JPH0553139B2

JPH0553139B2 -

Info

Publication number: JPH0553139B2
Application number: JP63240601A
Authority: JP
Inventors: Chuu Jooji; Nazan Ranga; Seidein Saido
Original assignee: Collagen Corp
Current assignee: Collagen Aesthetics Inc
Priority date: 1987-09-25
Filing date: 1988-09-26
Publication date: 1993-08-09
Also published as: JPH01158964A; ES2060656T3; DE3886493D1; AU2275188A; ATE98879T1; AU618756B2; EP0309241B1; CA1335177C; EP0309241A2; EP0309241A3; US4888366A; DE3886493T2

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は骨修復材料の調製方法および該方法に
より調製された材料に関する。さらに詳しくは、
本発明は軟骨形成性／骨形成タンパク質を含む、
コラーゲン／無機質担体の調製に関する。

（従来の技術）骨欠損および骨折の生理学的修復は、細胞の分
化および骨の無機質成分の形成を促進する因子に
よつて仲介されることは良く知られている。最
近、これらの活性が著しい１つまたは複数の因子
を同定する試みがなされている。米国特許第
4440750号および4430760号には、移植物におい
て、あるいは注入に必要な、天然に存在するあら
ゆる因子の代わりをする無機物除去骨粉末
（DMB）の使用が開示されている。Uristの米国
特許第4294753号および第4455256号には、骨形態
形成タンパク（BMP）が開示されている。これ
は、尿素または塩化グアニジンを用いる無機物除
去骨から抽出され、次いで再沈澱されるものであ
る。この因子をさらに精製したものは、Uristに
より報告されている：Clin Orthop Rel Res
（1982）162：219，Science（1983）220：680；お
よびProc Natl Acad Sci（USA）81：371。
BMPについてUristが記載したものとは異なる特
徴を有する骨形成因子タンパクは、DMBから単
離されて、SeyedinおよびThomasにより精製さ
れた（米国特許第4434094号および第4627982号）。

上記因子は、骨の再形成を助けるので、骨修復
のために投与される組成物に含有させるのが望ま
しいとされている。米国特許第4440750号（前出）
では、再構成アテロペプチドコラーゲン調製物
が、DMBまたはDMB抽出物のキヤリアとして
使用された。Jefferiesの米国特許第4394370号に
は、粗DMB抽出物のキヤリアとして、非アテロ
ペプチドコラーゲン組成物が開示されている。こ
れはUristの出版物に引用されている。

さらに別の研究が、Reddiらにより行われてい
る（Proc Natl Acad Sci（1983）69：1601）。こ
の文献には、ラツト宿主動物における同種起源の
無機物除去骨粉末の使用について記載されてい
る。Sampath，T.K.ら（Proc Natl Acad Sci
（1983）80：6591）は、数多くの種からの骨形成
因子をさらに精製することを報告した。

米国特許第4563350号（本出願の優先権主張の
基礎をなす米国特許出願の親出願は、この米国特
許の一部継続出願である）には、コラーゲン骨修
復組成物の使用について記載されている。しか
し、この組成物には、効果的に誘導活性をもたら
す非繊維状コラーゲンの存在が必要である。本出
願の優先権主張の基礎をなす米国特許出願の親出
願である米国特許第816268号（1986年１月６日出
願；この米国特許出願は同じ譲受人に譲渡されて
おり、参照文献としてここに採用する）には、低
免疫原性の非繊維状または繊維状コラーゲンに加
えて、硬質組成移植物に対して少なくとも75％
（wt／wt）の無機質を含有する組成物が記載され
ている。その出願に記載されている調製物は以下
のような方法により調製される。すなわち、コラ
ーゲンとキヤリアの無機質成分との分離を妨げる
ような条件下で、適切な均質混合を必要とせず、
かつその望ましさも認めないような方法である。
その出願に記載され、提案された調製物において
は、やはり骨形成因子を含有する約３mg／mlの溶
液状のコラーゲンが固体無機質粉末と混合され、
得られた材料が凍結乾燥される。もう１つの方法
では、骨形成因子と無機質との凍結乾燥混合物を
用いてペーストが調製され、これが60mg／mlの
Zyderm コラーゲン移植物繊維状コラーゲン懸
濁液に添加される。

骨の伝導性修復用のコラーゲン／無機質調製
物、すなわち新しい軟骨および骨細胞の内方成長
を可能にするが、外因性骨誘導因子が導入されて
いないマトリツクスも記載されている。米国特許
第848443号（1986年４月４日出願；この米国特許
出願は米国特許第717072号の一部継続出願である
が、今では放棄されている。しかし、同じ譲受人
に譲渡されており、参照文献としてここに採用す
る）には60〜98重量％の無機質と２〜40重量％の
コラーゲンとを含有する、無機質とアテロペプチ
ドコラーゲンとの湿潤混合物および乾燥混合物の
調製が記載されている。これらの組成物は、固体
粉末無機質と、65mg／mlのコラーゲン懸濁液とを
混合することにより調製される。得られた混合物
は、ペーストとして使用されるか、あるいは常温
常圧で乾燥される。

Bellの米国特許第4485097号には、線維芽細胞
および無機質除去骨粉末を含有するコラーゲン格
子について記載されている。しかし、これは無機
質含有量を持たない。

米国特許第4097937号には、コラーゲンと混合
して、骨の置換混合物が得られるヒドロキシアパ
タイトセラミツク材料について記載されている。

上記組成物のいずれも、骨の移植に直接使用で
き、かつ含有されている骨形成因子の効果的な供
給による骨修復の仲介が効果的であるような、均
質かつ硬質の調製物が得られない。

（発明の要旨）骨形成因子の効果的なキヤリアである乾燥プロ
テーゼは、均質かつ強力であつて、それに含有さ
れる骨形成因子により骨の内方成長を誘導し得る
ものが得られるということが見い出された。この
結果は、まず骨形成因子調製物の溶液を、コラー
ゲンまたは無機質成分と混合し、次いで残りの成
分を、この混合物と組み合わせて、全懸濁液中の
コラーゲン濃度が30〜100mg／ml程度の調製物と
することにより達成される。次いで、この混合物
を常圧で、わずかに高い温度で乾燥する。調製方
法がこようにして行われる場合、得られた組成物
は、圧縮強度が少なくとも20N／cm²であり、剛性
を有するという特徴、および均一に分散し、生物
学的に活性で、かつ利用可能な骨形成因子が包含
されているという特徴を有する。これらの組成物
はまた低免疫原性でもある。

