JPH07108225B2 - Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子 - Google Patents
Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子Info
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- JPH07108225B2 JPH07108225B2 JP61215878A JP21587886A JPH07108225B2 JP H07108225 B2 JPH07108225 B2 JP H07108225B2 JP 61215878 A JP61215878 A JP 61215878A JP 21587886 A JP21587886 A JP 21587886A JP H07108225 B2 JPH07108225 B2 JP H07108225B2
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- ser
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はトリゴノプシス・バリアビリス（Trigonopsis
variabilis）由来であり、セファロスポリンＣを酸化す
ることのできるＤ−アミノ酸オキシダーゼの遺伝子を担
うDNA断片およびこのDNA断片で形質転換されたＤ−アミ
ノ酸オキシダーザ産生能を有する新規な大腸菌に関す
る。
variabilis）由来であり、セファロスポリンＣを酸化す
ることのできるＤ−アミノ酸オキシダーゼの遺伝子を担
うDNA断片およびこのDNA断片で形質転換されたＤ−アミ
ノ酸オキシダーザ産生能を有する新規な大腸菌に関す
る。
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｄ−アミノ酸の酸化的脱
アミノ反応を触媒する酵素である。この酵素はDL−アミ
ノ酸ラセミ混合体からのＬ−アミノ酸分離、Ｄ−アミノ
酸からのケト酸の調製、あるいはアミノ酸の分析に応用
され、産業的に有用な特質をもつことが知られている。
この中で酵母トリゴノプシス・バリアビリスが生産する
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｄ−アミノ酸を酸化する
のみならず、抗生物質の一種であるセファロスポリンＣ
を酸化して７−β−（５−カルボキシ−５−オキソペン
タンアミド）セファロスポラン酸を生成させることで注
目されている。またこの化合物は同時に生成するH2O2と
反応して７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セフ
ァロスポラン酸を生成することが知られている。これら
の化合物は医薬として重要なセファロスポリン系抗生物
質合成の中間原料を提供するものであり（たとえば特公
昭50−7158）、さらにこれらの化合物にH2O2やある種の
セファロスポリン・アシラーゼを作用させてより有用な
中間原料である７−アミノセファロスポラン酸を製造す
る方法が発明されている（たとえば特公昭54−1703
2）。
アミノ反応を触媒する酵素である。この酵素はDL−アミ
ノ酸ラセミ混合体からのＬ−アミノ酸分離、Ｄ−アミノ
酸からのケト酸の調製、あるいはアミノ酸の分析に応用
され、産業的に有用な特質をもつことが知られている。
この中で酵母トリゴノプシス・バリアビリスが生産する
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｄ−アミノ酸を酸化する
のみならず、抗生物質の一種であるセファロスポリンＣ
を酸化して７−β−（５−カルボキシ−５−オキソペン
タンアミド）セファロスポラン酸を生成させることで注
目されている。またこの化合物は同時に生成するH2O2と
反応して７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セフ
ァロスポラン酸を生成することが知られている。これら
の化合物は医薬として重要なセファロスポリン系抗生物
質合成の中間原料を提供するものであり（たとえば特公
昭50−7158）、さらにこれらの化合物にH2O2やある種の
セファロスポリン・アシラーゼを作用させてより有用な
中間原料である７−アミノセファロスポラン酸を製造す
る方法が発明されている（たとえば特公昭54−1703
2）。
しかしながらこの酵素が上記の目的のために工業的に有
利に用いられるためには、容易にかつ安価に製造され、
他の諸反応と容易に連結されうることが必要であるが、
上記酵母菌によるＤ−アミノ酸オキシダーゼ生成には特
定の誘導条件を必要とし、また混在する他の種々の酵素
の生成を人為的に抑制することが困難である。このため
他の諸反応と連結させて有用物質生産をはかるには、複
雑な反応調整、あるいは該酵素の充分な程度までの分離
精製が要求される。
利に用いられるためには、容易にかつ安価に製造され、
他の諸反応と容易に連結されうることが必要であるが、
上記酵母菌によるＤ−アミノ酸オキシダーゼ生成には特
定の誘導条件を必要とし、また混在する他の種々の酵素
の生成を人為的に抑制することが困難である。このため
他の諸反応と連結させて有用物質生産をはかるには、複
雑な反応調整、あるいは該酵素の充分な程度までの分離
精製が要求される。
本発明者らは上記の問題を解決すべく鋭意研究を展開
し、トリゴノプシス・バリアビリスから、Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼ遺伝子を担うDNAを分離し、これを大腸菌
にクローニングすることに成功した。さらにこのDNA断
片に必要な修飾をほどこして、これをベクターに組みこ
んだ組換え体DNAを導入した大腸菌がＤ−アミノ酸オキ
シダーゼを著量に生産することを見出した。こうして本
発明者らはＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子のクローン
化によって、それを容易に発現させ、あるいはこの遺伝
子を容易に他の細胞に導入可能な形態に修飾することに
よって、この酵素の生産や応用が飛躍的に改良されうる
ことをみとめ、本発明を完成するにいたった。
し、トリゴノプシス・バリアビリスから、Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼ遺伝子を担うDNAを分離し、これを大腸菌
にクローニングすることに成功した。さらにこのDNA断
片に必要な修飾をほどこして、これをベクターに組みこ
んだ組換え体DNAを導入した大腸菌がＤ−アミノ酸オキ
シダーゼを著量に生産することを見出した。こうして本
発明者らはＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子のクローン
化によって、それを容易に発現させ、あるいはこの遺伝
子を容易に他の細胞に導入可能な形態に修飾することに
よって、この酵素の生産や応用が飛躍的に改良されうる
ことをみとめ、本発明を完成するにいたった。
すなわち本発明によれば、トリゴノプシス・バリアビリ
ス由来であり、かつ第１図に示される Ala−Lys−Ile−Val−Val−Ile−Gly−Ala−Gly−Val−
Ala−Gly−Leu−Thr−Thr−Ala−Leu−Gln−Leu−Leu−
Arg−Lys−Gly−His−Glu−Val−Thr−Ile−Val−Ser−
