino acids and their derivatives. (b) Prior Art Fluorescence methods are often used to analyze compounds having a primary amino group, especially amino acids and their derivatives, but post-label methods are generally employed. However, in post-labeling methods, for example, amino acids are separated using ion-exchange resins and then
The separated amino acids are guided into a reaction coil and reacted with a fluorescent reagent, such as orthophthalaldehyde or fluoresthamine, to fluorescently derivatize the amino acid and detect it. As the band is diluted, the resulting chromatogram becomes less separable.Moreover, in order to perform a sufficient reaction in the reaction coil, the reaction coil must be made long enough to prevent diffusion after separation. The reaction tends not to be carried out sufficiently, and its accuracy is also not sufficient. Furthermore, since the fluorescent reagent is supplied by a pump immediately before detection, pulsation occurs, which tends to cause noise, which is a problem. In addition, in order to avoid diffusion after separation in the separation column in the post-label method, there is a method of manually pre-labeling and introducing it into the separation column, but the pre-labeling reaction operation is carried out precisely under certain conditions and for a certain period of time. It was not easy to do this internally, so automation was desired. Therefore, an automated method was adopted in which the sample and fluorescent reagent were passed through a reaction coil to react, and the resulting product was passed through a separation column. However, since this analyzer uses an autoinjector, the distance from the suction section to the separation column is long, and the spread of the sample band at the inlet of the separation column is unavoidable. However, the larger the amount of sample, the more the band tends to spread even during the aspiration stage, which is a problem. Furthermore, in this method, since the fluorescent reagent is introduced into the separation column, the analytical components are diluted, which is undesirable.In addition, the reaction conditions need to be similar to the separation conditions, and the condition setting There was also a problem. (c) Purpose The present invention solves the problems in these conventional methods by separating a pre-labeled compound from a fluorescent reagent before introducing it into a separation column, and is suitable for automation. The present invention provides an apparatus for analyzing compounds having a primary or secondary amino group, particularly amino acids, using a pre-labeling method. (D) Structure The present invention provides a labeled reagent supply device, a sample introduction device for a reagent containing a compound having a primary or secondary amino group, and a flow path switching device having a plurality of inlets, connection ports, and outlets. In an apparatus for analyzing compounds having a primary or secondary amino group using liquid chromatography, which is equipped with a valve, a pre-column, and a liquid chromatography separation column, the labeled reagent supply path and the A flow path connecting a sample introduction path of a sample introduction device for a sample containing a compound having a primary or secondary amino group is connected to an inlet of a reaction coil, and an outlet of the reaction coil is connected to a flow path switching valve. The first connection port of the flow path switching valve is connected to the inlet of the precolumn, the outlet of the precolumn is connected to a second connection port of the flow path switching valve, and the flow path switching valve is connected to a first inlet of the flow path switching valve. The first outlet of the switching valve is connected to the inlet of the liquid chromatography separation column, and the separation mobile phase supply path of the separation mobile phase supply device is connected to the second inlet of the flow path switching valve. In a first connection form of the switching valve, the inlet of the precolumn is connected to the outlet of the reaction coil via a flow switching valve, and the outlet of the precolumn is connected to the outside of the system via a flow switching valve, In the second connection form of the flow path switching valve, the separation mobile phase supply path of the separation mobile phase supply device is connected to the outlet of the precolumn via the flow path switching valve, and the outlet of the precolumn is connected to the outlet of the precolumn via the flow path switching valve. The present invention relates to an apparatus for analyzing compounds having primary or secondary amino groups using liquid chromatography, which is connected to the inlet of a fluid chromatography separation column. In the present invention, liquid chromatography means liquid chromatography, high performance liquid chromatography and ultra high performance liquid chromatography. In the present invention, the pre-labeling reagent includes:
Extra-visible/visible absorption labeling reagents, fluorescent labeling reagents,
There are radioactive reagents labeled with ¹⁴ C or ³ H. Fluorescent reagents include orthophthalaldehyde, fluorescamine, 1-dimethylamino-naphthalene 5-sulfonyl chloride (DNS-Cl),
7-chloro-4-nitrobenzofurazan (NBD
-Cl), but ortho-phthalaldehyde is preferred because it is water-soluble. Radioactive reagents include ¹⁴ C- or ³ H-labeled DNS-Cl. When water-soluble ortho-phthalaldehyde is used as a fluorescent reagent, it should contain N-acetylcysteine or 2-mercaptoethanol and be adjusted to pH 9 to 100% with sodium borate or potassium borate.
