JPH0552462B2 - - Google Patents
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- JPH0552462B2 JPH0552462B2 JP58251657A JP25165783A JPH0552462B2 JP H0552462 B2 JPH0552462 B2 JP H0552462B2 JP 58251657 A JP58251657 A JP 58251657A JP 25165783 A JP25165783 A JP 25165783A JP H0552462 B2 JPH0552462 B2 JP H0552462B2
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
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Description
(イ) 産業上の利用分野
本発明は、第１級或は第２級のアミノ基を有す
る化合物の分析装置に関し、特に、第１級或は第
２級のアミノ基を有するアミノ酸、ポリアミン、
インドールアミン、イミダゾールアミン及びアミ
ノ配糖体系抗生物質の分析装置に関する。 また、本発明は、有機化学、生化学、食品、医
薬品、医療機器等の産業分野における、生体試料
についてのアミノ酸、インドールアミン、イミダ
ゾールアミン及びアミノ配糖体系抗生物質の自動
分析に適したプレラベル法による第１級或は第２
級のアミノ基を有する化合物、その中でも特に、
アミノ酸及びその誘導体用の分析装置に関する。 (ロ) 従来技術 第１級のアミノ基を有する化合物、中でもアミ
ノ酸及びその誘導体についての分析には、螢光法
が多用されているが、一般に、ポストラベル法が
採用されている。 しかし、ポストラベル法では、例えば、アミノ
酸は、イオン交換樹脂を使用して分離された後、
反応コイルに導かれて、螢光試薬、例えば、オル
トフタルアルデヒド或はフルオレツサミン等と反
応して、該アミノ酸を螢光性誘導体化して検出す
るために、分離されたアミノ酸が、反応試薬によ
つて希釈されて、そのバンドが広がり、得られる
クロマトグラムは分離性が低くなり、しかも、反
応コイルでの反応を充分に行うにも、分離後の拡
散を防止する関係上、反応コイルを充分に長くす
ることができず、反応が充分に行われない傾向が
あり、その精度も充分ではない。さらに、検出直
前に、螢光試薬をポンプで供給するために、脈動
が生じて、ノイズを生じ易く、問題であつた。 また、ポストラベル法における分離カラムで分
離後の拡散を避けるために、マニアルでプレラベ
ル化して分離カラムに導入する方法があるが、プ
レラベル化の反応操作を正確に一定の条件下でし
かも一定の時間内に行うことは容易でなく、自動
化が望まれていた。 そこで、試料と螢光試薬を反応コイルに流して
反応させ、その生成物を分離カラムに流して自動
化する方法がとられた。 しかし、この分析装置は、オートインジエクタ
を使用するものであるが、吸引部から分離カラム
までの距離が長くなり、分離カラム入口での試料
バンドの広がりが大きくなるのが避けられないと
ころ、しかも、試料の量が多くなればなる程、吸
引段階で、既に、バンドは大きく広がる傾向を有
し、問題であつた。さらに、この方法では、分離
カラムには、螢光試薬に導入されるため、分析成
分は希釈される結果となり好ましくなく、加え
て、分離される条件と反応条件が類似する必要が
あり、条件設定にも問題があつた。 (ハ) 目的 本発明は、これら従来法における問題点を、プ
レラベル化した化合物を分離カラムに導入する前
に、螢光試薬と分離することによつて、解消する
ものであつて、自動化に適したプレラベル法によ
る第１級或は第２級アミノ基を有する化合物、特
にアミノ酸の分析装置を提供するものである。 (ニ) 構成 本発明は、ラベル化試薬供給装置、第１級或は
第２級のアミノ基を有する化合物を含有する試薬
用試料導入装置、複数の入口、接続口及び出口を
備える流路切換えバルブ、プレカラム並びに液体
クロマトグラフイ分離カラムを具備する液体クロ
マトグラフイによる第１級或は第２級のアミノ基
を有する化合物の分析装置において、ラベル化試
薬供給装置のラベル化試薬供給路と第１級或は第
２級のアミノ基を有する化合物を含有する試料用
試料導入装置の試料導入路とを接続する流路は反
応コイルの入口に接続し、該反応コイルの出口は
流路切換えバルブの第１の入口に接続し、該流路
切換えバルブの第１の接続口は該プレカラムの入