Glu−Phe−Thr−Pro−Gly−Asp−Leu−Ser−Ile−Gly−
Tyr−Thr−Ser−Pro−Trp−Ala−Gly−Ala−Asn−Trp−
Leu−Thr−Phe−Tyr−Asp−Gly−Gly−Lys−Leu−Ala−
Asp−Tyr−Asp−Ala−Val−Ser−Tyr−Pro−Ile−Leu−
Arg−Glu−Leu−Ala−Arg−Ser−Ser−Pro−Glu−Ala−
Gly−Ile−Arg−Leu−Ile−Asn−Gln−Arg−Ser−His−
Val−Leu−Lys−Arg−Asp−Leu−Pro−Lys−Leu−Glu−
Gly−Ala−Met−Ser−Ala−Ile−Cys−Gln−Arg−Asn−
Pro−Trp−Phe−Lys−Asn−Thr−Val−Asp−Ser−Phe−
Glu−Ile−Ile−Glu−Asp−Arg−Ser−Arg−Ile−Val−
His−Asp−Asp−Glu−Ala−Tyr−Leu−Val−Glu−Phe−
Arg−Ser−Val−Cys−Ile−His−Thr−Gly−Val−Tyr−
Leu−Asn−Trp−Leu−Met−Ser−Gln−Cys−Leu−Ser−
Leu−Gly−Ala−Thr−Val−Val−Lys−Arg−Arg−Val−
Asn−His−Ile−Lys−Asp−Ala−Asn−Leu−Leu−His−
Ser−Ser−Gly−Ser−Arg−Pro−Asp−Val−Ile−Val−
Asn−Cys−Ser−Gly−Leu−Phe−Ala−Arg−Phe−Leu−
Gly−Gly−Val−Glu−Asp−Lys−Lys−Met−Tyr−Pro−
Ile−Arg−Gly−Gln−Val−Val−Leu−Val−Arg−Asn−
Ser−Leu−Pro−Phe−Met−Ala−Ser−Phe−Ser−Ser−
Thr−Pro−Glu−Lys−Glu−Asn−Glu−Asp−Glu−Ala−
Leu−Tyr−Ile−Met−Thr−Arg−Phe−Asp−Gly−Thr−
Ser−Ile−Ile−Gly−Gly−Cys−Phe−Gln−Pro−Asn−
Asn−Trp−Ser−Ser−Glu−Pro−Asp−Pro−Ser−Leu−
Thr−His−Arg−Ile−Leu−Ser−Arg−Ala−Leu−Asp−
Arg−Phe−Pro−Glu−Leu−Thr−Lys−Asp−Gly−Pro−
Leu−Asp−Ile−Val−Arg−Glu−Cys−Val−Gly−His−
Arg−Pro−Gly−Arg−Glu−Gly−Gly−Pro−Arg−Val−
Glu−Leu−Glu−Lys−Ile−Pro−Gly−Val−Gly−Phe−
Val−Val−His−Asn−Tyr−Gly−Ala−Ala−Gly−Ala−
Gly−Tyr−Gln−Ser−Ser−Tyr−Gly−Met−Ala−Asp−
Glu−Ala−Val−Ser−Tyr−Val−Glu−Arg−Ala−Leu−
Thr−Arg−Pro−Asn−Leu であらわされるアミノ酸配列をコードするＤ−アミノ酸
オキシダーゼ遺伝子を担うDNA断片が提供される。
ス由来であり、かつ第１図に示される Ala−Lys−Ile−Val−Val−Ile−Gly−Ala−Gly−Val−
Ala−Gly−Leu−Thr−Thr−Ala−Leu−Gln−Leu−Leu−
Arg−Lys−Gly−His−Glu−Val−Thr−Ile−Val−Ser−
Glu−Phe−Thr−Pro−Gly−Asp−Leu−Ser−Ile−Gly−
Tyr−Thr−Ser−Pro−Trp−Ala−Gly−Ala−Asn−Trp−
Leu−Thr−Phe−Tyr−Asp−Gly−Gly−Lys−Leu−Ala−
Asp−Tyr−Asp−Ala−Val−Ser−Tyr−Pro−Ile−Leu−
Arg−Glu−Leu−Ala−Arg−Ser−Ser−Pro−Glu−Ala−
Gly−Ile−Arg−Leu−Ile−Asn−Gln−Arg−Ser−His−
Val−Leu−Lys−Arg−Asp−Leu−Pro−Lys−Leu−Glu−
Gly−Ala−Met−Ser−Ala−Ile−Cys−Gln−Arg−Asn−
Pro−Trp−Phe−Lys−Asn−Thr−Val−Asp−Ser−Phe−
Glu−Ile−Ile−Glu−Asp−Arg−Ser−Arg−Ile−Val−
His−Asp−Asp−Glu−Ala−Tyr−Leu−Val−Glu−Phe−
Arg−Ser−Val−Cys−Ile−His−Thr−Gly−Val−Tyr−
Leu−Asn−Trp−Leu−Met−Ser−Gln−Cys−Leu−Ser−
Leu−Gly−Ala−Thr−Val−Val−Lys−Arg−Arg−Val−
Asn−His−Ile−Lys−Asp−Ala−Asn−Leu−Leu−His−
Ser−Ser−Gly−Ser−Arg−Pro−Asp−Val−Ile−Val−
Asn−Cys−Ser−Gly−Leu−Phe−Ala−Arg−Phe−Leu−
Gly−Gly−Val−Glu−Asp−Lys−Lys−Met−Tyr−Pro−
Ile−Arg−Gly−Gln−Val−Val−Leu−Val−Arg−Asn−
Ser−Leu−Pro−Phe−Met−Ala−Ser−Phe−Ser−Ser−
Thr−Pro−Glu−Lys−Glu−Asn−Glu−Asp−Glu−Ala−
Leu−Tyr−Ile−Met−Thr−Arg−Phe−Asp−Gly−Thr−
Ser−Ile−Ile−Gly−Gly−Cys−Phe−Gln−Pro−Asn−
Asn−Trp−Ser−Ser−Glu−Pro−Asp−Pro−Ser−Leu−
Thr−His−Arg−Ile−Leu−Ser−Arg−Ala−Leu−Asp−
Arg−Phe−Pro−Glu−Leu−Thr−Lys−Asp−Gly−Pro−
Leu−Asp−Ile−Val−Arg−Glu−Cys−Val−Gly−His−
Arg−Pro−Gly−Arg−Glu−Gly−Gly−Pro−Arg−Val−
Glu−Leu−Glu−Lys−Ile−Pro−Gly−Val−Gly−Phe−
Val−Val−His−Asn−Tyr−Gly−Ala−Ala−Gly−Ala−
Gly−Tyr−Gln−Ser−Ser−Tyr−Gly−Met−Ala−Asp−
Glu−Ala−Val−Ser−Tyr−Val−Glu−Arg−Ala−Leu−
Thr−Arg−Pro−Asn−Leu であらわされるアミノ酸配列をコードするＤ−アミノ酸
オキシダーゼ遺伝子を担うDNA断片が提供される。
また、本発明によれば、上記DNA断片を大腸菌の宿主ベ
クター系で用いられるベクターに組込んだ組換え体DNA
が提供される。
クター系で用いられるベクターに組込んだ組換え体DNA
が提供される。
更にまた本発明によれば、上記DNA断片を組み込んだ組
換え体DNAで形質転換した新規な大腸菌が提供される。
換え体DNAで形質転換した新規な大腸菌が提供される。
本発明にかかるDNAおよび組換え体微生物は、大略下記
の工程によって造成することができる。
の工程によって造成することができる。
（１） トリゴノプシス・バリアビリスCBS4095から全D
NAを抽出し、制限酵素で切断した後、ベクターに組みこ
み、大腸菌に導入し、DNAライブラリーを作成する。ト
リゴノプシス・バリアビリスCBS4095は寄託機関である
セントラール・ビューロー・フォーア・シメルカルチュ
レス（Centraal Bureau voor Schimmelcultures）、オ
