JPH0559084A - メチルエステル化ポリエン系抗生物質の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ポリエン系抗生物質のメチルエステル化反応液
またはメチルエステル化ポリエンの粗沈澱物中に存在す
るメチルエステル化ポリエン系抗生物質を酸アミド、そ
の誘導体、尿素または尿素誘導体と酸とを使用して水性
溶液化する。その水溶液から不溶物を除くことにより、
未反応のポリエン系抗生物質等を除くことができる。得
られた水性溶液を塩基でpH12以上のアルカリ性にするこ
とにより、メチルエステル化ポリエン系抗生物質を沈澱
させて分離することにより、さらに精製することができ
る。 【効果】大量の有機溶剤を使うことなく、メチルエステ
ル化ポリエン系抗生物質を分離精製することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、メチルエステル化ポリ
エン系抗生物質の精製法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】メチルエステル化ポリエン系抗生物質
は、通常のポリエン系抗生物質より水に溶解し易いが、
通常の水溶性物質に比較すると水に難溶なため、結局多
量の有機溶媒を用いて溶液にしていた。具体的には、メ
チルエステル化ポリエン系抗生物質をそのエステル化反
応液から分離取得する際には、まず、反応液に直接水を
添加して生成した沈澱を回収していた。ついで、有機溶
媒を添加してそこに存在する固体のメチルエステル化ポ
リエン系抗生物質を溶解した後、向流分配法、逆相クロ
マトグラフィーなど（J. Antibiot., 33,591(1980))で
精製していた。このため、メタノール、エタノール、プ
ロパノール、ブタノールなどの大量の有機溶剤を使用す
る必要があった（特開昭61−189224号公報、米国特許第
3,773,925号公報。）そのほか、ドデシル硫酸ナトリウ
ムなどの界面活性剤を用いて可溶化する方法も知られて
いる（特開昭51−51587号公報）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】メチルエステル化ポリ
エン系抗生物質をその反応液から分離取得する場合、上
記のように大量の有機溶剤を使用しており、工業的にこ
れを行う場合、火災、爆発などの危険があった。また、
メチルエステル化ポリエン系抗生物質とエステル化の原
料とした未反応ポリエン系抗生物質を分画分離する方法
も煩雑であった。

【０００４】一方、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面
活性剤を使用する場合、ポリエン系抗生物質と界面活性
剤とを分離することが非常に困難で効率的、安全、簡単
なメチルエステル化抗生物質の分離取得法の開発が望ま
れている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記問題点を
解決すべく鋭意研究した結果、メチルエステル化ポリエ
ン系抗生物質が酸アミド、酸アミド誘導体、尿素または
尿素誘導体と酸とを併用することにより水に可溶化され
うることを発見し、この発見に基づき本発明を完成し
た。

【０００６】即ち、本発明はポリエン系抗生物質のメチ
ルエステル化反応液またはこれからメチルエステル化ポ
リエン系抗生物質を分離取得する中間工程産物に、酸ア
ミド、その誘導体、尿素またはその誘導体の少なくとも
１種と酸を加えてメチルエテル化ポリエン系抗生物質の
水性溶液を得、該水性溶液から不溶物を分離することを
特徴とするメチルエステル化ポリエン系抗生物質の精製
法に関するものである。

【０００７】ポリエン系抗生物質としては、例えばオー
レオファシン(Aureofuscin）、レクチバレンドマイシン
(Rectivarendomycin）、オーレノマイシン(Aurenomyci
n）Ｂ、オーレニン(Aurenin）、リモシジン(Rimocidi
n）、ヒリピン(Filipin）、アウロシジン(Ewrocidin）
Ａ＆Ｂ、ガンニバマイシン(Gannibamycin)、ミコチシン
(Mycoticin）Ａ＆Ｂ、ラパマイシン(Rapamycin）、ロフ
ラマイコシン(Roflamycocin)、デルモスタチン(Derumos
tatin)、ナイスタチン(Nystatin)、アンホテリシン(Amp
hotericin)Ｂ、パートリシン(Partricin）Ａ＆Ｂ、リエ
ノマイシン(Lienomycin)、キャンジシジン(Candicidin)
など（S. Omura, "Macrolide Antibiotics",Academic P
ress(1984))やＶ−28−３Ｂ（特開昭61−189224号公
報）などを挙げることができる。そして、これらの抗生
物質がそれぞれの抗生物質の生産菌を栄養培地に培養す
るいわゆる発酵法によって製造されること及びジアゾメ
タンと反応するとメチルエステル化され、メチルエステ
ル化ポリエン抗生物質が得られることは当業者に周知で
ある。メチルエステル化ポリエン系抗生物質を製造する
場合には、通常は培養液からポリエン系抗生物質を分離
し、精製品あるいは粗製品を原料としてメチルエステル
化を行なっている。メチルエステル化反応液からメチル
エステル化ポリエン系抗生物質を分離取得する中間工程
産物は液体であると固体であるとを問わない。固体の例
としては、ポリエン系抗生物質をジアゾメタン反応して
得たエステル化反応液を減圧濃縮または水添加によって
得られる粗沈澱物が挙げられる。

