JPH0555149B2 - - Google Patents

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JPH0555149B2
JPH0555149B2 JP60234381A JP23438185A JPH0555149B2 JP H0555149 B2 JPH0555149 B2 JP H0555149B2 JP 60234381 A JP60234381 A JP 60234381A JP 23438185 A JP23438185 A JP 23438185A JP H0555149 B2 JPH0555149 B2 JP H0555149B2
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collagen
bone
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Nasan Ranga
Saijin Saiado
Piitsu Kaaru
Bentsu Han
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Collagen Corp
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Publication of JPH0555149B2 publication Critical patent/JPH0555149B2/ja
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は骨修復材に関する。さらに詳しくは、
本発明は軟骨原性／骨形成原性蛋白質のための非
繊維性コラーゲン担体に関する。
発明の背景 単純な骨折の治療以上の損傷または欠損骨の修
復は必要な骨組織の供給に３つの方法を用いてい
る。もつとも簡単な方法では、欠損した骨の代替
物として永久的な補綴が取り付けられ、補綴が宿
主の骨格構造と一体となるように準備される。こ
こような骨代替物は生体適合性金属のような人工
材料で作製することができ、あるいは、宿主のど
こかの骨構造から由来する同種移植片で構成する
ことができる。もう少し複雑な方法は、周囲の健
康な組織からの骨の内部生長を支持するマトリツ
クスを与えることであり、ついで、マトリツクス
は吸収されうる。第３の方法は、マトリツクスお
よび軟骨中間体と共にまたはなしで骨の内部生長
を生化学的に誘導する骨形成原性因子の両方を供
給することである。
後者の２方法は、しばしば、各々、「伝導性
（conductive）」および「誘導性（inductive）」修
復とよばれ、その発達の歴史は望ましくない副作
用なしにそれらの機能を発揮するのに充分な低免
疫原性の生物学的に由来した物質への進歩が続い
ていることを示している。コラーゲンは骨の主有
機成分であるので、隣接細胞による無機骨成分の
以降の沈積のためのマトリツクスとして、あるい
はマトリツクス中にコラーゲンを用いることが広
がつている。しかし、コラーゲン自体は免疫原性
である「テロペプチド（telopeptide）」単位を含
有し、このようなマトリツクス形成に用いるコラ
ーゲンに関する大きな改善に、「アテロペプチド
（atelopeptide）」コラーゲンの使用がある。テロ
ペプチドの除去または部分除去およびその結果と
しての免疫原性応答の抑制は、それが宿主にとつ
ては異質の種から由来したコラーゲンの伝導性骨
修復の実行、すなわち、「異種」コラーゲンの使
用を改善するので重要となりうる。ヒト受容者に
とつては、死体あるいは関係のあるヒト供与者よ
りも、ブタ、ウシあるいは他の哺乳動物源を調製
物に使用でき、したがつて、非常に安価な、か
つ、豊富な供給源を提供できるので、非常に重要
となる。一方、アテロペプチド含有コラーゲンは
いくつかの例においても有用である。
マトリツクスが宿主と許容できる程に適合する
必要があるばかりでなく、軟骨および骨形成を誘
導するいずれの因子の調製も適合が必要であるの
で、誘導性移植を用いる場合は非適合性の問題が
増加する。早期の仕事においては、このような因
子を提供するために脱ミネラル化した骨
（DMB）を移植調製物の一部に使用している。
例えば、米国特許第4440750号および第4430760号
ならびに米国特許出願第411659号参照。骨から骨
誘導に関与する、多分、蛋白質である因子を精製
するために、種々の試みがなされている。ユリス
ト（Urist）の米国特許第4294753号および第
4455256号は、尿素または塩化グアニジンを用い
て脱ミネラル化骨から抽出され、再沈殿される骨
形態形成蛋白（BMP）を開示している。この因
子をさらに精製することが、ユリストにより、ク
リニカル・オーソピデイスク・リレイテイング・
リサーチ（Clin.Orthop.Rel.Res.）162：219
（1982）、サイエンス（Science）220：680（1983）
およびプロシーデイングス・オブ・ナシヨナル・
アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー・エ
ス・エイ（Proc.Natl.Acad.Sci.（USA））81：371