ランダ国に寄託番号4095号の下に寄託されている酵母で
ある。
NAを抽出し、制限酵素で切断した後、ベクターに組みこ
み、大腸菌に導入し、DNAライブラリーを作成する。ト
リゴノプシス・バリアビリスCBS4095は寄託機関である
セントラール・ビューロー・フォーア・シメルカルチュ
レス（Centraal Bureau voor Schimmelcultures）、オ
ランダ国に寄託番号4095号の下に寄託されている酵母で
ある。
（２） トリゴノプシス・バリアビリスCBS4095からセ
ファロスポリンＣを酸化する能力をもつＤ−アミノ酸オ
キシダーゼを抽出・精製し、アミノ基末端アミノ酸配列
を決定する。
ファロスポリンＣを酸化する能力をもつＤ−アミノ酸オ
キシダーゼを抽出・精製し、アミノ基末端アミノ酸配列
を決定する。
（３） 得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ基
末端アミノ酸配列の一部分について、これより推定され
る遺伝子のDNA塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの混
合物を合成し、これをDNAプローブと称する。
末端アミノ酸配列の一部分について、これより推定され
る遺伝子のDNA塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの混
合物を合成し、これをDNAプローブと称する。
（４） DNAプローブを32Pでラベルし、前記（１）で得
られたDNAライブラリーとコロニー・ハイブリダイゼー
ションを行なわせ、DNAプローブと相捕性を示した大腸
菌のコロニーを選択・分離する。
られたDNAライブラリーとコロニー・ハイブリダイゼー
ションを行なわせ、DNAプローブと相捕性を示した大腸
菌のコロニーを選択・分離する。
（５） 選択された大腸菌の菌株からプラスミドDNAを
とりだし、ベクターに組みこまれたトリゴノプシス・バ
リアビリスCBS4095由来のDNAの塩基配列を決定する。
とりだし、ベクターに組みこまれたトリゴノプシス・バ
リアビリスCBS4095由来のDNAの塩基配列を決定する。
（６） 決定されたDNA塩基配列中にＤ−アミノ酸オキ
シダーゼのアミノ基末端アミノ酸配列を正しくふくむア
ミノ酸配列の読取り枠を見出し、これをふくむDNA断片
に適当な修飾をほどこした上で、大腸菌の遺伝子発現の
ためのベクターに組みこみ、発現用の組換え体DNAを造
成する。
シダーゼのアミノ基末端アミノ酸配列を正しくふくむア
ミノ酸配列の読取り枠を見出し、これをふくむDNA断片
に適当な修飾をほどこした上で、大腸菌の遺伝子発現の
ためのベクターに組みこみ、発現用の組換え体DNAを造
成する。
（７） 発現用の組換え体DNAを宿主たる大腸菌に導入
し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを産生する新規な大腸菌
を造成する。
し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを産生する新規な大腸菌
を造成する。
上記の工程中でDNAの取扱いに必要な一般的な操作は当
業者ならば容易に行うことができるものであり、たとえ
ばモレキュラークローニング（Molecular Cloning）
〔ティー・マニアティス（T.Maniatis）ら、コールドス
プリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor L
aboratory）社（1982）〕のような実験操作書にしたが
えば、容易に実施できる。使用される酵素・試薬類もす
べて市販の製品が使用可能であり、特にことわらないか
ぎり製品で指定されている使用条件にしたがえば完全に
目的を達成することができる。上記工程（２）におい
て、トリゴノプシス・バリアビリスからのＤ−アミノ酸
オキシダーゼの精製は公知であり（たとえば文献：スワ
ジュセル（Szwajcer）ら（1985）バイオテクノロジーレ
ターズ（Biotechnology Letters）７,1−７）、また蛋
白質のアミノ酸配列の決定も公知である〔たとえば文
献：ハンカピラー（Hunkapiller）ら（1983）サイエン
ス（Science），219,650−659〕。上記工程（３）にお
いて指定された塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの混
合物の合成には、市販のDNA合成機を用い、その操作手
順にしたがって実施することができる。上記工程（５）
におけるDNA塩基配列の決定法も公知の方法を用いるこ
とができる〔たとえば文献：サンガー（Sanger）ら（19
77）プロシーディングスオブナショナルアカデミーサイ
エンスユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），74,5
463−5467〕。上記工程（６）において目的の遺伝子を
ふくむDNA断片を発現用ベクターに組みこむ際は、大腸
菌中で遺伝子が発現するのに障害となり得るトリゴノプ
シス・バリアビリスCBS4095由来のアミノ酸非コード領
域を削除する必要がある。このような特定のDNAの領域
を削除するには、合成オリゴヌクレオチドを用いて欠損
変異を誘導する公知の方法（たとえば文献：ゾラー（Zo
ller）ら（1983）メソッズインエンザイモロジー（Meth
ods Enzymol.），101,468−500）にしたがえばよい。ま
た発現用ベクターとしては宿主内で機能するプロモータ
ーやリボゾーム結合部位をそなえたものであればいずれ
でもよいが、セファロスポリンＣを基質とする場合は、
これを分解するβ−ラクタマーゼ遺伝子を保有しないか
あるいは不活化されているものも用いることが好まし
い。上記工程（７）において用いる宿主は、通常遺伝子
操作で用いられている大腸菌でよいが、大腸菌は本来セ
ファロスポリンＣを分解するセファロスポリナーゼを産
生するので、のぞもしくはこの遺伝子が欠損した宿主を
造成して用いる。またＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の
簡便な検出には、Ｏ−ジアニシジンを用いる公知の方法
〔たとえば文献：ヘドリック（Hedrick）ら（1968）ア
ーカイブスオブバイオケミストリーアンドバイオフィジ
ックス（Arch.Biochem.Biophys.），126,155−164〕を
用いることができる。
業者ならば容易に行うことができるものであり、たとえ
ばモレキュラークローニング（Molecular Cloning）
〔ティー・マニアティス（T.Maniatis）ら、コールドス
プリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor L
aboratory）社（1982）〕のような実験操作書にしたが
えば、容易に実施できる。使用される酵素・試薬類もす
べて市販の製品が使用可能であり、特にことわらないか
ぎり製品で指定されている使用条件にしたがえば完全に
目的を達成することができる。上記工程（２）におい
て、トリゴノプシス・バリアビリスからのＤ−アミノ酸
オキシダーゼの精製は公知であり（たとえば文献：スワ
ジュセル（Szwajcer）ら（1985）バイオテクノロジーレ
ターズ（Biotechnology Letters）７,1−７）、また蛋
白質のアミノ酸配列の決定も公知である〔たとえば文
献：ハンカピラー（Hunkapiller）ら（1983）サイエン
