JPH0558606B2 - - Google Patents
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- JPH0558606B2 JPH0558606B2 JP62092963A JP9296387A JPH0558606B2 JP H0558606 B2 JPH0558606 B2 JP H0558606B2 JP 62092963 A JP62092963 A JP 62092963A JP 9296387 A JP9296387 A JP 9296387A JP H0558606 B2 JPH0558606 B2 JP H0558606B2
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- stimulation
- bone
- ohc
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Description
(1) 緒言
本発明は軟骨細胞および骨芽細胞を刺激するオ
セインヒドロキシアパタイトコンパウンド
（OHC）に関する。さらに本発明はOHCを製造
する方法に関する。本発明はさらに変形性関節症
および骨粗鬆症の予防および治療、並びに骨折、
軟骨欠損および骨欠損の治癒をするための、殊に
経口投与用の製剤組成物に対するOHCの使用に
関する。 (2) 発明の背景 コルチコステロイド療法に基く骨粗鬆症の予防
に対する微結晶ヒドロキシアパタイト組成物
（MCHC）が既に知られている；ピネル（A.
Pines）ほか、カーレント・メデイカル・リサー
チ・アンド・オピニオン（Current Medical
Research and Opinion）、８巻、10号、1984、
734〜742頁参照。該組成物はヒドロキシアパタイ
トとリン酸カルシウムとの複合塩約50重量％を含
む。それはさらに約26％のコラーゲンおよび約９
％の非コラーゲン性タンパク質／ペプチドを含有
する。さらにそれは約0.05％のナトリウム並びに
マグネシウムおよびカリウム、並びに微量元素と
してフツ素、亜鉛、ストロンチウム、ケイ素、
鉄、ルビジウム、セシウムおよび白金を含有す
る。最後に該組成物はグリコサミノグリカン類、
クエン酸塩および水を含有する。MCHCの製法
については何も知られていない。 (3) 発明の概要 本発明の目的はオセインヒドロキシアパタイト
コンパウンド（OHC）およびその製造方法を提
供することである。他の目的はOHCを含有し、
軟骨細胞および骨芽細胞の刺激（増殖）に、従つ
て変形性関節症および骨粗鬆症の予防および治
療、並びに骨折、軟骨欠損および骨欠損の治癒に
適する製剤組成物を提供することである。 OHCは、有機成分を非変質状態で、また無機
成分を生理的均衡割合で含有するので、骨および
軟骨の代謝に対し特異的効果を有することが認め
られた。OHCの投与はヒトおよび動物生体に骨
格系に必須の物質（非コラーゲン性の骨特異的ペ
プチド、局所活性の骨および軟骨細胞調整因子、
カルシウムおよびリン酸塩）が供給されることを
保証する。OHCはコラーゲン並びに必須の骨特
異的非コラーゲン性ペプチドおよびプロテオグリ
カンの有機オセインマトリツクスで骨代謝を支持
し、骨再生を促進し、オセインマトリツクス中に
包埋されるヒドロキシアパタイトの無機成分の骨
中のとり込みを高める。さらに、OHCは身体軟
骨修復機構を刺激し、軟骨組成を変質から保護す
る。 OHCは、骨組織の生成に関与する細胞である
骨芽細胞の特有の生物学的作用を示す。OHCは
骨芽細胞の増殖および代謝を増強し、さらに非特
異的間葉細胞の軟骨芽細胞または骨芽細胞への分
化を促進する。従つて、OHCは異なる起源の骨
疾患、例えば一次および二次骨粗鬆症における、
並びに骨折および骨欠損の治癒における、並びに
プロテーゼの最適化に対する新治癒薬である。そ
れは記載する細胞生物学特性から明らかであり、
OHCが従来のカルシウム製剤および全骨粉より
著しく優れていることは動物において生体内薬理
学的およびヒトにおいて臨床的に確認された。
OHCは骨吸収を抑制するだけでなく何よりも骨
成長を促進するので、OHCは骨粗鬆症に対する
治療製品内の純骨吸収抑制剤例えばエストロゲン
およびカルシトニンに対する真の代替物を提供す
る。OHCは、それが生ずる副作用が著しく少な
く例えば胃腸の副作用、関節の痛みがない事実に
より同様に骨代謝を刺激する現存治療製品例えば
フツ化ナトリウムおよびジホスホナート類とは区
別される。ジホスホナート類は非常に狭い治療範
囲を有するがDHCは事実上無毒性である。 さらに、OHCは軟骨組織の形成および吸収に
関与する軟骨細胞に対して生物学的作用を及ぼ
す。この表現型の損失なく軟骨細胞はOHCによ
り増殖およびその代謝の増加を刺激され、並ひに
医原性病毒例えばコルチコステロイドから保護さ
れる。さらに、OHCは軟骨細胞に対する非特異
的間葉細胞の分化を促進し、従つて、軟骨細胞の
再生に主要役割を果す過程である軟骨様化生を促
進する。 従つてOHCは、軟骨細胞の数およびそれらの
代謝活性の低下があり、また軟骨の再生が適切な
軟骨様化生を要求する変形性関節生の治療に顕著
に有用である。OHCはさらに骨粗鬆症の治療、
並びに骨折並びに骨および軟骨の欠損の治癒の支
持に適する。 OHCの生物学的活性は試験管内で、例えば次
のように確認することができる、 (a) 骨芽細胞、軟骨細胞および線維芽細胞の
DNA合成の刺激、 (b) 軟骨細胞および線維芽細胞のタンパク質合成
の刺激、 (c) 全タンパク質合成の刺激に比べて、軟骨細胞
のコラーゲン全合成の選択的刺激、 (d) 軟骨細胞中のタンパク質ｖおよびｙの合成の
誘発、 (e) 非特異的間葉細胞の軟骨細胞または骨芽細胞
への分化の促進。 コラーゲン全合成の刺激において、コラーゲン
型およびの割合は軟骨細胞培養中24時間不変
のままであり、それにより軟骨細胞の表現型をこ
の時間にわたつて保持する。 DNA合成に対する生物学的効果は普通に使用
される方法で、細胞系例えば3T3線維芽細胞によ
る3−チミジンとり込み刺激の測定により決定さ
れる：ジメネズ・ド・アスナ（Jimenez de
Asua）ほか、プロシーデイング・オブ・ザ・ナ
シヨナル・アカデミー・オフ・サイエンス
（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）、72巻（1975）、2724
〜2728頁参照。これはマイトジエン物質の確認に
普通に使用される生物学的方法である。細胞系は
培養が容易であるので細胞系をこの確認法に用い
ることが有利である。 この試験法は細胞培養中の非形質転換線維芽細
胞が２極端成長状態を示すことの考察に基く。静
止状態において細胞はG0〜Ｇ期にあり、従つて
分裂しない。さらに活性増殖の状態が存在する。
静止状態から増殖状態への転移は必須栄養、血清
または他の成長促進因子の濃度により調整するこ
とができる。OHCはそのような成長促進因子を
含有する。後者は中性緩衝生理溶媒例えばリン酸
塩緩衝食塩水（PBS）または生理食塩水に可溶
性であり、それらは静止3T3線維芽細胞による
3H−チミジンの高刺激性用量関連とり込みに影
響を与える。 ガンマ線の照射による食品および製剤調整物の
滅菌にしばしば使用される方法は、3T3線維芽細
胞の3H−チミジンとり込みに対する刺激効果に
より測定してOHCの生物学的活性を低下しない。 この試験系はまた骨芽細胞のDNA合成の細胞
特異的刺激の測定に使用できる。ラツト頭蓋冠か
ら逐次酵素消化により得られる骨芽細胞集団が使
用される。骨芽細胞集団は骨芽細胞の成熟におけ
る種々の段階を示し、集団１〜は前骨芽細胞型
であると、集団〜は骨芽細胞型と、また集団
Ｌは静止骨芽細胞型細胞または骨細胞とみなされ
る。 中性可溶化のOHC成分は集団およびの骨
芽細胞に対する用量依存性刺激効果を有する。平
行して検定したラツト線維芽細胞の初代培養の増
殖は刺激されない。これらの試験結果から推論す
ると中性可溶化OHC成分は骨細胞特異的活性を
示すであろう。 タンパク質合成に対する生物学的効果は普通に
使用される方法で、細胞例えば3T3線維芽細胞の
ような細胞系、またはヒト包皮線維芽細胞のＬ−
（５−3H）−プロリンとり込みの刺激を測定する
ことにより決定される。この方法は刺激された細
胞のタンパク質合成が増殖するとの考察に基く。
Ｌ−（５−3H）−プロリンが細胞培地中の刺激細
胞に提供されると、細胞はそれを新合成タンパク
質中へとり込む。設定インキユベーシヨン期間
後、刺激効果は尺度である放射能とり込み量を測
定する。OHCは3T3線維芽細胞およびヒト包皮
線維芽細胞中のタンパク合成に高刺激、用量依存
性効果を与える中性可溶化成分を含む。 アルカリ性ホスフアターゼ検定はドイツ臨床化
学会（Deutsche Gesellschaft fu¨r Klinische
Chemie）、ツアイトシユリフト・フユア・クリニ
ツエ・ヘミー・ウント・クリニツシユ・バイオヘ
ミー（Z.klin. Chem.and Klin，Biochem.）、８
巻（1970）、658；９巻（1971）、464；および10巻
（1972）、182により推奨された方法により行なわ
れる。ホスフアターゼ活性は本発明の方法におい
て各段階で品質制御のために検定される。 表には分析により測定されたOHCの組成
（約150バツチから得た値）が総括される。
セインヒドロキシアパタイトコンパウンド
（OHC）に関する。さらに本発明はOHCを製造
する方法に関する。本発明はさらに変形性関節症
および骨粗鬆症の予防および治療、並びに骨折、
軟骨欠損および骨欠損の治癒をするための、殊に
経口投与用の製剤組成物に対するOHCの使用に
関する。 (2) 発明の背景 コルチコステロイド療法に基く骨粗鬆症の予防
に対する微結晶ヒドロキシアパタイト組成物
（MCHC）が既に知られている；ピネル（A.