このようにして、ある局面においては、本発明
は、リン酸カルシウムの微粒子無機質成分を60〜
98重量％、好ましくは75〜95重量％と、アテロペ
プチド精製コラーゲン調製物を２〜40％、好まし
くは５〜25％と、そして有効量の骨形成因子
（OF）との混合物から実質的に成る固体骨修復組
成物を目的としている。有効量のある評価規準
は、「部分的に精製された」骨形成因子抽出物
（OFE）の約0.5〜４％を含有させることにより得
られる活性に相当する。該因子およびキヤリアの
いずれも、低免疫原性であるのに充分なほど純粋
である。OFEは、活性において充分に濃縮され
ているので、調製物において４％（wt／wt）の
OFEという、挙げられている最大量が必要とさ
れているだけである。これらの組成物は、三成分
全部の分布に関して均質である、含有されるOF
が生物学的に活性かつ利用可能である、そして圧
縮係数が少なくとも20N／cm²であるという特徴を
有する。

脊椎動物における骨修復を実施するための移植
に適した本発明の低免疫原性組成物は、60〜98％
の無機粒子；２〜40％のアテロペプチド低免疫原
性コラーゲン；および有効量のOF調製物から実
質的に成り、移植物は20N／cm²より大きな圧縮係
数の多孔質硬質固体であり、かつその成分に関し
て均質であり、そして該OFは生物学的に活性か
つ利用可能な形態にある。

脊椎動物における骨修復を実施するための移植
に適した本発明の他の低免疫原性組成物は、骨に
由来するタンパク骨誘導因子（OF）の骨誘導的
に有効な量と、少なくとも75重量％の無機質キヤ
リアとを含有し、該OFは異種宿主において低免
疫原性であるのに充分なほど純粋である。

他の局面では、本発明は、これらの組成物の調
製方法に関する。一般的に、これらの方法は、上
記の混合物成分を混合し、コラーゲン濃度が、調
節された乾燥の前に、30〜100mg／mlであるよう
な懸濁液とし、そしてこの懸濁液を、固体材料が
得られるのに充分なほど水分含量が減少するま
で、常圧下にて乾燥させることを特徴とする。

本発明の方法は、脊椎動物における骨修復を実
施するための移植に適した低免疫原性組成物の調
製方法であつて、該組成物は、異種宿主において
低免疫原性であるのに充分なほど純粋であるタン
パク骨誘導性因子（OF）の骨誘導的に有効な量
と、該組成物の60〜98％を構成する無機質および
該組成物の２〜40％を構成するコラーゲンから実
質的に成る成分を有するキヤリアとを含有し、該
方法は、(a)該組成物のコラーゲン、無機質、およ
びOF成分を含む均一な水性懸濁液を、該懸濁液
中のコラーゲン濃度が30〜100mg／mlになるよう
に調製すること；および(b)該懸濁液を常圧下にて
調節された乾燥に供し、硬質の固体を得ること、
を包含する。

（発明の構成）Ａ定義ここで用いられているように、「骨誘導性」お
よび「骨形成」という用語は、互換的に使用さ
れ、骨の始原細胞が生きた骨組織へ転換すること
を意味する。骨誘導は、骨形成、すなわち骨の有
機成分および無機成分の分泌による無機質化骨の
直接形成をもたらし得る。あるいは、骨誘導は、
軟骨の中間形成をも伴い得る。すなわち、骨誘導
因子はまた、軟骨形成性であり得る。実際には、
軟骨形成の特徴を示すプロテオグリカンが、本発
明の組成物の骨誘導活性の指標として用いられ
る。

ここで骨形成因子に関して使用される場合、
「由来する」という表現は、構造的関係または相
同性を意味する。これは物理的な由来に限定され
ない。従つて、骨から「由来する」骨形成因子
は、１つまたは複数の因子が、骨組織において本
来産生される因子のアミノ酸配列に対して、相同
性を有し、かつ同様の機能を有するアミノ酸配列
を持つことを示す。これは必ずしも、使用される
材料が骨それ自体から直接単離されることを意味
しているわけではない。この材料は、例えば合成
により、あるいは組換えDNA技術を用いて製造
されるものであつてもよい。

「低免疫原性」とは、許容し得る生物学的適合
性を示す。多くの物質が、ある種の動物および適
用においては免疫原性であり得るが、別の場合に
は特定の免疫グロブリンの検出可能レベルを上昇
させることはできないことは理解されている。特
定の免疫グロブリンおよび炎症が完全に存在しな
いということが、必ずしも必要とされないことも
理解されている。従つて、「低免疫原性」とは、
本発明の組成物成分または組成物を記載するため
に使用される場合には、すべての免疫応答が許容
レベル内にあることを意味するように機能的に定
義される。

「アテロペプチドコラーゲン」とは、テロペプ
チドまたは免疫原性部分を除去するか、あるいは
一部除去するように適切に処理されたコラーゲン
を意味する。簡単に説明すれば、コラーゲンは、
繰り返しのアミノ酸配列からなる三重らせん構造
の束から構成される繊維状構造を含む。これらの
三重らせん配列は非らせん構造で終結している。
これらの非らせん構造は、様々なコラーゲン鎖間
の架橋、および部分的にはコラーゲン調製物の免
疫原性の両方の原因ともなる「テロペプチド」で
ある。これらの構造の除去は、適切なタンパク分
解酵素、例えばトリプシンによる処理によつて行
なうことができる。主な種特異的免疫原がこのよ
うにして除去されているので、得られたアテロペ
プチドコラーゲンは異種間の使用に対してより適
している。

「非繊維状コラーゲン」は、その本来の繊維状
構造を維持しないように処理されている。従つ
て、この用語は、可溶化され、かつその本来の繊
維状形態に再構成されていないコラーゲンを意味
する。繊維状構造は溶解により粉砕し得る。これ
は、繊維（原繊維）を再構成することにより、あ
るいは非特異的凝集（非原繊維）により、固体形
態に戻すことができる。

