JPH0559703B2 - - Google Patents
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- JPH0559703B2 JPH0559703B2 JP59274108A JP27410884A JPH0559703B2 JP H0559703 B2 JPH0559703 B2 JP H0559703B2 JP 59274108 A JP59274108 A JP 59274108A JP 27410884 A JP27410884 A JP 27410884A JP H0559703 B2 JPH0559703 B2 JP H0559703B2
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- JP
- Japan
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- dna
- cephalosporin
- amino acid
- acid sequence
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
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- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明はセフアロスポリン・アシラーゼ産生遺
伝情報（以下セフアロスポリン・アシラーゼ遺伝
子と略記する）をになうDNA断片およびこれを
用いてセフアロスポリン・アシラーゼ産生能を有
するようになつた新規な大腸菌に関する。 〔従来の技術および発明が解決しようとする問題
点〕 セフアロスポリンＣは７位アミノ基に結合した
アシル基を除去する反応（以下脱アシル化と略記
する）により７−アミノセフアロスポラン酸（以
下7ACAと略記する）に誘導され、これを出発原
料として種々のセフアロスポリン系抗生物質が合
成され、医薬品として実用に供されている。 セフアロスポリンＣの脱アシル化方法としては
酵素的にあるいは微生物の作用で一段の反応で行
なう方法が工業的に有利であると想定され、すで
にいくつかの方法（米国特許No.3239394（1966）、
特開昭52−143289、特開昭53−94093、特開昭59
−44392）がある。しかしこれらの方法の工業的
利用に成功した例は知られていない。一方最近工
業的に有利な方法としてシユードモナス・エスピ
ー（Pseudomonas SP.）SE83（微工研菌寄第
7649号）によるセフアロスポリンＣより7ACAの
製造法が発明された（特願昭59−141475）。それ
によると該菌株は２種類のセフアロスポリン・ア
シラーゼを有し、そのうちの１酵素（アシラーゼ
型）はセフアロスポリンＣを直接脱アシル化し
て7ACAを生成させる（以下の記述ではこの酵素
をセフアロスポリンＣアシラーゼと呼称する）。
このことからセフアロスポリンＣアシラーゼのみ
を著量生産する菌株を造成すれば、工業的に飛躍
的に有利な7ACAの製造法が確立されると推定さ
れる。しかしながらセフアロスポリンＣアシラー
ゼのみを著量生産する菌株は従来得られなかつ
た。 〔問題を解決するための手段および作用〕 本発明者らはセフアロスポリンＣアシラーゼの
みを著量生産する菌株を得るために鋭意研究を行
なつた結果、シユードモナス属細菌SE83
〔Pseudomonas SP.SE83〕よりセフアロスポリ
ンＣアシラーゼ産生遺伝情報を担うDNA断片を
分離し、大腸菌でこれをクローニングすることに
成功し、該DNA断片をベクターに組みこんだ組
み換え体DNAを導入させた大腸菌がセフアロス
ポリンＣアシラーゼを著量に生産することを見い
出した。本発明者らはこれら知見に基づき本発明
を完成するに到つた。 即ち、基本的には、本発明によればシユードモ
ナス・エスピー（Pseudomonas SP.）由来であ
り、かつ (a) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列：
伝情報（以下セフアロスポリン・アシラーゼ遺伝
子と略記する）をになうDNA断片およびこれを
用いてセフアロスポリン・アシラーゼ産生能を有
するようになつた新規な大腸菌に関する。 〔従来の技術および発明が解決しようとする問題
点〕 セフアロスポリンＣは７位アミノ基に結合した
アシル基を除去する反応（以下脱アシル化と略記
する）により７−アミノセフアロスポラン酸（以
下7ACAと略記する）に誘導され、これを出発原
料として種々のセフアロスポリン系抗生物質が合
成され、医薬品として実用に供されている。 セフアロスポリンＣの脱アシル化方法としては
酵素的にあるいは微生物の作用で一段の反応で行
なう方法が工業的に有利であると想定され、すで
にいくつかの方法（米国特許No.3239394（1966）、
特開昭52−143289、特開昭53−94093、特開昭59
−44392）がある。しかしこれらの方法の工業的
利用に成功した例は知られていない。一方最近工
業的に有利な方法としてシユードモナス・エスピ
ー（Pseudomonas SP.）SE83（微工研菌寄第
7649号）によるセフアロスポリンＣより7ACAの
製造法が発明された（特願昭59−141475）。それ
によると該菌株は２種類のセフアロスポリン・ア
シラーゼを有し、そのうちの１酵素（アシラーゼ