Pines）ほか、カーレント・メデイカル・リサー
チ・アンド・オピニオン（Current Medical
Research and Opinion）、８巻、10号、1984、
734〜742頁参照。該組成物はヒドロキシアパタイ
トとリン酸カルシウムとの複合塩約50重量％を含
む。それはさらに約26％のコラーゲンおよび約９
％の非コラーゲン性タンパク質／ペプチドを含有
する。さらにそれは約0.05％のナトリウム並びに
マグネシウムおよびカリウム、並びに微量元素と
してフツ素、亜鉛、ストロンチウム、ケイ素、
鉄、ルビジウム、セシウムおよび白金を含有す
る。最後に該組成物はグリコサミノグリカン類、
クエン酸塩および水を含有する。MCHCの製法
については何も知られていない。 (3) 発明の概要 本発明の目的はオセインヒドロキシアパタイト
コンパウンド（OHC）およびその製造方法を提
供することである。他の目的はOHCを含有し、
軟骨細胞および骨芽細胞の刺激（増殖）に、従つ
て変形性関節症および骨粗鬆症の予防および治
療、並びに骨折、軟骨欠損および骨欠損の治癒に
適する製剤組成物を提供することである。 OHCは、有機成分を非変質状態で、また無機
成分を生理的均衡割合で含有するので、骨および
軟骨の代謝に対し特異的効果を有することが認め
られた。OHCの投与はヒトおよび動物生体に骨
格系に必須の物質（非コラーゲン性の骨特異的ペ
プチド、局所活性の骨および軟骨細胞調整因子、
カルシウムおよびリン酸塩）が供給されることを
保証する。OHCはコラーゲン並びに必須の骨特
異的非コラーゲン性ペプチドおよびプロテオグリ
カンの有機オセインマトリツクスで骨代謝を支持
し、骨再生を促進し、オセインマトリツクス中に
包埋されるヒドロキシアパタイトの無機成分の骨
中のとり込みを高める。さらに、OHCは身体軟
骨修復機構を刺激し、軟骨組成を変質から保護す
る。 OHCは、骨組織の生成に関与する細胞である
骨芽細胞の特有の生物学的作用を示す。OHCは
骨芽細胞の増殖および代謝を増強し、さらに非特
異的間葉細胞の軟骨芽細胞または骨芽細胞への分
化を促進する。従つて、OHCは異なる起源の骨
疾患、例えば一次および二次骨粗鬆症における、
並びに骨折および骨欠損の治癒における、並びに
プロテーゼの最適化に対する新治癒薬である。そ
れは記載する細胞生物学特性から明らかであり、
OHCが従来のカルシウム製剤および全骨粉より
著しく優れていることは動物において生体内薬理
学的およびヒトにおいて臨床的に確認された。
OHCは骨吸収を抑制するだけでなく何よりも骨
成長を促進するので、OHCは骨粗鬆症に対する
治療製品内の純骨吸収抑制剤例えばエストロゲン
およびカルシトニンに対する真の代替物を提供す
る。OHCは、それが生ずる副作用が著しく少な
く例えば胃腸の副作用、関節の痛みがない事実に
より同様に骨代謝を刺激する現存治療製品例えば
フツ化ナトリウムおよびジホスホナート類とは区
別される。ジホスホナート類は非常に狭い治療範
囲を有するがDHCは事実上無毒性である。 さらに、OHCは軟骨組織の形成および吸収に
関与する軟骨細胞に対して生物学的作用を及ぼ
す。この表現型の損失なく軟骨細胞はOHCによ
り増殖およびその代謝の増加を刺激され、並ひに
医原性病毒例えばコルチコステロイドから保護さ
れる。さらに、OHCは軟骨細胞に対する非特異
的間葉細胞の分化を促進し、従つて、軟骨細胞の
再生に主要役割を果す過程である軟骨様化生を促
進する。 従つてOHCは、軟骨細胞の数およびそれらの
代謝活性の低下があり、また軟骨の再生が適切な
軟骨様化生を要求する変形性関節生の治療に顕著
に有用である。OHCはさらに骨粗鬆症の治療、
並びに骨折並びに骨および軟骨の欠損の治癒の支
持に適する。 OHCの生物学的活性は試験管内で、例えば次
のように確認することができる、 (a) 骨芽細胞、軟骨細胞および線維芽細胞の
DNA合成の刺激、 (b) 軟骨細胞および線維芽細胞のタンパク質合成
の刺激、 (c) 全タンパク質合成の刺激に比べて、軟骨細胞
のコラーゲン全合成の選択的刺激、 (d) 軟骨細胞中のタンパク質ｖおよびｙの合成の
誘発、 (e) 非特異的間葉細胞の軟骨細胞または骨芽細胞
への分化の促進。 コラーゲン全合成の刺激において、コラーゲン
型およびの割合は軟骨細胞培養中24時間不変
のままであり、それにより軟骨細胞の表現型をこ
の時間にわたつて保持する。 DNA合成に対する生物学的効果は普通に使用
される方法で、細胞系例えば3T3線維芽細胞によ
る3−チミジンとり込み刺激の測定により決定さ
れる：ジメネズ・ド・アスナ（Jimenez de
Asua）ほか、プロシーデイング・オブ・ザ・ナ
シヨナル・アカデミー・オフ・サイエンス
（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）、72巻（1975）、2724
〜2728頁参照。これはマイトジエン物質の確認に
普通に使用される生物学的方法である。細胞系は
培養が容易であるので細胞系をこの確認法に用い
ることが有利である。 この試験法は細胞培養中の非形質転換線維芽細
胞が２極端成長状態を示すことの考察に基く。静
止状態において細胞はG0〜Ｇ期にあり、従つて
分裂しない。さらに活性増殖の状態が存在する。
静止状態から増殖状態への転移は必須栄養、血清
または他の成長促進因子の濃度により調整するこ
とができる。OHCはそのような成長促進因子を
含有する。後者は中性緩衝生理溶媒例えばリン酸
塩緩衝食塩水（PBS）または生理食塩水に可溶
性であり、それらは静止3T3線維芽細胞による
3H−チミジンの高刺激性用量関連とり込みに影
響を与える。 ガンマ線の照射による食品および製剤調整物の
滅菌にしばしば使用される方法は、3T3線維芽細
胞の3H−チミジンとり込みに対する刺激効果に
より測定してOHCの生物学的活性を低下しない。 この試験系はまた骨芽細胞のDNA合成の細胞
特異的刺激の測定に使用できる。ラツト頭蓋冠か
ら逐次酵素消化により得られる骨芽細胞集団が使
用される。骨芽細胞集団は骨芽細胞の成熟におけ
る種々の段階を示し、集団１〜は前骨芽細胞型
であると、集団〜は骨芽細胞型と、また集団
Ｌは静止骨芽細胞型細胞または骨細胞とみなされ
る。 中性可溶化のOHC成分は集団およびの骨
芽細胞に対する用量依存性刺激効果を有する。平
行して検定したラツト線維芽細胞の初代培養の増
殖は刺激されない。これらの試験結果から推論す
ると中性可溶化OHC成分は骨細胞特異的活性を
示すであろう。 タンパク質合成に対する生物学的効果は普通に
使用される方法で、細胞例えば3T3線維芽細胞の
ような細胞系、またはヒト包皮線維芽細胞のＬ−
（５−3H）−プロリンとり込みの刺激を測定する
ことにより決定される。この方法は刺激された細
胞のタンパク質合成が増殖するとの考察に基く。
Ｌ−（５−3H）−プロリンが細胞培地中の刺激細
胞に提供されると、細胞はそれを新合成タンパク
質中へとり込む。設定インキユベーシヨン期間
後、刺激効果は尺度である放射能とり込み量を測
定する。OHCは3T3線維芽細胞およびヒト包皮
線維芽細胞中のタンパク合成に高刺激、用量依存
性効果を与える中性可溶化成分を含む。 アルカリ性ホスフアターゼ検定はドイツ臨床化
学会（Deutsche Gesellschaft fu¨r Klinische
Chemie）、ツアイトシユリフト・フユア・クリニ
ツエ・ヘミー・ウント・クリニツシユ・バイオヘ
ミー（Z.klin. Chem.and Klin，Biochem.）、８
巻（1970）、658；９巻（1971）、464；および10巻
（1972）、182により推奨された方法により行なわ
れる。ホスフアターゼ活性は本発明の方法におい
て各段階で品質制御のために検定される。 表には分析により測定されたOHCの組成
（約150バツチから得た値）が総括される。
【表】
【表】
(4) 発明の説明
本発明によれば次の工程がOHCの製造に行な
われる： 初めに公認獣医により検査された胎児〜約12月
令の哺乳動物から骨をとり出す。とり出した後、
清浄な骨を速やかに冷凍し、必要になるまで約−
20〜−30℃で保存する：第１図、囲枠１参照。そ
の後緒する前に骨を検査し、それがなお新鮮であ
ることを調べる、それはその臭および色により決
定することができる。骨はまた検査してそれが清
浄であり実際に必要な骨であることを調べる。必
要であれば骨は大きさおよび形状について家畜の
解剖学マニユアルに対して検査す。残存する肉、
腱および軟骨もまた除去する。 動物のアイデンテイテイについて疑いがあれ
ば、種もまた通常の免疫反応例えば沈降の助けに
より決定することができる。 次いで骨を粉砕機中で最大約１cmの粒径に粉砕
する（第１図、囲枠２参照）。骨粒子は次いでそ
の残留成分が最大約10％、または約10〜25％にな
るまで減圧下に20〜80℃で乾燥する（第１図、囲
枠３ａおよび３ｂ参照）。得られた骨物質を次に
酸例えば演算、リン酸、酢酸、ギ酸またはクエン