A solution with 11 buffers is used. Since 2-mercaptoethanol has poor stability, it is preferable to use N-acetyl-cysteine. The solvent for separating this fluorescent reagent from, for example, a pre-labeled amino acid is selected from citric acid, phosphoric acid, etc., and a neutral buffer solution such as phosphate buffer, citrate buffer, etc. is used. good. This neutral buffer solution can also contain a small amount of acetonitrile. In the case of analysis of amino acids having secondary amine groups, ascorbic acid is used. When analyzing a compound having a secondary amino group, particularly an amino acid such as proline or hydroxyproline, a flow path is formed to introduce a hypochlorous acid reagent. In this way, secondary amines can also be fluorescently labeled. As a pre-column for separating pre-labeled derivatives of compounds having primary or secondary amine groups, especially pre-labeled derivatives of amino acids having primary or secondary amino groups, from ortho-phthalaldehyde reagents, A resin-based column for reversed-phase chromatography with excellent alkalinity, such as a column with an octadecylsilylated stationary phase (ODS column)
is used. The flow path switching valves formed at both ends of the precolumn can be arranged separately, but for example,
It is preferable to use a six-way valve to switch both flow paths at the same time, since this simplifies the structure. (e) Example FIG. 1 is a flow path diagram showing an example of the apparatus for analyzing compounds having a primary amino group according to the present invention, particularly an example applied to amino acid analysis. FIG. 2 is a flow path diagram showing steps up to the pre-labeling step in one embodiment of the analyzer for compounds having primary and secondary amino groups of the present invention. Hereinafter, the present invention will be explained in detail with reference to these drawings, but it goes without saying that the present invention is not limited to these explanations and can take various forms. In FIG. 1, an O-phthalaldehyde reagent containing N-acetylcysteine is used as a fluorescent reagent, and a weakly basic buffer solution is used as its solvent. The O-phthalaldehyde reagent container 1 and the neutral buffer container 2 are connected to a pump 4 via a three-way valve 3 via a conduit. The flow path from the pump 4 branches, one communicating with the sample introduction device 5 and the other communicating with the bypass flow path 6. The channels from the sample introduction device 5 and the bypass channel 6 are connected together to a reaction coil 7. The outlet of the reaction coil 7 communicates with the inlet hole 9 of the six-way valve 8, and the hole 10 also communicates with the conduit 2.
0 communicates with one port of the precolumn 15 of the ODS column (octadecylsilylated), and the other port of the precolumn 15 communicates with the hole 13 of the six-way valve 8 via a conduit 21. The mobile phase for separation is a neutral buffer containing acetonitrile, and the same solution as the neutral buffer in container 2 is used except for the acetonitrile. as needed,
A gradient device can also be attached to change the acetonyl concentration over time. The mobile phase container 19 for separation is connected from the pump 18 to the hole 12 of the six-way valve 8 via a conduit 23. The hole 11 of the six-way valve 8 communicates with the separation column of the ODS column via a conduit 22, and the outlet of the separation column 16 communicates with the detector 17. The procedure for amino acid analysis using the apparatus of this example will be explained below. The three-way valve 3 and the six-way valve 8 are both connected to the flow path on the solid line side. First, by operating the pump 4, the O-phthalaldehyde reagent is transferred from the O-phthalaldehyde reagent container 1 to the reaction coil 7, the conduit 20, the precolumn 15,
Meanwhile, the mobile phase for separation is sent to the pipe line 21 from the mobile phase container for separation 19 by the operation of the pump 18.