ス（Science），219,650−659〕。上記工程（３）にお
いて指定された塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの混
合物の合成には、市販のDNA合成機を用い、その操作手
順にしたがって実施することができる。上記工程（５）
におけるDNA塩基配列の決定法も公知の方法を用いるこ
とができる〔たとえば文献：サンガー（Sanger）ら（19
77）プロシーディングスオブナショナルアカデミーサイ
エンスユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），74,5
463−5467〕。上記工程（６）において目的の遺伝子を
ふくむDNA断片を発現用ベクターに組みこむ際は、大腸
菌中で遺伝子が発現するのに障害となり得るトリゴノプ
シス・バリアビリスCBS4095由来のアミノ酸非コード領
域を削除する必要がある。このような特定のDNAの領域
を削除するには、合成オリゴヌクレオチドを用いて欠損
変異を誘導する公知の方法（たとえば文献：ゾラー（Zo
ller）ら（1983）メソッズインエンザイモロジー（Meth
ods Enzymol.），101,468−500）にしたがえばよい。ま
た発現用ベクターとしては宿主内で機能するプロモータ
ーやリボゾーム結合部位をそなえたものであればいずれ
でもよいが、セファロスポリンＣを基質とする場合は、
これを分解するβ−ラクタマーゼ遺伝子を保有しないか
あるいは不活化されているものも用いることが好まし
い。上記工程（７）において用いる宿主は、通常遺伝子
操作で用いられている大腸菌でよいが、大腸菌は本来セ
ファロスポリンＣを分解するセファロスポリナーゼを産
生するので、のぞもしくはこの遺伝子が欠損した宿主を
造成して用いる。またＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の
簡便な検出には、Ｏ−ジアニシジンを用いる公知の方法
〔たとえば文献：ヘドリック（Hedrick）ら（1968）ア
ーカイブスオブバイオケミストリーアンドバイオフィジ
ックス（Arch.Biochem.Biophys.），126,155−164〕を
用いることができる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本
発明は下記の実施例に限定されるものではない。
発明は下記の実施例に限定されるものではない。
実施例１ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子のクローニングと大腸
菌における発現 1. トリゴノプシス・バリアビリスからの全DNAの抽出
と切断 クライヤー（Cryer）らの方法〔文献：メソッズインセ
ルバイオロジー（Methods in Cell Biology）12巻,39−
44,アカデミック プレス（Academic Press）社,1975〕
にしたがって、トリゴノプシス・バリアビリスCBS4095
から全DNAを抽出精製した。このDNA40μｇをとり、制限
酵素Mbo I4単位と37℃,15分間反応させた。反応液を等
量のフェノール・クロロホルム（1:1）で抽出し、DNAを
エタノールで沈殿させた後、0.1倍濃度のTE緩衝液〔10m
lトリス−塩酸（pH8.0）,1mM EDTA〕にとかした。得ら
れたDNA溶液の全量を0.7％アガロースゲル電気泳動に供
し、６〜9kbの大きさに相当するDNAをふくむ部分を切出
して、電気溶出法によりゲルからDNA断片を溶出させ
た。ついで溶出液を等量のフェノールおよびフェノール
・クロロホルムで順次抽出し、得られた水層にエタノー
ルを添加してDNAを沈殿させた後、0.1倍濃度のTE緩衝液
20μにとかした。
菌における発現 1. トリゴノプシス・バリアビリスからの全DNAの抽出
と切断 クライヤー（Cryer）らの方法〔文献：メソッズインセ
ルバイオロジー（Methods in Cell Biology）12巻,39−
44,アカデミック プレス（Academic Press）社,1975〕
にしたがって、トリゴノプシス・バリアビリスCBS4095
から全DNAを抽出精製した。このDNA40μｇをとり、制限
酵素Mbo I4単位と37℃,15分間反応させた。反応液を等
量のフェノール・クロロホルム（1:1）で抽出し、DNAを
エタノールで沈殿させた後、0.1倍濃度のTE緩衝液〔10m
lトリス−塩酸（pH8.0）,1mM EDTA〕にとかした。得ら
れたDNA溶液の全量を0.7％アガロースゲル電気泳動に供
し、６〜9kbの大きさに相当するDNAをふくむ部分を切出
して、電気溶出法によりゲルからDNA断片を溶出させ
た。ついで溶出液を等量のフェノールおよびフェノール
・クロロホルムで順次抽出し、得られた水層にエタノー
ルを添加してDNAを沈殿させた後、0.1倍濃度のTE緩衝液
20μにとかした。
2. ベクターDNAの開裂 ベクターpUC18 30μｇをBam HIで完全に開裂させ、得
られたDNA断片を0.1倍濃度のTE緩衝液20μにとかし
た。
られたDNA断片を0.1倍濃度のTE緩衝液20μにとかし
た。
3. ベクターへのDNA断片の挿入 上記工程１で得られた溶液と上記工程２で得られた溶液
を3:1の割合に混合し、T4・DNAリガーゼを15℃で６時間
反応させ、ベクターとトリゴノプシス・バリアビリスCB
S4095のDNA断片を結合させた。
を3:1の割合に混合し、T4・DNAリガーゼを15℃で６時間
反応させ、ベクターとトリゴノプシス・バリアビリスCB
S4095のDNA断片を結合させた。
4. トリゴノプシス・バリアビリスのDNAライブラリー
の作成 まず大腸菌宿主としてセファロスポリナーゼ欠損変異菌
株を造成した。すなわちエシェリヒア・コリ（Escheric
hia coli）MC1061（米国シカゴ大学マルコム カサダバ
ン（Malcom Casadaban）博士より入手。本菌の性質はジ
ャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（J.Mol.
Biol.），138,179−207,1980に記載されている）をＮ−
メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで処理
した後、セファロスポリンＣに対する感受性が増大した
コロニーを選択した。これらの中からセファロスポリナ
ーゼ活性をほとんど示さない株を選択分離し、その一株
をエシェリヒア・コリMB65と命名して宿主として用い
た。なお本変異株エシェリヒア・コリMB65は工業技術院
微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第8900号として寄
託されている。つぎに上記工程３で得られた組換え体DN
Aを形質転換によりエシェリヒア・コリMB65に導入し、
アンピシリン50μg/mlをふくむＬ−ブロス寒天培地上で
生育してきたコロニーを集めて、これをトリゴノプシス
・バリアビリスCBS4095のDNAライブラリーと称した。
の作成 まず大腸菌宿主としてセファロスポリナーゼ欠損変異菌
株を造成した。すなわちエシェリヒア・コリ（Escheric
hia coli）MC1061（米国シカゴ大学マルコム カサダバ
ン（Malcom Casadaban）博士より入手。本菌の性質はジ
ャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（J.Mol.