型）はセフアロスポリンＣを直接脱アシル化し
て7ACAを生成させる（以下の記述ではこの酵素
をセフアロスポリンＣアシラーゼと呼称する）。
このことからセフアロスポリンＣアシラーゼのみ
を著量生産する菌株を造成すれば、工業的に飛躍
的に有利な7ACAの製造法が確立されると推定さ
れる。しかしながらセフアロスポリンＣアシラー
ゼのみを著量生産する菌株は従来得られなかつ
た。 〔問題を解決するための手段および作用〕 本発明者らはセフアロスポリンＣアシラーゼの
みを著量生産する菌株を得るために鋭意研究を行
なつた結果、シユードモナス属細菌SE83
〔Pseudomonas SP.SE83〕よりセフアロスポリ
ンＣアシラーゼ産生遺伝情報を担うDNA断片を
分離し、大腸菌でこれをクローニングすることに
成功し、該DNA断片をベクターに組みこんだ組
み換え体DNAを導入させた大腸菌がセフアロス
ポリンＣアシラーゼを著量に生産することを見い
出した。本発明者らはこれら知見に基づき本発明
を完成するに到つた。 即ち、基本的には、本発明によればシユードモ
ナス・エスピー（Pseudomonas SP.）由来であ
り、かつ (a) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列：
【表】
を含有する約26キロダルトン（KD）のサブユニ
ツトをコードするDNAと (b) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列：
ツトをコードするDNAと (b) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列：
【表】
を含有する約58KDのサブユニツトをコードする
DNAとを含有することを特徴とするセフアロス
ポリンＣアシラーゼ産生遺伝情報を担うDNA断
片が提供される。 また、本発明によれば、シユードモナス・エス
ピー（Pseudomonas SP.）由来であり、かつ (a) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列：
DNAとを含有することを特徴とするセフアロス
ポリンＣアシラーゼ産生遺伝情報を担うDNA断
片が提供される。 また、本発明によれば、シユードモナス・エス
ピー（Pseudomonas SP.）由来であり、かつ (a) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列：
【表】
を含有する約26キロダルトン（KD）のサブユニ
ツトをコードするDNAと (b) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列：
ツトをコードするDNAと (b) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列：
【表】
を含有する約58KDのサブユニツトをコードする
DNAとを含有することを特徴とするDNA断片を
ベクターに組みこんだ組換え体DNAが提供され
る。 更にまた、本発明によれば、シユードモナス・
エスピー（Pseudomonas SP.）由来であり、か
つ (a) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列：
DNAとを含有することを特徴とするDNA断片を
ベクターに組みこんだ組換え体DNAが提供され
る。 更にまた、本発明によれば、シユードモナス・
エスピー（Pseudomonas SP.）由来であり、か
つ (a) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列：
【表】
を含有する約26キロダルトン（KD）のサブユニ
ツトをコードするDNAと (b) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列：
ツトをコードするDNAと (b) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列：
実施例 １
セフアロスポリンＣアシラーゼ遺伝子の大腸菌
へのクローニング １ シユードモナスエスピー（Pseudomonas
SP.）SE83（微工研菌寄第7649号）の全DNAの
断片 シユードモナスエスピー（Pseudomonas SP.）
SE83（微工研菌寄第7649号）からの全DNAの抽
出はマーマー（Marmur）らの方法〔文献：ジエ
イ．モル．バイオル．（J.Mol.Biol.）、38巻227〜
239頁1961年〕に準じて行なう。DNAの切断のた
めには1μｇのDNAに対し、各0.3単位のBamH
およびBglを加え、37℃にて1.5時間反応を行な
わせた後、反応液と等量のフエノール・クロロホ
ルム混液（１：１，Ｖ／Ｖ）を加えて反応を停止
させる。この溶液を遠心分離してその水層をと
り、これに２倍量のエチルアルコールを加えて、
−20℃で２時間放置後、遠心分離によつてDNA
の沈殿を集め、真空中で乾燥した後、DNA緩衝
液（1mM Tris−HCl，0.1mM EDTA.PH8.0）
に溶解する。 ２ ベクターDNAの修飾および開裂 大腸菌用のベクターpBR325はβ−ラクタマー
ゼの遺伝子を保有し、この産物であるβ−ラクタ
マーゼがセフアロスポリン化合物を分解するた
め、本実験の目的には不都合である。そこで下記