3 to a separation column 16 via a six-way valve 8. A sample is introduced into the sample introduction device 5. Amino acids in the sample are reacted with O-phthalaldehyde in the reaction coil 7 to be prelabeled and collected in the precolumn 15. After a sufficient reaction, the three-way valve 3 is switched to the flow path on the dotted line side, and the neutral buffer is passed from the neutral buffer container 2 to the reaction coil 7 via the pre-column 15 and the pipe line 21 to the six-way valve. 8, the pre-labeled amino acid derivative remaining in the reaction column 7 is sent to the pre-column 15 and collected, and the O-phthalaldehyde reagent is expelled from the pre-column 15. Once O-phthalaldehyde and N-acetylcysteine have been expelled from precolumn 15,
The six-way valve 8 is switched to the flow path indicated by the dotted line, and the neutral buffer containing acetonitrile is passed through the pump 18, the pipe 23, the holes 12 and 13 of the six-way valve, and the pipe 2.
1 to the pre-column 15, and the pre-labeled amino acid derivative in the pre-column 15 is passed through the conduit 2, the holes 10 and 11 of the six-way valve 8, and the conduit 2.
2 to the separation column 16. The prelabeled amino acid derivatives are, respectively,
It is chromatographically separated in a separation column and detected with a fluorescence detector 17. Generally, the larger the number of samples, the wider the sample band becomes during the sample introduction process. However, in the device of this embodiment, since the sample band is pre-labeled and collected in the pre-column 15, such a sample band becomes wider. The spread of is eliminated. Moreover, since the mobile phase for separation is sent from the pre-column 15 to the separation column 16 and detected immediately after separation, it is possible to avoid diffusion after separation, so there is no reduction in resolution due to band broadening. . In FIG. 2, a sodium hypochlorite reagent container 26 is connected to a sample introduction device 30 through a pump 29. In FIG. This sample introduction device 30 has a reaction coil 32
communicate with. O-phthalaldehyde reagent container 24
and neutral buffer container 25, three-way valve 27, pump 2
8 to the reaction coil 33. The analysis procedure for amino acids having a secondary amino group will be explained below. The three-way valve 27 is connected to the flow path indicated by the solid line. The pump 29 is operated to send the hypochlorous acid reagent from the hypochlorous acid reagent container 26 to the reaction coil 32 . A sample is introduced from a sample introduction device 30 and reacted with hypochlorous acid in a reaction coil 32 to convert secondary amino groups into primary amino groups. Meanwhile, the O-phthalaldehyde reagent was added to pump 2
8 is activated and sent from the container 24 to the reaction coil 33, and is reacted with the amino acid having a primary amino group produced in the reaction coil 32 to produce a pre-labeled derivative of the amino acid. When the amino acid pre-labeling reaction is completed, the three-way valve 27 is switched to the dotted line flow path to send the neutral buffer solution containing ascorbic acid from the container 25 to the reaction coil 33, and the following operations are performed in the same manner as in FIG. Perform amino acid analysis. An example of amino acid analysis using the apparatus shown in FIG. 1 is shown below. As a precolumn, SWF-2600 (inner diameter 4.0 mm,
Shim-Pack CLC was used as a separation column (length 30 mm) [manufactured by Sekisui Hua In Chemical Co., Ltd.].
- Analyze amino acids such as phenylalanine, tyrosine, histidine, 1-methylhistidine, 3-methylhistidine, etc. in biological samples using ODS (inner diameter 6.0 mm, length 150 mm) [manufactured by Shimadzu Corporation]. Ivy. The OPA reagent used was a 0.1% OPA solution containing 0.1% N-acetylcysteine and adjusted to pH 9.2 with a 0.1M potassium borate solution. Furthermore, a 10 mM potassium phosphate solution with a pH of 7 was used as a washing solution, and a mixed solution of a 10 mM potassium phosphate solution with a pH of 7 and acetonitrile was used as a mobile phase for separation. This separated mobile phase is
Using a gradient device, first use a mixed solution of 5% acetonitrile, gradually increase the concentration of acetonitrile, and finally add 50% acetonitrile.