口に接続し、該プレカラムの出口は流路切換えバ
ルブの第２の接続口に接続し、流路切換えバルブ
の第１の出口は液体クロマトグラフ分離カラムの
入口に接続し、分離用移動相供給装置の分離用移
動相供給路は流路切換えバルブの第２の入口に接
続しており、流路切換えバルブの第１の接続形態
において、該プレカラムの入口は流路切換えバル
ブを介して該反応コイルの出口に接続し、また該
プレカラムの出口は流路切換えバルブを介して系
外に接続し、流路切換えバルブの第２の接続形態
において、分離用移動相供給装置の分離用移動相
供給路は流路切換えバルブを介してプレカラムの
出口に接続し、プレカラムの出口は流路切換えバ
ルブを介して流体クロマトグラフイ分離カラムの
入口に接続することを特徴とする液体クロマトグ
ラフイによる第１級或は第２級のアミノ基を有す
る化合物の分析装置にある。 本発明において、液体クロマトグラフイは、液
体クロマトグラフイ、高速液体クロマトグラフイ
及び超高速液体クロマトグラフイを意味する。 本発明において、プレラベル化試薬としては、
視外・可視吸光ラベル試薬、螢光ラベル化試薬、
14C又は3Hでラベル化された放射試薬等がある。 螢光試薬としては、オルトーフタルアルデヒ
ド、フルオレサミン、１−ジメチルアミノ−ナフ
タレン５−スルホニルクロライド（DNS−Cl）、
７−クロロ−４−ニトロベンゾフラザン（NBD
−Cl）等があるが、オルト−フタルアルデヒドは
水溶性であるために好ましい。放射試薬として
は、14C又は3Hでラベル化されたDNS−Clがある。 螢光試薬として、水溶性のオルト−フタルアル
デヒドを使用する場合は、Ｎ−アセチルシステイ
ン或は２−メルカプトエタノールを含有させ、ホ
ウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウムで、PH９ないし
11の緩衝剤を有する溶液を使用する。２−メルカ
プトエタノールは安定性が悪いため、Ｎ−アセチ
ル−システインを使用するとよい。 この螢光試薬を例えばプレラベル化したアミノ
酸と分離する溶媒としては、クエン酸、リン酸等
の中から選んで、中性の緩衝溶液、例えばリン酸
緩衝液、クエン酸緩衝液等とするのがよい。この
中性緩衝溶液に、少量のアセトニトリルを含有さ
せることもできる。第２級のアミン基を有するア
ミノ酸分析の場合には、アスコルビン酸を添加し
たものを使用する。 ２級のアミノ基を有する化合物、特にアミノ
酸、例えば、プロリン、ヒドロキシプロリンを分
析する場合は、次亜塩素酸試薬を導入する流路を
形成する。このようにすると、２級アミンも螢光
ラベル化が可能となる。 第１級或は第２級アミン基を有する化合物のプ
レラベル誘導体、特に、第１級或は第２級アミノ
基を有するアミノ酸のプレラベル誘導体を、オル
ト−フタルアルデヒド試薬と分離するプレカラム
としては、耐アルカリ性にすぐれた樹脂性の逆相
クロマト用カラム、例えば、オクタデシルシリル
化したものを固定相としたカラム（ODSカラム）
が使用される。 プレカラムの両端に形成される流路切換えバル
ブは、別個に配設することもできるが、例えば、
六方バルブにより、両流路の切換えを同時に行う
ことができるようにするのが、構造が簡単になる
ので好ましい。 (ホ) 実施例 第１図は、本発明の第１級のアミノ基を有する
化合物の分析装置の一実施例、特に、アミノ酸分
析に適用した一例を示す流路図である。第２図
は、本発明の第１級及び第２級のアミノ基を有す
る化合物の分析装置の一実施例の中プレラベル化
工程までを示す流路図である。 以下、これらの図面を参照して本発明を詳細に
説明するが、本発明は、これらの説明に限定され
るものではなく、種々の態様をとりうることはい
うまでもない。 第１図において、螢光試薬として、Ｎ−アセチ
ルシステインを含有するＯ−フタルアルデヒド試
薬が使用され、その溶媒として、弱塩基性緩衝溶
液が使用されている。 Ｏ−フタルアルデヒド試薬容器１及び中性緩衝
液容器２は、管路により、三方弁３を経てポンプ
４に連通している。ポンプ４からの流路は、分岐
して、一方は、試料導入装置５に、そして、他方
はバイパス流路６に連通する。試料導入装置５及
びバイパス流路６からの流路は合して、反応コイ
ル７に接続する。反応コイル７の出口は六方バル
ブ８の入口孔９に連通し、同じく孔１０は管路２
０により、ODSカラム（オクタデシルシリル化
したもの）のプレカラム１５の一方の口に連通
し、プレカラム１５の他方の口は、管路２１によ
り、六方バルブ８の孔１３に連通する。分離用の