のようにしてβ−ラクタマーゼ遺伝子が不活化さ
れたベクターを造成し、これをpSK12と命名し
た。すなわち1μｇのpBR325〔ベセスダリサーチ
ラボラトリー（Bethesda Research
Laboratories）社製〕に対し１単位のPstを作
用させ完全に開環させる。ついでこれにT4DNA
リガーゼを作用させて再び閉環させた後、反応物
をトランスホーメーシヨンによつてエシエリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）K12C600（ATCC
33525）に導入し、テトラサイクリン10μｇ／ml
をふくむＬ−ブロス（トリプトン１％、酵母エキ
ス0.5％、NaCl0.5％）寒天培地上に生育してくる
コロニーからアンピシリンに感受性になつた株を
分離する。そのうちの１株よりプラスミドDNA
を単離し、pSK12と命名した。pSK12の1μｇに
１単位のBam HIを加え、37℃で２時間反応させ
て完全に開裂させる。 ３ ベクターへのDNA断片の挿入 上記1.において切断されたSE83菌のDNA0.8μ
ｇと上記2.において開裂されたpSK12 0.4μｇを
100μのリガーゼ緩衝液（30mM Tris−HCl（PH
7.5）、10mM2−メルカプトエタノール、0.1mM
ATP）に混合し、１単位のT4DNAリガーゼを加
え、15℃にて２時間反応させる。その後70℃にて
10分間加熱することにより反応を停止させる。 ４ 組換え体DNAの大腸菌への導入 上記3.で得られた組換え体DNAをトランスホ
ーメーシヨンによりエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）K12MM294（ATCC 33625）
に導入し、クロラムフエニコール25μｇ／mlをふ
くむＬ−ブロス寒天培地上にコロニーを出現させ
る。出現したコロニーについてテトラサイクリン
をふくむＬ−ブロス寒天培地上で生育させ、生育
できないようなコロニーを組換え体DNAを保持
した大腸菌として分離する。 ５ セフアロスポリンＣアシラーゼ産生能を有す
る大腸菌の選択分離 上記4.で得られたテトラサイクリン感受性株を
クロラムフエニコールをふくむＬ−ブロス寒天培
地上で32℃にて一夜培養し、生育した菌にクロロ
ホルムの蒸気を15分間作用させ、その一部をかき
とつて100μの７−β−（４−カルボキシブタン
アミド）セフアロスポラン酸（１mg／ml）をふく
む0.1M燐酸緩衝液（PH7.5）に懸濁した後、37℃
にて５時間反応させる。その後120μの反応停
止液（100％酢酸２容と0.25MNaOH1容の混合
液）を加え、さらに40μの発色液（ｐ−ジメチ
ルアミノベンズアルデヒドを0.5％になるように
メタノールに加えた液）を加える。この反応でア
シラーゼ産生能を有する大腸菌は反応液を黄色に
変色させる。こうして選択された大腸菌をクロラ
ムフエニコールをふくむＬ−ブロス1.5mlに接種
し、37℃にて一夜振とう培養する。菌株を遠心分
離により集め、200μの0.1M燐酸緩衝液（PH
7.5）に懸濁し、クロロホルム10μを加えて37℃
にて30分振とうする。これに200μのセフアロ
スポリンＣ（15mgを１mlの0.1M燐酸緩衝液（PH
7.8）に溶解する）を加え、37℃で１時間反応さ
せる。反応液から菌株を除去した後、液を高速液
体クロマトグラフイーに供し7ACAを検出・定量
する。高速液体クロマトグラムのカラムはμ−
Bondapak C18（ウオーターズ社製、米国）を用
い、移動相としては５％酢酸アンモニウム98容と
アセトニトリル２容の混合液を用いて、検出は
260nmで行なう。 上記の試験の結果１株がセフアロスポリンＣか
ら副生物を生ずることなく7ACAを生成すること
が認められた。この株よりプラスミドDNAを抽
出し、プラスミドをもたない大腸菌に導入すると
プラスミドを導入された大腸菌はすべてセフアロ
スポリンＣから7ACAを生成する能力を保持する
ようになつた。このプラスミドはpAMK3と命名
され、これを導入された大腸菌はエシエリヒア・
コリ（Escherichia coli）K12MM294／pAMK3
と命名された。この菌株のセフアロスポリンＣか
らの7ACA生成能力を単位重量の菌株当りで比較
すると、シユードモナスエスピー
（Pseudomonas SP.）SE83の約５倍であつた。 ６ 組換え体DNAの制限酵素地図 プラスミドpAMK3のDNAを大腸菌より単離
し種種の制限酵素により切断し、構造を解析し
た。その結果第１図に示されるような制限酵素地
図を得た。この図よりpAMK3においてはpSK12
のBamHI部位に約6KbのDNA断片が挿入されて
いることが判明した。 実施例 ２ DNA断片上におけるセフアロスポリンＣアシ
ラーゼ遺伝子の位置づけと遺伝子読みとり方向
の決定 プラスミドpAMK3の4μｇをSmaで切断し、
つづいてHindで切断した後、反応物をアガロ
ースゲル電気泳動〔低融点アガロースゲル、ベセ
スダリサーチラボラトリー（Bethesda
Research Laboratories）社製、）1.2％〕にか
け、3.0Kbに相当するDNA断片をアガロースゲ
ルから切り取り、フエノールおよびフエノール・
クロロホルムで抽出精製し、エチルアルコール沈
殿によりDNAを回収する。ついでこのDNAに
DNAポリメラーゼＩ Klenowフラグメントと
４種類のデオキシヌクレオシド３燐酸（ATP，