酸を用いて約5.0〜5.5のPHにする。次に骨物質を
親水性かつ親油性溶媒を用いて約５％の最大残留
水分および残留脂肪含量に脱水、脱脂するか、ま
たは初めに親水性溶媒を用いて20〜80℃で約５％
の最大残留水分に脱水し次いで親油性溶媒を用い
て20〜80℃で最大約５％の残留脂肪含量に脱脂す
る（第１図、囲枠４ａおよび４ｂ参照）。 生じた脱水、脱脂した骨物質を次にさらに減圧
下に20〜80℃で、例えば渦流で、約１％の最大溶
媒含量に達するまで乾燥する（第１図、囲枠５参
照）。 意図する用途により得られた骨物質は次いで常
法で粉砕および篩別機中で約50〜300ミクロンの
種々の粒径の粉末に粉砕する（第１図、囲枠６参
照）。 骨物質中の微生物の数が約10000毎グラムを越
えれば、骨物質を常法で、例えばそれをエチレン
オキシドで処理するかまたはガンマ線で照射する
ことにより滅菌する（第１図、囲枠１０〜１２参
照）。製剤薬物の製造に適するOHCが得られる
（第１図、囲枠１３参照）。 本発明の方法の他の様式において、上記哺乳動
物の骨を約１cmの最大粒径に、例えば粉砕機中で
粉砕する（第２図、囲枠２参照）。骨の粒子は次
に酸でPH5.0〜5.5にする。次にそれを親水性かつ
親油性溶媒を用いて約５％の最大残留水分および
脂肪含量に脱水、脱脂するか、または初めに親水
性溶媒で20〜80℃において約５％の最大残留水分
に脱水し次に親油性溶媒で20〜80℃において約５
％の最大残留脂肪含量に脱脂する（第２図、囲枠
３ａおよび３ｂ参照）。 次いで生じた脱水、脱脂した骨物質をさらに減
圧下に−20〜80℃で、例えば渦流で、約１％の最
大溶媒含量が達成されるまで乾燥する（第２図、
囲枠４参照）。必要であれば骨物質をさらに上記
のように処理することができる（第２図、囲枠５
〜１１参照）。製剤薬物の製造に適するOHCが得
られる（第２図、囲枠１２）。 上記のように本発明の方法に使用する好ましい
骨は長骨例えば上腕骨、大腿骨、脛骨、橈骨およ
び尺骨、中手骨または中足骨である。さらに仔牛
（Bos taurus）から骨の好ましく使用される。 生成物が変質するのを防ぐために、その場合に
も水分および溶媒含量だ低下すると乾燥および脱
脂温度を低下させることが必要であることは明ら
かである。既に言及したように80℃の最高温度が
脱水および乾燥に使用される。水および溶媒含量
が低下すると温度を低下させ、操作を非常に速や
かに行なう。 脱水および乾燥操作中、圧力は最大約400ミリ
バールである。 適当な親油性溶媒の典型的な例はアセトン、ト
リクロロエチレン、塩化メチレンおよび低沸点石
油エーテルである。適当な親水性溶媒の典型的な
例はアセトン、エタノールおよびイソプロパノー
ルである。 生じたOHCは常法で経口投与用製剤製品、例
えば顆粒、フイルムコーテイング錠、カプセル、
コーテイング丸剤、粉末または懸濁液に調製する
ことができる。一日量は0.6〜10ｇで２〜３回の
個々の用量に分割される。用量の単位は200〜
4000mgである。 顆粒の製造には、OHCは充填剤および矯味料
を混合し、水で濡らし、粒化し、乾燥する。 フイルムコーテイング錠の製造には、OHCを
湿り状態で粒化し、乾燥し、次いでふるいにかけ
る。流展剤（flowance agent）、滑沢剤および崩
解剤が配合される。成形準備のできた混合物を錠
剤にし、次に薄い有色ラツカーで被覆する。 コーテイング丸剤の製造には、OHCを湿り状
態で粒化し、乾燥し、ふるいにかける。次いで通
常の錠剤化補助剤を加え、村剤核を形成させる。
核を分離し、白色トツプコートを与え、着色し、
つや出しする。 粉末の製造には、OHCを皮殻で覆われた粒子
に加工し芳香をつけ、ふるいにかける。 懸濁液の製造には、OHCを粘度を高める補助
剤とともに糖蜜中に懸濁させる。懸濁液を着色
し、芳香をつけ、次いで保存する。 第１図は実施例１におけるようにOHCを製造
する図式を示し、 第２図は実施例２におけるようにOHCを製造
する図式を示し、 第３図はOHC抽出物による3T3線維芽細胞中
の3H−チミジンのとり込み刺激を示す。横軸は
OHC抽出物の濃度をμ／ml−培地で示す。縦
軸は3H−チミジンのとり込みをcpm×104で示
す。バーは９個の測定値の平均値に対する標準偏
差を示す。相関係数は、0.917。 第４図はウシ胎児血清（…）およびOHC成分
（−）による3T3線維芽細胞中のＬ−（５−3H）−
プロリンとり込みの刺激を示す。横軸は試験した
資料中の濃度をμ／ml−培地で示し、縦軸はＬ
−（５−3H）−プロリンのとり込みをcpm×103で
示す。 第５図はウシ軟骨細胞中の3H−チミジンとり
込みの刺激をOHC34／４の用量を関数として示
す。横軸は試験した試料中の濃度をμ／ml−培
地で、縦軸は3H−チミジンとり込みをcpm×104
で示す。 第６図は単層培養中の軟骨細胞のコラーゲン合
成の刺激および全タンパク質をOHC濃度の関数
として示す。横軸は用いた活性検定タンパク質の
料、μｇ毎ml−培地を示す。縦軸は核培養バツチ
に対するそれぞれ新合成タンパク質Ｘ−Ｘおよび
コラーゲンＯ…Ｏの量、μｇを示す。 第７図は全タンパク質中のコラーゲン含量の増
加パーセントをOHC用量の関数として示す。 第８図は照射および非照射OHC抽出物による
3T3線維芽細胞中の3H−チミジンとり込みの刺
激を示す。照射OHC抽出物は690μｇ／mlのタン
パク質含量を示す（−）。非照射OHC抽出物は
670μｇ／mlのタンパク質含量を示す（…）。横軸
はOHC抽出物の濃度をμｇ／2.5ml−培地で示
す。縦軸は3H−チミジンのとり込みをcpmで示
す。 第９図はレンコル〔Lencoll.（登録商標）〕、レ
ンホス〔Lenphos（登録商標）〕、レンソル
〔Lensol（登録商標）〕、レンソル凝集体
（Lensolagglomerated）、オス・プルビツト
（Oss Pulvit）、ミツビシ・クツキー（Mitsubishi
Cookies）、オステオトロフイツク・コンセント
レート、カンゾカル（Canzocal）、PMCおよび
OHCによる3T3線維芽細胞上の3H−チミジンと
り込みの刺激を示す。横軸は試験した試料中の濃
度をμｇ／ml−培地で示し、縦軸は3H−チミジ
ンとり込みをcpmで示す。 調べた細胞生物学系中、単にCHCおよびPMC
並びにレンコル（登録商標）のみが活性である。 調査した生成物各１ｇをPBS10mlで抽出し、
遠心分離上澄みの一部を試験した。 第１０図はビタミンD2、グルコン酸カルシウ
ムによる、およびOHCによる処置14月後の骨皮
質厚さの変化率を示す。ビタミンD2と比較する
とOHCを用いたときに11.6％の増加がある。 第１１図は２年の期間にわたりOHCで処置し
か患者（−）および対照（…）中の橈骨鉱物含量
BMCの平均変化をｇ／mlで示す。標準偏差がバ
ーにより示されている。 第１２図は２年の期間OHCで処置した患者
（−）および対照（…）中の海綿質
（trabecularbone）体積（TBV）および腸骨稜の
皮質厚さ（CPT）の平均変化を示す。標準偏差
がバーにより示されている。 第１３図中縦軸は3H−チミジンとり込みを
cpmで示し、横軸は調べた試料の濃度をμｇ／
200μ−培地で示す。 本発明は実施例により一層詳細に例示される。 実施例 １ OHCの製造（方法１） 約３月令の仔牛（boa taurus）の長骨（上腕
骨、大腿骨、脛骨、橈骨および尺骨、中手骨およ
び中足骨）を出発物質としてOHCの製造に用い
る。 動物は公認獣医により検査される。次いでそれ
を屠殺して骨をとり出す。骨をとり出した後清浄
な骨を速やかに冷凍し、後の処理まで−20〜−30
℃で貯蔵する：第１図、囲枠１参照。 それを後に後する前に、骨と新鮮さ（その臭お
よび色により識別できる）、清浄さについて検査
し、それが真に必要な骨であることを確認すく。
肉、腱および軟骨残留物を除去する。 方法の第１段階において凍結骨1600Kg（１バツ
チ）を20mm網目を有するステンレス鋼製粉砕機中
で粉砕する。粉砕した骨の粒子の大きさは約１cm
である。骨の温度は粉末中０℃以下に維持され
る；第１図、囲枠２参照。 次いで粉砕骨をステンレス骨羽根付乾燥器中で
0.97〜0.98バールの圧力で脱水する。熱水は初め
約90℃の温度であり、乾燥の過程中に約40℃に低
下される。それ以上水が凝集物捕修器中へ留去し
なくなると（乾燥開始後約10時間）、加熱を中止
し骨組成物をさらに減圧下に、残留水分が最大約
10％（第１図、囲枠３ａ参照）または10〜25％
（第１図、囲枠３ｂ）になるまで乾燥する。この
後者の乾燥操作における骨組成物の温度は40℃を
越えてはならない。 次いで乾燥骨組成物をクエン酸でPH5.0〜5.5に
する。次に乾燥骨組成物を再度80〜20℃で脱水
し、脂質を除去する。このためアセトンを親水性
かつ親油性溶媒として用いるか、または乾燥骨組
成物を初めに20〜80℃の温度においてアセトン
で、次に第２操作で20〜80℃においてトリクロロ