移動相は、アセトニトリルを含有する中性緩衝液
であり、アセトニトリルを除いて、容器２の中性
緩衝液と同一の溶液を使用する。必要に応じて、
グラジエント装置を付属し、アセトニリル濃度を
経時的に変化させることもできる。この分離用の
移動相容器１９はポンプ１８から、管路２３によ
り、六方バルブ８の孔１２に接続している。六方
バルブ８の孔１１は、管路２２を経てODSカラ
ムの分離カラムに連通し、分離カラム１６の出口
は検出器１７に連通する。 この実施例の装置によるアミノ酸分析の手順を
以下説明する。 三方弁３及び六方バルブ８は、いずれも実線側
の流路に接続している。 まず、ポンプ４の作動により、Ｏ−フタルアル
デヒド試薬容器１から、Ｏ−フタルアルデヒド試
薬を反応コイル７、管路２０、プレカラム１５、
管路２１へ送り、一方、ポンプ１８の作動により
分離用移動相容器１９から分離用移動相を管路２
３から六方バルブ８を経由して分離カラム１６に
流れる。 試料を試料導入装置５に導入する。試料中のア
ミノ酸は、反応コイル７中で、Ｏ−フタルアルデ
ヒドと反応して、プレラベル化され、プレカラム
１５に捕集される。充分に反応させた後、三方弁
３を点線側の、流路に切換えて、中性緩衝液容器
２から中性緩衝液を反応コイル７からプレカラム
１５及び管路２１を経由して、六方バルブ８の出
口孔１４に流して、反応カラム７に残留するプレ
ラベル化したアミノ酸誘導体をプレカラム１５に
送り、捕集すると共に、Ｏ−フタルアルデヒド試
薬をプレカラム１５から駆逐する。 Ｏ−フタルアルデヒドとＮ−アセチルシステイ
ンが、プレカラム１５から駆逐されたところで、
六方バルブ８を点線の流路に切換えて、アセトニ
トリルを含有する中性緩衝液を、ポンプ１８、管
路２３、六方バルブの孔１２、孔１３及び管路２
１を経由して、プレカラム１５に流し、プレカラ
ム１５中のプレラベル化されたアミノ酸誘導体を
管路２、六方バルブ８の孔１０，１１及び管路２
２を経由して、分離カラム１６に送る。 プレラベル化されたアミノ酸誘導体は、夫々、
分離カラム中で、クロマトグラフイ分離され、螢
光検出器１７で検出される。 一般に、試料が多くなればなる程、試料導入過
程での試料バンドの巾は大きく広がるが、本実施
例の装置においては、プレカラム１５に一旦プレ
ラベル化して捕集されるので、そのような試料バ
ンドの広がりは解消される。しかも、プレカラム
１５から分離カラム１６に分離用移動相によつて
送られ、分離後、直ちに検出されるので、分離後
の拡散を避けることができるので、バンドの広が
りによる分離度の低下が起こらない。 第２図において、次亜塩素酸ナトリウム試薬容
器２６は、ポンプ２９から試料導入装置３０に接
続する。この試料導入装置３０は反応コイル３２
に連通する。Ｏ−フタルアルデヒド試薬容器２４
及び中性緩衝容器２５は、三方弁２７、ポンプ２
８を介して反応コイル３３に接続している。 ２級のアミノ基を有するアミノ酸についての分
析手順を以下説明する。 三方弁２７は実線の流路に接続している。 次亜塩素酸試薬容器２６から、ポンプ２９を作
動させて、次亜塩素酸試薬を反応コイル３２に送
る。試料を試料導入装置３０から導入し反応コイ
ル３２ で次亜塩素酸と反応させて、第２級アミノ基を第
１級アミノ基に変化させる。 一方、Ｏ−フタルアルデヒド試薬を、ポンプ２
８を作動させて容器２４から反応コイル３３に送
り、反応コイル３２で生成した第１級アミノ基を
有するアミノ酸と反応させ、該アミノ酸のプレラ
ベル化誘導体を生成させる。 アミノ酸のプレラベル化反応が終了したところ
で、三方弁２７を点線の流路に切換えて、アスコ
ルビン酸を含有する中性緩衝液を容器２５から反
応コイル３３に送り、以下第１図と同様に操作し
てアミノ酸の分析を行う。 第１図の装置の使用したアミノ酸分析の例を次
に示す。 プレカラムとして、SWF−2600（内径4.0mm、
長さ30mm）［セキスイフアインケミカル社製］を
使用し、分離カラムとして、Shim−Pack CLC
−ODS（内径6.0mm、長さ150mm）［島津製作所社
製］を使用して、生体試料中のフエニルアラニ
ン、チロシン、ヒスチジン、１−メチルヒスチジ
ン、３−メチルヒスチジン等のアミノ酸の分析を
行つた。 使用したOPA試薬としては、0.1％Ｎ−アセチ
ルシステインを含有し、0.1Mホウ酸カリウム溶
液でPH9.2とした0.1％OPA溶液を用いた。 また、洗浄用溶液としては、PH７の10ｍＭリン
酸カリウム溶液を使用し、分離用移動相として
は、PHの10ｍＭリン酸カリウム溶液とアセトニト