（1984）に報告されている。ユリストによつて報
告されたBMPは17500〜18000ダルトンの分子量
を有し、PH4.8でカルボキシメチルセルロース
（CMC）に非吸着性である。
推定的に異なる骨形成因子（OF）蛋白質がサ
イジンおよびトーマス（Seyedin and Thomas）
によりDMBから単離され、精製された（米国特
許第4434094号および1984年７月16日に出願され、
同じ譲受人に譲渡された米国特許出願第630938号
参照）。これらの調製物は１つの因子について、
分子量約26000と表示しており、これは、ユリス
トの因子と異なり、PH4.8でCMCに吸着される。
この因子は異種宿主において免疫原にならない程
に充分精製された。
骨誘導性因子源を生体適合性担体と組合せる試
みがなされている。前記米国特許第4440750号は
DMBまたはDMB抽出物と組合せた再構成アテ
ロペプチド・コラーゲン調製物を開示している。
ジエフリース（Jeffries）の米国特許第4394370号
はコラーゲン調製物（しかしながら、テロペプチ
ド）およびDMBの粗抽出物の組合せを開示して
いる。このジエフリースの開示は、「BMP」はそ
の活性において種特異性ではないとしているが、
抽出物の出発物質として同種DMBの使用のみを
例示しており、これは免疫原性による問題を認識
してのものと考えられる。また、ジエフリースの
開示は組成物中、最少５重量％のDBM抽出物の
使用を必要とする。コラーゲン担体との組合せが
in vivoでテストされた例は見当らない。レジら
はプロシーデイングス・オブ・ナシヨナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Reddi、et al.、
Proc、Natl.Acad.Sci.）69：1601（1983）におい
て、同種脱ミネラル化骨粉を用い、ラツト宿主に
おいて軟骨および骨形成を生じさせたことを記載
している。サンパス、テイー・ケイらはプロシー
デイングス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エイ
（Sampath、T.K.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA））80：6591〜6595（1983）において、同種
ラツト骨コラーゲン粉末（骨形成原性因子を欠く
と考えられる）および低分子量形成因子（ユリス
トのものと考えられる）の組合せがラツトにおけ
る骨修復に有効であることを示唆している。すな
わち、骨形成因子は異種であるが、前記サンパス
において開示された移植物の伝導部によつて与え
られる担体は同種である。
供給および価格の考慮から、完全に異種骨誘導
性担体移植物を提供することが有利である。この
ため、担体およびOF蛋白質の両方が許容できる
ほどに低免疫原性の、OF蛋白質の有効な沈着を
有する担体を提供することが必要である。
発明の開示 本発明は、骨生長用の、化学的に明らかな低免
疫原性担体マトリツクスおよび骨の内部生長を生
化学的に促進させる有効量の精製骨誘導因子の両
方を含む誘導性骨修復用移植材料を提供するもの
である。軟骨組織の中間形成も生じうる。本発明
の組成物は、再構造、上張りまたは歯周用目的の
いずれにも、大きな、また、小さな骨欠損の修復
に利用できる。
かくして、１つの態様において、本発明は哺乳
類宿主において骨生長を誘導し、支持するのに有
効な組成物からなり、該組成物は、低免疫原性と
するに充分な程に不純物のない骨から由来した、
骨誘導有効量の軟骨原性／骨形成原性（OF）蛋
白質と、少なくとも５％、好ましくは、少なくと
も10％の非繊維性コラーゲンを含有する担体調製
物を組合せてなる。担体調製物の残り（補足）部
分は、繊維性コラーゲン、ヒドロキシアパタイ
ト、リン酸トリカルシウムまたはこれらの混合物
のような、いずれの生体適合性材料とすることが
できる。
OFは通常、組成物全体に基いて、精製OFとし
て約１〜1000ppmの量存在させ、組成物調製に用
いるOF調製物は、最大、２％wt／wtOF調製物
を加えればよい程度に充分精製されたものであ
る。
他の態様において、本発明は、本発明の組成物
を移植することにより、哺乳類において骨修復を
行なう方法にも関する。
図面の説明 第１図は、濃縮、再可溶化したDMBからの抽
出物のセフアクリル（Sephacryl）Ｓ−200分画
の結果を示す。10000〜30000ダルトンの分子量範
囲のフラクシヨンＦ２がOF活性を含む。
第２図は、第１図のＦ２フラクシヨンのCMC
分画の結果を示す。100〜250ｍＭ NaClの間で
溶出するフラクシヨンがOF活性を含む。
第３図は第２図のCMCカラムからの100〜250
ｍＭ NaClフラクシヨンについて行なつたRP−
HPLCの吸光度および電気泳動の結果を示す。
第４図は、第３図に示すRP−HPLCで得られ
た活性フラクシヨンを用いるエライサ（ELISA）
の結果を示す。
第５図は、第２図に示すCMCからの100〜250
ｍＭ NaCl溶出物の電気泳動で得られたゲル・
フラクシヨンについてのエライサの結果を示す。