GTP，CTP，TTP）を作用させることにより、
Hindにより生じた粘着末端を平滑末端に変え
る。 一方ベクターpSK12の0.5μｇをBam HIで開裂
させ、生じたBam HIによる粘着末端を同様にし
て平滑末端に変える。こうして得られた２種類の
DNAを混合し、T4リガーゼを作用させて結合・
閉環させる。ついでこれをエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）K12MM294に導入し、クロ
ラムフエニコール耐性になつたコロニーを選択す
る。得られたコロニーに関してセフアロスポリン
Ｃアシラーゼ活性の有無をしらべ、さらにそれら
が保有するプラスミドを分離し、制限酵素による
解析を行なう。 上記の実験を実施した結果、第２図及び第３図
に示される２種類の新規なプラスミドが得られ
た。得られたプラスミドをそれぞれpHS1および
pHS1′と命名した。得られた２種類のプラスミド
は、Hind−Smaで生じた断片がたがいに逆
方向に挿入されている他は同一の構造をしてい
た。このうちベクターpSK12上のテトラサイクリ
ン耐性プロモータに対してHind→Smaの方
向でDNA断片が挿入されたプラスミドPHS1を導
入された大腸菌は全てセフアロスポリンＣアシラ
ーゼ活性を示し、一方Sma→Hindの方向で
挿入されたプラスミドpHS1′を導入された大腸菌
は全てセフアロスポリンＣアシラーゼ活性を示さ
なかつた。 上記の結果より下記のような事実が判明した。 (1) セフアロスポリンＣアシラーゼ遺伝子はクロ
ーン化されたDNA断片上でHindとSma部
位の間に限定される。 (2) 遺伝子の読みとり方向はHind→Smaで
あり、かつ遺伝子の発現はベクター上のプロモ
ータに依存している。 実施例 ３ セフアロスポリンＣアシラーゼ蛋白のアミノ基
末端アミノ酸配列と遺伝子のDNA塩基配列 １ アミノ基末端アミノ酸配列決定 エシエリヒア・コリ（Escherichia coli）
K12MM294／pAMK3を培養して菌体を集め、
超音波破砕機で処理した後、その遠心上清から60
％飽和硫酸アンモニウムによる沈殿物をDEAEセ
フアデツクスA50（フアルマシア社製）カラムに
通し、NaClによる濃度勾配溶出法により溶出し
て、セフアロスポリンＣアシラーゼ活性画分を集
めた。ついでこの画分をクロマトフオーカシング
に供し、PH4.5で溶出される活性画分を集めた。
こうして得られた酵素蛋白をSDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（10％ゲル）に供したところ、
約26KDと約58KDの蛋白質が認められ、セフア
ロスポリンＣアシラーゼは２つのサブユニツトか
らなることが判明した。上記２つのサブユニツト
をゲルから抽出し、各々のアミノ基末端アミノ酸
配列を決定した。その結果、26KDサブユニツト
は下記：
へのクローニング １ シユードモナスエスピー（Pseudomonas
SP.）SE83（微工研菌寄第7649号）の全DNAの
断片 シユードモナスエスピー（Pseudomonas SP.）
SE83（微工研菌寄第7649号）からの全DNAの抽
出はマーマー（Marmur）らの方法〔文献：ジエ
イ．モル．バイオル．（J.Mol.Biol.）、38巻227〜
239頁1961年〕に準じて行なう。DNAの切断のた
めには1μｇのDNAに対し、各0.3単位のBamH
およびBglを加え、37℃にて1.5時間反応を行な
わせた後、反応液と等量のフエノール・クロロホ
ルム混液（１：１，Ｖ／Ｖ）を加えて反応を停止
させる。この溶液を遠心分離してその水層をと
り、これに２倍量のエチルアルコールを加えて、
−20℃で２時間放置後、遠心分離によつてDNA
の沈殿を集め、真空中で乾燥した後、DNA緩衝
液（1mM Tris−HCl，0.1mM EDTA.PH8.0）
に溶解する。 ２ ベクターDNAの修飾および開裂 大腸菌用のベクターpBR325はβ−ラクタマー
ゼの遺伝子を保有し、この産物であるβ−ラクタ
マーゼがセフアロスポリン化合物を分解するた
め、本実験の目的には不都合である。そこで下記
のようにしてβ−ラクタマーゼ遺伝子が不活化さ
れたベクターを造成し、これをpSK12と命名し
た。すなわち1μｇのpBR325〔ベセスダリサーチ
ラボラトリー（Bethesda Research
Laboratories）社製〕に対し１単位のPstを作
用させ完全に開環させる。ついでこれにT4DNA
リガーゼを作用させて再び閉環させた後、反応物
をトランスホーメーシヨンによつてエシエリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）K12C600（ATCC
33525）に導入し、テトラサイクリン10μｇ／ml
をふくむＬ−ブロス（トリプトン１％、酵母エキ
ス0.5％、NaCl0.5％）寒天培地上に生育してくる
コロニーからアンピシリンに感受性になつた株を
分離する。そのうちの１株よりプラスミドDNA
を単離し、pSK12と命名した。pSK12の1μｇに
１単位のBam HIを加え、37℃で２時間反応させ
て完全に開裂させる。 ３ ベクターへのDNA断片の挿入 上記1.において切断されたSE83菌のDNA0.8μ
ｇと上記2.において開裂されたpSK12 0.4μｇを
100μのリガーゼ緩衝液（30mM Tris−HCl（PH