リルの混合溶液を使用した。この分離移動相は、
グラジエント装置を使用して、最初アセトニトリ
ル５％の混合溶液を用い、漸次アセトニトリルの
濃度を高めて、最終において、アセトニトリル50
％の混合液とした。 温度は40℃とし、いずれの溶液も流量1.0ml／
分で送液された。 その結果、フエニルアラニン、チロシン、ヒス
チジン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒス
チジン等のアミノ酸について分析結果は良好であ
つた。 (ヘ) 効果 本発明は、逆相クロマトグラフイ用のODSカ
ラムをプレカラムに使用して、螢光試薬等で、第
１級或は第２級のアミノ基を有する化合物のプレ
カラム化した誘導体を、該カラムに一旦捕集し
て、余剰の螢光試薬を、該プレラベル化した誘導
体から分離除去して、該プレラベル化した誘導体
を濃縮することができるので、従来のプレラベル
法における試料導入の際のバンドの広がりが解消
される。 しかも、プレカラムにおけるこのような第１級
或は第２級のアミノ基を有する化合物のプレラベ
ル化した誘導体の濃縮機能に応じて、反応コイル
の長さを長くすることができるので、プレラベル
化の反応を同一条件下で機械的に行うことができ
る。したがつて、従来の、ポストラベル法及びプ
レラベル法に比較して、手軽に実施をすることが
でき、しかも、バルブ操作で、例えば、アミノ酸
分析を簡単に、かつ、高い精度で行うことができ
るので、自動化に適するといえる。 しかも、本発明は、従来のポストカラム法等で
困難であつた第２級アミノ基を有する化合物の分
析が容易に行うことができるものである。 また、本発明のプレラベル法は、分析対象成分
が限定されれば、高速液体クロマトグラフイ分析
の自動化はもとより、超高速クロマトグラフイ分
析の自動化も容易となる。 以上のように、本発明は、従来のアミノ基を有
する化合物、特に、アミノ酸の分析装置と比較し
て、優れた点が多く、その影響は大きい。
る化合物の分析装置に関し、特に、第１級或は第
２級のアミノ基を有するアミノ酸、ポリアミン、
インドールアミン、イミダゾールアミン及びアミ
ノ配糖体系抗生物質の分析装置に関する。 また、本発明は、有機化学、生化学、食品、医
薬品、医療機器等の産業分野における、生体試料
についてのアミノ酸、インドールアミン、イミダ
ゾールアミン及びアミノ配糖体系抗生物質の自動
分析に適したプレラベル法による第１級或は第２
級のアミノ基を有する化合物、その中でも特に、
アミノ酸及びその誘導体用の分析装置に関する。 (ロ) 従来技術 第１級のアミノ基を有する化合物、中でもアミ
ノ酸及びその誘導体についての分析には、螢光法
が多用されているが、一般に、ポストラベル法が
採用されている。 しかし、ポストラベル法では、例えば、アミノ
酸は、イオン交換樹脂を使用して分離された後、
反応コイルに導かれて、螢光試薬、例えば、オル
トフタルアルデヒド或はフルオレツサミン等と反
応して、該アミノ酸を螢光性誘導体化して検出す
るために、分離されたアミノ酸が、反応試薬によ
つて希釈されて、そのバンドが広がり、得られる
クロマトグラムは分離性が低くなり、しかも、反
応コイルでの反応を充分に行うにも、分離後の拡
散を防止する関係上、反応コイルを充分に長くす
ることができず、反応が充分に行われない傾向が
あり、その精度も充分ではない。さらに、検出直
前に、螢光試薬をポンプで供給するために、脈動
が生じて、ノイズを生じ易く、問題であつた。 また、ポストラベル法における分離カラムで分
離後の拡散を避けるために、マニアルでプレラベ
ル化して分離カラムに導入する方法があるが、プ
レラベル化の反応操作を正確に一定の条件下でし
かも一定の時間内に行うことは容易でなく、自動
化が望まれていた。 そこで、試料と螢光試薬を反応コイルに流して
反応させ、その生成物を分離カラムに流して自動
化する方法がとられた。 しかし、この分析装置は、オートインジエクタ
を使用するものであるが、吸引部から分離カラム
までの距離が長くなり、分離カラム入口での試料
バンドの広がりが大きくなるのが避けられないと
ころ、しかも、試料の量が多くなればなる程、吸
引段階で、既に、バンドは大きく広がる傾向を有
し、問題であつた。さらに、この方法では、分離
カラムには、螢光試薬に導入されるため、分析成
分は希釈される結果となり好ましくなく、加え
て、分離される条件と反応条件が類似する必要が
あり、条件設定にも問題があつた。 (ハ) 目的 本発明は、これら従来法における問題点を、プ
レラベル化した化合物を分離カラムに導入する前