【０００８】酸アミドとしてはホルムアミド、アセトア
ミド、ニコチン酸アミドなどを挙げることができ、酸ア
ミド誘導体としては1-メチルニコチン酸アミド、N-メチ
ルニコチン酸アミドなどを挙げることができる。酸アミ
ド及びその誘導体は多数知られており、そのうちから本
発明の方法に有利に使用できるものを単位重量当たりの
ポリエン系抗生物質の溶解量、入手の難易およびその価
格などの見地から容易に選択することができる。

【０００９】尿素及びその誘導体としては、尿素、チオ
尿素などを挙げることができる。本発明の方法に有利に
使用できる尿素及びその誘導体は、上記と同様の見地か
ら容易に選択することができる。

【００１０】酸としてはグルタミン酸、アスパラギン酸
などのアミノ酸、塩酸、硫酸などの無機酸、蟻酸、酢
酸、クエン酸などの有機酸をいずれも使用することがで
きる。これらは、その水溶液の形態で使用するとよい。

【００１１】メチルエステル化ポリエン系抗生物質の水
性溶液化は、メチルエステル化ポリエン系抗生物質を溶
解するに足る量の酸アミド、その誘導体、尿素またはそ
の誘導体の少なくとも１種と酸を単に添加混合するだけ
でよい。適当な添加量は添加後の濃度で表して、通常、
例えば尿素およびニコチン酸アミドの場合は１％（本明
細書において、％はすべて重量％を意味する。)以上、好
ましくは尿素では３〜60％程度、ニコチン酸アミドでは
１〜20％程度である。酸の適当な添加量はグルタミン
酸、アスパラギン酸、酢酸、クエン酸などの場合は１〜
10％であり、塩酸、硫酸などの場合は0.01Ｎ以上、好ま
しくは0.01〜0.5Ｎである。

【００１２】本発明方法の実施においては、火災、爆発
などの危険性のない量のメタノール、エタノールなど水
可溶性でかつポリエン系抗生物質を溶解しうる有機溶媒
を併用することもできる。有機溶媒の添加量としては、
有機溶媒添加後の濃度で表して60％以下が適当である。
有機溶媒を使用することにより酸アミド系および／また
は尿素系物質と酸とよりなる本発明の溶解剤の使用量を
節減することができる。なおこの場合、メチルエステル
化ポリエン系抗生物質を溶解した溶媒は、酸アミド系お
よび／または尿素系物質と酸系物質の水溶液由来の水分
と有機溶媒の混合溶媒である。

【００１３】本発明の方法におけるメチルエステル化ポ
リエン系抗生物質の溶液化は、前記のような水単独溶媒
の態様と水と有機溶媒との混合溶媒の態様とがあるの
で、両態様を総称するものとして水性溶液化なる表現を
用いる。

【００１４】上記の溶液化を行なった後は遠心分離、濾
過などの手段により未反応ポリエン系抗生物質その他の
不溶物を除去する。このようにして、純度の向上したメ
チルエステル化ポリエン系抗生物質の水溶液が得られ
る。

【００１５】上記のようにして得られた純度の向上した
メチルエステル化ポリエン系抗生物質の水性溶液から、
例えば減圧下に濃縮乾固してメチルエステル化ポリエン
系抗生物質を回収することができるが、単にこの溶液の
pHをアルカリ性にしてメチルエステル化ポリエン系抗生
物質を沈澱せしめ、ついでこの沈澱を分離することによ
っても極めて容易に回収することができる。