7.5）、10mM2−メルカプトエタノール、0.1mM
ATP）に混合し、１単位のT4DNAリガーゼを加
え、15℃にて２時間反応させる。その後70℃にて
10分間加熱することにより反応を停止させる。 ４ 組換え体DNAの大腸菌への導入 上記3.で得られた組換え体DNAをトランスホ
ーメーシヨンによりエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）K12MM294（ATCC 33625）
に導入し、クロラムフエニコール25μｇ／mlをふ
くむＬ−ブロス寒天培地上にコロニーを出現させ
る。出現したコロニーについてテトラサイクリン
をふくむＬ−ブロス寒天培地上で生育させ、生育
できないようなコロニーを組換え体DNAを保持
した大腸菌として分離する。 ５ セフアロスポリンＣアシラーゼ産生能を有す
る大腸菌の選択分離 上記4.で得られたテトラサイクリン感受性株を
クロラムフエニコールをふくむＬ−ブロス寒天培
地上で32℃にて一夜培養し、生育した菌にクロロ
ホルムの蒸気を15分間作用させ、その一部をかき
とつて100μの７−β−（４−カルボキシブタン
アミド）セフアロスポラン酸（１mg／ml）をふく
む0.1M燐酸緩衝液（PH7.5）に懸濁した後、37℃
にて５時間反応させる。その後120μの反応停
止液（100％酢酸２容と0.25MNaOH1容の混合
液）を加え、さらに40μの発色液（ｐ−ジメチ
ルアミノベンズアルデヒドを0.5％になるように
メタノールに加えた液）を加える。この反応でア
シラーゼ産生能を有する大腸菌は反応液を黄色に
変色させる。こうして選択された大腸菌をクロラ
ムフエニコールをふくむＬ−ブロス1.5mlに接種
し、37℃にて一夜振とう培養する。菌株を遠心分
離により集め、200μの0.1M燐酸緩衝液（PH
7.5）に懸濁し、クロロホルム10μを加えて37℃
にて30分振とうする。これに200μのセフアロ
スポリンＣ（15mgを１mlの0.1M燐酸緩衝液（PH
7.8）に溶解する）を加え、37℃で１時間反応さ
せる。反応液から菌株を除去した後、液を高速液
体クロマトグラフイーに供し7ACAを検出・定量
する。高速液体クロマトグラムのカラムはμ−
Bondapak C18（ウオーターズ社製、米国）を用
い、移動相としては５％酢酸アンモニウム98容と
アセトニトリル２容の混合液を用いて、検出は
260nmで行なう。 上記の試験の結果１株がセフアロスポリンＣか
ら副生物を生ずることなく7ACAを生成すること
が認められた。この株よりプラスミドDNAを抽
出し、プラスミドをもたない大腸菌に導入すると
プラスミドを導入された大腸菌はすべてセフアロ
スポリンＣから7ACAを生成する能力を保持する
ようになつた。このプラスミドはpAMK3と命名
され、これを導入された大腸菌はエシエリヒア・
コリ（Escherichia coli）K12MM294／pAMK3
と命名された。この菌株のセフアロスポリンＣか
らの7ACA生成能力を単位重量の菌株当りで比較
すると、シユードモナスエスピー
（Pseudomonas SP.）SE83の約５倍であつた。 ６ 組換え体DNAの制限酵素地図 プラスミドpAMK3のDNAを大腸菌より単離
し種種の制限酵素により切断し、構造を解析し
た。その結果第１図に示されるような制限酵素地
図を得た。この図よりpAMK3においてはpSK12
のBamHI部位に約6KbのDNA断片が挿入されて
いることが判明した。 実施例 ２ DNA断片上におけるセフアロスポリンＣアシ
ラーゼ遺伝子の位置づけと遺伝子読みとり方向
の決定 プラスミドpAMK3の4μｇをSmaで切断し、
つづいてHindで切断した後、反応物をアガロ
ースゲル電気泳動〔低融点アガロースゲル、ベセ
スダリサーチラボラトリー（Bethesda
Research Laboratories）社製、）1.2％〕にか
け、3.0Kbに相当するDNA断片をアガロースゲ
ルから切り取り、フエノールおよびフエノール・
クロロホルムで抽出精製し、エチルアルコール沈
殿によりDNAを回収する。ついでこのDNAに
DNAポリメラーゼＩ Klenowフラグメントと
４種類のデオキシヌクレオシド３燐酸（ATP，
GTP，CTP，TTP）を作用させることにより、
Hindにより生じた粘着末端を平滑末端に変え
る。 一方ベクターpSK12の0.5μｇをBam HIで開裂
させ、生じたBam HIによる粘着末端を同様にし
て平滑末端に変える。こうして得られた２種類の
DNAを混合し、T4リガーゼを作用させて結合・
閉環させる。ついでこれをエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）K12MM294に導入し、クロ
ラムフエニコール耐性になつたコロニーを選択す
る。得られたコロニーに関してセフアロスポリン
Ｃアシラーゼ活性の有無をしらべ、さらにそれら
が保有するプラスミドを分離し、制限酵素による
解析を行なう。 上記の実験を実施した結果、第２図及び第３図
に示される２種類の新規なプラスミドが得られ
た。得られたプラスミドをそれぞれpHS1および
pHS1′と命名した。得られた２種類のプラスミド
は、Hind−Smaで生じた断片がたがいに逆
方向に挿入されている他は同一の構造をしてい
た。このうちベクターpSK12上のテトラサイクリ
ン耐性プロモータに対してHind→Smaの方
向でDNA断片が挿入されたプラスミドPHS1を導