に、螢光試薬と分離することによつて、解消する
ものであつて、自動化に適したプレラベル法によ
る第１級或は第２級アミノ基を有する化合物、特
にアミノ酸の分析装置を提供するものである。 (ニ) 構成 本発明は、ラベル化試薬供給装置、第１級或は
第２級のアミノ基を有する化合物を含有する試薬
用試料導入装置、複数の入口、接続口及び出口を
備える流路切換えバルブ、プレカラム並びに液体
クロマトグラフイ分離カラムを具備する液体クロ
マトグラフイによる第１級或は第２級のアミノ基
を有する化合物の分析装置において、ラベル化試
薬供給装置のラベル化試薬供給路と第１級或は第
２級のアミノ基を有する化合物を含有する試料用
試料導入装置の試料導入路とを接続する流路は反
応コイルの入口に接続し、該反応コイルの出口は
流路切換えバルブの第１の入口に接続し、該流路
切換えバルブの第１の接続口は該プレカラムの入
口に接続し、該プレカラムの出口は流路切換えバ
ルブの第２の接続口に接続し、流路切換えバルブ
の第１の出口は液体クロマトグラフ分離カラムの
入口に接続し、分離用移動相供給装置の分離用移
動相供給路は流路切換えバルブの第２の入口に接
続しており、流路切換えバルブの第１の接続形態
において、該プレカラムの入口は流路切換えバル
ブを介して該反応コイルの出口に接続し、また該
プレカラムの出口は流路切換えバルブを介して系
外に接続し、流路切換えバルブの第２の接続形態
において、分離用移動相供給装置の分離用移動相
供給路は流路切換えバルブを介してプレカラムの
出口に接続し、プレカラムの出口は流路切換えバ
ルブを介して流体クロマトグラフイ分離カラムの
入口に接続することを特徴とする液体クロマトグ
ラフイによる第１級或は第２級のアミノ基を有す
る化合物の分析装置にある。 本発明において、液体クロマトグラフイは、液
体クロマトグラフイ、高速液体クロマトグラフイ
及び超高速液体クロマトグラフイを意味する。 本発明において、プレラベル化試薬としては、
視外・可視吸光ラベル試薬、螢光ラベル化試薬、
14C又は3Hでラベル化された放射試薬等がある。 螢光試薬としては、オルトーフタルアルデヒ
ド、フルオレサミン、１−ジメチルアミノ−ナフ
タレン５−スルホニルクロライド（DNS−Cl）、
７−クロロ−４−ニトロベンゾフラザン（NBD
−Cl）等があるが、オルト−フタルアルデヒドは
水溶性であるために好ましい。放射試薬として
は、14C又は3Hでラベル化されたDNS−Clがある。 螢光試薬として、水溶性のオルト−フタルアル
デヒドを使用する場合は、Ｎ−アセチルシステイ
ン或は２−メルカプトエタノールを含有させ、ホ
ウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウムで、PH９ないし
11の緩衝剤を有する溶液を使用する。２−メルカ
プトエタノールは安定性が悪いため、Ｎ−アセチ
ル−システインを使用するとよい。 この螢光試薬を例えばプレラベル化したアミノ
酸と分離する溶媒としては、クエン酸、リン酸等
の中から選んで、中性の緩衝溶液、例えばリン酸
緩衝液、クエン酸緩衝液等とするのがよい。この
中性緩衝溶液に、少量のアセトニトリルを含有さ
せることもできる。第２級のアミン基を有するア
ミノ酸分析の場合には、アスコルビン酸を添加し
たものを使用する。 ２級のアミノ基を有する化合物、特にアミノ
酸、例えば、プロリン、ヒドロキシプロリンを分
析する場合は、次亜塩素酸試薬を導入する流路を
形成する。このようにすると、２級アミンも螢光
ラベル化が可能となる。 第１級或は第２級アミン基を有する化合物のプ
レラベル誘導体、特に、第１級或は第２級アミノ
基を有するアミノ酸のプレラベル誘導体を、オル
ト−フタルアルデヒド試薬と分離するプレカラム
としては、耐アルカリ性にすぐれた樹脂性の逆相
クロマト用カラム、例えば、オクタデシルシリル
化したものを固定相としたカラム（ODSカラム）
が使用される。 プレカラムの両端に形成される流路切換えバル
ブは、別個に配設することもできるが、例えば、
六方バルブにより、両流路の切換えを同時に行う
ことができるようにするのが、構造が簡単になる
ので好ましい。 (ホ) 実施例 第１図は、本発明の第１級のアミノ基を有する
化合物の分析装置の一実施例、特に、アミノ酸分
析に適用した一例を示す流路図である。第２図
は、本発明の第１級及び第２級のアミノ基を有す
る化合物の分析装置の一実施例の中プレラベル化
工程までを示す流路図である。 以下、これらの図面を参照して本発明を詳細に
説明するが、本発明は、これらの説明に限定され