発明の実施態様 Ａ 定義 本明細書においては、「骨誘導性」および
「骨形成原性」なる語は互換的に用いており、
骨幹細胞の生骨組織への変換を意味している。
誘導は骨形成、すなわち、骨の有機および無機
成分の分泌によるミネラル化骨の直接形成をも
たらすことができ、あるいは、骨誘導は軟骨の
中間形成をも包含しえ、すなわち、骨誘導因子
は軟骨原性でもありうる。事実、軟骨形成の特
徴であるプロテオグリカンを本発明の組成物の
骨誘導活性の指標として用いる。
「から由来」するなる語を骨形成原性因子に
ついて用いる場合、構造的類縁関係または相同
を意味する。物理的な由来に限定するものでは
ない。すなわち、骨「から由来」した骨形成原
性因子とは、自然に骨組織内で生成されるもの
と相同な、かつ、同様に機能するアミノ酸鎖を
有する因子または因子群を示し、必ずしも、骨
自体から直接単離された物質を意味するもので
はない。例えば、これは、合成的に、あるい
は、組換型DNM技法を用いて作製してもよ
い。
「低免疫原性」なる語は許容できる生体適合
性を意味する。多くの物質が、ある種の動物お
よび適用では免疫原性でありうるが、他の動物
においては検知できるレベルの特異免疫グロブ
リンを生じることができないことが知られてい
る。また、特異免疫グロブリンおよび炎症が完
全にないことが必須でない場合もあることも知
られている。したがつて、本発明の組織物成分
または組成物の記載に用いる場合、「低免疫原
性」なる語は、いずれの免疫応答も許容できる
レベル内にあることを意味する。
「アテロペプチド」なる語は、そのテロペプ
チドまたは免疫原性部分を除去または部分的除
去するために適宜処理されたコラーゲンを意味
する。簡単に説明すると、コラーゲンは、アミ
ノ酸鎖のくり返しの三重螺旋状配置の束から構
成される繊維構造からなる。これらの三重螺旋
配列は非螺旋構造、すなわち、「テロペプチド」
で終つており、「テロペプチド」は種々のコラ
ーゲン鎖間の架橋および、一部、コラーゲン調
製物の免疫原性に関与している。この構造の除
去は、トリプシンのような適当な蛋白分解酵素
による処理で行なうことができる。得られたア
テロペプチドコラーゲンは、主な種特異性免疫
原が除去されているので、異種用途により適し
ている。
「非繊維性コラーゲン」は、その天然の繊維
構造を維持しないように処理されたものであ
る。したがつて、この語は、可溶化され、その
天然の繊維形を再構成していないコラーゲンを
意味する。繊維構造は溶解により崩壊でき、繊
維の再構成（繊維性）または非特異的凝集（非
繊維性）によつて固体形に戻ることができる。
非繊維性コラーゲンは、例えば、まず、可溶化
し、あるいは、せずに繊維を加熱するような変
性によつて調製できる。
本発明で有用な非繊維性コラーゲンは、溶
液、ゲル、または、凍結乾燥のような、溶解
後、非特異的に凝集させた固体として用いられ
る。再構成、すなわち、繊維性形に戻つていて
はならない。
本発明の組成物におけるOFの割合（％）は、
精製骨誘導性蛋白質に基くもので、粗調製物で
はない。以下の記載から明らかなごとく、OF
蛋白質を均一に精製する技術が利用できるよう
になり、蛋白mgと活性単位間の相関性が確立で
きた。かくして、比較的不純な調製物も、その
活性の検定により、存在するOFのmgとして評
価でき、所望の重量の精製蛋白質を与える調製
物の量が計算できる。
Ｂ 概説 本発明の組成物は、異種的に使用した場合に
低免疫原であるように充分精製された、有効量
の骨誘導性因子（OF）調製物と、担体調製物
の混合物であり、担体調製物はその重量の少な
くとも５％、好ましくは、少なくとも10％の非
繊維性コラーゲン調製物を含有する。この組成
物に必要な実際のOF調製物の割合（％）は、
もちろん、その純度に依存する。
骨誘導性活性を示す蛋白質は、1984年７月６
日に出願され、同一嬢受人に譲渡された米国特
許出願第630938号に開示されているごとく、均
一に精製した。かくして、有効レベルは、粗抽
出物の量より、この精製物質の含量によつて理
論的に計算できる。事実、本明細書に記載のご
とく組成物は精製因子に基いて計算されてい
る。したがつて、組成物は、ほぼ全体がOFの
精製調製物用のコラーゲンマトリツクスであ
り、すなわち、それらは、約１〜1000ppmの
OF蛋白質を含有する。しかし、OFの純度の低
い調製物を用いる場合、混合物の２％までが、
この調製物製であつてもよい。
異種宿主において低免疫原性であるに充分な
純度の基準に合うOF調製物はいくつかの方法
で調製できる。この因子源としては、骨、象牙
質、骨肉腫または軟骨肉腫おびOFを含有する
脊椎動物起源の他の組織が使用できる。ヒト、
サル、ウシおよびラツトからのOF調製物は、
それらの異種移植における軟骨内骨を生じる能
力が非種特異性であることがサンパス、テイ
ー・ケイらのプロシーデイングス・オブ・ナシ
ヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オ
ブ・ユー・エス・エイ（Sampath、T.K.et
al.、proc.Natl.Acad.Sci（USA））80：6591
（1983）によつて示されている。すなわち、本
発明の混合物において使用できるOFはこれら