入された大腸菌は全てセフアロスポリンＣアシラ
ーゼ活性を示し、一方Sma→Hindの方向で
挿入されたプラスミドpHS1′を導入された大腸菌
は全てセフアロスポリンＣアシラーゼ活性を示さ
なかつた。 上記の結果より下記のような事実が判明した。 (1) セフアロスポリンＣアシラーゼ遺伝子はクロ
ーン化されたDNA断片上でHindとSma部
位の間に限定される。 (2) 遺伝子の読みとり方向はHind→Smaで
あり、かつ遺伝子の発現はベクター上のプロモ
ータに依存している。 実施例 ３ セフアロスポリンＣアシラーゼ蛋白のアミノ基
末端アミノ酸配列と遺伝子のDNA塩基配列 １ アミノ基末端アミノ酸配列決定 エシエリヒア・コリ（Escherichia coli）
K12MM294／pAMK3を培養して菌体を集め、
超音波破砕機で処理した後、その遠心上清から60
％飽和硫酸アンモニウムによる沈殿物をDEAEセ
フアデツクスA50（フアルマシア社製）カラムに
通し、NaClによる濃度勾配溶出法により溶出し
て、セフアロスポリンＣアシラーゼ活性画分を集
めた。ついでこの画分をクロマトフオーカシング
に供し、PH4.5で溶出される活性画分を集めた。
こうして得られた酵素蛋白をSDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（10％ゲル）に供したところ、
約26KDと約58KDの蛋白質が認められ、セフア
ロスポリンＣアシラーゼは２つのサブユニツトか
らなることが判明した。上記２つのサブユニツト
をゲルから抽出し、各々のアミノ基末端アミノ酸
配列を決定した。その結果、26KDサブユニツト
は下記：
【表】
58KDサブユニツトは下記：
【表】
のアミノ基末端アミノ酸配列をもつことが判明し
た。 ２ DNA塩基配列決定 挿入DNA断片上の種々の制限酵素部位から
DNA塩基配列を読んだ。このうちMlu−近
傍の配列：
た。 ２ DNA塩基配列決定 挿入DNA断片上の種々の制限酵素部位から
DNA塩基配列を読んだ。このうちMlu−近
傍の配列：
【表】
が約26KDサブユニツトのアミノ基末端アミノ酸
配列と完全に一致するアミノ酸列をコード化して
いた。 またSac−近傍の配列：
配列と完全に一致するアミノ酸列をコード化して
いた。 またSac−近傍の配列：
【表】
が約58KDサブユニツトのアミノ基末端アミノ酸
配列と完全に一致するアミノ酸配列をコード化し
ていた。 約26KDサブユニツトのアミノ基末端をコード
化する配列の直前に蛋白合成開始コドン（ATG）
が存在し、この位置からトリプレツト・コドンを
組むと、第１表に示されるようなアミノ酸配列が
得られ、下記のことが判明した。 (1) 約26KDと約58KDサブユニツトのアミノ基
末端アミノ酸配列を連続したアミノ酸配列上に
正しく配列している。 (2) 約26KDサブユニツトのアミノ基末端アミノ
酸配列をコードするDNA塩基配列と約58KD
サブユニツトのアミノ基末端アミノ酸配列をコ
ードするDNA塩基配列の間には蛋白合成停止
コドン（TGA，TAA，TAG）は存在せず、
実施例２で限定されたHind−Sma断片の
Sma部位近傍ではじめて蛋白合成停止コド
ン（TGA）が出現する。 (3) 約26KDサブユニツトのアミノ基末端配列か
ら約58KDサブユニツトのアミノ基末端配列の
直前までのDNA塩基配列は約26KDの蛋白質
をコードし、約58KDサブユニツトのアミノ基
末端配列から蛋白合成停止コドンまでは約
58KDの蛋白質をコードする。 上記の事実により第１表に示されるDNA配列
がセフアロスポリンＣアシラーゼ遺伝子の最小単
位をふくむことが判明した。尚、第１表において
下線を引いてある部分のうちは約26KDのサブ
ユニツトのアミノ基末端アミノ酸配列に対応する
部分であり、は約58KDのサブユニツトのアミ
ノ基末端アミノ酸配列に対応する部分であること
を示す。
配列と完全に一致するアミノ酸配列をコード化し
ていた。 約26KDサブユニツトのアミノ基末端をコード
化する配列の直前に蛋白合成開始コドン（ATG）
が存在し、この位置からトリプレツト・コドンを
組むと、第１表に示されるようなアミノ酸配列が
得られ、下記のことが判明した。 (1) 約26KDと約58KDサブユニツトのアミノ基
末端アミノ酸配列を連続したアミノ酸配列上に
正しく配列している。 (2) 約26KDサブユニツトのアミノ基末端アミノ
酸配列をコードするDNA塩基配列と約58KD
サブユニツトのアミノ基末端アミノ酸配列をコ
ードするDNA塩基配列の間には蛋白合成停止
コドン（TGA，TAA，TAG）は存在せず、
実施例２で限定されたHind−Sma断片の
Sma部位近傍ではじめて蛋白合成停止コド
ン（TGA）が出現する。 (3) 約26KDサブユニツトのアミノ基末端配列か
ら約58KDサブユニツトのアミノ基末端配列の
直前までのDNA塩基配列は約26KDの蛋白質
をコードし、約58KDサブユニツトのアミノ基
末端配列から蛋白合成停止コドンまでは約
58KDの蛋白質をコードする。 上記の事実により第１表に示されるDNA配列
がセフアロスポリンＣアシラーゼ遺伝子の最小単
位をふくむことが判明した。尚、第１表において
下線を引いてある部分のうちは約26KDのサブ
ユニツトのアミノ基末端アミノ酸配列に対応する
部分であり、は約58KDのサブユニツトのアミ
ノ基末端アミノ酸配列に対応する部分であること
を示す。
【表】
【表】
実施例において詳述されたように本発明者らは