るものではなく、種々の態様をとりうることはい
うまでもない。 第１図において、螢光試薬として、Ｎ−アセチ
ルシステインを含有するＯ−フタルアルデヒド試
薬が使用され、その溶媒として、弱塩基性緩衝溶
液が使用されている。 Ｏ−フタルアルデヒド試薬容器１及び中性緩衝
液容器２は、管路により、三方弁３を経てポンプ
４に連通している。ポンプ４からの流路は、分岐
して、一方は、試料導入装置５に、そして、他方
はバイパス流路６に連通する。試料導入装置５及
びバイパス流路６からの流路は合して、反応コイ
ル７に接続する。反応コイル７の出口は六方バル
ブ８の入口孔９に連通し、同じく孔１０は管路２
０により、ODSカラム（オクタデシルシリル化
したもの）のプレカラム１５の一方の口に連通
し、プレカラム１５の他方の口は、管路２１によ
り、六方バルブ８の孔１３に連通する。分離用の
移動相は、アセトニトリルを含有する中性緩衝液
であり、アセトニトリルを除いて、容器２の中性
緩衝液と同一の溶液を使用する。必要に応じて、
グラジエント装置を付属し、アセトニリル濃度を
経時的に変化させることもできる。この分離用の
移動相容器１９はポンプ１８から、管路２３によ
り、六方バルブ８の孔１２に接続している。六方
バルブ８の孔１１は、管路２２を経てODSカラ
ムの分離カラムに連通し、分離カラム１６の出口
は検出器１７に連通する。 この実施例の装置によるアミノ酸分析の手順を
以下説明する。 三方弁３及び六方バルブ８は、いずれも実線側
の流路に接続している。 まず、ポンプ４の作動により、Ｏ−フタルアル
デヒド試薬容器１から、Ｏ−フタルアルデヒド試
薬を反応コイル７、管路２０、プレカラム１５、
管路２１へ送り、一方、ポンプ１８の作動により
分離用移動相容器１９から分離用移動相を管路２
３から六方バルブ８を経由して分離カラム１６に
流れる。 試料を試料導入装置５に導入する。試料中のア
ミノ酸は、反応コイル７中で、Ｏ−フタルアルデ
ヒドと反応して、プレラベル化され、プレカラム
１５に捕集される。充分に反応させた後、三方弁
３を点線側の、流路に切換えて、中性緩衝液容器
２から中性緩衝液を反応コイル７からプレカラム
１５及び管路２１を経由して、六方バルブ８の出
口孔１４に流して、反応カラム７に残留するプレ
ラベル化したアミノ酸誘導体をプレカラム１５に
送り、捕集すると共に、Ｏ−フタルアルデヒド試
薬をプレカラム１５から駆逐する。 Ｏ−フタルアルデヒドとＮ−アセチルシステイ
ンが、プレカラム１５から駆逐されたところで、
六方バルブ８を点線の流路に切換えて、アセトニ
トリルを含有する中性緩衝液を、ポンプ１８、管
路２３、六方バルブの孔１２、孔１３及び管路２
１を経由して、プレカラム１５に流し、プレカラ
ム１５中のプレラベル化されたアミノ酸誘導体を
管路２、六方バルブ８の孔１０，１１及び管路２
２を経由して、分離カラム１６に送る。 プレラベル化されたアミノ酸誘導体は、夫々、
分離カラム中で、クロマトグラフイ分離され、螢
光検出器１７で検出される。 一般に、試料が多くなればなる程、試料導入過
程での試料バンドの巾は大きく広がるが、本実施
例の装置においては、プレカラム１５に一旦プレ
ラベル化して捕集されるので、そのような試料バ
ンドの広がりは解消される。しかも、プレカラム
１５から分離カラム１６に分離用移動相によつて
送られ、分離後、直ちに検出されるので、分離後
の拡散を避けることができるので、バンドの広が
りによる分離度の低下が起こらない。 第２図において、次亜塩素酸ナトリウム試薬容
器２６は、ポンプ２９から試料導入装置３０に接
続する。この試料導入装置３０は反応コイル３２
に連通する。Ｏ−フタルアルデヒド試薬容器２４
及び中性緩衝容器２５は、三方弁２７、ポンプ２
８を介して反応コイル３３に接続している。 ２級のアミノ基を有するアミノ酸についての分
析手順を以下説明する。 三方弁２７は実線の流路に接続している。 次亜塩素酸試薬容器２６から、ポンプ２９を作
動させて、次亜塩素酸試薬を反応コイル３２に送
る。試料を試料導入装置３０から導入し反応コイ
ル３２ で次亜塩素酸と反応させて、第２級アミノ基を第
１級アミノ基に変化させる。 一方、Ｏ−フタルアルデヒド試薬を、ポンプ２
８を作動させて容器２４から反応コイル３３に送
り、反応コイル３２で生成した第１級アミノ基を
有するアミノ酸と反応させ、該アミノ酸のプレラ
ベル化誘導体を生成させる。 アミノ酸のプレラベル化反応が終了したところ
で、三方弁２７を点線の流路に切換えて、アスコ
ルビン酸を含有する中性緩衝液を容器２５から反