「OFE」または「部分的に精製されたOFE」
として示される骨形成因子抽出物は、以下に記載
される骨からの部分的に精製された抽出物と定義
される。これは、米国特許第4627982号（参照文
献としてここに採用する）に記載されているよう
に、カチオン交換樹脂に結合させ、そしてそれか
ら溶離された、分子量が30000より小さな画分で
ある。本発明の組成物におけるOFEの割合は、
記載された「部分的に精製された」調製物に関し
て与えられている。しかし、低免疫原性であるの
に充分なほど純粋であれば、同等量の骨形成活性
が得られる他の調製方法を用いても良いことは理
解される。これらの抽出物の骨形成活性は、その
中に含まれる１つまたはそれ以上の骨形成因子
（OF）の存在による。この１つまたは複数の因子
（OF）の組成物への供給は、抽出物（OFE）の
形態で行なうことができる。あるいは、１つまた
は複数の因子の合成形態またはその組合せを使用
してもよい。もちろん、「部分的に精製された」
と言われるものより純度の高いOFEまたはOF調
製物を、同様の活性レベルで、ここで特定された
ものに対応する量で使用することもできる。

「OF」は、抽出物から得られたものでも、化
学的に合成されたものでもよく、それ自体が抽出
物の骨形成活性の原因となる１つまたは複数の因
子として定義される。OFはまた、骨形成活性お
よび天然物質の薬理学的挙動を保持する、すなわ
ち本発明の組成物においても依然として生理学的
に利用可能な、天然に存在する変異体をも包含す
る。

従つて、「部分的に精製されたOFEと同等の
OFの割合（％）」とは、0.5〜４％の割合で、前
記のような「部分的に精製されたOFE」の使用
により得られた活性を提供するOF調製物の量の
ことを言う。一般に、同種または異種の宿主にお
ける使用に必要な低免疫原性のレベルを達成する
ためには、同様に精製された、あるいはより高度
に精製された調製物が必要とされるため、当量は
前記範囲内またはそれ以下となる。高度に精製さ
れた抽出物または合成物質が使用されるならば、
より小さい割合（％）が効果的である。

本発明の方法による混合物の「攪拌」とは、例
えばかきまぜ、振盪、振動等のような従来の手段
により、混合物の粒子の運動を機械的に起こすこ
とを言う。

「インキユベーテイング」とは、調節されたま
たは特定の条件下で、所定の時間にわたつて、被
検物質または混合物を保持することを意味する。
ここでは、水分含量は、この期間を通じて同じで
ある。

本発明の組成物についてここで示される割合
（％）は、乾燥した特定の成分のWt／Wt％であ
る。水は、多くの場合（常時ではないが）これら
の組成物の重要な部分であるが、その割合（％）
は、該組成物において所望の物理的性質によつて
様々である。例えば組成物は、多くの場合乾燥状
態で保存され、その後乾燥状態で移植されるか、
あるいは移植のために再水和される。

「調節された乾燥」とは、常圧および室温で行
なわれる、水分を除去する方法のことを意味す
る。もちろん、ほぼ大気圧を維持するために空気
を用いる必要はない。例えば窒素も使用しうる。
しかしながら、ここでの組成物に関して、大きな
安定性の問題は無いので、空気を選択するのが便
宜上最もよい。乾燥過程を速めるために、温度を
室温よりやや上げてもよい。

Ｂ一般的説明本発明の組成物は、異種間で使用される時、低
免疫原性となるほど精製されている、骨誘導性因
子（OF）調製物の有効量分と、本発明の組成物
の無機質／コラーゲンキヤリア等の低免疫原性キ
ヤリアとの混合物である。該組成物において必要
とされる特定のOF調製物の割合（％）は、当然
調製物の純度によるが、前記のような、「部分的
に精製されたOFE」については、0.5〜４％の範
囲が適している。より高度に精製されたOFは、
相応じて、より少ない量で使用され得る。

OF調製物異種の宿主において、低免疫原性であるほどの
純度の基準に合うOF調製物は、いくつかの方法
で調製されうる。この因子源として、骨、象牙
質、骨肉腫、または軟骨肉腫、およびOFを含む
脊椎動物起源の他の組織を使用しうる。ヒト、サ
ル、ウシおよびラツト起源のOFを含む調製物は、
異種間移植において軟質性骨を作る能力において
種特異的でないということが示されている、
（Sampath，T.K.ら、Proc Natl Acad Sci
（USA）（1983）80：6591）。従つて、本発明の混
合物において使用しうるOFは、これらの源のい
ずれに由来するものでもよく、実際、脊椎動物に
由来するタンパクに実質的に類似した骨誘導活性
を有するタンパクであれば、このようにして調製
されたものであつても、偶然のあるいは意図的手
段で改変されたものであつても、化学的合成、組
替えDNA技術あるいは他のような方法によつて
調製されたものであつてもよい。さらに例えば、
Uristの骨の形態発生的タンパクも、充分に精製
すればおそらく使用し得る。OFは脊椎動物源に
由来しうるタンパクへの実質的類似性、骨誘導性
機能、および許容し得る低い免疫原性の要求条件
にだけ合えばよい。

本発明の組成物において有用な、「部分的に精
製されたOFE」を調製するための１つの有用な
方法が、米国特許第4627982号（前記）に記載さ
れている。簡潔に記載すれば、これは、先ずブタ
またはウシの長骨材料（容易に入手できるため）
を、機械的および研磨技術によつて処理して、清
浄にし、かつ粉砕し、エーテルまたは酢酸エチル
等の有機溶媒を用いた抽出により脱脂し、その
後、通常標準的技術を用いた、強酸での抽出によ
り無機質を除去し、次いで得られた無機質除去骨
（DMB）を出発物質として用いることにより開
始される。

その後、可溶化OFEを得るために、DMBをカ
オトロピツク試薬で抽出する。抽出されたタンパ
クの消化または変性の可能性を低減するために、
好ましくは抽出をプロテアーゼ阻害剤の存在下
で、１日あたり約４時間にわたつて、低温で実施
する。抽出後、抽出剤を適切な手段、例えば水に
対する透析、調節された電気泳動、またはゲル濾
過、あるいは他のいかなる適切な手段によつて除
去してもよい。その後、除去した抽出剤を用い
て、あるいは用いずに抽出物をゲル濾過または他
のサイズ調製法に供し、標準的技術を用いて、約
30000ダルトン以下の分子量の画分を得る。