セフアロスポリンＣアシラーゼの２つのサブユニ
ツトに対応する遺伝情報を連続したDNA塩基配
列上に含有する明確に決定されたDNA断片を得
ることにより、飛躍的にすぐれたセフアロスポリ
ンＣアシラーゼ生産の前提条件を与えることがで
きた。上記DNA断片の酵素蛋白合成開始部位の
前に任意に強力なプロモータを結合させ、セフア
ロスポリンＣアシラーゼ生産能を増大し、かつ調
節しうることは公知の事実（たとえば文献：プリ
ブノー（Pribnow）（1979年）、バイオロジカル
レギユレーシヨン アンド デベロツプメント
（Biological Regulation and Development）、
第１巻231〜277頁プレナム プレス（Plenum
Press）社）により可能であり、実施例１におい
てその顕著な効果がみとめられる通りである。こ
のようにして得られた組換え体DNAを導入され
た新規な大腸菌は、もとのセフアロスポリンＣア
シラーゼ生産菌であるシユードモナス・エスピー
（Pseudomonas SP.）SE83よりも下記の点にお
いて格別すぐれた特徴をもつ。 (1) セフアロスポリンＣアシラーゼ活性が飛躍的
に増大する。 (2) 従来のSE83菌はセフアロスポリンＣに作用
する複数の酵素を保有し、かつこのためセフア
ロスポリンＣに作用して7ACA以外の化合物も
副生する。しかし新規な大腸菌はセフアロスポ
リンＣアシラーゼのみを生産し、この故にセフ
アロスポリンＣから直接に7ACAのみを効率よ
く生成させることができる。
セフアロスポリンＣアシラーゼの２つのサブユニ
ツトに対応する遺伝情報を連続したDNA塩基配
列上に含有する明確に決定されたDNA断片を得
ることにより、飛躍的にすぐれたセフアロスポリ
ンＣアシラーゼ生産の前提条件を与えることがで
きた。上記DNA断片の酵素蛋白合成開始部位の
前に任意に強力なプロモータを結合させ、セフア
ロスポリンＣアシラーゼ生産能を増大し、かつ調
節しうることは公知の事実（たとえば文献：プリ
ブノー（Pribnow）（1979年）、バイオロジカル
レギユレーシヨン アンド デベロツプメント
（Biological Regulation and Development）、
第１巻231〜277頁プレナム プレス（Plenum
Press）社）により可能であり、実施例１におい
てその顕著な効果がみとめられる通りである。こ
のようにして得られた組換え体DNAを導入され
た新規な大腸菌は、もとのセフアロスポリンＣア
シラーゼ生産菌であるシユードモナス・エスピー
（Pseudomonas SP.）SE83よりも下記の点にお
いて格別すぐれた特徴をもつ。 (1) セフアロスポリンＣアシラーゼ活性が飛躍的
に増大する。 (2) 従来のSE83菌はセフアロスポリンＣに作用
する複数の酵素を保有し、かつこのためセフア
ロスポリンＣに作用して7ACA以外の化合物も
副生する。しかし新規な大腸菌はセフアロスポ
リンＣアシラーゼのみを生産し、この故にセフ
アロスポリンＣから直接に7ACAのみを効率よ
く生成させることができる。
第１図はエシエリヒア・コリ（Escherichia
coli）K12 MM294／pAMK3より分離された組
換え体プラスミドの制限酵素地図である。第２図
および第３図はそれぞれ実施例２において造成さ
れたプラスミドpHS1およびpHS1′の制限酵素地
図である。図中に表示の3.0Kb内の詳細な地図は
pAMK3の相当する部分と同一である。また図中
に〓の記号で示してある部分はベクターpSK12上
のテトラサイクリン耐性プロモータの位置を示
す。
coli）K12 MM294／pAMK3より分離された組
換え体プラスミドの制限酵素地図である。第２図
および第３図はそれぞれ実施例２において造成さ
れたプラスミドpHS1およびpHS1′の制限酵素地
図である。図中に表示の3.0Kb内の詳細な地図は
pAMK3の相当する部分と同一である。また図中
に〓の記号で示してある部分はベクターpSK12上
のテトラサイクリン耐性プロモータの位置を示
す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ シユードモナス・エスピー（Pseudomonas
SP.）由来であり、かつ (a) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列： 【表】 を含有する約26キロダルトン（KD）のサブユニ
ツトをコードするDNAと (b) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列： 【表】 を含有する約58KDのサブユニツトをコードする
DNAとを含有することを特徴とするセフアロス
ポリンＣアシラーゼ産生遺伝情報を担うDNA断
片。 ２ 【表】 【表】 【表】 【表】 で表わされるアミノ酸配列をコードすることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載のDNA断片。 ３ シユードモナス・エスピー（Pseudomonas
SP.）由来であり、かつ (a) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列： 【表】 を含有する約26キロダルトン（KD）のサブユニ
ツトをコードするDNAと (b) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列： 【表】 を含有する約58KDのサブユニツトをコードする