応コイル３３に送り、以下第１図と同様に操作し
てアミノ酸の分析を行う。 第１図の装置の使用したアミノ酸分析の例を次
に示す。 プレカラムとして、SWF−2600（内径4.0mm、
長さ30mm）［セキスイフアインケミカル社製］を
使用し、分離カラムとして、Shim−Pack CLC
−ODS（内径6.0mm、長さ150mm）［島津製作所社
製］を使用して、生体試料中のフエニルアラニ
ン、チロシン、ヒスチジン、１−メチルヒスチジ
ン、３−メチルヒスチジン等のアミノ酸の分析を
行つた。 使用したOPA試薬としては、0.1％Ｎ−アセチ
ルシステインを含有し、0.1Mホウ酸カリウム溶
液でPH9.2とした0.1％OPA溶液を用いた。 また、洗浄用溶液としては、PH７の10ｍＭリン
酸カリウム溶液を使用し、分離用移動相として
は、PHの10ｍＭリン酸カリウム溶液とアセトニト
リルの混合溶液を使用した。この分離移動相は、
グラジエント装置を使用して、最初アセトニトリ
ル５％の混合溶液を用い、漸次アセトニトリルの
濃度を高めて、最終において、アセトニトリル50
％の混合液とした。 温度は40℃とし、いずれの溶液も流量1.0ml／
分で送液された。 その結果、フエニルアラニン、チロシン、ヒス
チジン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒス
チジン等のアミノ酸について分析結果は良好であ
つた。 (ヘ) 効果 本発明は、逆相クロマトグラフイ用のODSカ
ラムをプレカラムに使用して、螢光試薬等で、第
１級或は第２級のアミノ基を有する化合物のプレ
カラム化した誘導体を、該カラムに一旦捕集し
て、余剰の螢光試薬を、該プレラベル化した誘導
体から分離除去して、該プレラベル化した誘導体
を濃縮することができるので、従来のプレラベル
法における試料導入の際のバンドの広がりが解消
される。 しかも、プレカラムにおけるこのような第１級
或は第２級のアミノ基を有する化合物のプレラベ
ル化した誘導体の濃縮機能に応じて、反応コイル
の長さを長くすることができるので、プレラベル
化の反応を同一条件下で機械的に行うことができ
る。したがつて、従来の、ポストラベル法及びプ
レラベル法に比較して、手軽に実施をすることが
でき、しかも、バルブ操作で、例えば、アミノ酸
分析を簡単に、かつ、高い精度で行うことができ
るので、自動化に適するといえる。 しかも、本発明は、従来のポストカラム法等で
困難であつた第２級アミノ基を有する化合物の分
析が容易に行うことができるものである。 また、本発明のプレラベル法は、分析対象成分
が限定されれば、高速液体クロマトグラフイ分析
の自動化はもとより、超高速クロマトグラフイ分
析の自動化も容易となる。 以上のように、本発明は、従来のアミノ基を有
する化合物、特に、アミノ酸の分析装置と比較し
て、優れた点が多く、その影響は大きい。
第１図は、本発明の第１級のアミノ基を有する
化合物の分析装置の一実施例、特に、アミノ酸分
析に適用した一例を示す流路図であり、第２図
は、本発明の第１級及び第２級アミノ基を有する
化合物の分析装置の一実施例の中のプレラベル化
工程までを示す流路図である。 １及び２４はＯ−フタルアルデヒド試薬容器、
２及び２５は中性緩衝液容器、３及び２７は三方
弁、４，１８，２８及び２９はポンプ、５及び３
０は試料導入装置、６及び３１はバイパス流路、
７，３２及び３３は反応コイル、８は六方バル
ブ、１５はプレカラム、１６は分離カラム、１７
は螢光検出器、１９は分離用移動相容器である。
化合物の分析装置の一実施例、特に、アミノ酸分
析に適用した一例を示す流路図であり、第２図
は、本発明の第１級及び第２級アミノ基を有する
化合物の分析装置の一実施例の中のプレラベル化
工程までを示す流路図である。 １及び２４はＯ−フタルアルデヒド試薬容器、
２及び２５は中性緩衝液容器、３及び２７は三方
弁、４，１８，２８及び２９はポンプ、５及び３
０は試料導入装置、６及び３１はバイパス流路、
７，３２及び３３は反応コイル、８は六方バル
ブ、１５はプレカラム、１６は分離カラム、１７
は螢光検出器、１９は分離用移動相容器である。
Claims (1)
- １ ラベル化試薬供給装置、第１級或は第２級の
アミノ基を有する化合物を含有する試薬用試料導
入装置、複数の入口、接続口及び出口を備える流
路切換えバルブ、プレカラム並びに液体クロマト
グラフイ分離カラムを具備する液体クロマトグラ
フイによる第１級或は第２級のアミノ基を有する
化合物の分析装置において、ラベル化試薬供給装