低分子量の画分は、競合イオンから遊離され、
ついで前述の「部分的に精製されたOFE」を得
るために、例えば尿素のような非イオン性カオト
ロピツク試薬の存在下、ほぼPH4.5〜5.2で、例え
ばCMCとの陽イオン交換を用いるか、あるいは
例えばほぼPH7.2における6M尿素および20mMリ
ン酸ナトリウムの存在下で、DEAE−セルロース
の陰イオン交換を用いて、イオン交換クロマトグ
ラフイに供する。

OFは陽イオン交換樹脂に吸着され、適切な条
件下で遊離される。陽イオン交換クロマトグラフ
イから得られる活性溶離画分は、本発明の組成物
において「部分的に精製されたOFE」として直
接使用され得る。0.5〜４％の割合の範囲は、最
終組成物中の部分的に精製されたタンパクの
Wt／Wt％に基づいている。

「部分的に精製されたOFE」に含まれるOF
は、0.01〜0.1Mのリン酸ナトリウムを添加して、
PH６〜８のリン酸塩緩衝液中で沈澱させることに
より、さらに精製され得る。ついで沈澱物は、非
イオン性カオトロピツク試薬に再溶解され、
HPLCによるヒドロキシアパタイトカラムでクロ
マトグラフイーに供される。

または、DMBに由来する低分子量画分を、陰
イオン交換樹脂による処理に供することにより得
られる非吸着材料は、OF活性を含み、この非吸
着タンパクはまた、尿素除去のための透析後、
「部分的に精製されたOFE」の同等物として適切
な割合（％）で使用されてもよい。陰イオン交換
樹脂処理溶液中のタンパクは、凍結乾燥により回
収され得るか、あるいは0.01NのHClに対する透
析によつて安定化され得る。（「部分的に精製され
たOFE」はまた、前述の陰イオン交換樹脂を用
いた処理に供することもできる。これは代替工程
としてよりはむしろ追加工程として利用される。）陰イオン交換処理は、1982年に発行された特許
には記載されていないため、詳細を以下に記載す
る。

ゲルからの低分子量、あるいは陽イオン交換溶
出液からのOF含有画分を、6M尿素、20mMリン
酸ナトリウム、PH7.2、20mM NaClおよびプロ
テアーゼ阻害剤を含む緩衝液中に溶解する。つい
で、この溶液を、同じ緩衝液を用いて平衡化した
DEAEセルロースカラムに流す。OFを含むフロ
ー・スルー画分を、水に対し透析して尿素を除去
し、OFを凍結乾燥によつて回収する。または、
フロー・スルー容積分を、0.01NのNClに対して
透析し、0.01N HCl中、１〜10mg／mlのタンパ
ク濃度で保存する。これらの溶液は数ケ月間安定
であり、凍結乾燥できる。

部分的に精製されたOFEは、単にOFすなわち
骨形成活性の原因となる１つまたは複数の因子の
便宜的な源として記載されていることに留意すべ
きである。OFはまた、他の源、例えばUristの
BMPの精製された形態、または合成材料からも
得られる。合成材料はまた、天然の対応物の生物
学的活性および生物学的利用可能性を保持する天
然の物質の変異体を含み得る。本発明は、OF源
とは無関係に、誘導性骨成長を提供するのに有効
な組成物を対象とする。

キヤリア好ましい組成物のキヤリアの部分は、組成物に
対して60〜90％、好ましくは75％、より好ましく
は約85〜95％の無機質成分、および繊維状もしく
は非繊維状コラーゲンまたはその両方から選択さ
れた追加成分を与える。

無機質成分は、一般に種々の形態のリン酸カル
シウム、好ましくはヒドロキシアパタイト
（HA）およびリン酸トリカルシウム（TCP）、ま
たは最も好ましくはそれらの混合物から選択され
る。HAおよびTCPはいずれも市販されており、
多数のメツシユサイズおよび多孔性から選択する
こともできる。これらの材料は、硬質の組織移植
物の構成に有用であることが開示されており、従
つて本発明の組成物の一部を含有するのに適した
生物学的適合性を有する。例えば、HA調製物を
開示している米国特許第4314380号、およびHA
の別の形態を開示しているHayashi，K.らの
Arch Orthop Traumat Surg（1982）99：265を
参照のこと。HAとTCPとの混合物を含有する組
成物に関しては、無機質含量が95％またはそれ以
下であることが特に好ましく、HAのみについて
は98％までを使用しうる。

本発明の組成物の特性は、許容しうる程度に低
免疫原性である。従つて、非繊維状または繊維状
コラーゲン成分のアテロペプチド形態を用いるの
が一般に好ましい。しかしながら、移植された組
成物の形状、宿主の感受性、あるいは何らか他の
理由によつて、組成物を許容できなくするほどア
テロペプチドの存在が低免疫原性に対して有害で
はないような例もあり得る。換言すれば、アテロ
ペプチドコラーゲンの使用は好ましいが、必ずし
も必要であるわけではない。低免疫原性は、異種
のコラーゲンの源の使用を可能にするのに特に重
要である。例えば、免疫原性を充分に低減するこ
とによつてウシまたはブタのコラーゲンを、ヒト
の被検者に用いることができる。

非繊維状コラーゲンは、溶液状コラーゲンとし
て、あるいは非特異的に会合している、溶液状コ
ラーゲンの凍結乾燥形態として供給され得る。非
繊維状コラーゲンの好ましい源は、溶液状コラー
ゲン（CIS）（Collagen Corporation，Palo
Alto，Californiaの商品名Vitrogen として入手
可能）である。したしながら、いかなる非再構成
コラーゲン調製物を使用してもよい。