Biol.），138,179−207,1980に記載されている）をＮ−
メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで処理
した後、セファロスポリンＣに対する感受性が増大した
コロニーを選択した。これらの中からセファロスポリナ
ーゼ活性をほとんど示さない株を選択分離し、その一株
をエシェリヒア・コリMB65と命名して宿主として用い
た。なお本変異株エシェリヒア・コリMB65は工業技術院
微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第8900号として寄
託されている。つぎに上記工程３で得られた組換え体DN
Aを形質転換によりエシェリヒア・コリMB65に導入し、
アンピシリン50μg/mlをふくむＬ−ブロス寒天培地上で
生育してきたコロニーを集めて、これをトリゴノプシス
・バリアビリスCBS4095のDNAライブラリーと称した。
5. Ｄ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末端アミノ酸
配列の決定 トリゴノプシス・バイアビスCBS4095から前述のスワジ
ュセル（Szwajcer）らの方法にしたがってＤ−アミノ酸
オキシダーゼを精製した。精製した酵素蛋白質のアミノ
基末端のアミノ酸配列を前述の方法により解析し、アミ
ノ基末端から41番目までのアミノ酸配列を決定した。得
られたＮ−末端アミノ酸配列を次式にて表わす。
配列の決定 トリゴノプシス・バイアビスCBS4095から前述のスワジ
ュセル（Szwajcer）らの方法にしたがってＤ−アミノ酸
オキシダーゼを精製した。精製した酵素蛋白質のアミノ
基末端のアミノ酸配列を前述の方法により解析し、アミ
ノ基末端から41番目までのアミノ酸配列を決定した。得
られたＮ−末端アミノ酸配列を次式にて表わす。
Ala−Lys−Ile−Val−Val−Ile−Gly−Ala−Gly−Val−
Ala−Gly−Leu−Thr−Thr−Ala−Leu−Gln−Leu−Leu−
Arg−Lys−Gly−His−Glu−Val−Thr−Ile−Val−Ser−
Glu−Phe−Thr−Pro−Gly−Asp−Leu−Ser−Ile−Gly−
Tyr− 注：下線部はプローブ合成に用いられた配列を示す。
Ala−Gly−Leu−Thr−Thr−Ala−Leu−Gln−Leu−Leu−
Arg−Lys−Gly−His−Glu−Val−Thr−Ile−Val−Ser−
Glu−Phe−Thr−Pro−Gly−Asp−Leu−Ser−Ile−Gly−
Tyr− 注：下線部はプローブ合成に用いられた配列を示す。
6. DNAプローブの合成 上記工程５で得られたアミノ酸配列中から前記式中に下
線で示される２個所の配列を選択し、これらのアミノ酸
配列から推定される遺伝子上の可能なDNA塩基配列すべ
てをふくむオリゴヌクレオチド混合物を第１表に示すよ
うに合成した。すなわち各アミノ酸配列ごとに可能なオ
リゴヌクレオチドを２群にわけて合成して混合物をつく
り、これらをDNAプローブDAO−１とDAO−２およびDAO−
３とDAO−４と称した。オリゴヌクレオチドの合成はす
べてアプライド バイオシステム（Applied Biosyste
m）社のDNAシンセサイザー（Synthesizer）モデル380−
Ａを用いて行なった。
線で示される２個所の配列を選択し、これらのアミノ酸
配列から推定される遺伝子上の可能なDNA塩基配列すべ
てをふくむオリゴヌクレオチド混合物を第１表に示すよ
うに合成した。すなわち各アミノ酸配列ごとに可能なオ
リゴヌクレオチドを２群にわけて合成して混合物をつく
り、これらをDNAプローブDAO−１とDAO−２およびDAO−
３とDAO−４と称した。オリゴヌクレオチドの合成はす
べてアプライド バイオシステム（Applied Biosyste
m）社のDNAシンセサイザー（Synthesizer）モデル380−
Ａを用いて行なった。
7. DNAライブラリーからＤ−アミノ酸アキシダーゼ・
クローンの候補の選択・分離 上記工程６で得られたDNAプローブを各々イングリア（I
nglia）らの方法〔文献：ヌクレイックアシッドリサー
チ（Nucleic Acids Res.），９,1627−1642,1982〕にし
たがってT4ポリヌクレオチドキナーゼとγ−32P−ATPを
用いてラベルした。つぎにDNAライブラリーである前記
工程４で得られた大腸菌をアンピシリン50μg/mlをふく
むＬ−ブロス寒天培地上でコロニーとして生育させ、こ
れをレプリカ法によってワットマン（Whatman）541紙
へうつし、リゾチーム溶菌し、アルカリでDNA変性さ
せ、塩酸による中和処理を行なった後、DAO−１およびD
AO−２とハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイ
ゼーションは６倍濃度のSSC（0.15M NaCl,0.015Mクエン
酸ナトリウム,pH7.0）,0.5％ノニデットＰ−40（シグマ
社、米国製）、DAO−１あるいはDAO−２約２×105cpm/m
lを用いて、44℃で１時間半行ない、この後６倍濃度のS
SCを用いて室温で２回、つづいて６倍濃度のSSCを用い
て44℃で１回紙を洗浄した。この後紙を乾燥させ、
オートラジオグラフィ（感光条件：−80℃,3時間）に供
した。その結果、DAO−１またはDAO−２に対しハイブリ
ダイゼーション陽性のコロニーが多数見出された。そこ
で陽性のコロニーから40株をとりあげ、液体培養した
後、バーンボイム（Birnboim）らの方法〔文献：ヌクレ
イックアシッドリサーチ（Nucleic Acids Res.），７,1
513−1523,1979〕によりプラスミドDNAを調製した。つ
いでこれらのDNAを常法により変性させた後、ニトロセ
ルロースフィルターにスポットして、DNAプローブとハ
イブリダイゼーションさせた。ハイブリダーゼーション
は６倍濃度のSSC、10倍濃度のデンハルト（Denhardt）
液（0.02％フィコール、0.02％ポリビニルピロリドン、
0.02％牛血清アルブミン）およびラベルしたDNAプロー
ブを用いて、44℃（DAO−１およびDAO−２の場合）また
は40℃（DAO−３およびDAO−４の場合）で１時間行な
い、この後６倍濃度のSSCを用いて室温で１回、ついで4
4℃（DAO−１およびDAO−２の場合）または40℃（DAO−
３およびDAO−４の場合）では１回洗浄した。この後フ
ィルターをオートラジオグラフィー（感光条件：−80
℃,3時間）に供した結果、DAO−１あるいはDAO−２にハ
イブリダイゼーション陽性を示すものでかつDAO−３あ
るいはDAO−４にも陽性を示すものが６株見出された。
これら６株からのプラスミドDNAを種々の制限酵素で切
断し、アガロースゲル電気泳動を行なった後、ラベルし
たDNAプローブとサザン・ハイブリダイゼーション〔方
法については文献：サザン（Southern）（1975）ジャー
ナルオブモレキュラーバイオロジー（J.Mol.Biol.），9
8,503−517）を行なった。その結果、EcoR I切断で生成
する約0.6kbのDNA断片にDAO−２とDAO−３またはDAO−
４が強くハイブリダイゼーション陽性を示すプラスミド
DNAが見出された。このプラスミドをpDAOC2−12と命名
し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ・クローンの候補とし
た。
クローンの候補の選択・分離 上記工程６で得られたDNAプローブを各々イングリア（I
nglia）らの方法〔文献：ヌクレイックアシッドリサー
チ（Nucleic Acids Res.），９,1627−1642,1982〕にし
たがってT4ポリヌクレオチドキナーゼとγ−32P−ATPを
用いてラベルした。つぎにDNAライブラリーである前記
工程４で得られた大腸菌をアンピシリン50μg/mlをふく
むＬ−ブロス寒天培地上でコロニーとして生育させ、こ
れをレプリカ法によってワットマン（Whatman）541紙
へうつし、リゾチーム溶菌し、アルカリでDNA変性さ
せ、塩酸による中和処理を行なった後、DAO−１およびD
AO−２とハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイ
ゼーションは６倍濃度のSSC（0.15M NaCl,0.015Mクエン
酸ナトリウム,pH7.0）,0.5％ノニデットＰ−40（シグマ
社、米国製）、DAO−１あるいはDAO−２約２×105cpm/m
lを用いて、44℃で１時間半行ない、この後６倍濃度のS
SCを用いて室温で２回、つづいて６倍濃度のSSCを用い
て44℃で１回紙を洗浄した。この後紙を乾燥させ、
オートラジオグラフィ（感光条件：−80℃,3時間）に供
した。その結果、DAO−１またはDAO−２に対しハイブリ
ダイゼーション陽性のコロニーが多数見出された。そこ
で陽性のコロニーから40株をとりあげ、液体培養した
後、バーンボイム（Birnboim）らの方法〔文献：ヌクレ
イックアシッドリサーチ（Nucleic Acids Res.），７,1
513−1523,1979〕によりプラスミドDNAを調製した。つ
いでこれらのDNAを常法により変性させた後、ニトロセ
ルロースフィルターにスポットして、DNAプローブとハ
イブリダイゼーションさせた。ハイブリダーゼーション
は６倍濃度のSSC、10倍濃度のデンハルト（Denhardt）
液（0.02％フィコール、0.02％ポリビニルピロリドン、
0.02％牛血清アルブミン）およびラベルしたDNAプロー
ブを用いて、44℃（DAO−１およびDAO−２の場合）また
は40℃（DAO−３およびDAO−４の場合）で１時間行な
い、この後６倍濃度のSSCを用いて室温で１回、ついで4
4℃（DAO−１およびDAO−２の場合）または40℃（DAO−
３およびDAO−４の場合）では１回洗浄した。この後フ
ィルターをオートラジオグラフィー（感光条件：−80
℃,3時間）に供した結果、DAO−１あるいはDAO−２にハ
イブリダイゼーション陽性を示すものでかつDAO−３あ
るいはDAO−４にも陽性を示すものが６株見出された。
これら６株からのプラスミドDNAを種々の制限酵素で切
断し、アガロースゲル電気泳動を行なった後、ラベルし
たDNAプローブとサザン・ハイブリダイゼーション〔方
法については文献：サザン（Southern）（1975）ジャー
ナルオブモレキュラーバイオロジー（J.Mol.Biol.），9
8,503−517）を行なった。その結果、EcoR I切断で生成
する約0.6kbのDNA断片にDAO−２とDAO−３またはDAO−
４が強くハイブリダイゼーション陽性を示すプラスミド
DNAが見出された。このプラスミドをpDAOC2−12と命名
し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ・クローンの候補とし
た。
8. Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ・クローンの同定とDNA
塩基配列の決定 プラスミドpDAOC2−12よりEcoR I切断により生成する0.