置のラベル化試薬供給路と第１級或は第２級のア
ミノ基を有する化合物を含有する試料用試薬導入
装置の試料導入路とを接続する流路は反応コイル
の入口に接続し、該反応コイルの出口は流路切換
えバルブの第１の入口に接続し、該流路切換えバ
ルブの第１の接続口は該プレカラムの入口に接続
し、該プレカラムの出口は流路切換えバルブの第
２の接続口に接続し、流路切換えバルブの第１の
出口は液体クロマトグラフ分離カラムの入口に接
続し、分離用移動相供給装置の分離用移動相供給
路は流路切換えバルブの第２の入口に接続してお
り、流路切換えバルブの第１の接続形態におい
て、該プレカラムの入口は流路切換えバルブを介
して該反応コイルの出口に接続し、また該プレカ
ラムの出口は流路切換えバルブを介して系外に接
続し、流路切換えバルブの第２の接続形態におい
て、分離用移動相供給装置の分離用移動相供給路
は流路切換えバルブを介してプレカラムの出口に
接属し、プレカラムの出口は流路切換えバルブを
介して液体クロマトグラフイ分離カラムの入口に
接属することを特徴とする液体クロマトグラフイ
による第１級或は第２級のアミノ基を有する化合
物の分析装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58251657A JPS60142250A (ja) | 1983-12-28 | 1983-12-28 | 液体クロマトグラフィによる第１級或いは第２級のアミノ基を有する化合物の分析装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58251657A JPS60142250A (ja) | 1983-12-28 | 1983-12-28 | 液体クロマトグラフィによる第１級或いは第２級のアミノ基を有する化合物の分析装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60142250A JPS60142250A (ja) | 1985-07-27 |
| JPH0552462B2 true JPH0552462B2 (ja) | 1993-08-05 |
Family
ID=17226072
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58251657A Granted JPS60142250A (ja) | 1983-12-28 | 1983-12-28 | 液体クロマトグラフィによる第１級或いは第２級のアミノ基を有する化合物の分析装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60142250A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0820426B2 (ja) * | 1989-10-20 | 1996-03-04 | 株式会社日立製作所 | 液体クロマトグラフ分析計およびプレラベル反応処理方法 |
| JPH087203B2 (ja) * | 1990-06-15 | 1996-01-29 | 株式会社日立製作所 | カテコールアミンの分析方法および分析装置 |
| JPH04169847A (ja) * | 1990-11-02 | 1992-06-17 | Seiko Instr Inc | ダブシルクロライドを用いたアミノ酸の自動分析装置 |
| JP2003156487A (ja) * | 2001-11-22 | 2003-05-30 | Hamamatsu Photonics Kk | 悪性腫瘍の検出方法および検出用キット |
| JP6040896B2 (ja) * | 2013-09-04 | 2016-12-07 | 株式会社島津製作所 | 液体クロマトグラフによるプレラベルアミノ酸分析法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58113748A (ja) * | 1981-12-26 | 1983-07-06 | Jeol Ltd | プレラベリング装置 |
-
1983
- 1983-12-28 JP JP58251657A patent/JPS60142250A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60142250A (ja) | 1985-07-27 |
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