エチレンを用いて脱脂する。残留水分および残留
脂肪含量が最大５％である骨組成物が得られる
（第１図、囲枠４ａおよび４ｂ参照）。次いで溶媒
残留物を渦流で20〜80℃、90ミリバールで除去す
る。残留溶媒含量は約１％である（第１図、囲枠
５参照）。 生じた骨組成物をハンマーミル中で２×20mmス
ロツト付ふるい中で粉砕し、上部ふるいが2.4mm
の網目大きさを有し、下部ふるいが0.34mmの網目
大きさを有する篩別機でふるう。2.4mmふるい上
に保持される物質は廃棄し、0.34mmふるいを通つ
たものは後に使用される。0.8mm目網を挿入した
粉砕機中で再度粉砕し、0.74mmの網目大きさを有
するふるいと0.34mmの網目を有するふるいを有す
る篩別機でふるう。0.74mmふるい上に保持される
物質を廃棄する。0.34mmふるいを通つた物質を捕
集し、再度0.8mm目網を挿入した粉砕機中で粉砕
する。次いで上記のようにふるいにかける。最後
に粉末を捕集し、0.25mmの網目大きさを有するふ
るいを用いて篩別け、0.5mm目網を挿入した粉砕
機中で粉砕する。次いで全粉末を0.25mmの網目大
きさのふるいに通す（第１図、囲枠６参照）。 表は生じたOHC粉末の分析値の摘要をる示
す。
われる： 初めに公認獣医により検査された胎児〜約12月
令の哺乳動物から骨をとり出す。とり出した後、
清浄な骨を速やかに冷凍し、必要になるまで約−
20〜−30℃で保存する：第１図、囲枠１参照。そ
の後緒する前に骨を検査し、それがなお新鮮であ
ることを調べる、それはその臭および色により決
定することができる。骨はまた検査してそれが清
浄であり実際に必要な骨であることを調べる。必
要であれば骨は大きさおよび形状について家畜の
解剖学マニユアルに対して検査す。残存する肉、
腱および軟骨もまた除去する。 動物のアイデンテイテイについて疑いがあれ
ば、種もまた通常の免疫反応例えば沈降の助けに
より決定することができる。 次いで骨を粉砕機中で最大約１cmの粒径に粉砕
する（第１図、囲枠２参照）。骨粒子は次いでそ
の残留成分が最大約10％、または約10〜25％にな
るまで減圧下に20〜80℃で乾燥する（第１図、囲
枠３ａおよび３ｂ参照）。得られた骨物質を次に
酸例えば演算、リン酸、酢酸、ギ酸またはクエン
酸を用いて約5.0〜5.5のPHにする。次に骨物質を
親水性かつ親油性溶媒を用いて約５％の最大残留
水分および残留脂肪含量に脱水、脱脂するか、ま
たは初めに親水性溶媒を用いて20〜80℃で約５％
の最大残留水分に脱水し次いで親油性溶媒を用い
て20〜80℃で最大約５％の残留脂肪含量に脱脂す
る（第１図、囲枠４ａおよび４ｂ参照）。 生じた脱水、脱脂した骨物質を次にさらに減圧
下に20〜80℃で、例えば渦流で、約１％の最大溶
媒含量に達するまで乾燥する（第１図、囲枠５参
照）。 意図する用途により得られた骨物質は次いで常
法で粉砕および篩別機中で約50〜300ミクロンの
種々の粒径の粉末に粉砕する（第１図、囲枠６参
照）。 骨物質中の微生物の数が約10000毎グラムを越
えれば、骨物質を常法で、例えばそれをエチレン
オキシドで処理するかまたはガンマ線で照射する
ことにより滅菌する（第１図、囲枠１０〜１２参
照）。製剤薬物の製造に適するOHCが得られる
（第１図、囲枠１３参照）。 本発明の方法の他の様式において、上記哺乳動
物の骨を約１cmの最大粒径に、例えば粉砕機中で
粉砕する（第２図、囲枠２参照）。骨の粒子は次
に酸でPH5.0〜5.5にする。次にそれを親水性かつ
親油性溶媒を用いて約５％の最大残留水分および
脂肪含量に脱水、脱脂するか、または初めに親水
性溶媒で20〜80℃において約５％の最大残留水分
に脱水し次に親油性溶媒で20〜80℃において約５
％の最大残留脂肪含量に脱脂する（第２図、囲枠
３ａおよび３ｂ参照）。 次いで生じた脱水、脱脂した骨物質をさらに減
圧下に−20〜80℃で、例えば渦流で、約１％の最
大溶媒含量が達成されるまで乾燥する（第２図、
囲枠４参照）。必要であれば骨物質をさらに上記
のように処理することができる（第２図、囲枠５
〜１１参照）。製剤薬物の製造に適するOHCが得
られる（第２図、囲枠１２）。 上記のように本発明の方法に使用する好ましい
骨は長骨例えば上腕骨、大腿骨、脛骨、橈骨およ
び尺骨、中手骨または中足骨である。さらに仔牛
（Bos taurus）から骨の好ましく使用される。 生成物が変質するのを防ぐために、その場合に
も水分および溶媒含量だ低下すると乾燥および脱
脂温度を低下させることが必要であることは明ら
かである。既に言及したように80℃の最高温度が
脱水および乾燥に使用される。水および溶媒含量
が低下すると温度を低下させ、操作を非常に速や
かに行なう。 脱水および乾燥操作中、圧力は最大約400ミリ
バールである。 適当な親油性溶媒の典型的な例はアセトン、ト
リクロロエチレン、塩化メチレンおよび低沸点石
油エーテルである。適当な親水性溶媒の典型的な
例はアセトン、エタノールおよびイソプロパノー
ルである。 生じたOHCは常法で経口投与用製剤製品、例
えば顆粒、フイルムコーテイング錠、カプセル、
コーテイング丸剤、粉末または懸濁液に調製する
ことができる。一日量は0.6〜10ｇで２〜３回の
個々の用量に分割される。用量の単位は200〜
4000mgである。 顆粒の製造には、OHCは充填剤および矯味料
を混合し、水で濡らし、粒化し、乾燥する。 フイルムコーテイング錠の製造には、OHCを
湿り状態で粒化し、乾燥し、次いでふるいにかけ
る。流展剤（flowance agent）、滑沢剤および崩
解剤が配合される。成形準備のできた混合物を錠
剤にし、次に薄い有色ラツカーで被覆する。 コーテイング丸剤の製造には、OHCを湿り状
態で粒化し、乾燥し、ふるいにかける。次いで通
常の錠剤化補助剤を加え、村剤核を形成させる。
核を分離し、白色トツプコートを与え、着色し、
つや出しする。 粉末の製造には、OHCを皮殻で覆われた粒子
に加工し芳香をつけ、ふるいにかける。 懸濁液の製造には、OHCを粘度を高める補助
剤とともに糖蜜中に懸濁させる。懸濁液を着色
し、芳香をつけ、次いで保存する。 第１図は実施例１におけるようにOHCを製造
する図式を示し、 第２図は実施例２におけるようにOHCを製造
する図式を示し、 第３図はOHC抽出物による3T3線維芽細胞中
の3H−チミジンのとり込み刺激を示す。横軸は
OHC抽出物の濃度をμ／ml−培地で示す。縦
軸は3H−チミジンのとり込みをcpm×104で示
す。バーは９個の測定値の平均値に対する標準偏
差を示す。相関係数は、0.917。 第４図はウシ胎児血清（…）およびOHC成分
（−）による3T3線維芽細胞中のＬ−（５−3H）−
プロリンとり込みの刺激を示す。横軸は試験した
資料中の濃度をμ／ml−培地で示し、縦軸はＬ
−（５−3H）−プロリンのとり込みをcpm×103で
示す。 第５図はウシ軟骨細胞中の3H−チミジンとり
込みの刺激をOHC34／４の用量を関数として示
す。横軸は試験した試料中の濃度をμ／ml−培
地で、縦軸は3H−チミジンとり込みをcpm×104
で示す。 第６図は単層培養中の軟骨細胞のコラーゲン合
成の刺激および全タンパク質をOHC濃度の関数
として示す。横軸は用いた活性検定タンパク質の
料、μｇ毎ml−培地を示す。縦軸は核培養バツチ
に対するそれぞれ新合成タンパク質Ｘ−Ｘおよび
コラーゲンＯ…Ｏの量、μｇを示す。 第７図は全タンパク質中のコラーゲン含量の増
加パーセントをOHC用量の関数として示す。 第８図は照射および非照射OHC抽出物による
3T3線維芽細胞中の3H−チミジンとり込みの刺
激を示す。照射OHC抽出物は690μｇ／mlのタン
パク質含量を示す（−）。非照射OHC抽出物は
670μｇ／mlのタンパク質含量を示す（…）。横軸
はOHC抽出物の濃度をμｇ／2.5ml−培地で示
す。縦軸は3H−チミジンのとり込みをcpmで示
す。 第９図はレンコル〔Lencoll.（登録商標）〕、レ
ンホス〔Lenphos（登録商標）〕、レンソル
〔Lensol（登録商標）〕、レンソル凝集体
（Lensolagglomerated）、オス・プルビツト
（Oss Pulvit）、ミツビシ・クツキー（Mitsubishi
Cookies）、オステオトロフイツク・コンセント
レート、カンゾカル（Canzocal）、PMCおよび
OHCによる3T3線維芽細胞上の3H−チミジンと
り込みの刺激を示す。横軸は試験した試料中の濃
度をμｇ／ml−培地で示し、縦軸は3H−チミジ
ンとり込みをcpmで示す。 調べた細胞生物学系中、単にCHCおよびPMC
並びにレンコル（登録商標）のみが活性である。 調査した生成物各１ｇをPBS10mlで抽出し、
遠心分離上澄みの一部を試験した。 第１０図はビタミンD2、グルコン酸カルシウ
ムによる、およびOHCによる処置14月後の骨皮
質厚さの変化率を示す。ビタミンD2と比較する
とOHCを用いたときに11.6％の増加がある。 第１１図は２年の期間にわたりOHCで処置し
か患者（−）および対照（…）中の橈骨鉱物含量
BMCの平均変化をｇ／mlで示す。標準偏差がバ
ーにより示されている。 第１２図は２年の期間OHCで処置した患者
（−）および対照（…）中の海綿質
（trabecularbone）体積（TBV）および腸骨稜の
皮質厚さ（CPT）の平均変化を示す。標準偏差
がバーにより示されている。 第１３図中縦軸は3H−チミジンとり込みを
cpmで示し、横軸は調べた試料の濃度をμｇ／
200μ−培地で示す。 本発明は実施例により一層詳細に例示される。 実施例 １ OHCの製造（方法１） 約３月令の仔牛（boa taurus）の長骨（上腕
骨、大腿骨、脛骨、橈骨および尺骨、中手骨およ
び中足骨）を出発物質としてOHCの製造に用い
る。 動物は公認獣医により検査される。次いでそれ
を屠殺して骨をとり出す。骨をとり出した後清浄
な骨を速やかに冷凍し、後の処理まで−20〜−30
℃で貯蔵する：第１図、囲枠１参照。 それを後に後する前に、骨と新鮮さ（その臭お
よび色により識別できる）、清浄さについて検査
し、それが真に必要な骨であることを確認すく。
肉、腱および軟骨残留物を除去する。 方法の第１段階において凍結骨1600Kg（１バツ
チ）を20mm網目を有するステンレス鋼製粉砕機中
で粉砕する。粉砕した骨の粒子の大きさは約１cm
である。骨の温度は粉末中０℃以下に維持され
る；第１図、囲枠２参照。 次いで粉砕骨をステンレス骨羽根付乾燥器中で
0.97〜0.98バールの圧力で脱水する。熱水は初め
約90℃の温度であり、乾燥の過程中に約40℃に低
下される。それ以上水が凝集物捕修器中へ留去し
なくなると（乾燥開始後約10時間）、加熱を中止
し骨組成物をさらに減圧下に、残留水分が最大約
10％（第１図、囲枠３ａ参照）または10〜25％
（第１図、囲枠３ｂ）になるまで乾燥する。この
後者の乾燥操作における骨組成物の温度は40℃を
越えてはならない。 次いで乾燥骨組成物をクエン酸でPH5.0〜5.5に
する。次に乾燥骨組成物を再度80〜20℃で脱水
し、脂質を除去する。このためアセトンを親水性
かつ親油性溶媒として用いるか、または乾燥骨組
成物を初めに20〜80℃の温度においてアセトン
で、次に第２操作で20〜80℃においてトリクロロ
エチレンを用いて脱脂する。残留水分および残留
脂肪含量が最大５％である骨組成物が得られる
（第１図、囲枠４ａおよび４ｂ参照）。次いで溶媒
残留物を渦流で20〜80℃、90ミリバールで除去す
る。残留溶媒含量は約１％である（第１図、囲枠
５参照）。 生じた骨組成物をハンマーミル中で２×20mmス
ロツト付ふるい中で粉砕し、上部ふるいが2.4mm
の網目大きさを有し、下部ふるいが0.34mmの網目
大きさを有する篩別機でふるう。2.4mmふるい上
に保持される物質は廃棄し、0.34mmふるいを通つ
たものは後に使用される。0.8mm目網を挿入した
粉砕機中で再度粉砕し、0.74mmの網目大きさを有
するふるいと0.34mmの網目を有するふるいを有す
る篩別機でふるう。0.74mmふるい上に保持される
物質を廃棄する。0.34mmふるいを通つた物質を捕
集し、再度0.8mm目網を挿入した粉砕機中で粉砕
する。次いで上記のようにふるいにかける。最後
に粉末を捕集し、0.25mmの網目大きさを有するふ
るいを用いて篩別け、0.5mm目網を挿入した粉砕
機中で粉砕する。次いで全粉末を0.25mmの網目大
きさのふるいに通す（第１図、囲枠６参照）。 表は生じたOHC粉末の分析値の摘要をる示
す。
【表】
【表】
分析でOHC組成物が10000微生物毎グラム以上
を含有することが示されれば、組成物をエチレン
オキシドで処理することにより、またはガンマ線
による照射により滅菌する（第１図、囲枠１０〜
１２参照）。 製剤組成物の製造に適するOHCが得られる （第１図、囲枠１３参照）。 実施例 ２ OHCの製造（方法２） １cmの最大粒径を有する粉砕骨組成物を実施例
１におけるように調製する。次いでこの骨組成物
をクエン酸でPH5.0〜5.5になし、さらに実施例１
におけるように処理する。 表に示す分析値を有するOHC組成物が得ら
れる。
を含有することが示されれば、組成物をエチレン
オキシドで処理することにより、またはガンマ線
による照射により滅菌する（第１図、囲枠１０〜
１２参照）。 製剤組成物の製造に適するOHCが得られる （第１図、囲枠１３参照）。 実施例 ２ OHCの製造（方法２） １cmの最大粒径を有する粉砕骨組成物を実施例
１におけるように調製する。次いでこの骨組成物
をクエン酸でPH5.0〜5.5になし、さらに実施例１
におけるように処理する。 表に示す分析値を有するOHC組成物が得ら
れる。
【表】
【表】
実施例 ３
3T3線維芽細胞中の3H−チミジンとり込みの
OHCによる刺激 スイスマウス3T3線維芽細胞〔フロー・ラボラ
トリーズ（Flow Laboratories）製〕をDMEM
〔ダルベツコの変性イーグル培地、ベーリンガー、
マンハイム（Boehringer Mannheim）製〕、中
で培養する。培地は初めに濾過滅菌前にCO2でPH
6.6にした後ペニシリン100単位／ml、ストレプト
マイシン100mg／ml（ともにベーリンガー、マン
ハイム製）およびNaHCO3〔メルク、ダルムシユ
タツト（Merck、Darmstadt）製〕3.7ｇ／を
補足する。さらに培地は細胞培養のために10％ウ
シ胎児血清（ベーリンガ、マンハイム製）を補足
する。サブコンフルエント（subconfluent）培養
を５％CO2圧下に37℃で90mmペトリ皿中に成長さ
せ、細胞を４×104細胞毎10ml培地毎ペトリ皿の
初期接種で週２回継代培養する。下記研究のそれ
ぞれにおいて３〜20継代の細胞を用いる。 3H−チミジンとり込みに体する検定はエル・
ジメネズ・デ・アスア（L.Jimenez de Asua）
ほか〔プロシーデイング・オブ・ザ・ナシヨナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA）、72巻（1975）、2724〜2728頁〕
により記載されたように行なう。上記保存培養か
らのスイスマウス3T3線維芽細胞を、0.05％トリ
プシン／0.02％EDTAの無菌溶液を用いてトリプ
シン処理する。細胞を再びDMEM／10％ウシ胎
児血清中に４×104細胞／mlの濃度に懸濁させる。
細胞懸濁液１mlを1.9cm2マイクロタイタ−プレー
ト上で培養する。細胞を培地の変更なくさらに４
日間インキユベートし、静止非増殖細胞の集蜜的
細胞単層を作る。次いで培地を吸出し、ウシ胎児
血清のない新培地１mlで置換し、試験する試料も
また加える。 実施例１または２において製造したOHC1ｇを
MgおよびCaのないリン酸塩緩衝食塩水（KCl0.2
ｇ、NaCl8ｇ、NaHPO4・12H2O2.7ｇ、
KH2PO40.2ｇ毎リツトル）10ml中に懸濁させる。
室温で２時間ふりまぜた後、試料を2000Xgで15
分間遠心分離する。 遠心分離後に得られる中性可溶化OHC成分を
含む透明上澄み２〜500μ部分を次いで上に得
られた3T3線維芽細胞培養に加える。 ブランクの測定には、同一量の新培地のみを培
養に加える。陽性対照としてウシ胎児血清２〜
200μを加える。検定する培養は、最後に５％
CO2圧下に37℃で20時間インキユベートし、次い
で3H−チミジンでパルスする。細胞は1μCi（メチ
ル−3H）チミジン〔アマシヤム（Amersham、
UK）製〕および0.9μｇメチルチミジン〔ジクマ
（Sigma、USA）製〕を含む無菌チミジン水溶液
10μ／ml培地毎ウエルを加えることにより放射
性標識する。3H−チミジンを加えた後上記条件下
にさらに４時間インキユベートする。 次いで試料をシンチレーシヨン計数にかける。
培地を吸出し、細胞層を0.02％EDTA／PBS溶液
0.5mlで洗浄する。細胞が十分離れるまで上記し
たように細胞をトリプシン処理する。懸濁した細
胞をマイクロタイタ−ダイナテク・マルチマツシ
ユ（Dynatech multimash）装置中で処理し、そ
れらは自動的にガラス微小繊維フイルター〔ワン
トマン（Whatman）934−AH〕に移される。装
置は次のようにプログラムされる： (i)PBS洗浄：(ii)５％トリクロロ酢酸〔メルク、
ダルムシユタツト製）による沈殿：(iii)エタノール
固定。ガラス微小繊維フイルターを乾燥し、シン
チレーシヨンバイアルに移す。液体シンチレーシ
ヨカクテル〔１：３比のトリトンＸ−100／トル
エン１中にパーマブレンド．パツカード
（Permablend Packard）７ｇ（メルク、ダルム
シユタツト）製〕を加え、試料の放射能をLKB
−ワラツク（Wallac）1217ラツクベータ
（Rackbeta）液体シンチレーシヨカウンター中で
壊変毎分として測定する。 OHCによる最大刺激は単にウシ胎児血清で達
成された最大刺激の1/2に達するだけである。し
かし、ウシ胎児血清がOHC抽出物より約60倍も
多い全タンパク質を含むことを想起しなければな
らない。従つて、3H−チミシンのとり込みはウシ
胎児血清を用いるときより有意に高い程度に使用
OHC抽出物により刺激される。OHCを用いて得
られた測定結果は第３図に要約される。 記載した検定系はまた実施例１または２により
得たOHC組成物の質の測定に使用できる。ウシ
胎児血清を陽性照射として、一方細胞生物検定系
における内部照合として、および他方OHC試料
で得られた値に体する参照として用いるとき、
OHC組成物の生物学的活性の確認に対する活性
単位を規定し、示すことができる。これはOHC
組成物の生物学的活性の標定を可能にする。 実施例 ４ 3T3線維芽細胞およびヒト包皮線維芽細胞にお
けるＬ−（５−3H）−プロリンとり込みのOHC
による刺激 培養細胞のプロリンとり込みは、実施例３にお
けるように、しかし既に記載した細胞培養系中の
3H−チミジンの代りにＬ−（５−3H）−プロリン
を用いて測定することができる。この検定は培養
細胞によるタンパク質の合成素度を測定し、細胞
により吸収された放射能の測定および定量化によ
りOHC組成物の生物学的活性を決定することが
できる。第４図はOHCによる3T3線維芽細胞中
のＬ−（５−3H）−プロリンとり込みの刺激を示
す。 第４図はOHC組成物が調査した細胞中のタイ
パク質合成速度を実質的に増すことを示す。 実施例 ５ ウシ軟骨細胞培養に対するOHCの中性可溶化
成分の効果 常法でウシ胎児の骨端軟骨から軟骨細胞を分離
する。各場合に10％ウシ胎児血清を補足したF12
倍地１mlで50000細胞を４〜６日間にサブコンフ
ルエントに成長させる。実施例３におけるよう
に、生じた細胞培養を実施例１または２により得
られたOHC組成物34／４で処理する。次いで細
胞を実施例３におけるように3H−チミジンでパ
ルスし、とり込まれた放射能を測定する。 第５図は第１試験の結果の要約を与える。ウシ
軟骨細胞による3H−チミジンのとり込みは物質
OHC34／４の用量に対する応答で示される。 調べたOHC35／４が全タンパク質合成および
コラーゲン合成の速度を刺激することは第６図お
よび第７図から明らかである。 34／４および35／４はバツチ連続番号を示す。 実施例 ６ 試験管内の骨細胞集団に対するOHCの中性
可溶化成分の効果 実質的にコーン（Cohn）ほか〔シモンズほか
（Simmons and Kanin）編、骨格研究、試験ア
プローチ（Skeletal Research、an
Experimental Approach）、アカデミツク・プレ
ス（Acaemic Press、New York、San
Francisco、London）、３〜20頁〕により記載さ
れたように、種々の骨細胞集団を１日令ウイスタ
ー（Wistar）ラツト頭蓋冠から逐次時間依存性
酵素消化手順により分離するが、しかしヒアルロ
ニダーゼ0.05％を追加酵素として、コラゲナーゼ
およびトリプシンとともに用いて骨組織から細胞
を遊離させる。 20分の消化中に遊離された種々の細胞集団は
個々の細胞画分が得られる順序に相応するローマ
数字で表わされる。頭蓋冠から遊離される最初の
細胞集団はと称され、消化の１時間の過程で遊
離される最後の細胞画分はＬと標識される。機能
試験は集団〜がおそらく骨原性
（osteoprogenitor）細胞プール（全骨芽細胞様）
の細胞に相当することを示唆する。細胞集団〜
は骨芽細胞様特性を有する特徴を示し、細胞集
団Ｌと称されるものは静止骨芽細胞様細胞また
はおそらく骨細胞様細胞とみなすことができる。 1.5×105細胞／mlのウシ胎児血清補足MEM倍
地〔アール塩（Earle′s salts）〕の懸濁液10mlを
250ml組織培養フラスコ中で培養する。５％CO2
圧下に37℃で９〜10日間インキユベートした後集
蜜的細胞層が得られ、それを0.2％トリプシンで
懸濁液にする。細胞を400Xｇで７分間遠心分離
することにより回収する。生じた細胞ペレツトを
20％ウシ胎児血清および10％DMSO補足MEM倍
地中に再懸濁させ、次いで懸脱液を後に使用する
まで液体窒素中で凍結する。 個々の凍結骨細胞集団を注意深く37℃にあげ、
20％ウシ胎児血清補足MEM40ml中に吸収させ
る。それを400Xgで７分間遠心分離し、生じた細
胞ペレツトを10％ウシ胎児血清補足新倍地中に再
び懸濁させ、96ウエルマイクロタイタ−プレート
中で７〜10×103細胞毎ウエルの密度で培養する。
細胞は２日間培養する。第３日に倍地を１％また
は２％ウシ胎児血清を含む倍地により置換する。
24時間インキユベートした後、倍地を再び１％ま
たは２％ウシ胎児血清、0.5μCi3H−チミジン／
mlおよび種々の濃度の中性可溶化OHC成分を含
む新倍地で置換する。PBS適量を対照溶液に加
える。 種々の骨細胞培養が実際にマイトジエンに応答
することを確認するためにEDGF（上皮成長因子）
を用いて試験を行なう。骨細胞培養を、3H−チミ
ジンを含む倍地で上記条件下に24時間インキユベ
ートする。次にとり込まれた3H−チミジンの量
を実施例３におけるように測定する。 試験結果は表に要約され、各値は５試験で得
られた平均を表わし、標準偏差とともに示され
る。PBS中に溶解したOHC成分は200μの全倍
地体積に対し５〜50μの量で倍地に添加する。
OHCによる刺激 スイスマウス3T3線維芽細胞〔フロー・ラボラ
トリーズ（Flow Laboratories）製〕をDMEM
〔ダルベツコの変性イーグル培地、ベーリンガー、
マンハイム（Boehringer Mannheim）製〕、中
で培養する。培地は初めに濾過滅菌前にCO2でPH
6.6にした後ペニシリン100単位／ml、ストレプト
マイシン100mg／ml（ともにベーリンガー、マン
ハイム製）およびNaHCO3〔メルク、ダルムシユ
タツト（Merck、Darmstadt）製〕3.7ｇ／を
補足する。さらに培地は細胞培養のために10％ウ
シ胎児血清（ベーリンガ、マンハイム製）を補足
する。サブコンフルエント（subconfluent）培養
を５％CO2圧下に37℃で90mmペトリ皿中に成長さ
せ、細胞を４×104細胞毎10ml培地毎ペトリ皿の
初期接種で週２回継代培養する。下記研究のそれ
ぞれにおいて３〜20継代の細胞を用いる。 3H−チミジンとり込みに体する検定はエル・
ジメネズ・デ・アスア（L.Jimenez de Asua）
ほか〔プロシーデイング・オブ・ザ・ナシヨナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA）、72巻（1975）、2724〜2728頁〕
により記載されたように行なう。上記保存培養か
らのスイスマウス3T3線維芽細胞を、0.05％トリ
プシン／0.02％EDTAの無菌溶液を用いてトリプ
シン処理する。細胞を再びDMEM／10％ウシ胎
児血清中に４×104細胞／mlの濃度に懸濁させる。
細胞懸濁液１mlを1.9cm2マイクロタイタ−プレー
ト上で培養する。細胞を培地の変更なくさらに４
日間インキユベートし、静止非増殖細胞の集蜜的
細胞単層を作る。次いで培地を吸出し、ウシ胎児
血清のない新培地１mlで置換し、試験する試料も
また加える。 実施例１または２において製造したOHC1ｇを
MgおよびCaのないリン酸塩緩衝食塩水（KCl0.2
ｇ、NaCl8ｇ、NaHPO4・12H2O2.7ｇ、
KH2PO40.2ｇ毎リツトル）10ml中に懸濁させる。
室温で２時間ふりまぜた後、試料を2000Xgで15
分間遠心分離する。 遠心分離後に得られる中性可溶化OHC成分を
含む透明上澄み２〜500μ部分を次いで上に得
られた3T3線維芽細胞培養に加える。 ブランクの測定には、同一量の新培地のみを培
養に加える。陽性対照としてウシ胎児血清２〜
200μを加える。検定する培養は、最後に５％
CO2圧下に37℃で20時間インキユベートし、次い
で3H−チミジンでパルスする。細胞は1μCi（メチ
ル−3H）チミジン〔アマシヤム（Amersham、
UK）製〕および0.9μｇメチルチミジン〔ジクマ
（Sigma、USA）製〕を含む無菌チミジン水溶液
10μ／ml培地毎ウエルを加えることにより放射
性標識する。3H−チミジンを加えた後上記条件下
にさらに４時間インキユベートする。 次いで試料をシンチレーシヨン計数にかける。
培地を吸出し、細胞層を0.02％EDTA／PBS溶液
0.5mlで洗浄する。細胞が十分離れるまで上記し
たように細胞をトリプシン処理する。懸濁した細
胞をマイクロタイタ−ダイナテク・マルチマツシ
ユ（Dynatech multimash）装置中で処理し、そ
れらは自動的にガラス微小繊維フイルター〔ワン
トマン（Whatman）934−AH〕に移される。装
置は次のようにプログラムされる： (i)PBS洗浄：(ii)５％トリクロロ酢酸〔メルク、
ダルムシユタツト製）による沈殿：(iii)エタノール
固定。ガラス微小繊維フイルターを乾燥し、シン
チレーシヨンバイアルに移す。液体シンチレーシ
ヨカクテル〔１：３比のトリトンＸ−100／トル
エン１中にパーマブレンド．パツカード
（Permablend Packard）７ｇ（メルク、ダルム
シユタツト）製〕を加え、試料の放射能をLKB
−ワラツク（Wallac）1217ラツクベータ
（Rackbeta）液体シンチレーシヨカウンター中で
壊変毎分として測定する。 OHCによる最大刺激は単にウシ胎児血清で達
成された最大刺激の1/2に達するだけである。し
かし、ウシ胎児血清がOHC抽出物より約60倍も
多い全タンパク質を含むことを想起しなければな
らない。従つて、3H−チミシンのとり込みはウシ
胎児血清を用いるときより有意に高い程度に使用
OHC抽出物により刺激される。OHCを用いて得
られた測定結果は第３図に要約される。 記載した検定系はまた実施例１または２により
得たOHC組成物の質の測定に使用できる。ウシ
胎児血清を陽性照射として、一方細胞生物検定系
における内部照合として、および他方OHC試料
で得られた値に体する参照として用いるとき、
OHC組成物の生物学的活性の確認に対する活性
単位を規定し、示すことができる。これはOHC
組成物の生物学的活性の標定を可能にする。 実施例 ４ 3T3線維芽細胞およびヒト包皮線維芽細胞にお
けるＬ−（５−3H）−プロリンとり込みのOHC
による刺激 培養細胞のプロリンとり込みは、実施例３にお
けるように、しかし既に記載した細胞培養系中の
3H−チミジンの代りにＬ−（５−3H）−プロリン
を用いて測定することができる。この検定は培養
細胞によるタンパク質の合成素度を測定し、細胞
により吸収された放射能の測定および定量化によ
りOHC組成物の生物学的活性を決定することが
できる。第４図はOHCによる3T3線維芽細胞中
のＬ−（５−3H）−プロリンとり込みの刺激を示
す。 第４図はOHC組成物が調査した細胞中のタイ
パク質合成速度を実質的に増すことを示す。 実施例 ５ ウシ軟骨細胞培養に対するOHCの中性可溶化
成分の効果 常法でウシ胎児の骨端軟骨から軟骨細胞を分離
する。各場合に10％ウシ胎児血清を補足したF12
倍地１mlで50000細胞を４〜６日間にサブコンフ
ルエントに成長させる。実施例３におけるよう
に、生じた細胞培養を実施例１または２により得
られたOHC組成物34／４で処理する。次いで細
胞を実施例３におけるように3H−チミジンでパ
ルスし、とり込まれた放射能を測定する。 第５図は第１試験の結果の要約を与える。ウシ
軟骨細胞による3H−チミジンのとり込みは物質
OHC34／４の用量に対する応答で示される。 調べたOHC35／４が全タンパク質合成および
コラーゲン合成の速度を刺激することは第６図お
よび第７図から明らかである。 34／４および35／４はバツチ連続番号を示す。 実施例 ６ 試験管内の骨細胞集団に対するOHCの中性
可溶化成分の効果 実質的にコーン（Cohn）ほか〔シモンズほか
（Simmons and Kanin）編、骨格研究、試験ア
プローチ（Skeletal Research、an
Experimental Approach）、アカデミツク・プレ
ス（Acaemic Press、New York、San
Francisco、London）、３〜20頁〕により記載さ
れたように、種々の骨細胞集団を１日令ウイスタ
ー（Wistar）ラツト頭蓋冠から逐次時間依存性
酵素消化手順により分離するが、しかしヒアルロ
ニダーゼ0.05％を追加酵素として、コラゲナーゼ
およびトリプシンとともに用いて骨組織から細胞
を遊離させる。 20分の消化中に遊離された種々の細胞集団は
個々の細胞画分が得られる順序に相応するローマ
数字で表わされる。頭蓋冠から遊離される最初の
細胞集団はと称され、消化の１時間の過程で遊
離される最後の細胞画分はＬと標識される。機能
試験は集団〜がおそらく骨原性
（osteoprogenitor）細胞プール（全骨芽細胞様）
の細胞に相当することを示唆する。細胞集団〜
は骨芽細胞様特性を有する特徴を示し、細胞集
団Ｌと称されるものは静止骨芽細胞様細胞また
はおそらく骨細胞様細胞とみなすことができる。 1.5×105細胞／mlのウシ胎児血清補足MEM倍
地〔アール塩（Earle′s salts）〕の懸濁液10mlを
250ml組織培養フラスコ中で培養する。５％CO2
圧下に37℃で９〜10日間インキユベートした後集
蜜的細胞層が得られ、それを0.2％トリプシンで
懸濁液にする。細胞を400Xｇで７分間遠心分離
することにより回収する。生じた細胞ペレツトを
20％ウシ胎児血清および10％DMSO補足MEM倍
地中に再懸濁させ、次いで懸脱液を後に使用する
まで液体窒素中で凍結する。 個々の凍結骨細胞集団を注意深く37℃にあげ、
20％ウシ胎児血清補足MEM40ml中に吸収させ
る。それを400Xgで７分間遠心分離し、生じた細
胞ペレツトを10％ウシ胎児血清補足新倍地中に再
び懸濁させ、96ウエルマイクロタイタ−プレート
中で７〜10×103細胞毎ウエルの密度で培養する。
細胞は２日間培養する。第３日に倍地を１％また
は２％ウシ胎児血清を含む倍地により置換する。
24時間インキユベートした後、倍地を再び１％ま
たは２％ウシ胎児血清、0.5μCi3H−チミジン／
mlおよび種々の濃度の中性可溶化OHC成分を含
む新倍地で置換する。PBS適量を対照溶液に加
える。 種々の骨細胞培養が実際にマイトジエンに応答
することを確認するためにEDGF（上皮成長因子）
を用いて試験を行なう。骨細胞培養を、3H−チミ
ジンを含む倍地で上記条件下に24時間インキユベ
ートする。次にとり込まれた3H−チミジンの量
を実施例３におけるように測定する。 試験結果は表に要約され、各値は５試験で得
られた平均を表わし、標準偏差とともに示され
る。PBS中に溶解したOHC成分は200μの全倍
地体積に対し５〜50μの量で倍地に添加する。
【表】
【表】
表から、中性可溶溶性OHC成分がPBSで処
理した照射培養に照射して骨細胞集団および
の増殖を刺激することが明らかである。骨細胞集
団およびは反応を示さない。結果は第１３図
にグラフで示される。 実施例 ７ 表に中性可溶化OHC成分（OHCX）の作用
をラツト皮膚線維芽細胞で検定した試験の結果の
要約が示される。
理した照射培養に照射して骨細胞集団および
の増殖を刺激することが明らかである。骨細胞集
団およびは反応を示さない。結果は第１３図
にグラフで示される。 実施例 ７ 表に中性可溶化OHC成分（OHCX）の作用
をラツト皮膚線維芽細胞で検定した試験の結果の
要約が示される。
【表】
【表】
表に要約される結果から、ラツト皮膚線維芽
細胞をOHCXにより刺激できないことを知見す
ることができる。 表に要約された試験結果と表に要約された
試験結果とを比較すると、OHCXの観察された
マイトジエン活性が骨芽細胞に特異的であること
が明らかになる。 実施例 ８ 照射OHCの生物学的活性の測定 実施例１または２におけるように製造した
OHCを25KGy（2.5Mrad）で照射する。試験を実
施例３におけるように行なう。結果は第８図に示
される。 第８図に照射および非照射OHCのPBS抽出物
の種々の量を用いた刺激る対する3T3線維芽細胞
によりとり込まれた3H−チミジンの結果が要約
される。第８図から照射がOHCの生物学的活性
に影響を与えないことを知見できる。 実施例 ９ 同領域の指標に対するOHCの効果と公知製剤
の効果との比較 検定する物質各１ｇをねじふたバイアルに秤取
し、PBS10mlを加える。室温で２時間ふりまぜ
た後、MSEテーブル遠心分離機中で3600rpmで
10分間遠心分離する。透明上澄みをデカントし、
沈殿を廃棄する。溶液のタンパク質含量をブラド
フオード（Bradford）〔アナリテイカル・バイオ
ケミストリー（Anal.Biochem.）、72（1976）、248
頁〕による記載のように測定する。3T3線維芽細
胞中の3H−チミジンのとり込みを実施例３にお
けるように刺激して評価する。 表に比較した製剤およびその抽出性タンパク
質含量が要約される。
細胞をOHCXにより刺激できないことを知見す
ることができる。 表に要約された試験結果と表に要約された
試験結果とを比較すると、OHCXの観察された
マイトジエン活性が骨芽細胞に特異的であること
が明らかになる。 実施例 ８ 照射OHCの生物学的活性の測定 実施例１または２におけるように製造した
OHCを25KGy（2.5Mrad）で照射する。試験を実
施例３におけるように行なう。結果は第８図に示
される。 第８図に照射および非照射OHCのPBS抽出物
の種々の量を用いた刺激る対する3T3線維芽細胞
によりとり込まれた3H−チミジンの結果が要約
される。第８図から照射がOHCの生物学的活性
に影響を与えないことを知見できる。 実施例 ９ 同領域の指標に対するOHCの効果と公知製剤
の効果との比較 検定する物質各１ｇをねじふたバイアルに秤取
し、PBS10mlを加える。室温で２時間ふりまぜ
た後、MSEテーブル遠心分離機中で3600rpmで
10分間遠心分離する。透明上澄みをデカントし、
沈殿を廃棄する。溶液のタンパク質含量をブラド
フオード（Bradford）〔アナリテイカル・バイオ
ケミストリー（Anal.Biochem.）、72（1976）、248
頁〕による記載のように測定する。3T3線維芽細
胞中の3H−チミジンのとり込みを実施例３にお
けるように刺激して評価する。 表に比較した製剤およびその抽出性タンパク
質含量が要約される。
【表】
試験結果は第９図に要約される。不活性物質は
ブランクと区別できず、従つて示すことができな
い。 第９図からOHCがDNA合成の刺激において他
の製品より著しく優れていることを知見できる。 実施例 10 動物試験における骨の治癒に及ぼすOHCの効
果 骨の治癒に及ぼすOHCの効果は60成ウサギは
用いた研究で確認される。精密工学を用いて両膝
関節の遠位大腿骨端中に大きさおよび位置の等し
い軟骨／骨欠損を導入する。 動物は無作為に各15動物４群に分ける。非処置
群が対照の役目をする。第１群は毎日OHC830mg
（カルシウム178.0mg）を与え、第２群は毎日灰化
OHC51mg（すなわち活性有機成分のない骨鉱物、
カルシウム178.9mg）を与え、第３群は毎日炭酸
カルシウム650mg（カルシウム189.7mg）を与え
る。表に試験設計が詳記される。
ブランクと区別できず、従つて示すことができな
い。 第９図からOHCがDNA合成の刺激において他
の製品より著しく優れていることを知見できる。 実施例 10 動物試験における骨の治癒に及ぼすOHCの効
果 骨の治癒に及ぼすOHCの効果は60成ウサギは
用いた研究で確認される。精密工学を用いて両膝
関節の遠位大腿骨端中に大きさおよび位置の等し
い軟骨／骨欠損を導入する。 動物は無作為に各15動物４群に分ける。非処置
群が対照の役目をする。第１群は毎日OHC830mg
（カルシウム178.0mg）を与え、第２群は毎日灰化
OHC51mg（すなわち活性有機成分のない骨鉱物、
カルシウム178.9mg）を与え、第３群は毎日炭酸
カルシウム650mg（カルシウム189.7mg）を与え
る。表に試験設計が詳記される。
【表】
欠損の導入後７日〜23日に動物を一連の螢光標
識で処置する。５動物を５週、８週および12週後
にそれぞれ解剖する。組織学切片を螢光顕微鏡で
骨欠損の領域中の切片平面の標準化位置および解
像力で調べる。顕微鏡写真を螢光強度、欠損充填
の性質および程度、並びに新骨成長の構造に基く
指数点系で評価する。表に結果が示される。
識で処置する。５動物を５週、８週および12週後
にそれぞれ解剖する。組織学切片を螢光顕微鏡で
骨欠損の領域中の切片平面の標準化位置および解
像力で調べる。顕微鏡写真を螢光強度、欠損充填
の性質および程度、並びに新骨成長の構造に基く
指数点系で評価する。表に結果が示される。
【表】
３処置群は非処置対照群より有意に改良された
無機質化を示す。他の２活性処置とは対照的に
OHCによる療法は骨欠損の治癒に著しい改良を
生ずる。 OHCおよび灰化OHCで得られた試験結果を比
較すると、有機成分が破壊されるとOHCの有利
な効果が失なわれることが明らかになる。 実施例 11 動物試験における関節軟骨細胞の超微細構造に
及ぼすOHCの効果 コルチコイド損傷後、関節軟骨細胞超微細構造
に及ぼすOHCの効果をラツトによる一連の生体
内試験で調査した。定量的評価は新再現性形態測
定の使用により行なうことができる；アンネフエ
ルド（M.Annefeld）、Int.J.Tiss.Reac.、巻
〔４〕、（1958）、273〜289頁参照。 試験は５おすウイスターラツト３群で行なわれ
る。第１群は対照群であり、処置されない。第２
群はデキサメサゾンを筋肉内に投与し、第３群は
デキサメサゾンを筋肉内およびさらにOHCを経
口で与える。試験設計は表に要約される。
無機質化を示す。他の２活性処置とは対照的に
OHCによる療法は骨欠損の治癒に著しい改良を
生ずる。 OHCおよび灰化OHCで得られた試験結果を比
較すると、有機成分が破壊されるとOHCの有利
な効果が失なわれることが明らかになる。 実施例 11 動物試験における関節軟骨細胞の超微細構造に
及ぼすOHCの効果 コルチコイド損傷後、関節軟骨細胞超微細構造
に及ぼすOHCの効果をラツトによる一連の生体
内試験で調査した。定量的評価は新再現性形態測
定の使用により行なうことができる；アンネフエ
ルド（M.Annefeld）、Int.J.Tiss.Reac.、巻
〔４〕、（1958）、273〜289頁参照。 試験は５おすウイスターラツト３群で行なわれ
る。第１群は対照群であり、処置されない。第２
群はデキサメサゾンを筋肉内に投与し、第３群は
デキサメサゾンを筋肉内およびさらにOHCを経
口で与える。試験設計は表に要約される。
【表】
ゾン
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の乾燥物質分析パラメーター： 【表】 【表】 に特徴があり、次の生物学的活性： (a) 骨芽細胞、軟骨細胞および線維芽細胞の
DNA合成の刺激、 (b) 軟骨細胞および線維芽細胞のタンパク質合成
の刺激、 (c) 全タンパク質合成の刺激に比べて、軟骨細胞
のコラーゲン全合成の選択的刺激、 (d) 非特異的間葉細胞の軟骨細胞または骨芽細胞
への分化の促進、 を特徴とするオセインヒドロキシアパタイトコン
パウンド（OHC）。 ２ 次の乾燥物質分析パラメーター： 【表】 に特徴があり、次の生物学的活性： (a) 骨芽細胞、軟骨細胞および線維芽細胞の
DNA合成の刺激、 (b) 軟骨細胞および線維芽細胞のタンパク質合成
の刺激、 (c) 全タンパク質合成の刺激に比べて、軟骨細胞
のコラーゲン全合成の選択的刺激、 (d) 非特異的間葉細胞の軟骨細胞または骨芽細胞
への分化の促進、 を特徴とするオセインヒドロキシアパタイトコン
パウンドを製造する方法であつて、 (a) 胎児〜約12月令哺乳動物の骨を最大約１cmの
粒径に粉砕し、 (b) 骨粒子を減圧で約20〜80℃において最大約10
％または約10〜25％の残留水分まで乾燥し、 (c) 生じた骨物質を酸でPH5.0〜5.5になし、 (d) 次いで親水かつ親油性溶媒で最大約５％の残
留水分および残留脂肪含量に脱水、脱脂する
か、または親水性溶媒で20〜80℃において最大
約５％の残留水分に脱水し次いで親油性溶媒で
20〜80℃において最大約５％の残留脂肪含量に
脱脂し、 (e) 脱水、脱脂した骨物質を減圧で20〜80℃にお
いて約１％の最大溶媒含量に乾燥し、 (f) 骨物質を約50〜300ミクロメートルの粒径に
粉砕し、次いで滅菌する、 ことを含む方法。 ３ 長骨を用いる、特許請求の範囲第２項記載の
方法。 ４ 肉用仔牛の長骨を用いる、特許請求の範囲第
２項記載の方法。 ５ 次の乾燥物質分析パラメーター： 【表】 に特徴があり、次の生物学的活性： (a) 骨芽細胞、軟骨細胞および線維芽細胞の
DNA合成の刺激、 (b) 軟骨細胞および線維芽細胞のタンパク質合成
の刺激、 (c) 全タンパク質合成の刺激に比べて、軟骨細胞
のコラーゲン全合成の選択的刺激、 (d) 非特異的間葉細胞の軟骨細胞または骨芽細胞
への分化の促進、 を特徴とするオセインヒドロキシアパタイトコン
パウンドを製造する方法であつて、 (a) 胎児〜約12月令哺乳動物の骨を最大約１cmの
粒径に粉砕し、 (b) 骨粒子を酸でPH5.0〜5.5になし、 (c) 次いで親水かつ親油性溶媒で最大約５％の残
留水分および残留脂肪含有に脱水、脱脂する
か、または親水性溶媒で20〜80℃において最大
約５％の残留水分に脱水し次いで親油性溶媒で
20〜80℃において最大約５％の残留脂肪含量に
脱脂し、 (d) 脱水、脱脂した骨物質を減圧で20〜80℃にお
いて約１％の最大溶媒含量に乾燥し、 (e) 骨物質を約50〜300ミクロメートルの粒径に
粉砕し、ついで滅菌する、 ことを含む方法。 ６ 長骨を用いる、特許請求の範囲第５項記載の
方法。 ７ 肉用仔牛の長骨を用いる、特許請求の範囲第
５項記載の方法。 ８ 次の乾燥物質分析パラメーター： 【表】 に特徴があり、次の生物学的活性： (a) 骨芽細胞、軟骨細胞および線維芽細胞の
DNA合成の刺激、 (b) 軟骨細胞および線維芽細胞のタンパク質合成
の刺激、 (c) 全タンパク質合成の刺激に比べて、軟骨細胞
のコラーゲン全合成の選択的刺激、 (d) 非特異的間葉細胞の軟骨細胞または骨芽細胞
への分化の促進、 を特徴とするオセインヒドロキシアパタイトコン
パウンドを含む変形性関節症および骨粗鬆症の予
防および治療、並びに骨折、軟骨欠損及び骨欠損
の治療用の経口投与用製剤組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3626414.8 | 1986-08-05 | ||
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