6kbのDNA断片について、前述のサンガー（Sanger）らの
方法に従ってDNA塩基配列を決定した。その結果、第２
図に示されるように真核生物の遺伝子中に存在するイン
トロン様の配列をはさんで、上記工程５で得られたＤ−
アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末端のアミノ酸配列に
完全に一致するアミノ酸配列をコードする塩基配列が見
出され、この断片がＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の
一部をふくむことが明らかになった。プラスミドpDAOC2
−12については、制限酵素切断の結果にもとづいて第３
図にあらわされる制限酵素開裂地図を作成した。上記の
結果にもとづいて、すでに決定された塩基配列から遺伝
子読取り方向の下流にあたる領域についてDNA塩基配列
を決定したところ、第１図に示される355個のアミノ酸
よりなる蛋白質をコードする塩基配列が存在することが
判明した（第１図では第２図で示されたイントロン様配
列を削除して表示してある）。かくしてプラスミドpDAO
C2−12中のトリゴノプシス・バリアビリスCBS4095由来
のDNA断片中にはＤ−アミノ酸オキシダーゼの構造遺伝
子が完全にふくまれているものと推定される。
塩基配列の決定 プラスミドpDAOC2−12よりEcoR I切断により生成する0.
6kbのDNA断片について、前述のサンガー（Sanger）らの
方法に従ってDNA塩基配列を決定した。その結果、第２
図に示されるように真核生物の遺伝子中に存在するイン
トロン様の配列をはさんで、上記工程５で得られたＤ−
アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末端のアミノ酸配列に
完全に一致するアミノ酸配列をコードする塩基配列が見
出され、この断片がＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の
一部をふくむことが明らかになった。プラスミドpDAOC2
−12については、制限酵素切断の結果にもとづいて第３
図にあらわされる制限酵素開裂地図を作成した。上記の
結果にもとづいて、すでに決定された塩基配列から遺伝
子読取り方向の下流にあたる領域についてDNA塩基配列
を決定したところ、第１図に示される355個のアミノ酸
よりなる蛋白質をコードする塩基配列が存在することが
判明した（第１図では第２図で示されたイントロン様配
列を削除して表示してある）。かくしてプラスミドpDAO
C2−12中のトリゴノプシス・バリアビリスCBS4095由来
のDNA断片中にはＤ−アミノ酸オキシダーゼの構造遺伝
子が完全にふくまれているものと推定される。
9. Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の修飾 クローニングされたＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子が
大腸菌で発現する上で障害となりうるDNA塩基配列部分
をプラスミドpDAOC2−12中のトリゴノプシス・バリアビ
リスCBS4095由来のDNA断片から第４図に示される工程に
したがって削除した。以下に各工程を詳述する。
大腸菌で発現する上で障害となりうるDNA塩基配列部分
をプラスミドpDAOC2−12中のトリゴノプシス・バリアビ
リスCBS4095由来のDNA断片から第４図に示される工程に
したがって削除した。以下に各工程を詳述する。
（１） プラスミドpDAOC2−12 40μｇをEcoR IとHind
IIIで切断し、得られる約0.45kbの断片を精製した後、
その0.8μｇにdATP,dGTP,dCTP,TTPを終濃度各0.33mM,DN
Aポリメラーゼクレノウ（Klenow）断片５単位を加え、1
0mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM MgCl2、1mMジチオス
レイトール、50mM NaClの反応液30μ中で30℃,20分間
反応させた。これにより両端が平滑端にされたDNA断片
を精製し、その約0.2μｇにBamH Iリンカー（0.0175O.
D.）とT4 DNAリガーゼ１単位を加え、50mMトリス−酢酸
（pH7.5）、10mM MgCl2、0.5mM ATP、5mMジチオスレイ
トールの反応液20μ中で15℃、一夜反応させた。反応
後DNA断片を精製し、EcoR IとBamH Iで両端を切断し、E
coR I−BamH I断片として回収した。一方ファージM13mp
18の２本鎖DNAをEcoR IとBamH Iで切断した後、これに
上記のEcoR I−BamH I断片を加え、T4 DNAリガーゼで結
合させて、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一部を組
みこんだファージM13M2−12−７を造成した。
IIIで切断し、得られる約0.45kbの断片を精製した後、
その0.8μｇにdATP,dGTP,dCTP,TTPを終濃度各0.33mM,DN
Aポリメラーゼクレノウ（Klenow）断片５単位を加え、1
0mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM MgCl2、1mMジチオス
レイトール、50mM NaClの反応液30μ中で30℃,20分間
反応させた。これにより両端が平滑端にされたDNA断片
を精製し、その約0.2μｇにBamH Iリンカー（0.0175O.