DNAを含有することを特徴とするDNA断片をベ
クターに組み込んだ組換え体DNA。 ４ シユードモナス・エスピー（Pseudomonas
SP.）由来であり、かつ (a) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列： 【表】 を含有する約26キロダルトン（KD）のサブユニ
ツトをコードするDNAと (b) 下記のアミノ基末端アミノ酸配列： 【表】 を含有する約58KDのサブユニツトをコードする
DNAとを含有することを特徴とするDNA断片を
ベクターに組み込んだ組み換え体DNAを導入さ
せた大腸菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59274108A JPS61152286A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | セフアロスポリンｃアシラ−ゼ産生遺伝情報を担うｄｎａ断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59274108A JPS61152286A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | セフアロスポリンｃアシラ−ゼ産生遺伝情報を担うｄｎａ断片 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61152286A JPS61152286A (ja) | 1986-07-10 |
| JPH0559703B2 true JPH0559703B2 (ja) | 1993-08-31 |
Family
ID=17537113
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59274108A Granted JPS61152286A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | セフアロスポリンｃアシラ−ゼ産生遺伝情報を担うｄｎａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61152286A (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0829114B2 (ja) * | 1986-09-18 | 1996-03-27 | 旭化成工業株式会社 | ７−アミノセフアロスポラン酸およびその誘導体の製造法 |
| US4981789A (en) * | 1987-03-18 | 1991-01-01 | Merck & Co., Inc. | One-step enzymatic conversion of cephalosporin C and derivatives to 7-aminocephalosporanic acid and derivatives |
| US5229274A (en) * | 1989-06-27 | 1993-07-20 | Merck & Co., Inc. | Gene encoding one step cephalosporin C amidase and expression thereof in recombinant bacillus |
| US5104800A (en) * | 1989-06-27 | 1992-04-14 | Merck & Co., Inc. | One-step cephalosporin c amidase enzyme |
| GB9019724D0 (en) * | 1990-09-10 | 1990-10-24 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Cephalosporin c acylase |
| KR100227711B1 (ko) * | 1991-10-15 | 1999-12-01 | 한스 발터 라벤 | 7-아미노세팔로스포란산 및 7-아미노데아세틸세팔로스포란산 제조를 위한 신규한 생물학적 공정 |
| GB9204439D0 (en) * | 1992-02-27 | 1992-04-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co | A new cephalosporin c acylase |
| GB9423212D0 (en) * | 1994-11-17 | 1995-01-04 | Glaxo Group Ltd | Industrial enzymes |
| KR100530299B1 (ko) | 2003-08-11 | 2005-11-22 | 산도즈 게엠베하 | 변이 세팔로스포린 ｃ 아실라제 및 이를 이용한 7-ａｃａ 제조방법 |
-
1984
- 1984-12-27 JP JP59274108A patent/JPS61152286A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61152286A (ja) | 1986-07-10 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |