JPH0552847A

JPH0552847A - 免疫学的定量分析方法

Info

Publication number: JPH0552847A
Application number: JP24437091A
Authority: JP
Inventors: Kazunori Shibata; 和典柴田; Satoshi Kinouchi; 智木ノ内; Takayuki Kono; 孝之河野; Minoru Takase; 實高瀬
Original assignee: Idemitsu Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Idemitsu Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1991-08-29
Filing date: 1991-08-29
Publication date: 1993-03-02

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】免疫学的定量分析の高速度化及び分析データ
の信頼性の向上を図る。【構成】回転可能なディスク１００上の半径方向に沿
って形成した複数の流路（チャンネル）の少なくとも１
つの流路の一部に抗体２００を固定しておき（図１
（I））、前記流路の内周部に体液３０１を導入した
後、ディスクを回転して体液をディスク上に展開して、
体液中の分析対象物である被検抗原３００を、ディスク
上に固定された抗体に、抗原−抗体反応により補足せし
める（第一次免疫反応）（図１（II））。さらに該抗原
３００に、その抗原３００と特異的に反応する抗体４０
０を固定してなる不溶性担体粒子５００を作用させ、前
記抗原３００に抗体４００を介して不溶性担体粒子５０
０を捕捉せしめる（第二次免疫反応）（図１（II
I））。この際、不溶性担体粒子５００の平均粒径ｒμ
ｍとその懸濁液の濃度Ｎｗｔ％との比の値Ｎ／ｒを０．
５≦Ｎ／ｒ≦２．０の範囲内とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は免疫学的定量分析方法に
関し、特に免疫学的検査の高速度化及び分析データの信
頼性の向上を図ることのできる免疫学的定量分析方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】近年、
医療分野においては、病気の早期発見等を目的として、
体液中の微量成分の定量分析が頻繁に行なわれている。
例えば、血液中の微量成分の定量が行なわれているが、
血液中に含まれる体液成分はその濃度がng（ナノグラ
ム）/ml オーダーと極めて微量なものが多く、これらの
微量成分を定量的に分析することは医療分野における重
要な課題となっている。従来より、血液中の微量成分の
定量方法としては、ラジオ免疫検査法（ＲＩＡ法）、酵
素免疫検査法（ＥＩＡ法）あるいはラテックス凝集反応
法（ＬＩＡ法）などの免疫学的定量法が知られている。

【０００３】ここで、ラテックス凝集反応法（ＬＩＡ
法）は、1965年にSingerとPlotzらによって開発された
方法であり、抗体を固定してなる不溶性担体粒子（ラテ
ックス）を用いて抗原−抗体反応を行なわせ、ラテック
ス粒子の凝集を生じさせて、濁度から抗原の濃度を求め
る方法である。しかし、ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）
は、濁度を目視法によって判断するものであるため、半
定量的であり、感度及び精度が不十分であるという問題
がある。

【０００４】また、特開昭56-151357号には、抗体を固
定化したディスク（スライドガラス）に被検液を接触さ
せ（第一次免疫反応）、次いで抗体を固定した微粒子を
反応させた後（第二次免疫反応）、スライドガラス上に
捕捉された微粒子の数を計数するようにした分析方法が
開示されている。しかし、特開昭56-151357号に開示さ
れた方法は、免疫反応時間及びラテックス濃度について
最適化が図られておらず、定量分析方法として完成され
たものであるとはいえない。また、免疫反応時間が長い
（第一次反応時間３０分、第二次反応時間３時間）上、
ラテックスの計測手段として顕微鏡等を用いているた
め、計測の自動化及び高速化が著しく困難であるという
問題がある。

【０００５】一方、本出願人は、回転可能な抗体固定デ
ィスクを使用すると共に、抗体固定微粒子の計数をディ
スクを回転させながら光学読み取り装置で行なうことに
よって、免疫学的定量分析の全工程の自動化、分析時間
の短縮化、測定の高感度化が図れることを知見し、出願
（特願平3-198784号）を行なっている。しかし、かかる
免疫学的定量分析法においても分析時間をさらに短縮す
ることが望まれている。また、特開昭56-151357号に開
示の技術に比べ高感度化が図られているものの、ラテッ
クスの濃度及び粒径等の条件については検討の余地があ
る。

【０００６】本発明は上記事情にかんがみてなされたも
のであり、免疫学的検査の高速度化及び分析データの信
頼性の向上を図ることのできる免疫学的定量分析方法の
提供を目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するために鋭意研究を重ねた結果、不溶性担体粒子
の平均粒径ｒ（μｍ）とその懸濁液の濃度Ｎ（ｗｔ％）
との比の値Ｎ／ｒ及び二次免疫反応の時間がそれぞれ一
定範囲内にあるとき、免疫学的検査の高速度化及び分析
データの信頼性の向上を図ることができることを見い出
し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明の免疫学的定量分析方法
は、被検抗原に対する抗体を固定した基板に被検抗原を
含む検体試料を接触させて、被検抗原を抗原−抗体反応
により基板上に固定された抗体に捕捉せしめる第一次免
疫反応を行なった後、被検抗原に対する抗体を固定して
なる不溶性担体粒子の懸濁液を該基板に接触させて、前
記基板上に固定された抗体に捕捉された抗原によって前
記抗体固定不溶性担体粒子を捕捉せしめる第二次免疫反
応を行ない、次いで抗体を介して被検抗原に捕捉された
不溶性担体粒子の粒子数又は粒子数と相関する物理量を
計測する免疫学的定量分析方法において、不溶性担体粒
子の平均粒径ｒμｍとその懸濁液の濃度Ｎｗｔ％との比
Ｎ／ｒの値を０．５≦Ｎ／ｒ≦２．０、好ましくは０．
５≦Ｎ／ｒ≦１．５の範囲内としてある。また、本発明
の免疫学的定量分析方法は、上記方法において、基板を
検体試料中の被検抗体に対する抗原を固定したものに代
え、かつ不溶性担体粒子を被検抗体に対する抗原を固定
したものに代えることにより、検体試料中の被検抗体を
定量するようにしてある。さらに、本発明の免疫学的定
量分析方法は、上記方法において、基板上に検体試料を
滴下し、基板を回転させて検体試料を基板上に展開した
後、基板の半径方向に沿って移動する光学読み取り装置
によって不溶性担体粒子の数を計測するようしてあり、
好ましくは不溶性担体粒子の平均粒子径ｒを０．１＜ｒ
≦０．３μｍとしてある。

【０００９】以下、本発明を図面を参照しつつ詳細に説
明する。図１は本発明の免疫学的定量分析方法の手順を
示す説明図である。本発明の免疫学的定量分析方法にお
いては、被検抗原に対する抗体２００を固定した基板１
００を使用する（図１（I））。

【００１０】ここで、基板１００の大きさ，厚さ，形状
等は適宜選択され、特に制限されないが、基板を回転さ
せて試料の展開及びレーザー光等による分析を行なう場
合には、回転に適するように円板状（ディスク状）であ
ることが好ましい。この場合、図２に示すように、回転
可能なディスク１００に多数の突条１００ａを放射状に
形成し、多数の試料展開面（チャンネル）１００ｂ及び
抗体２００を固定した反応部１００ｃを設けることによ
り、多数の試料の分析を同時に行なうことができる。ま
た、基板１００は、例えばスライドガラスのように長方
形状であってもよい。

【００１１】基板１００の形成材料としては、ポリカー
ボネート，ポリメチルメタクリレート，ポリスチレン，
ポリ塩化ビニル，ポリ酢酸ビニル，ポリウレタン，エポ
キシ樹脂等のプラスチック材料やガラス等の透明材料が
挙げられるが、好ましくは、ポリカーボネート，ポリメ
チルメタクリレート等の透明プラスチック材料である。
このように基板を透明材料で形成するのは、レーザー等
による光学的分析を可能とするためである。但し、反射
光を利用する分析を行なう場合は、基板は透明でなくて
もよい。

【００１２】基板１００に固定される抗体２００は、測
定しようとする抗原によって異なるが、例えば、測定し
ようとする抗原（被検抗原）をある免疫動物（例えば、
兎，山羊，羊など）に投与して産生させたポリクロナー
ル抗体やモノクローナル抗体等が挙げられる。

【００１３】抗体２００を基板１００に固定するには、
例えば、抗体の0.05Mトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）溶液
（ｐＨ8.2，濃度0.5〜10μg/ml）あるいは0.05M炭酸・
重炭酸緩衝溶液（ｐＨ9.6，濃度0.5〜10μg/ml) を基板
上に滴下し、４℃の温度下で一昼夜（あるいは20〜30℃
で2時間）放置して、抗体２００を基板１００上に物理
的に吸着させればよい。この場合、基板表面にスルホン
基，アミノ基，カルボキシル基またはその誘導体等の官
能基を有する基板を用いることにより、抗体を基板上に
化学結合させることもできる（ P.Tijssen著、石川栄治
監訳“生化学実験法１１エンザイムノアッセイ”東京化
学同人刊、岩崎辰夫，安東民衛著“単クローン抗体ハ
イブリドーマとＥＬＩＳＡ”講談社刊参照）。

【００１４】本発明方法においては、まず、上記抗体固
定基板１００上で、抗体２００に検体試料中の抗原３０
０を抗原−抗体反応により捕捉せしめる（第一次免疫反
応）（図１(II)）。ここで、分析対象とされる検体試料
としては、抗原を含むものであれば特に制限されない。
例えば、血液，尿等の体液を挙げることができる。分析
対象物である被検抗原は特に制限されないが、例えば、
Ｃ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）、α−フェトプロティン
（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）等が挙げられる。

【００１５】基板１００上で抗原−抗体反応を行なわせ
るには、抗体固定基板に被検抗原を含む検体試料を接触
させる。具体的には抗体固定基板上に検体試料を滴下す
るか、あるいは検体試料中に抗体固定基板を浸漬するな
どすればよい。また、回転可能なディスクを用いる場合
には、例えば、抗体固定基板上に分析対象物である被検
抗原３００を含んだ検体試料を適量（例えば50μl程
度）滴下し、基板１００を回転して、遠心力によって検
体試料を基板１００上に薄膜状に展開することによっ
て、基板１００上に固定された抗体２００と検体試料中
の被検抗原３００との間に効率よく抗原−抗体反応を行
なわせることができる。この場合、抗原−抗体反応に要
する時間は１〜５分程度の短い時間で済む。抗原−抗
体反応後、捕捉された被検抗原３００以外の残余の検体
試料は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ7.4）、あ
るいはトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）（0.05M，ｐＨ8.2）
等を適量（例えば、１ml程度）滴下した後、基板を傾け
あるいは回転可能な基板１００を回転して洗い流す。

【００１６】次いで、上記第一次免疫反応後の基板１０
０に、被検抗原３００と特異的に反応する抗体４００を
固定してなる不溶性担体粒子５００の懸濁液を接触させ
る（第二次免疫反応）（図１(III) ）。なお、不溶性担
体粒子の懸濁液を接触させる方法は上記第一次反応の場
合と同様である。

【００１７】ここで、抗体４００を固定してなる不溶性
担体粒子５００とは、不溶性担体粒子（ラテックス）
（例えば、プラスチック粒子、コロイド粒子等）に、分
析対象物である被検抗原３００に対する抗体４００を、
物理的あるいは化学的に吸着または結合させて固定した
ものをいう。具体的には、例えば、１．０％ラテックス
水溶液に抗体を入れ、温室で２時間放置して、ラテック
スに抗体を物理吸着させる。その後、遠心分離にかけて
上清を捨て、吸着されなかった抗体を除去し、沈殿部に
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ7.4）を注ぎ、再分
散させて抗体固定不溶性担体粒子の懸濁液を作成する。
（特開昭62-267298 号，Applied and Environmental Mi
crobiology, Oct.1988, P2345-2348参照) 。

【００１８】不溶性担体粒子は、蛍光性を有するもの、
あるいは着色されたものであってもよい。この場合、蛍
光性あるいは着色性を利用した分析が可能となる。な
お、不溶性担体粒子自体が蛍光物質で形成されている場
合の他、蛍光材料でコーティングされている場合や蛍光
物質が不溶性担体粒子に付着している場合も含まれる。

【００１９】本発明においては、不溶性担体粒子の平均
粒径ｒ（μｍ）と、その懸濁液の濃度Ｎ（ｗｔ％）との
比（Ｎ／ｒ）の値を、０．５≦Ｎ／ｒ≦２．０の範囲
内、好ましくは０．５≦Ｎ／ｒ≦１．５の範囲内、特に
好ましくは１．０≦Ｎ／ｒ≦１．５の範囲内とする。こ
れにより、第二次免疫反応を短時間で完了させることが
できる。これに対し、Ｎ／ｒの値が０．５未満の場合に
は、不溶性担体粒子の捕捉数が減少し、定量分析の感度
が著しく低下すると共に、短時間の第二次免疫反応では
再現生も悪くなる。一方、２．０を超える場合には、後
述する非特異吸着が増大し、測定精度が低下すると共
に、高濃度検体の定量において不溶性担体粒子数の計測
が困難になる。従って、いずれの場合も、第二次免疫反
応を短時間で行なうことについて問題がある。

【００２０】ここで、図３にＮ／ｒの値と不溶性担体粒
子の占有面積比との関係を示す。但し、二次免疫反応時
間を５分としてある。占有面積比とは、測定領域の面積
に占める不溶性担体粒子の面積（平面面積）の割合をい
う。図４から分かるように、Ｎ／ｒの値が０．５未満の
領域では不溶性担体粒子の占有面積比が１０％より低く
なり、血液中に存在する目的成分の測定濃度領域を有効
にカバーするのに不都合を生じる。このため、Ｎ／ｒの
値を０．５以上とすることが必要となる。また、図４か
ら分かるように、Ｎ／ｒの値が２．０では不溶性担体粒
子の占有面積比が２７％程度となると共に、２．０を超
えると不溶性担体粒子の凝集が多くなり、光学的読み取
り機を使用する場合、高濃度領域を測定するのに困難を
生じる。このため、Ｎ／ｒの値を２．０以下とすること
が必要となる。

【００２１】本発明において、光学的読み取り装置を用
いる場合にあっては、不溶性担体粒子の平均粒径ｒを、
０．１μｍ＜ｒ≦０．３μｍの範囲内とすることが好ま
しい。ｒが０．１μｍ以下の場合は、レーザー光に対す
る信号が弱くなり、Ｓ／Ｎ比が悪化して光学的読み取り
装置による検出が困難となるため、電子顕微鏡等の他の
計測手段によって計測しなければならない。ｒが０．３
μｍを超えると、感度等の点で第二次免疫反応上不利に
なる。なお、蛍光を発する不溶性担体粒子を場合には、
蛍光強度を粒子数に換算して抗原濃度を測定しているの
で、粒径が小さくてもよい。

【００２２】本発明の免疫学的定量分析方法において
は、上記二次免疫反応時間を５分以内とすることが好ま
しい。。二次免疫反応時間が５分以内であると非特異吸
着の発生が少なくなり、データのばらつきが少なくな
る。ここで、非特異吸着とは、抗原−抗体反応以外の物
理吸着等によって、基板上に抗体固定不溶性担体粒子が
吸着されることをいう。この非特異吸着が増加すると、
被検抗原の数と抗体固定不溶性担体粒子の数との対応関
係が損なわれる。なお、二次免疫反応のより好ましい時
間は１０秒〜５分、特に３０秒〜３分である。

【００２３】上述した二次免疫反応において、不溶性担
体粒子５００に固定された抗体４００は、基板１００上
の固定抗体２００に捕捉された被検抗原３００と抗原−
抗体反応を起こし、これにより抗体固定不溶性担体粒子
が捕捉される（図１(III) ）。基板上に捕捉されなかっ
た不溶性担体粒子は、上述した検体試料と同様の方法で
洗い流される。このようにして、サンプル基板が作製さ
れる。次に、上記サンプル基板上の抗原によって捕捉さ
れた不溶性粒子の数または粒子数に相当する物理量を測
定手段６００で測定して、抗原３００の数（抗原の濃
度）を求める（図１(IV)）。

【００２４】ここで、粒子数等の測定手段６００として
は、光学的測定手段が好ましい。光学的測定手段として
は、反射率の変化，特定波長の光に対する吸収、蛍光強
度あるいは偏光した光の偏光面の回転等の測定手段が例
示される。不溶性担体粒子の数を直接測定する場合に
は、光学的測定手段としてレーザーを用いることが好ま
しい。使用されるレーザー源としては、一般に使用され
ている半導体レーザー等をそのまま利用でき、不溶性担
体粒子の大きさに応じて適当なレーザー源が選択され
る。光学的測定手段を具備した分析装置としては、例え
ば、図５に示すような装置が使用される（特願平1-0923
67号参照）。

【００２５】同図において、１００はディスクであり、
回転テーブル２上に装着されている。ディスク１００の
下部外周には、ディスク１００から落ちる試料を受ける
ための受け皿６が配置され、回収タンク７に回収される
ようになっている。モータ８はディスク１００を回転さ
せるためのものであり、駆動制御回路９はモータ８の駆
動を制御するものである。ノズル１１は、試料送り装置
１２から送られる試料をディスク１００上に滴下する。
光学式測定ヘッド１４は、ディスク半径方向に延びる送
りねじ軸１５に沿って往復移動する。モータ１６はヘッ
ド１４を駆動するためのものであり、駆動制御回路１７
はモーター１６の駆動を制御する。光学読み取り装置
（光学式測定ヘッド）１４はレーザー光の投光部と受光
部を有し、図６（ａ）に示すように、投光部からの照射
光１９はハーフミラー２０，レンズ２１を経て収束光と
して試料展開面５上の試料に照射され、試料から反射さ
れた反射光２２は受光部で受けられるようになってい
る。なお、図６（ｂ）に示すように、ディスクの裏面側
から投射光１９を照射するようにしてもよく、また、反
射光でなく、透過光によって分析を行なうようにしても
よい。これらの場合には回転テーブル２を透明材料で形
成するか、あるいは回転テーブル２を取り払う。

【００２６】信号処理装置２３は、ヘッド１４に信号を
送り光源を点灯させる機能と、ヘッド１４で受光された
光信号を処理し、分析する機能を有する。ディスプレイ
装置２４は分析結果を画面表示し、記録装置２５は分析
結果をプリントアウトして出力する。ＣＰＵ（中央処理
装置）２７は、試料送り装置１２、駆動制循回路９及び
１７、信号処理装置２３等の制御を行ない、これらをプ
ログラム通り作動させる。ＣＰＵ２７は、プログラムの
操作装置２８と、プログラムの記憶装置２９を有してい
る。上記構成からなる分析装置によれば、免疫学的定量
分析の全ての工程をディスク上で行なうことができ、ま
た、分析の全自動化を図ることができる。

【００２７】なお、不溶性担体粒子が蛍光を発するもの
である場合には、光学的測定手段としてフォトディテク
ターを用いることができる。この場合、フィルターを介
在させることによって、特定波長（例えば、397nm，472
nm，577nmなど）の蛍光強度を検出し、その蛍光強度を
粒子数に換算する。

【００２８】計測した不溶性担体粒子の個数から抗原の
濃度を求めるには、抗原濃度既知の試料を用いること以
外は上述の場合と同様にし、抗原濃度と不溶性担体粒子
の数との関係を求めてあらかじめ検量線を作成してお
き、この検量線から抗原濃度を求めればよい。なお、上
述した本発明の免疫学的定量分析方法においては、説明
の都合上、ディスク／抗体／抗原／抗体／不溶性担体粒
子の構成となる場合を示したが、かわりに、ディスク／
抗原／抗体／抗原／不溶性担体粒子の構成とし、抗体濃
度の定量を行なうものとしてもよい。

【００２９】

【実施例】以下、実施例にもとづき本発明をさらに詳細
に説明する。実施例１（１）ヒトＣＲＰ抗原を予め兎に免疫してえられたＣＲ
Ｐ抗体のトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）溶液（濃度1.69×
10^-3g/ml）５μlを、半径13.0cmの回転可能なポリカー
ボネートディスク上のチャンネル内の半径3.5cmの地点
に滴下し、２時間静置してＣＲＰ抗体を基板上に感作
（固定）せさた。その後、ＴＢＳ溶液２００μｌで洗浄
し、残りの抗体を除去した。（２）その後、ブロッキング剤（ブロックエース：雪印
社製）１０μｌを抗体感作部位に滴下し、４℃で２４時
間静置してブロッキング処理を行なった。（３）上記抗体固定基板を図５に示した分析装置の回転
テーブルにセットし、ＴＢＳで調整した各々のＣＲＰ試
料（濃度0、1.0 ×10^-9、1.0×10^-7、1.0×10^-5g/ml）
１０μｌを抗体感作部位に滴下し、室温で１０秒間抗原
抗体反応を行なわせ、抗原を抗体固定基板上に捕捉させ
た（一次免疫反応）。その後、回転テーブルを５００ｒ
ｐｍで回転させて基板上の試料を除去し、さらに界面活
性剤（ポリサイエンス社製Tween-20）０．１％を含有す
るＴＢＳ溶液（ＴＢＳ-Tween）２００μｌで洗浄除去し
た。

【００３０】（４）粒径０．３μｍのポリスチレンラテ
ックスにＣＲＰ抗体を感作させてなる抗ＣＲＰラテック
スの濃度０．３ｗｔ％の溶液（Ｎ／ｒ＝１．０）１０μ
ｌを抗体感作部位に滴下し、室温で３００秒間二次免疫
反応を行なわせ、ラテックス粒子を基板上に捕捉させ
た。その後、回転テーブルを５００ｒｐｍで回転させて
余分なラテックスを除去し、２００μｌのＴＢＳ-Tween
溶液で残ったラテックスを洗浄し、さらに２００μｌの
蒸留水で洗浄除去した。（５）このディスクを１８００ｒｐｍで回転させなが
ら、波長８３０ｎｍの半導体レーザーを光源とした光学
ヘッドを半径方向に走査させて、基板上に捕捉されたラ
テックス粒子の個数を計測した。各々の濃度と相当する
個数をプロットすると、図７に示された良好な検量線が
得られた。

【００３１】比較例１ラテックス溶液濃度を０．７５ｗｔ％（Ｎ／ｒ＝２．
５）としたこと以外は実施例１と同様にして各抗原濃度
における捕捉数をプロットしたところ、非特異吸着が増
大してベースラインが大きく上がり、また高濃度領域で
ラテックスの個数が測定不能で良好な検量線は得られな
かった。

【００３２】比較例２ラテックス溶液濃度を０．０６ｗｔ％（Ｎ／ｒ＝０．
３）としたこと以外は実施例１と同様にして各抗原濃度
における捕捉数をプロットしたところ、高濃度領域にお
いてもラテックス捕捉数が増大せず、また各濃度での再
現性が悪く、良好な検量線は得られなかった。

【００３３】

【発明の効果】以上説明したように本発明の免疫学的定
量分析方法によれば、免疫学的検査の高速度化及び分析
データの信頼性の向上を図ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の免疫学的定量分析方法の手順を示す説
明図である。

【図２】複数試料の同時分析を行なうための複数に区画
されたディスクを示す平面図である。

【図３】Ｎ／ｒの値と不溶性担体粒子の占有面積比との
関係を示すグラフである。

【図４】二次免疫反応時間と不溶性担体粒子の占有面積
比との関係を示すグラフである。

【図５】分析装置の一例を示す構成図である。

【図６】光学的分析手段による測定の態様を示す図であ
る。

【図７】実施例における検量線を表わすグラフである。

【符号の説明】

１００：基板（ディスク）２００：抗体３００：抗原４００：抗体５００：不溶性担体粒子

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者高瀬實千葉県袖ケ浦市上泉1660番地出光石油化学株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被検抗原に対する抗体を固定した基板に
被検抗原を含む検体試料を接触させて、被検抗原を抗原
−抗体反応により基板上に固定された抗体に捕捉せしめ
る第一次免疫反応を行なった後、被検抗原に対する抗体
を固定してなる不溶性担体粒子の懸濁液を該基板に接触
させて、前記基板上に固定された抗体に捕捉された抗原
によって前記抗体固定不溶性担体粒子を捕捉せしめる第
二次免疫反応を行ない、次いで抗体を介して被検抗原に
捕捉された不溶性担体粒子の粒子数又は粒子数と相関す
る物理量を計測する免疫学的定量分析方法において、不
溶性担体粒子の平均粒径ｒμｍとその懸濁液の濃度Ｎｗ
ｔ％との比Ｎ／ｒの値を０．５≦Ｎ／ｒ≦２．０の範囲
内としたことを特徴とする免疫学的定量分析方法。
【請求項２】被検抗体に対する抗原を固定した基板に
被検抗体を含む検体試料を接触させて、被検抗体を抗原
−抗体反応により基板上に固定された抗原に捕捉せしめ
る第一次免疫反応を行なった後、被検抗体に対する抗原
を固定してなる不溶性担体粒子の懸濁液を該基板に接触
させて、前記基板上に固定された抗原に捕捉された抗体
によって前記抗原固定不溶性担体粒子を捕捉せしめる第
二次免疫反応を行ない、次いで抗原を介して被検抗体に
捕捉された不溶性担体粒子の粒子数又は粒子数と相関す
る物理量を計測する免疫学的定量分析方法において、不
溶性担体粒子の平均粒径ｒμｍとその懸濁液の濃度Ｎｗ
ｔ％との比Ｎ／ｒの値を０．５≦Ｎ／ｒ≦２．０の範囲
内としたことを特徴とする免疫学的定量分析方法。
【請求項３】二次免疫反応時間を５分以内とした請求
項１又は２記載の免疫学的定量分析方法。
【請求項４】Ｎ／ｒの値を０．５≦Ｎ／ｒ≦１．５と
した請求項１、２又は３記載の免疫学的定量分析方法。
【請求項５】基板上に検体試料を滴下し、基板を回転
させて検体試料を基板上に展開した後、基板の半径方向
に沿って移動する光学読み取り装置によって不溶性担体
粒子の数を計測することを特徴とする請求項１、２、３
又は４記載の免疫学的定量分析方法。
【請求項６】不溶性担体粒子の粒子径ｒが０．１＜ｒ
≦０．３μｍである請求項５記載の免疫学的定量分析方
法。