繊維状コラーゲンは、種々の源に由来するもの
であつてもよく、当該分野において多数の繊維状
コラーゲン調製物が利用できる。当該分野におい
ては、種々の哺乳動物の骨または皮膚に由来する
コラーゲンが可溶化されるかあるいは液状媒体中
に分散され、ついで繊維状の形態で回収される。
コラーゲンが再構成されて繊維状になつている調
製物には、例えばZyderm コラーゲン移植物
（ZCI）（Collagen Corporation，Palo Alto，
Californiaから入手可能）が含まれる。他の繊維
状調製物には、本来の繊維状形態を保つたまま分
散された繊維であるAvitene 、およびその後に
冷凍乾燥される分散された調製物である
Collagenfleece が含まれる。（従つて、これら
後者の調製物は、「再構成」されていない。）組成物の特徴本発明の組成物（これは、60〜98％、好ましく
は75〜95％の微粒子無機質と、２〜40％、好まし
くは５〜25％のコラーゲンと、0.5〜４％の、前
述の如く部分的に精製されたOFEによつて供給
されたものまたはその同等物等のような有効量の
OFとを含有する）は、以下の記載された方法に
よつて調製される場合、その調製法に起因する所
定の望ましい特性を有する。先ず第１に、全ての
成分は充分に純粋であるか、さもなければ組成物
が宿主中で低免疫原性であるように調製されなけ
ればならないことに留意すべきである。第２に、
OF成分は、均一に分散され、かつ生物学的に活
性で有用でなければならない。最後に、無機質お
よびコラーゲン成分は均一に分散されなければな
らず、組成物は多孔質であり、海綿状であるより
はむしろ硬質である。圧縮係数は、少なくとも
20N／cm²である。

コラーゲン／無機質成分に関する均質性は、効
果的に視覚評価できる。移植物内のOFの均一性
は、調製法によつて保証される。これは、標本の
一部の標準的分析法によつて証明され得る。OF
の生物学的利用可能性および活性は、骨形成を誘
導する移植物の能力により評価される。この評価
には種々の方法が利用できるが、最も著名なもの
は組織学的試験である。さらに、以下に示される
ように、アルカリホスフアターゼのレベルを、生
化学レベルにおける骨形成を評価するために使用
できる。カルシウムレベルの評価およびプロテオ
グリカンについての分析による軟骨形成のモニタ
ー等、他の基準も利用しうる。必要に応じて、移
植物の低免疫原性は、移植された材料またはその
成分と反応する抗体についての宿主の血清レベル
をモニターすることによつて確かめられ得る。

圧縮係数の分析には、American Society for
Testing Materialsが公表した圧縮係数測定ガイ
ドラインに従つて、市販の装置、例えばInstron
の汎用テストモデル4202を使用しうる。

この測定を行なうために、組成物をまず初めに
５〜24時間、生理食塩水に浸漬する。この浸漬
は、完全な湿潤を保証できるだけの時間行われ
る。ついで組成物を試験装置に入れる。材料に弾
性があるならば、材料をさらに圧縮するために、
顕微鏡レベルで固有の構造を粉砕する必要がある
ような点に達するまで、材料は容易に圧縮され
る。材料が硬質であれば、弾性のある材料の場合
より変形しないでその点に達する。コラーゲン／
無機質混合物については、顕微鏡的組織は、三重
らせんそれ自体によりまず維持されるが、また繊
維の各成分のコラーゲン三重らせん部分間の相互
作用および繊維相互の結合によつても維持され
る。これらの組織レベルのいずれをも粉砕する圧
縮は、中空の空間の容積を減少させる一般的な圧
縮により困難である。もちろん組成物中のコラー
ゲン鎖がより高度に組織化され、かつ架橋されて
いればいるほど、この顕微鏡的圧縮はより困難と
なる。

従つて、高い圧縮係数（Ｎ／cm²単位で測定され
た）は、顕微鏡レベルにおける高い組織化のレベ
ル、特にコラーゲン分子間の高い架橋のレベルを
示す。低い圧縮係数は、架橋が低いことを示す。
適切な物理的取扱い特性および移植物としての結
合性の維持のために、圧縮係数は適度に高く、少
なくとも約20N／cm²またはそれ以上であることが
重要である。圧縮係数の上限レベルは材料の性質
によつて決定され、この種の組成物は、実際、架
橋の程度に関わらず100N／cm²よりはるかに大き
い係数値に達することはできないと考えられてい
る。とにかく、圧縮係数が20N／cm²を越え、好ま
しい範囲が20〜30N／cm²であることは、本発明の
組成物に対して適切な物理的特性を維持する上で
重要である（より高い強度が所望されるなら、下
記のように組成物を熱硬化して50〜60N／cm²の圧
縮係数を得ることができる）。本発明の方法によ
り調製され、得られた組成物は、必要な圧縮抵抗
強度が達成されるのを確認するために、この測定
によつて評価される。

組成物の調製本発明の方法において、組成物は、生物学的に
利用し得るOFが得られるような、高い圧縮係数
の固体均質調製物が得られるような方法で調整さ
れる。このような結果を得るために、組成物の最
終乾燥工程は、30〜100mg／mlの濃度のコラーゲ
ン懸濁液、必要量の無機質、および懸濁液中に均
一に分散されたOFを含む混合物を用いて実施さ
れなければならない。この材料は、実質的に大気
圧で、好ましくはわずかに高い温度で乾燥させな
ければならない。最終工程における凍結乾燥によ
る乾燥により、強度および均質性について同一で
はない、海面状生成物が生じる。

従つて、本発明の組成物を得るために必要とさ
れる方法において、懸濁液をOFと共に攪拌し、
所望の形状に成形しここに述べられたような調節
された条件下において乾燥を行う。上記懸濁液中
には、最終的なコラーゲンの割合が組成物中に２
〜40％、好ましくは５〜25％となるのに充分な、
低免疫原性の、好ましくはアテロペプチド、好ま
しくは再構成繊維状コラーゲンが、30〜100mg／
mlの割合で、そして、最終的な無機質の割合が60
〜98％、好ましくは75〜95％となるのに充分な微
粒子状の無機質が含有される。上記OFは、部分
的に精製されたOFE調製物が0.5〜４％の割合で
含有されるのと同等の活性を有するのに充分な量
である。調節された条件下における乾燥は、少な
くとも20N／cm²の圧縮係数を有する固体材料とな
るような水分量に達するまで続けられる。

より大きな物理的強度、例えば約50〜60N／cm²
の圧縮係数を有する組成物を調製するために、上
記生成物を、50〜120℃、好ましくは75〜90℃で
４〜168時間にわたり熱硬化させる。調製を開始
するために、OFの希釈水溶液（ある実施態様に
おいては温和な酸の溶液）を、キヤリア全部また
は一部と混合する。キヤリアは、本質的に無機質
およびコラーゲン成分からなるので、OFは、予
備工程においてコラーゲンまたは無機質調製物と
混合されてもよく、あるいは、OFはキヤリアの
懸濁液中に混合されてもよい。

一般に、無機質は微粒子として添加される。コ
ラーゲンは、始めは懸濁液またはゲル（繊維状コ
ラーゲン、FC）または溶液（非繊維状コラーゲ
ン、NFC）として添加される。

あるプロトコルにおいては、OFは予備工程に
おいてコラーゲンと混合される。そして、その混
合物は、室温で約12〜24時間にわたつてインキユ
ベートされ、遠心分離によつて回収され、コラー
ゲンの濃度が、緩衝溶液中に、30〜100mg／mlの
範囲となるように調整されて再懸濁される。次
に、この懸濁液を攪拌により無機質成分と混合
し、所望の形状に成形し、そして、低温または室
温における調節された乾燥に供する。あるいは、
予備工程において無機質を攪拌下に添加し、そし
て、混合物を低温または室温における調節された
乾燥に供する。次に、コラーゲン成分は、所定の
コラーゲン濃度を有する凝集塊を形成するように
添加され、所望の形状に成形され、次いで調節さ
れた乾燥に付される。

関連したプロトコルにおいては、コラーゲンお
よび／または無機質成分のどちらかまたは両方の
合計の一部、例えば1/2または1/3または3/4が、
予備工程において添加され、残りがその後に添加
されてもよい。添加される各成分の部分は、同量
である必要はない。

調節された乾燥は、OFをキヤリアに組込み、
かつ均質性を保持するのに役立つ。調節された乾
燥の条件は時間および温度に関連するので、当
然、互いに関連する。しかし、一般的に、室温が
好ましい。適温は、１〜40℃の範囲であり、好ま
しくは約15〜37℃である。これらの条件下におい
て、効果的な時間の範囲は10〜20時間であり、便
宜的には一晩である。

調節された乾燥方法において、懸濁液は、感知
しうる水分がなくなるまで、能動または受動ガス
流、好ましくは空気流で、同様に、例えば窒素の
ような不活性ガス流で乾燥される。次に、乾燥生
成物は保存され、再成形が必要である場合には使
用のために再水和され、あるいは直接使用され得
る。

下記に、典型的なプロトコルの例を示す。第１
図は、本発明の３つの特別に好ましい方法の図式
を示す。

第１図ａにおいて、希釈溶液中のOF調製物は、
適当な量の無機質、好ましくは多孔質HA／TCP
混合物と混合され、充分に混合される。次に、材
料を空気乾燥して、無機質とOFとが充分に結合
した混合物を得る。OF抽出物の精製レベルに従
つて、最終的な組成物におけるOFの必要な活性
を得るために、相対的な量が選択される。

次に、コラーゲン成分が、再構成繊維状アテロ
ペプチドコラーゲン60〜70mg／mlのコラーゲン懸
濁液として供給される。この濃度のコラーゲン
は、市販のZyderm Collagen Implantとして供
給され得、あるいはこれは第１図ａに示されるよ
うに標準的な方法を用いて調製され得る。この方
法においては、溶液状コラーゲンを適当な濃度の
塩基性リン酸塩緩衝液でインキユベートし、そし
て、中性PHで適当に希釈して所望の濃度とし、生
じた沈澱物を回収することにより調製される。次
に、コラーゲン成分および無機質／OF混合物が
合併される。これらは、全混合物中に無機質の割
合が60〜98％、好ましくは75〜95％、そして、コ
ラーゲンの割合が５〜25％となるように、そし
て、部分的に精製されたOFE調製物の0.5〜４％
の活性が得られるのに充分なOFと共に合併され
る。これらの材料は、攪拌して充分に混合され、
適温での空気乾燥の前に所望の形状に成形され
る。

第１図ｂに示された他の方法においては、OF
調製物は、溶液中でコラーゲン（非繊維状）と結
合してしる。希釈コラーゲンを、0.2Mのリン酸
塩緩衝液1/10容で処理することによつて再構成
し、OFを含む沈澱物を形成する。リン酸塩緩衝
液のPHは、最終PHが7.0〜7.5となるように選択さ
れる。室温での適当な時間のインキユベーシヨ
ン、つまり、約12〜24時間インキユベーシヨンの
後、沈澱物を遠心分離して回収する。適度を適当
なレベル、つまり、30〜100mg／mlに調製した後、
OFを含むコラーゲンマトリツクスを、微粒子状
の無機質と混合し、成形し、適温で空気乾燥し
て、所望の固体移植物を得る。第１図Ｃに示され
るように、無機質とOF調製物との充分な混合物
を凍結乾燥によつて乾燥し、固体無機物／OFを
得、次いで、これを成形および空気乾燥に適した
濃度で、繊維状コラーゲンと混合してもよい。

もちろん、調節された乾燥工程に供される最終
混合物が、必要とされる割合の組成物の均一で均
質な混合物を含み、そして、30〜100mg／mlのレ
ベルでコラーゲンが含まれるのに充分な水を懸濁
液中に含んでいる限り、他のプロトコルを使用す
ることもできる。

本発明の組成物は、成形して、骨の再構成、骨
折治療、およびその他の整形外科の用途（例えば
脊椎融合術）におけるアンレー移植物としての使
用に適した形状とする。そのような移植物を形成
するために固体組織物を使用する方法、およびそ
れらを移植するための外科的方法は、当技術にお
いてよく知られており、本発明の組成物は、これ
らの標準的手段を用いるのに有用である。

所望の位置に置かれると、移植組成物は、新し
い軟骨および骨の内方成長のためのマトリツクス
を与え、そして、骨誘導性因子の存在により、こ
れらの物質の生成に刺激を与える。

組成物の使用本発明の組成物は、外傷、疾病または先天性の
欠陥によつて引き起こされた大きなまたは小さな
骨の欠陥を修正するために、該分野において一般
に知られた方法で使用される。

下記の特定の実施例に記載されているように、
これらの組成物は、異種宿主の皮下に移植される
と、骨組織形成を刺激し得る。それらの、そのよ
うな能力は、組成物を外移植し、該外移植物を、
軟質プロテオグリカンの形成、カルシウムの存在
およびアルカリホスフアターゼの存在について、
組織学的に評価することによつて、確認すること
ができる。（軟質プロテオグリカンは、軟骨形成
の目安であり、アルカリホスフアターゼは、石灰
化肥大性軟骨の指標である。）さらに、宿主主体
には、移植物質に対して反応する抗体がないこと
が示される。

Ｃ実施例次の実施例によつて、本発明を説明する。得ら
れる組成物が添付の特許請求の範囲内にあるなら
ば、組成物の成分の調製および組成物自体の調製
の別の方法も本発明の範囲に入る。

実施例１誘導性移植物の検定移植生後30〜34日のオスのSprague−Dawleyラツ
トの腹面胸郭部分に、試料を、皮下的に移植し
た。各ラツトは、両側面に、同じ材料の２つの移
植を受けた。そして、試験のための外移植物を、
14日および28日目に取り出した。この外移植片
を、14日および28日目に取り出した。この外移植
片を、組織学的に、そしてアルカリホスフアター
ゼ活性測定により、検定した。

外移植物の組織学的特徴付け 14日および28日目後に取り出された外移植物
を、10％中性ホルマリンで26時間をかけて固定
し、その後、パラフイン包埋処理することによつ
て、組織学的評価を行つた。４〜６ミクロンの切
片を、包埋組織から摂取し、続いてこれをヘマト
キシリン−エオシン、またはサフラニン−０で染
色した。サフラニン−０は、軟骨プロテオグリカ
ンに対して選択的である。

アルカリホスフアターゼ分析アルカリホスフアターゼレベルは、骨形成の指
標として使用され得る。アルカリホスフアターゼ
（AP）を測定するために、外移植物を小片に裁断
し、氷冷下の1.5M NaCl、3mM NaHCO₃、PH
7.5、３ml中でホモジナイズした。次に、ホモジ
ナイズした試料を、４℃にて12000rpmで50分間
遠心分離し、上清の一部を、冷蒸留水で１：10に
希釈した。Hugginsらの、Ｊ Exp Med（1961）
114；761の方法ををアルカリホスフアターゼを評
価するために採用し、ポリスチレンプレートを用
いた。

移植物の非免疫原性 28日後に、移植した動物から血清を取り出し、
酵素結合免疫吸着検定（ELISA）法を用いて、
移植材料に対する抗体の存在についての検定を行
う。マイクロタイターのウエルを、４℃にて一
夜、組成物の各成分２〜5g〔PH9.6の20mM炭酸塩
緩衝液中（100：１）で被覆した。結合していな
い抗原を除去するために、ウエルを、0.05％
Tween20界面活性剤を含むPBSで３回洗浄する。

次いで血清を２時間にわたり室温で添加し、ウ
エルを、PBS−Tween20界面活性剤で３回洗浄
する。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤ
ギ抗ラツトInG（１：2000稀釈）を添加し、ウエ
ルを、1.5〜２時間、室温にてインキユベートす
る。その後、結合していない標識抗体を、界面活
性体を含むPBS−Tween20で除去し、ペルオキ
シダーゼ基質を添加する。プレートを室温で30分
間インキユベートし、そして、プレートをスキヤ
ンニングし、吸光度を求める。

抽出可能カルシウムの測定骨の形成もまた、カルシウム測定によつて評価
し得る。外移植物を小片に裁断し、0.5N HCl中
に１：10（ｍ／Ｖ）および１：20（ｍ／Ｖ）となる
ように懸濁し、骨を溶解させる。試料をさらに室
温で５日間インキユベートし、12000rpmで40分
間遠心分離する。そして、上清のカルシウム濃度
を、原子吸光により測定する（Trace Analysis
Laboratory，Hayward，California）。

実施例２凍結乾燥された誘導性組成物の調製部分的に精製されたOFEを、0.01NのHCl中３
mg／mlの溶液として用いた。

OFE溶液5.4mlの試料を、22ml Vitrogen CIS
と共に、４℃にて５分間攪拌する。Zimmer
Corp，Warsaw，INから入手した、微粒子形態
の多孔質HA／TCPセラミツク569mgを添加し、
混合物を４℃で５分間インキユベートし、次いで
凍結乾燥した。得られた固体は、セラミツク87.5
％、非繊維状コラーゲン（NFC）10％および
OFE2.5％であつた。％はすべて重量単位で表示
される。この方法で調製された組成物を、第２図
および第３図に「実施例２」として示す（実施例
５参照）。同じ方法で、対照調製物を調製したが、
OFE溶液の代わりに0.01NのHClを使用した。

実施例３調節条件下で乾燥された誘導性組成物の調製部分的に精製されたOFEを、３mg／ml溶液
（0.01N HCl中）として用いた。OFE溶液の5.4ml
の試料を、Zimmer Corp，Warsaw，INから入
手したHA／TCP569mgと共に20℃で５分間攪拌
し、次いで37℃にて空気乾燥した。得られた固体
を、65mg／mlのZydermコラーゲンの移植物（繊
維状コラーゲン）1.0mlと充分に混合し、再び37
℃で空気乾燥して、完全に乾燥させた。得られた
固体は、セラミツク87.5％、繊維状コラーゲン10
％、そして、OFE2.5％であつた。％はすべて重
量単位で表示されている。組成物を、第２図およ
び第３図に「実施例３」として示す。同じ方法
で、対照調製物を調製したが、OFE溶液のを代
わりに0.01NのHClを使用した。

実施例４調節条件下で乾燥された誘導性組成物の他の調
製法部分的に精製されたOFEを、３mg／ml溶液
（0.01NのHCl中）として用いた。OFE溶液の6.5
mlを、Vitrogenコラーゲン溶液（３mg／ml）25
mlおよび0.2M Na₂HPO₄／0.09M NaOH、PH
11.2、3.5mlと共に攪拌した。混合物を、室温で、
16〜20時間、つまり便宜上一晩インキユベートし
た。得られたOFEと繊維状コラーゲン（FC）と
の共沈澱物を、13000×ｇにて30分間遠心分離す
ることにより回収した。共沈澱物のタンパク濃度
を、PBSで65mg／mlに調整した。

このOFEとFCとの共沈澱物65mg／mlを、
HA／TCP（Zimmer，Corp.，Warsaw INから
入手）569mgと混合し、37℃で空気乾燥して、完
全に乾燥させた。得られた固体は、セラミツク
87.5％、繊維状コラーゲン10％、およびOFE2.5
％であつた。％はすべて重量単位で表示されてい
る。同じ方法で、対照調製物を調製したが、
OFE溶液の代わりに0.01NのHClを使用した。

実施例５種々の誘導組成物の比較移植実施例２により調製された材料（凍結乾燥され
たOFE／NFC／セラミツク）を、ほぼ半分の容
量の水で水和し、５分間浸漬し、移植に先立つ
て、所望の大きさに成形した。

実施例３により調製された材料（空気乾燥され
たOFE／FC／セラミツク）を、乾燥形態で移植
した。

骨の形成アルカリホスフアターゼ（AP）の活性レベル
を、移植後14日および28日後について第２図に示
す。OFE含有組成物のすべてが、14日後には高
いレベルのAP活性を示した。28日後には、骨形
成工程の完成の途中で予期されるように、すべて
のレベルが低下した。しかし、「実施例３」の材
料は、顕著に、より高いレベルを示すしている。

組織学的試験外移植物の組織学的誘導試験の結果を第３図Ａ
（14日）および第３図Ｂ（28日）に示す。OFEを
含むすべての試料は、14日後に中程度〜良好な軟
骨および骨の形成を示した。28日までに、良好な
骨形成および骨髄分化があつた。どちらの時点で
も、実施例３に従つて調製された本発明の組成物
は、実施例２による空気乾燥を行わずに調製され
た材料より、効果的に骨形成を促進するようであ
つた。

（発明の要約）骨修復用の無機質／コラーゲン／OF（骨形成因
子）誘導性移植物の改良された調製方法は、常圧
条件下にて、75〜95％の無機粒子、５〜25％のコ
ラーゲン、および有効量のOF（例えば、0.5〜４
％の部分的に精製されたOFEまたはその同等物）
の懸濁液を乾燥することを利用する。この方法に
おいて、乾燥に供される懸濁液中のコラーゲン濃
度は、30〜100mg／mlである。得られた移植物は
以下の点で改善されている。すなわち、これらの
移植物は、組成が均一であり、生物学的に活性か
つ利用可能な形態でのOFを含有すると同時に、
高い圧縮係数をも有する。

【図面の簡単な説明】

第１図はいくつかの典型的な本発明の方法を示
す図である。第２図はアルカリホスフアターゼを
指標として用いた本発明の組成物の骨形成活性を
示す図である。第３図Ａおよび第３図Ｂは組織学
的評価を規準として用いた、これら組成物の骨成
長の結果を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１脊椎動物における骨修復を実施するための移
植に適した低免疫原性組成物の調製方法であつ
て、該組成物は、異種宿主において低免疫原性であ
るのに充分なほど純粋であるタンパク骨誘導性因
子（OF）の骨誘導的に有効な量と、該組成物の
60〜98％を構成する無機質および該組成物の２〜
40％を構成するコラーゲンから実質的に成る成分
を有するキヤリアとを含有し、該方法は、 (a) 該組成物のコラーゲン、無機質、およびOF
成分を含む均一な水性懸濁液を、該懸濁液中の
コラーゲン濃度が30〜100mg／mlになるように
調製すること；および (b) 該懸濁液を常圧下にて調節された乾燥に供
し、少なくとも20N／cm²の圧縮係数を有する多
孔質の硬質の固体を得ること、を包含する方法。２さらに、(b)の生成物の熱硬化を包含する、特
許請求の範囲第１項に記載の方法。３前記熱硬化が、50〜120℃にて４〜168時間実
施される、特許請求の範囲第２項に記載の方法。４前記(a)の懸濁液が、OFの希釈溶液を無機質
粒子と混合し、得られた混合物を乾燥し、そして
その乾燥混合物を、30〜100mg／mlのコラーゲン
を含有する再構成アテロペプチド繊維状コラーゲ
ン懸濁液と混合することにより調製される、特許
請求の範囲第１項に記載の方法。５前記(a)の懸濁液が、OFの溶液を溶液状コラ
ーゲンに添加し、コラーゲンおよびOFを沈澱さ
せ、コラーゲン濃度が30〜100mg／mlになるよう
に沈澱物を再懸濁し、次いで得られた懸濁液を無
機質粒子と混合することにより調製される、特許
請求の範囲第１項に記載の方法。６脊椎動物における骨修復を実施するための移
植に適した低免疫原性組成物であつて、該組成物は、60〜98％の無機粒子；２〜40％の
低免疫原性コラーゲン；および有効量のOF調製
物から実質的に成り、移植物が20N／cm²より大きな圧縮係数の多孔質
硬化固体であり、かつその成分に関して均質であ
り、そして該OFが生物学的に活性かつ利用可能
な形態にある、組成物。７前記有効量のOF調製物が、0.5〜４％の部分
的に精製されたOFまたはその同等物である、特
許請求の範囲第６項に記載の組成物。８以下の組成物から成る群より選択される特許
請求の範囲第６項に記載の低免疫原性組成物： (a) 87.5％の骨コラーゲン粉末および10％の非繊
維状コラーゲンを含有する組成物であつて、そ
のOF量が、部分的に精製されたOFとして移植
物の約2.5重量％の割合で含ませることにより
得られるOF量に相当する組成物； (b) 85〜95％の無機質キヤリアおよび５〜15％の
アテロペプチドコラーゲンを含有する組成物で
あつて、そのOF量が、部分的に精製されたOF
を移植物の約0.5〜４重量％の割合で含ませる
ことにより得られるOF量に相当する組成物； (c) 87.5％のTCP／HA混合物および10％の非繊
維状コラーゲンを含有する組成物であつて、そ
のOF量が、部分的に精製されたOFとして移植
物の約2.5重量％の割合で含ませることにより
得られるOF量に相当する組成物；および (d) 91.5％のTCP／HA混合物および６％の再構
成繊維状コラーゲンを含有する組成物であつ
て、そのOF量が、部分的に精製されたOFとし
て移植物の約2.5重量％の割合で含ませること
により得られるOF量に相当する組成物。