D.）とT4 DNAリガーゼ１単位を加え、50mMトリス−酢酸
（pH7.5）、10mM MgCl2、0.5mM ATP、5mMジチオスレイ
トールの反応液20μ中で15℃、一夜反応させた。反応
後DNA断片を精製し、EcoR IとBamH Iで両端を切断し、E
coR I−BamH I断片として回収した。一方ファージM13mp
18の２本鎖DNAをEcoR IとBamH Iで切断した後、これに
上記のEcoR I−BamH I断片を加え、T4 DNAリガーゼで結
合させて、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一部を組
みこんだファージM13M2−12−７を造成した。
（２） イントロン様配列を削除するために、第４図に
示されるようにイントロン様配列の前後を直結した配列
に相捕するオリゴヌクレオチドを合成し、DAOE1と命名
した。DAOE1 25pmoleとM13プライマーM1（宝酒造社製）
10pmoleをT4ポリヌクレオチドキナーゼでりん酸化し、
メッシング（Messing）の方法〔文献：メソッズインエ
ンザイモロジー（Methods Enzymol.），101,20−78,198
3〕にしたがって調製したファージM13M2−12−７の１本
鎖DNA約0.5pmoleを加え、95℃で５分間加熱後室温にな
るまで放置した。ついでこれにdATP,dGTP,dCTP,TTP（各
0.4mM）,ATP（0.4mM）,DNAポリメラーゼクレノウ（Klen
ow）断片（５単位）、T4 DNAリガーゼ（２単位）を加
え、各7mMのトリス−塩酸（pH7.5）、MgCl2,NaClおよび
14mMのジチオスレイトールの反応液50μ中で37℃,30
分間反応させた。0.5MのEDTA5μを加えて反応停止
後、メッシング（Messing）の方法〔文献前出）にした
がってエシェリヒア・コリ（Escherchia coli）JM105を
反応液でトランスフェクション処理し、ファージ導入菌
をプラークとして検出した。出現したファージ・プラー
クをプラーク・ハイブリダイゼーション法〔文献：ベン
トン（Benton）ら（1977）サイエンス（Science），19
6,180−182〕によって32PでラベルしたDAOE1とハイブリ
ダイゼーションさせ、陽性を示したプラークを見出し
た。陽性プラーク中のファージを再度エシェリヒア・コ
リJM105に感染させて、上記と同様にしてDAOE1とハイブ
リダイゼーションを示すプラークを純化して分離した
後、プラーク中に存在するファージを常法によって液体
培養し、１本鎖DNAを分離した。得られた１本鎖DNAの塩
基配列を解析したところ、予定通りイントロン様配列を
欠失した塩基配列をもつトリゴノプシス・バリアビリス
CBS4095由来のDNA断片をもつことが判明したので、この
ファージをM13ME1と命名した。
示されるようにイントロン様配列の前後を直結した配列
に相捕するオリゴヌクレオチドを合成し、DAOE1と命名
した。DAOE1 25pmoleとM13プライマーM1（宝酒造社製）
10pmoleをT4ポリヌクレオチドキナーゼでりん酸化し、
メッシング（Messing）の方法〔文献：メソッズインエ
ンザイモロジー（Methods Enzymol.），101,20−78,198
3〕にしたがって調製したファージM13M2−12−７の１本
鎖DNA約0.5pmoleを加え、95℃で５分間加熱後室温にな
るまで放置した。ついでこれにdATP,dGTP,dCTP,TTP（各
0.4mM）,ATP（0.4mM）,DNAポリメラーゼクレノウ（Klen
ow）断片（５単位）、T4 DNAリガーゼ（２単位）を加
え、各7mMのトリス−塩酸（pH7.5）、MgCl2,NaClおよび
14mMのジチオスレイトールの反応液50μ中で37℃,30
分間反応させた。0.5MのEDTA5μを加えて反応停止
後、メッシング（Messing）の方法〔文献前出）にした
がってエシェリヒア・コリ（Escherchia coli）JM105を
反応液でトランスフェクション処理し、ファージ導入菌
をプラークとして検出した。出現したファージ・プラー
クをプラーク・ハイブリダイゼーション法〔文献：ベン
トン（Benton）ら（1977）サイエンス（Science），19
6,180−182〕によって32PでラベルしたDAOE1とハイブリ
ダイゼーションさせ、陽性を示したプラークを見出し
た。陽性プラーク中のファージを再度エシェリヒア・コ
リJM105に感染させて、上記と同様にしてDAOE1とハイブ
リダイゼーションを示すプラークを純化して分離した
後、プラーク中に存在するファージを常法によって液体
培養し、１本鎖DNAを分離した。得られた１本鎖DNAの塩
基配列を解析したところ、予定通りイントロン様配列を
欠失した塩基配列をもつトリゴノプシス・バリアビリス
CBS4095由来のDNA断片をもつことが判明したので、この
ファージをM13ME1と命名した。
（３） つぎにＤ−アミノ酸オキシダーゼ蛋白質合成開
始部位（ATG）よりも上流にあるトリゴノプシス・バリ
アビリスCBS4095由来のアミノ酸非コード領域を削除す
るために、第４図に示されるようにこの領域の前後を直
結した配列に相捕するポリヌクレオチドを合成し、DAOE
2と命名した。ついでDAOE2とファージM13ME1の１本鎖DN
Aとから、上記工程（２）でのべた方法と同一の工程に
したがって、イントロン様配列の削除に加えてATGより
上流のアミノ酸非コード領域をも削除されたＤ−アミノ
酸オキシダーゼ遺伝子の一部を保有するファージを造成
し、これをM13ME12と命名した。
始部位（ATG）よりも上流にあるトリゴノプシス・バリ
アビリスCBS4095由来のアミノ酸非コード領域を削除す
るために、第４図に示されるようにこの領域の前後を直
結した配列に相捕するポリヌクレオチドを合成し、DAOE
2と命名した。ついでDAOE2とファージM13ME1の１本鎖DN
Aとから、上記工程（２）でのべた方法と同一の工程に
したがって、イントロン様配列の削除に加えてATGより
上流のアミノ酸非コード領域をも削除されたＤ−アミノ
酸オキシダーゼ遺伝子の一部を保有するファージを造成
し、これをM13ME12と命名した。
10. 発現ベクターの造成 本実施例に用いられる発現用ベクター造成の出発プラス
ミドであるpAKKM1は公知の文献マツダ（Matsuda）ら（1
985）ジャーナルオブバクテリオロジー（J.Bacterio
l.），163,1222−1228にその造成方法が示されており、
β−ラクタマーゼ遺伝子が不活化された特徴をもつ。第
５図に示すように、まずpAKKM1をEcoR IとBamH Iで切断
し、これより約5kbのDNA断片を分離・精製した。一方la
c UV5プロモーターをふくむプラスミドpRZ4022〔米国ウ
ィスコンシン大学ダブリュー・レズニコフ（W.Reznikof
f）博士より入手〕をEcoR IとBamH Iで切断することに
よりlac UV5プロモーターを含む95bpの断片を調製し
た。ついで上記２断片をT4 DNAリガーゼを用いて結合さ
せ、発現用ベクターpEX002を得た。なお上記で用いたプ
ラスミドpRZ4022はギルバート（Gilbert）らの方法〔文
献：プロシーディングスオブナショナルアカデミーサイ
エンスユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），70,3
581−3584,1973〕にしたがってlac−UV5プロモーターを
ふくむ95bpのALu I断片を調製し、pBR322のEcoR I−Bam
H I部位に置換挿入することによって造成される。
ミドであるpAKKM1は公知の文献マツダ（Matsuda）ら（1
985）ジャーナルオブバクテリオロジー（J.Bacterio
l.），163,1222−1228にその造成方法が示されており、
β−ラクタマーゼ遺伝子が不活化された特徴をもつ。第