% mixed solution. The temperature was 40℃, and the flow rate of each solution was 1.0ml/
The liquid was delivered in minutes. As a result, the analysis results were good for amino acids such as phenylalanine, tyrosine, histidine, 1-methylhistidine, and 3-methylhistidine. (F) Effect The present invention uses an ODS column for reversed phase chromatography as a precolumn to precolumnize a derivative of a compound having a primary or secondary amino group with a fluorescent reagent or the like. , the excess fluorescent reagent can be collected in the column, separated and removed from the pre-labeled derivative, and the pre-labeled derivative can be concentrated. The spread of the band is eliminated. Furthermore, the length of the reaction coil can be increased depending on the concentration function of the pre-labeled derivative of a compound having a primary or secondary amino group in the pre-column. can be performed mechanically under the same conditions. Therefore, compared to the conventional post-label method and pre-label method, it is easier to carry out, and moreover, by operating a valve, for example, amino acid analysis can be performed easily and with high precision. Therefore, it can be said that it is suitable for automation. Furthermore, the present invention allows easy analysis of compounds having secondary amino groups, which has been difficult using conventional post-column methods. Furthermore, the pre-labeling method of the present invention facilitates automation of not only high-performance liquid chromatography analysis but also ultra-high-performance chromatography analysis if the target components are limited. As described above, the present invention has many advantages over conventional analyzers for compounds having amino groups, especially amino acids, and has a great influence.

[Brief explanation of the drawing]

第１図は、本発明の第１級のアミノ基を有する
化合物の分析装置の一実施例、特に、アミノ酸分
析に適用した一例を示す流路図であり、第２図
は、本発明の第１級及び第２級アミノ基を有する
化合物の分析装置の一実施例の中のプレラベル化
工程までを示す流路図である。１及び２４はＯ−フタルアルデヒド試薬容器、
２及び２５は中性緩衝液容器、３及び２７は三方
弁、４，１８，２８及び２９はポンプ、５及び３
０は試料導入装置、６及び３１はバイパス流路、
７，３２及び３３は反応コイル、８は六方バル
ブ、１５はプレカラム、１６は分離カラム、１７
は螢光検出器、１９は分離用移動相容器である。 FIG. 1 is a flow path diagram showing an embodiment of the device for analyzing compounds having a primary amino group of the present invention, in particular, an example of the device applied to amino acid analysis. FIG. 2 is a flow path diagram showing steps up to a pre-labeling step in an embodiment of an analyzer for compounds having primary and secondary amino groups. 1 and 24 are O-phthalaldehyde reagent containers;
2 and 25 are neutral buffer containers, 3 and 27 are three-way valves, 4, 18, 28 and 29 are pumps, 5 and 3
0 is a sample introduction device, 6 and 31 are bypass channels,
7, 32 and 33 are reaction coils, 8 is a six-way valve, 15 is a pre-column, 16 is a separation column, 17
1 is a fluorescence detector, and 19 is a mobile phase container for separation.

Claims

[Claims]

1 Labeled reagent supply device, sample introduction device for a reagent containing a compound having a primary or secondary amino group, flow path switching valve with multiple inlets, connection ports, and outlets, precolumn, and liquid chromatograph (b) In an apparatus for analyzing compounds having a primary or secondary amino group using liquid chromatography, which is equipped with a separation column, the labeling reagent supply path and the primary or secondary amino group of the labeling reagent supply device The flow path connecting the sample introduction path of the sample reagent introduction device containing a compound having an amino group is connected to the inlet of the reaction coil, and the outlet of the reaction coil is connected to the first inlet of the flow path switching valve. a first connection port of the flow path switching valve is connected to an inlet of the precolumn, an outlet of the precolumn is connected to a second connection port of the flow path switching valve, and a first connection port of the flow path switching valve is connected to an inlet of the precolumn; is connected to the inlet of the liquid chromatography separation column, the separation mobile phase supply path of the separation mobile phase supply device is connected to the second inlet of the flow path switching valve, and the separation mobile phase supply path of the separation mobile phase supply device is connected to the second inlet of the flow path switching valve. In this embodiment, the inlet of the precolumn is connected to the outlet of the reaction coil via a flow switching valve, the outlet of the precolumn is connected to the outside of the system via a flow switching valve, and the second of the flow switching valve is connected to the outlet of the reaction coil. In this connection configuration, the separation mobile phase supply path of the separation mobile phase supply device is connected to the outlet of the precolumn via the flow path switching valve, and the outlet of the precolumn is connected to the liquid chromatography separation column via the flow path switching valve. An apparatus for analyzing a compound having a primary or secondary amino group using liquid chromatography, characterized in that the apparatus is attached to an inlet of a liquid chromatography system.