【００１６】pHをアルカリ性にするには、メチルエステ
ル化ポリエン系抗生物質の水性溶液に水酸化ナトリウ
ム、水酸化アンモニウムなどの塩基を加えることによっ
て行うことができる。塩基の添加量は、溶液中に存在す
る酸の量で決まる。通常、pHが12以上になる様に加える
のが好ましい。pHをアルカリ性にすることでメチルエス
テル化ポリエン系抗生物質の沈澱が生成される。これを
濾過や遠心分離で回収し、乾燥すれば目的のメチルエス
テル化ポリエン系抗生物質が得られる。

【００１７】必要に応じて、通常の分離精製方法により
更に精製することができ、例えば「カプセル・パックＯ
ＤＳカラム」（資生堂社製）や「ＬＲＰ−１」（ワット
マン社製）等のＣ−18逆相クロマトグラフィー用担体な
どを用いる逆相カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過
法、イオン交換クロマトグラフィー、加水沈澱法、アル
カリ沈澱法などの組合せで高純度に精製されたメチルエ
ステル化抗生物質が製造できる。

【００１８】

【作用】メチルエステル化ポリエン系抗生物質の反応液
には、メチルエステル化ポリエン系抗生物質と原料とし
て用いたポリエン系抗生物質が溶解状態で存在してい
る。このような状態のメチルエステル化ポリエン系抗生
物質を分離取得するために、減圧濃縮後水を使用する従
来法では、メチルエステル化ポリエン系抗生物質とエス
テル化されなかった未反応のポリエン系抗生物質が共存
状態で沈澱してくるので、これを分画してメチルエステ
ル化ポリエン系抗生物質の純度を上げるためにクロマト
グラフィーなどの操作を大量の有機溶媒を使用して行わ
なければならい。

【００１９】本発明の方法では、例えばポリエン系抗生
物質のエステル化反応液に、本発明の溶解剤を加えてメ
チルエステル化ポリエン系抗生物質を溶液状態のままに
維持し、未反応のポリエン系抗生物質を沈澱せしめる。
この場合、溶媒として少なくとも水を溶媒として使用し
なければならない。メチルエステル化ポリエン系抗生物
質を含む反応液を溶解剤で処理した後、未反応のポリエ
ン系抗生物質およびその他の不溶物を固液分離で除去し
て純度の向上したメチルエステル化ポリエン系抗生物質
の水性溶液が得られる。

【００２０】

【実施例】

実施例１ 表１に示す組成の培地１klを加熱殺菌して発酵槽に入
れ、これにパートリシンＢ生産菌ストレプトミセス・ア
レネ(Streptomyces arenae) FERM BP-1537(FERMP-809
9）を接種して28℃で３日間培養した。

【００２１】

【表１】

【００２２】培養後、遠心分離にて菌糸を集め、これに
100lのメタノールを加えた。酢酸でpHを6.0に調節し、
室温で24時間放置した。次いで濾過し、得られた濾液10
0lを40℃で減圧下10ｌまで濃縮した。遠心分離して沈澱
物を集め、凍結乾燥して200gの粗パートリシンＢ（純度
65％）を得た。

【００２３】粗パートリシンＢ 100ｇを逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（カプセル・パックＯＤＳカラム、資
生堂社製）により精製し、80ｇの精製パートリシンＢ
（純度98％）乾燥物を得た。精製パートリシンＢの理化
学的性質を調べたところ、分子量1112(FABMSにより測定
した）、薄層クロマトグラフィー（ワットマン社製品 P
LKC18F TLCプレート、展開溶剤；100％アセトニトリル5
0mM酢酸アンモニウム水溶液(pH9.0）＝45：55）に於け
るRf値0.34、逆相クロマトグラフィー〔カラム：山村化
学研究所(株)製 YMC AM-312 φ4.5×150mm、溶剤：100
％アセトリトリル−50mM酢酸アンモニウム水溶液(pH5.
5）＝4.5：5.5、流速：１ml/min〕に於ける保持時間5.1
0分、紫外線吸収（ＵＶ）スペクトル（メタノール中で
測定し、図１に破線で示した）及び赤外線吸収（ＩＲ）
スペクトルが、パートリシンＢ（J. Antibiotics；35,
997(1982))と良く一致し、上述の薄層クロマトグラムと
逆相クロマトグラムでそれぞれ単一のスポット、単一の
ピークを与えた。

【００２４】上記方法で調製した精製パートリシンＢを
3g/lの濃度になるように30％尿素水溶液に溶解した。こ
の溶液5.5lをガラス製反応槽に入れ、回転数500rpmで攪
拌しながら暗室で高圧水銀ランプ（主波長約365nm、430
nm、400Ｗ、アリオン社製）を用いて３時間光照射し、1
6.5ｇのＶ−28−３Ｂ（特開昭61−189224号公報）を得
た。照射液を減圧下600mlまで濃縮し、生じた沈澱を遠
心分離により集めた。

【００２５】該沈澱を水150mlで２回洗い、少量のテト
ラヒドロフラン溶液に溶解した。これをＬＲＰ−１逆相
カラムに吸着させ、100％アセトニトリル：50mM酢酸ア
ンモニウム水溶液(pH9.0）−4.5：5.5の混液で溶出し
た。360nmの吸光度測定によりＶ−28−３Ｂの溶出画分
を回収し、減圧下濃縮し冷蔵庫に一晩放置した。翌日析
出したＶ−28−３Ｂの黄色結晶を遠心分離で集め乾燥し
た結果、11.5ｇのＶ−28−３Ｂ精製物が得られた。

【００２６】かくして得られたＶ−28−３Ｂ（10ｇ）を
2000mlのメチルアルコールに懸濁後、ジアゾメタンのテ
トラヒドロフラン溶液を氷冷下懸濁液に滴下し、反応液
を得た。

【００２７】反応により生成したＶ−28−３Ｂメチルエ
ステルは、例えば反応液より減圧下濃縮した残渣より一
般に抗生物質の単離に用いられる手段によって分離、精
製することができる。

【００２８】かくして得られたＶ−28−３Ｂメチルエス
テルは、担体としてノババックＣ18（ウォーターズ
社）、移動相として65％アセトニトリルを含む10mM酢酸
アンモニウム緩衝液(pH8.5）、検出器としてＵＶ(405nm
および254nm)検出器を用いた高速液体クロマトグラフィ
（以下HPLCと略す、流速1.0ml/分）において7.5分に単
一ピークを与え、表２に示した理化学的性質を示す。

【００２９】

【表２】

【００３０】更に、このようにして得られたＶ−28−３
Ｂメチルエステルを含む反応液５ｌに尿素を30％に成る
ように加え、ついで６Ｎ塩酸水溶液を0.02Ｎになるよう
に加えた。30分室温にて攪拌後、固液分離して不溶物を
含まないＶ−28−３Ｂメチルエステルの水溶液とした。

【００３１】この水溶液に６Ｎ水酸化ナトリウムを0.01
Ｎになるように加え、５℃で４時間放置してＶ−28−３
Ｂメチルエステルを沈澱させ、遠心分離で沈澱物を回収
した。該沈澱に水１ｌを加え洗浄後、メタノール５ｌ、
ついで水１ｌで再度洗浄した後凍結乾燥した。その結
果、５ｇのＶ−28−３Ｂメチルエステルが得られた。得
られたＶ−28−３Ｂメチルエステルの理化学的性質は表
２に示した結果とよく一致した。本実施例で得られたＶ
−28−３Ｂメチルエステルは強い抗菌活性を示し、カン
ヂダ・アルビカンスATCC 10231に対する最小生育阻止濃
度は0.39μg/mlであった。

【００３２】実施例２ 実施例１と同様な方法で得たＶ−28−３Ｂメチルエステ
ルを含む反応液５ｌに10％になるようにニコチン酸アミ
ドを加え、ついで0.01Ｎになるよう６Ｎ塩酸を加え、実
施例１と同じ操作で５ｇのＶ−28−３Ｂメチルエステル
を得た。得られたＶ−28−３Ｂメチルエステルの理化学
的性質は表２に示した結果とよく一致し、抗真菌活性は
実施例１に示した結果と同様であった。

【００３３】実施例３ 実施例１と同様な方法で得たＶ−28−３Ｂメチルエステ
ルを含む反応液に１％になるようにニコチン酸アミド
と、0.01Ｎになるように濃塩酸を加えた。更に、50％メ
タノール水溶液となるようメタノールを加え、実施例１
と同じ操作で５ｇのＶ−28−３Ｂメチルエステルを得
た。得られたＶ−28−３Ｂメチルエステルの理化学的性
質、抗真菌活性は実施例１に示した結果と一致した。

【００３４】実施例４ 実施例１と同様な方法で得たＶ−28−３Ｂメチルエステ
ルを含む反応液に３％になるように尿素と0.03Ｎになる
ように水酸化アンモニウムを加え、50％エタノール水溶
液となるようにエタノールを加え、実施例１と同じ操作
で５ｇのＶ−28−３Ｂメチルエステルを得た。得られた
Ｖ−28−３Ｂメチルエステルは、実施例１と同様な理化
学的性質と抗真菌活性を示した。

【００３５】実施例５ 実施例１と同様な方法で得たＶ−28−３Ｂメチルエステ
ルを含む反応液に表３に示した各種溶媒を添加、溶解
し、実施例１と同じ操作でＶ−28−３Ｂメチルエステル
を単離、洗浄、凍結乾燥した結果、表３で示した量のＶ
−28−３Ｂメチルエステルが取得された。

【００３６】

【表３】

【００３７】因みに、(11)〜(17)が本発明に係わるもの
である。

【００３８】実施例６ 実施例１と同様な方法で得たＶ−28−３Ｂメチルエステ
ルを含む反応液に、１％となるようニコチン酸アミドと
0.02Ｎになるよう濃塩酸を加え、50％のプロパノール水
溶液になるようプロパノールを加えて、実施例１と同じ
操作で５ｇのＶ−28−３Ｂメチルエステルを得た。得ら
れたＶ−28−３Ｂメチルエステルは、実施例１と同様な
理化学的性質と抗真菌活性を示した。

【００３９】実施例７ 実施例１のメチルエステル化と同様な方法で得られたア
ンホテリシンＢメチルエステルを含む反応液に30％にな
るよう尿素水溶液を加え、ついで６Ｎ塩酸水溶液を0.00
1Ｎになるように加えた。30分室温にて攪拌後、不溶物
を含まないアンホテリシンＢメチルエステルの溶液とし
た。これを0.01Ｎになるように６Ｎ水酸化ナトリウムを
加えてアンホテリシンＢメチルエステルを沈澱させ、遠
心分離で沈澱物を回収した。該沈澱に水１ｌを加え洗浄
後、メタノール５ｌ、ついで水１ｌで再度洗浄した後凍
結乾燥した。その結果５ｇのアンホテリシンＢメチルエ
ステルが得られた。

【００４０】

【発明の効果】本発明によれば、メチルエステル化ポリ
エン系抗生物質を大量の有機溶剤を使用することなく、
しかも簡単にかつ効率的にその水性溶液から分離精製で
きる。これにより、工業的スケールでメチルエステル化
ポリエン系抗生物質の生産が安全に行なうことができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】パートリシンＢメチルエステルのＵＶスペクト
ル図である。

【図２】パートリシンＢメチルエステルの¹Ｈ−ＮＭＲ
スペクトル図である。

【図３】パートリシンＢメチルエステルの¹³Ｃ−ＮＭＲ
スペクトル図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリエン系抗生物質のメチルエステル化
   反応液またはこれからメチルエステル化ポリエン系抗生
   物質を分離取得する中間工程産物に、酸アミド、その誘
   導体、尿素またはその誘導体の少なくとも１種と酸を加
   えてメチルエテル化ポリエン系抗生物質の水性溶液を
   得、該水性溶液から不溶物を分離することを特徴とする
   メチルエステル化ポリエン系抗生物質の精製法。
2. 【請求項２】 請求項１の方法で不溶物を分離したメチ
   ルエステル化ポリエン系抗生物質を含む水性溶液に塩基
   を加えてpH12以上とし、生成したメチルエステル化ポリ
   エン系抗生物質の沈澱を分離することを特徴とするメチ
   ルエステル化ポリエン系抗生物質の精製法。