の源から由来することができ、事実、偶然また
は故意の手段により調製され、修飾され、化学
的合成法、組換型DNA法または他の方法によ
り調製された、脊椎動物源から由来するそれら
の蛋白質と実質的に類似する骨誘導活性を有す
るいずれの蛋白質でもよい。さらに、例えば、
ユリストの骨形態発生蛋白質も、充分に精製す
れば用いることができる。OFは、脊椎動物源
から由来できる蛋白質と実質的に類似なこと、
骨誘導機能および許容できる低免疫原性の要件
のみを満足すればよい。
本発明の組成物において有用なOFの１つの
有用な調製法が米国特許出願第630938号に開示
されている。この方法は均一な蛋白質を生じ
る。要約すると、この方法は、ブタまたはウシ
の長骨原料（入手の容易性から）を機械的およ
び研摩技術によつて処理してきれいにし、砕
き、エーテルまたは酢酸エチルのような有機溶
媒で抽出して脱脂し、通常、標準的な方法を用
いる強酸での抽出により脱ミネラル化し、つい
で、得られたDMBを出発物質として用いるこ
とからなる。
因子を単離するため、ついで、DMBを、グ
アニジン塩酸塩（少なくとも約4M）、尿素
（8M）プラス塩のようなカオトロピツク剤また
は種々の他のカオトロピツク剤で抽出する。抽
出は、好ましくは、抽出された蛋白質の消化ま
たは変性可能性を減じるため、プロテアーゼ阻
害剤の存在下、低温で約４時間〜１日行なう。
抽出後、抽出剤は、水に対する透析、制御した
電気泳動、モレキユラー・シーブのような適当
な手段あるいはその他の適当な手段によつて除
去できる。抽出剤を除去あるいは除去しない抽
出物を、ついで、ゲル過に付し、標準的技術
を用いて約30000ダルトン以下の分子量のフラ
クシヨンを得る。この低分子量フラクシヨンは
競争イオンを含まず、ついで、PH約4.5〜5.2、
好ましくは、約4.8で、尿素のような非イオン
性カオトロピツク剤の存在下、CMCを用いる
イオン交換クロマトグラフイーに付す。他のカ
チオン交換体を用いることもできる。
カチオン交換クロマトグラフイーから得られ
た活性溶出フラクシヨンは直接、本発明の組成
物において使用できる。また、これらは、所望
により、逆相HPLCまたは非変性ゲル電気泳動
によつてさらに精製できる。これらの２つの方
法のいずれかを溶出物に適用する場合、均一な
蛋白質調製物が得られる。
別法として、前記のサイズ分別から得られた
低分子量蛋白質は、例えば、6M尿素および20
ｍＭリン酸ナトリウムの存在下、約PH7.2で、
DEAEセルロースのようなアニオン交換樹脂で
処理できる。この処理において、透析後、尿素
を除去した非蛋白質を用いることができる。ア
ニオン交換樹脂処理溶液中の蛋白質は凍結乾燥
により回収でき、0.01NHClに対して透析して
安定化できる。この方法によるOF含有溶液ま
たは固体も、所望により、さらに精製できる。
これは任意工程である。このOF蛋白質を満足
するレベルに精製する方法の１例は以下のＣ項
に詳しく示す。いずれの場合も、OF含有フラ
クシヨンは、組成物において、コラーゲンに対
して２％wt／wtを超える因子調製物を用いな
いように、充分精製されている。
組成物の担体部分は、少なくとも５％、好ま
しくは、少なくとも10％の非繊維性コラーゲン
と、所望により、繊維性コラーゲンまたはセラ
ミツクあるいは両方を含有する。
用いる非繊維性コラーゲンは、溶液状コラー
ゲン、非特異的に凝集している溶液状コラーゲ
ンの凍結乾燥物、ゼラチン担体またはこれらの
混合物として供給することができる。
好ましい非繊維性コラーゲン源は、カリフオ
ルニア州、パロ・アルト、コラーゲン・コーポ
レーシヨン（Collagen Corporation、Palo
Alto、California）からチゲナ（Zygena^）の
商標の下に得られる溶液状コラーゲン（CIS）
である。しかし、いずれの非再構成コラーゲン
調製物も使用できる。この非繊維性部分は、組
成物中、少なくとも、約５％の量存在させなけ
ればならない。しかしながら、組成物の全コラ
ーゲン成分を構成してもよい。本発明の組成物
の特質は許容できる低免疫原性である。したが
つて、この非繊維性コラーゲン成分の調製物の
全てにおいてコラーゲンのアテロペプチド型を
用いることが好ましい。しかし、移植組成物の
形態、宿主の感受性またはその他の理由によ
り、組成物の低免疫原性が損なわれなければ、
テロペプチドが存在してもよい。換言すれば、
アテロペプチド非繊維性コラーゲンの使用が好
ましいが、必ずしも必要とするものではない。
組成物の残りの材料は、もしあれば、繊維性
コラーゲン調製物、セラミツクまたは両方のよ
うないずれの生体適合性材料であつてもよい。
繊維性コラーゲンは種々の源から由来でき、多
数の繊維性コラーゲン調製物が入手可能であ
る。これらは、種々の哺乳類の骨または皮膚か
ら由来するコラーゲンを液体媒体中で可溶化ま
たは分散し、ついで、繊維状の形で回収された
ものである。繊維状の再構成されているコラー
ゲン調製物には、例えば、コラーゲン・コーポ
レーシヨンから入手できるチデルマ
（Zyderma^）コラーゲン・インプラント（ZCI）
が包含される。他の繊維状調製物には、未だ天
然の繊維状形を有する分散繊維であるアビテネ
ア（Avitenea^）および分散調製物であり、つ
いで凍結乾燥したコラーゲンフレーシア
（Collagenfleecea^）が包含される。好ましいコ
ラーゲンは、骨コラーゲン粉末（BCP）のよ
うな骨から由来したものである。
BCPの調製は米国特許出願第628328号
（1984年７月６日出願、同一譲受人へ譲渡）に
詳細に記載されている。使用できる他のコラー
ゲン調製物、例えば、ZCIまたは凍結乾燥コラ
ーゲン・ゲルのような非骨源から再構成された
調製物も、非繊維性成分と混合する許容される
充填材として有効である。
非コラーゲン性成分も単独で、あるいはコラ
ーゲン性補足材と共に使用してもよい。例え
ば、ヒドロキシアパタイト（HA）または他の
リン酸カルシウム調製物のようなセラミツク材
料を用いることもできる。これらの材料は硬組
織移植物の構成に有用であることが開示されて
おり、したがつて、本発明の組成物の一部を構
成するのに適した生体適合性を有している。例
えば、米国特許第4314380号はHA調製物を開
示しており、ハヤシ、ケイら、アーク・オルソ
プ・トローマト・サージ（Hayashi、K.et al.、
Arch.Orthop.Traumat Surg）99：265（1982）
はHAの別の形を開示している。
本発明の組成物は、アルミニウムまたは合金
製のような金属補綴と一緒に使用できる。例え
ば、米国特許第3820167号はチタンまたはその
合金製の補綴を記載している。本発明の組成物
は補綴と周囲の骨との間のいずれの空隙をもふ
さぎ、したがつて、補綴をよりしつかりとその
場に固定する働きをする。
本発明の組成物における非繊維性コラーゲン
の必要な％を補足するこれらの追加成分は単独
でも、相互に混合して用いてもよく、また、全
く用いないでもよい。これらは、最終組成物の
担体部分の95％までを構成する。担体中におけ
るこれらの追加成分の性質および調製法によ
り、組成物の性質を特定の型の骨再構成または
修復操作に適するように変えることができい。
多くの用途用の好ましい組成物においては、担
体補足材は繊維性コラーゲン、ヒドロキシアパ
タイトまたはこれらの混合物を含有する。
本発明の組成物を構成する混合物の調製に適
した方法においては、非繊維性コラーゲンを
CISのような溶液として、あるいはゼラチンと
して供給し、所望により、例えば、BCPまた
は他の生体適合性材料のような追加成分と混合
する。しかし、HAのようなある種のセラミツ
ク材料はつぎの工程で溶解しうるので、凍結乾
燥後に加えなければならない（後記参照）。得
られた混合物を精製OF含有調製物または精製
蛋白質と混合し、希鉱酸、例えば、0.01N塩酸
中、約４℃の低温にて１〜２時間撹拌する。つ
いで、混合物をPH約５以下で水に対して透析
し、凍結乾燥して固体物質を得る。この固体物
質も追加の適合物質で補足することができる。
得られた固体物質の物性は前記方法を適宜修
飾し、補足担体材料の性質および量を調整する
ことにより変えることができる。すなわち、組
成物は粉末、シートまたは、ブロツクもしくは
ロツドのような硬い固体形とすることができ
る。固体物質は、上張り移植用片として、骨再
構成に、骨折の治療に、他の整形外科的適用に
おける骨の修復に用いるのに適した移植物に成
形できる。固体組成物をそのような移植物の成
形に利用する方法およびそれらを移植する外科
的方法は当該分野でよく知られており、本発明
はこれらの標準的な手段を用いるのに有用であ
る。
所望の場所に位置させる場合、移植組成物
は、骨誘導因子の存在により、新たな軟骨およ
び骨の生成を刺激すると共に、これらの物質の
内部生長用のマトリツクスを提供する。
以下の実施例に記載のごとく、本発明の組成物
は異種宿主の皮下に移植すると、骨組織形成を刺
激する能力がある。その能力は組成物を移植し、
移植物の軟骨プロテログリカン形成、カルシウム
の存在およびアルカリ性ホスフアターゼの存在に
ついて組織学的に評価することにより証明でき
る。さらに、宿主生物は移植した物質に対して抗
体反応を生じないことも示す。
実施例 つぎに実施令を挙げて本発明をさらに詳しく説
明する。組成物の成分の他の調製法および組成物
の他の調整法も、得られる組成物が本発明範囲の
ものであれば、それらも本発明に包含するもので
ある。
Ｃ 骨誘導因子の調製 C1 予備抽出および精製工程 C1a〜C1cは例示した全ての調製物に共通
である。C1cに示すフラクシヨンＦ２はつい
で数種の別法に使用できる。まず、C2項に
示すごとく、イオン交換クロマトグラフイー
に付し、本発明の組成物におけるOF調製物
して使用するOF活性を有するフラクシヨン
を集めることができる。つぎに、これらのフ
ラクシヨンは、C3項に示すような逆相
HPLCまたはC4項に示すようなゲル電気泳
動に付してさらに精製できる。これらのさら
に精製した材料のいずれをも用いることがで
き、使用すべき調製物の量はより少量でよ
い。さらに、C1c項におけるフラクシヨンＦ
２で示される物質はC5項に示すような
DEAEセルロースによる処理に付してもよ
い。DEAEセルロース処理後、非吸着溶液も
本発明の組成物に使用でき、また、カルボキ
シメチルセルロース（CMC）溶出物と同様
な方法でさらに精製できる。すなわち、一般
に、この項で示す精製技術に従つて、カオト
ロピツク剤による抽出、サイズ分別および以
後のDEAEまたはCMCのいずれかによる処
理の組合せによつて適当な調製物を与えるた
めの、充分な精製が行なわれる。その上の精
製工程は任意である。
C1a 脱ミネラル化骨（DMB）の調製 新鮮なウシ中足骨を屠殺場から得、ドラ
イアイスを用いて輸送する。骨から骨髄お
よび非骨組織を除去し、４℃にてミル中で
粉砕する。粉砕骨を骨１Kg当り、再蒸留水
9.4で約15分間づつ２回洗浄し、0.01N塩
酸中、４℃にて一夜洗浄する。洗浄骨を３
容のエタノールで３回、ついで、３容のジ
エチルエーテルで３回脱脂する。各洗浄は
20分間とし、いずれも室温で行なう。得ら
れた脱脂骨粉を、４℃にて0.5N塩酸中
（25／Kg脱脂骨）で脱ミネラル化する。
酸をデカンテーシヨンして除き、得られた
DMBをPHが４以上になるまで洗浄し、
DMBを吸引フイルター上で乾燥する。
C1b 非コラーゲン性蛋白質の抽出 C1a項で調製したDMBを１Kg当り、3.3
の4Mゲアニジン塩酸塩、10ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸（EDTA）、PH6.8、１ｍ
Ｍ PMSF、10ｍＭ NEMで16時間抽出
し、懸濁液を吸引過し、非可溶性物質を
再び４時間抽出する。可溶性フラクシヨン
を合し、アミコン（Amicon）限外過
（10K）ユニツトを用い、少なくとも５倍
濃縮し、濃縮物を４日間、35容の冷脱イオ
ン水に対し、６回変えながら、透析し、凍
結乾燥する。この項の全ての操作は凍結乾
燥を除いて４℃で行ない、凍結乾燥は標準
的な凍結乾燥条件下で行なう。いくつかの
場合には、限外過からの濃縮抽出物を
C1c項のゲル過工程に直接用いる。
C1c ゲル過 C1bからの限外過抽出物または凍結乾
燥物を4Mグアニジン塩酸塩に再溶解し、
4Mグアニジン塩酸塩、0.02％ナトリウム
アジド、10ｍＭ EDTA.PH6.8で平衡させ
たセフアクリルＳ−200カラム上で分画す
る。フラクシヨンを280nｍの吸光度によ
り、また、エライサによる軟骨原性活性
〔サイジンら、ジヤーナル・オブ・セル・
バイオロジー（Seyedin et al.，J.Cell
Biol.）97：1950（1983）〕を検定し、第１
図に示すごとく、フラクシヨンを合する。
最大の活性を有する低分子量（LMW、
10000〜30000ダルトン）蛋白フラクシヨン
で構成される第１図のフラクシヨンＦ２を
脱イオン水180容に対し、６回変えながら
透析し、凍結乾燥する。凍結乾燥を除き、
全ての操作は室温で行なう。
C2 イオン交換クロマトグラフイー C1c項からのフラクシヨンＦ２を6M尿素、
10ｍM.NaCl、１ｍＭ NEM、50ｍＭ酢酸
ナトリウムに溶解し、1000rpｍで５分間遠心
分解する。上澄液を、同じ緩衝液で平衡させ
たCM52（商業的に入手できるCMC）カラム
上で分画する。カラムを、同じ緩衝液中、10
ｍＭ〜400ｍＭ NaClグラジエントを用いて
溶出し、集めたフラクシヨンを、第２図に示
すごとく、280nｍにおける吸光度に基づい
て合する。100〜250ｍＭ NaClの間の溶出
物を４日間、110容の脱イオン水に対し、６
回変えて透析し、凍結乾燥する。前記の全て
の操作は、透析（４℃）を除いて室温で行な
う。
C3 RP−HPLC C2項の凍結乾燥フラクシヨンを0.1％トリ
フルオロ酢酸（TFA）に溶解し、この溶液
の一部をバイダツク（Vydac）C18RP−
HPLCカラム（内径4.6mm×25cm）にのせ、
１ml／分にて５分間、0.1％TFAで洗浄す
る。溶出溶媒は0.1％TFA中、２％／分の割
合の０〜60％アセトニトリル・グラジエント
である。活性物質を含有する２つのピークが
得られる。ピークＡは約29.5分、ピークＢは
約31.3分のところにある。第３図はピークＡ
およびＢの吸光度および電気泳動的特性（還
元および非還元）を示す。
第４図は、ピークＡおよびＢの精製蛋白質
を１、５、20および75nｇ／mlの濃度で用い
て行なつたエライサの結果を示す。これらの
結果は明らかな用量応答を示している。
C4 ゲルによる精製 電気泳動 C2項の凍結乾燥フラクシヨンを、ペイニ
ム、エスおよびチヤルクレイ、アール、アー
カイブズ・オブ・バイオケミストリー・アン
ド・バイオフイジクス（Paynim，S.and
Chalkley，R.，Arch.Bioch.Biophys.）
130：337〜346（1969）の一般的方法を用い、
酢酸−尿素ゲル上での電気泳動により分画す
る。ゲルスライスについてのエライサの結果
を第５表に示す。結果は、RP−HPLCのピ
ークＡおよびＢに匹敵する（ゲルスライス７
および６に相当）。
C5 アニオン交換樹脂による精製処理 C1cからの低分子量蛋白質のフラクシヨン
Ｆ２を6M尿素、20ｍＭリン酸ナトリウム、
PH7.2、20ｍＭ NaClおよびプロテアーゼ阻
害剤を含有する緩衝液に溶解する。ついで、
溶液を、同じ緩衝液で平衡させたDEAEセル
ロースカラムにかける。OFを含有する流出
フラクシヨンを水に対して透析して尿素を除
去し、回収したOFを凍結乾燥する。別法と
して、流出分を0.01N酸塩に対して透析し、
１〜10mg／mlの蛋白濃度で、0.01N塩酸塩中
で保持する。この溶液は数カ月の間安定であ
る。
Ｄ 非繊維性コラーゲンの調製 非繊維性コラーゲンは、商業的に入手できる
溶液状コラーゲン（CIS）、チゲナ（Zygena^）
を用いることにより、商業的な形態で供給でき
る。これは、PH約２の可溶化コラーゲンのアテ
ロペプチド形である。
Ｅ 誘導性組成物の調製 E1 非繊維性コラーゲンのみ 精製OFと混合した非繊維性コラーゲンの
みを含有する組成物を調製するため、0.01N
塩酸中、１〜３mg／mlのCISを、同様に
0.01N塩酸に溶解した部分精製または高度精
製OF（前記Ｃ項に記載）と混合し、最終組成
物中、約10ppmの量となるようにし、４℃で
１〜２時間撹拌する。混合物を水に対して透
析し、凍結乾燥する。
E2 非繊維性コラーゲン＋BCP 小さな割合（％）の非繊維性コラーゲンし
か含有しない組成物を調製するため、１〜３
mg／mlの濃度のCISを骨コラーゲン粉末（前
記米国特許出願第628328号の記載に従つて調
製）と混合し、CISから由来するコラーゲン
の濃度を総コラーゲンの５重量％とする。こ
の混合物に、前記C5で示した部分精製OF
を、精製均質物質に基いて50ppmとなるよう
な量で加える。この混合物を４℃で１〜２時
間撹拌し、水に対して透析し、凍結乾燥す
る。
Ｆ 誘導性移植物の検定 F1 本発明の組成物の移植 E2で得られた凍結乾燥物質を２重量部の
滅菌水で再水和する。再水和した物質を湿潤
重量約80〜100mgのペレツトにする。このペ
レツトをゼラチンカプセルに入れ、ペレツト
を雄ラツトの腹胸域の皮下に移植する。各ラ
ツトには両側部に同じ物質の移植物を移植
し、テストのため移植物は14および28日目に
摘出する。摘出した移植物を、組織学的に、
アルカリ性ホスフアターゼ活性、金属イオン
および軟骨プロテオグリカンについての検定
によりテストした。
移植したラツトの血清についても、移植物
に対する循環抗体についても試験する。
F2 移植物の非免疫原性 28日後に移植物から血清を採取し、エライ
サ法（固相酵素免疫測定法）を用い、移植物
に対する抗体の存在を検定した。マイクロタ
イターのウエルを、20ｍＭ炭酸塩緩衝液
（100）、PH9.6中、組成物の各成分２〜５ｇ
で４℃にて一夜コートする。ウエルを0.05％
ツイーン20界面活性剤含有PBSで３回洗浄
し、未結合抗原を除去する。ついで、ラツト
の血清を２時間添加し、ウエルをPBS−ツ
イ−ン20界面活性剤で３回洗浄する。ワサ
ビ・パーオキシダーゼと結合したヤギ抗ラツ
トIgG（１：2000希釈）を加え、ウエルを室
温で1.5〜２時間インキユベートする。未結
合ラベル抗体をPBS−ツイーン20界面活性
剤で除去し、パーオキシダーゼ基質を加え
る。プレートを室温で30分間インキユベート
し、プレートをスキヤンして光学的密度を調
べる。
未希釈血清を用いても、血清をテストした
ラツトのいずれにおいても抗体を検出できな
かつた。対照はDMBからの粗抽出物（すな
わち、C1bに従つて調製した未分画物質）を
注射したラツトからの、用いたエライサ法に
おいて陽性の血清からなり、高抗体力価を与
える。
F3 移植物の特性−組織学 ７、14および28日後に摘出した移植物を、
10％中性ホルマリン中で26時間固定し、パラ
フイン封埋処理して組織学的に評価する。封
埋された組織から４〜６ミクロンの薄片を取
り、ついで、ヘマトキシリン−エオシンまた
はセフラニン−Ｏで染色する。セフラニン−
Ｏは軟骨プロテオグリカンに対して選択性で
ある。この方法により、全ての移植物は軟骨
プロテオグリカンの存在を示した。
F4 抽出骨成分の検定 E2項において調製したOF含有マトリツク
スを６尾のラツトに移植し、また、陰性対照
として、OFを含有しない同様なマトリツク
スを６尾のラツトに移植した。移植物を14日
および28日後に摘出した。14日の移植物を、
以下のごとく、プロテオグリカンおよびアル
カリ性ホスフアターゼの分析前に抽出し、28
日の移植物をカルシウムイオンの測定に用い
た。
F4a プロテオグリカンの形成 軟骨プロテオグリカンをエライサ法によ
り検定する。移植物を摘出後、直ちに秤量
し、抽出まで−70℃で凍結する。抽出のた
め、移植物をスライスに切断し、テクマ
ー・テイツシユマイザー（Tekmar
Tissuemizer）中、最大セツトで30秒間、
２回、冷抽出緩衝液中で均質化する。抽出
緩衝液は20ｍＭ EDTA、１ｍＭ
PMSFおよび10ｍＭ NEMを含有するPH
5.8の、6Mグアニジン塩酸塩、75ｍＭ酢酸
ナトリウム または4Mグアニジン塩酸塩、
50ｍＭ酢酸である。緩衝液は抽出した移植
物の重量に等しい容量で用い、試料を４℃
で一夜（20時間）インキユベートする。つ
いで、試料を４℃にて12000rpmで１時間
遠心分離し、上澄液を４℃で一夜、50容の
50ｍＭトリス、200ｍＭ NaCl、PH7.4に
対して透析する。透析物を、レナードら、
アーカイブズ・オブ・バイオケミストリ
ー・アンド・バイオフイジオロジー
（Rennard.et.al.，Arch.Biochem.
Biophys）207：399（1980）およびサイジ
ン・エスら、ジヤーナル・オブ・セル・バ
イオロジー（Seyedin，S.et al.，J.
CellBioll.）97：1950（1983）の記載に従
い、ポリスチレン・マイクロプレート〔フ
ロー・ラボラトリーズ、マクリーン、バー
ジニア（Flow Laboratories，McClean，
Virginia）〕を用いて行なうエライサに付
す。前記サイジン・エスらによる記載に従
つて、スウオーム（Swarm）ラツト軟骨
肉腫組織から抗血清およびプロテオグリカ
ン標準を調製する。ヤギ抗ウサギ1gGに結
合したワサビ・パーキオキシダーゼを二次
抗体として用い、試料をPBS0.05％、ツイ
ーン20 １mg／mlBSAの別々の溶液中で検
定し、シユーアースら、クリニカ・シミカ
（Shuures，et al.，Clin.Chim.）81：１
（1977）に記載される阻害エライサを用い
て定量する。
OFを含有する移植物は490±30mg／ｇ湿
潤組織のプロテオグリカン含量を、OFを
含有しない移植物は35±５mg／ｇ湿潤組織
のみを示した。
F4b 可抽出性カルシウム 骨の形成もカルシウムの測定により評価
する。
移植物を小片に切断し、１：10（ｍ／ｖ）
および１：20（ｍ／ｖ）の0.5N塩酸に懸濁
し、イオンを溶解する。試料を室温でさら
に５日間インキユベートし、12000rpmで
40分間遠心分離する。上澄液のカルシウム
濃度を原子吸光〔トレイス・アナリシス・
ラボラトリー、ヘイワード、カリフオルニ
ア（Trace Analysis Laboratory、
Hayward、California）により測定し、
30±５mg／ｇ湿潤組織であることが判明し
た。
F4c アルカリ性ホスフアターゼの分析 アルカリ性ホスフアターゼ（AP）の測
定のため、移植物を小片に切断し、３mlの
氷冷1.5M NaCl、３ｍＭ NaCO3、PH7.5
中で均質可する。均質化試料を12000rpm
で４℃にて50分間遠心分離し、上澄液の一
部を冷蒸留水中で１：10に希釈する。フギ
ンスら、ジヤーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メジシン（Huggins，et al.，J.
Exp.Med.）114：761（1961）の方法を用
い、ポリスチレン・プレートを用いてアル
カリ性ホスフアターゼを評定する。初めか
らOFを含有する移植物は湿潤組織１ｇ当
り17±5APユニツトを示し、OFを含有し
ない移植物はAP活性を示さなかつた。
【図面の簡単な説明】
第１図はDMB抽出物のセフアクリルＳ−200
分画におけるクロマトグラム、第２図はCMC分
画によるLMW蛋白質フラクシヨンのクロマトグ
ラム、第３図は第２図のCMCカラムからの100〜
250ｍＭ NaClフラクシヨンについて行なつた
RP−HPLCの吸光度および電気泳動の結果を示
すグラフ、第４図は第３図のRP−HPLCで得ら
れた活性成分のエライサの結果を示すグラフ、第
５図は第２図に示すCMCからの100〜250ｍＭ
NaCl溶出物の電気泳動で得られたゲル・フラク
シヨンのエライサ結果を示すグラフである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 異種宿主において低免疫原性であるに充分な
    純度の、骨から由来する蛋白質骨誘導性因子
    （OF）の骨誘導性有効量と、異種宿主において低
    免疫原性の、少なくとも５重量％の非繊維性コラ
    ーゲンを含有する担体を混合してなる脊椎動物に
    おける骨修復に有効な移植用低免疫原性組成物。 ２ OFが移植物の約1ppm〜1000ppmを構成する
    前記第１項の組成物。 ３ 担体が少なくとも10重量％の非繊維性コラー
    ゲンを含有する前記第１項の組成物。 ４ 非繊維性コラーゲンがアテロペプチド・コラ
    ーゲンである前記第１項の組成物。 ５ 非繊維性コラーゲンが溶液状コラーゲンとて
    し与えられる前記第１項の組成物。 ６ 担体が95％を超えない量の骨コラーゲン粉末
    を含有する前記第１項の組成物。 ７ 担体が95％を超えない量のヒドロキシアパタ
    イトを含有する前記１項の組成物。 ８ 担体が合計で95％を超えない量の骨コラーゲ
    ン粉末およびヒドロキシアパタイトを含有する前
    記第１項の組成物。 ９ OFが、骨のカオトロピツク抽出物のモレキ
    ユラー・シーブスによる処理での分子量30000以
    下のフラクシヨンの単離を包含する方法により調
    製される前記第１項の組成物。 １０ OFが、DEAEセルロースにより処理し、
    非結合フラクシヨンを利用することにより、さら
    に精製される前記第９項の組成物。 １１ OFが、該フラクシヨンをカチオン交換樹
    脂に吸着させ、フラクシヨンを回収してさらに精
    製される前記第９項の組成物。 １２ OFがHPLCにより、さらに精製されてい
    る前記第１１項の組成物。 １３ OFがゲル電気泳動により、さらに精製さ
    れている前記第１１項の組成物。
JP60234381A 1984-10-24 1985-10-19 誘導性コラ−ゲン・ベ−ス骨修復調製物 Granted JPS6216421A (ja)

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