５図に示すように、まずpAKKM1をEcoR IとBamH Iで切断
し、これより約5kbのDNA断片を分離・精製した。一方la
c UV5プロモーターをふくむプラスミドpRZ4022〔米国ウ
ィスコンシン大学ダブリュー・レズニコフ（W.Reznikof
f）博士より入手〕をEcoR IとBamH Iで切断することに
よりlac UV5プロモーターを含む95bpの断片を調製し
た。ついで上記２断片をT4 DNAリガーゼを用いて結合さ
せ、発現用ベクターpEX002を得た。なお上記で用いたプ
ラスミドpRZ4022はギルバート（Gilbert）らの方法〔文
献：プロシーディングスオブナショナルアカデミーサイ
エンスユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），70,3
581−3584,1973〕にしたがってlac−UV5プロモーターを
ふくむ95bpのALu I断片を調製し、pBR322のEcoR I−Bam
H I部位に置換挿入することによって造成される。
11. Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の発現 第６図にＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換え
体の造成工程を示す。まずファージM13ME12の２本鎖DNA
よりEcoR IおよびBamH I切断により約0.3kbのＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼのアミノ酸末端部分をコードするDNA
断片を分離した。ついでpDAOC2−12よりEcoR IおよびSa
l I切断によりM13ME12にふくまれている部分をのぞく約
1.2kbのＤ−アミノ酸オキシダーゼの構造遺伝子部分を
コードするDNA断片を分離した。さらに発現用ベクターp
EX002をBamH IおよびXho Iで切断した後、上記の２つの
断片と混合し、T4 DNAリガーゼで結合反応を行なわせ
た。その反応液を用いてエシェリヒア・コリMB65を形質
転換し、カナマイシン40μg/mlをふくむＬ−ブロス寒天
培地上で生育してくるコロニーを選択した。得られたコ
ロニーについて、Ｄ−メチオニンを基質とし、Ｏ−ジア
ニシジンを用いるＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の検出
（方法に関する文献前出）を行なった結果、多数の陽性
コロニーを得た。この中の１株からプラスミドDNAを抽
出し、これをpEDAO1と命名し、制限酵素切断により第６
図に示される構造を確認した。またこの組換え体を保有
する大腸菌をエシェリヒア・コリMB65/pEDAO1と命名し
た。
体の造成工程を示す。まずファージM13ME12の２本鎖DNA
よりEcoR IおよびBamH I切断により約0.3kbのＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼのアミノ酸末端部分をコードするDNA
断片を分離した。ついでpDAOC2−12よりEcoR IおよびSa
l I切断によりM13ME12にふくまれている部分をのぞく約
1.2kbのＤ−アミノ酸オキシダーゼの構造遺伝子部分を
コードするDNA断片を分離した。さらに発現用ベクターp
EX002をBamH IおよびXho Iで切断した後、上記の２つの
断片と混合し、T4 DNAリガーゼで結合反応を行なわせ
た。その反応液を用いてエシェリヒア・コリMB65を形質
転換し、カナマイシン40μg/mlをふくむＬ−ブロス寒天
培地上で生育してくるコロニーを選択した。得られたコ
ロニーについて、Ｄ−メチオニンを基質とし、Ｏ−ジア
ニシジンを用いるＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の検出
（方法に関する文献前出）を行なった結果、多数の陽性
コロニーを得た。この中の１株からプラスミドDNAを抽
出し、これをpEDAO1と命名し、制限酵素切断により第６
図に示される構造を確認した。またこの組換え体を保有
する大腸菌をエシェリヒア・コリMB65/pEDAO1と命名し
た。
12. 組換え体を保有する大腸菌によるＤ−メチオニン
およびセファロスポリンＣの酸化 エシェリヒア・コリMB65/pEDAO1をカナマイシン40μg/m
lをふくむＬ−ブロス100mlに植菌し、37℃で24時間振と
う培養した。培養液を遠心分離により集菌し、7mlの100
mMピロリン酸緩衝液（pH8.0）に懸濁し、超音波破砕機
で細胞を破砕後、これを遠心分離して得られる上清を酵
素液とした。一方比較のためトリゴノプシス・バリアビ
リスCBS4095を酵母エキス１％、麦芽エキス1.5％、DL−
メチオニン0.2％をふくむ培地100mlに植菌し、30℃で48
時間振とう培養した。ついで上記と同様にして集菌し、
細胞破砕機（ブラウン社、西独）で処理した後、細胞破
砕上清を酵素液とした。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ反応
は、Ｄ−メチオニン27mM、ピロリン酸緩衝液（pH8.0）8
0mMおよび酵素液からなる3mlの反応液中で37℃で行な
い、酵素電極〔イエロースプリングスインストルーメン
ツ（Yellow Springs Instruments）社（米国），モデル
513〕を用いてO2消費量を測定することにより酵素活性
を定量した。反応の１分間に１μmoleのO2を消費する酵
素活性を１単位と定め、比活性を酵素液中の蛋白質1mg
当りの単位数として表示した。その結果、エシェリヒア
・コリMB65/pEDAO1の比活性は1.6であった。これに対
し、トリゴノプシス・バリアビリスCBS4095の比活性は
0.17であった。
およびセファロスポリンＣの酸化 エシェリヒア・コリMB65/pEDAO1をカナマイシン40μg/m
lをふくむＬ−ブロス100mlに植菌し、37℃で24時間振と
う培養した。培養液を遠心分離により集菌し、7mlの100
mMピロリン酸緩衝液（pH8.0）に懸濁し、超音波破砕機
で細胞を破砕後、これを遠心分離して得られる上清を酵
素液とした。一方比較のためトリゴノプシス・バリアビ
リスCBS4095を酵母エキス１％、麦芽エキス1.5％、DL−
メチオニン0.2％をふくむ培地100mlに植菌し、30℃で48
時間振とう培養した。ついで上記と同様にして集菌し、
細胞破砕機（ブラウン社、西独）で処理した後、細胞破
砕上清を酵素液とした。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ反応
は、Ｄ−メチオニン27mM、ピロリン酸緩衝液（pH8.0）8
0mMおよび酵素液からなる3mlの反応液中で37℃で行な
い、酵素電極〔イエロースプリングスインストルーメン
ツ（Yellow Springs Instruments）社（米国），モデル
513〕を用いてO2消費量を測定することにより酵素活性
を定量した。反応の１分間に１μmoleのO2を消費する酵
素活性を１単位と定め、比活性を酵素液中の蛋白質1mg
当りの単位数として表示した。その結果、エシェリヒア
・コリMB65/pEDAO1の比活性は1.6であった。これに対
し、トリゴノプシス・バリアビリスCBS4095の比活性は
0.17であった。
つぎにエシェリヒア・コリMB65/pEDAO1の酵素液をセフ
ァロスポリンＣに作用させた。反応はセファロスポリン
C22.3mM、リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）100mM、酵素
液200μからなる全量1mlの反応液中で37℃で90分行な
い、反応液を高速液体カラムクロマトグラフィーに供
し、生成物を定量した。高速液体カラムクロマトグラム
のカラムはコスモシール（Cosmosil）5C18（半井化学社
製）を用い、移動相としては５％酢酸アンモニウムと1.
4％アセトニトリルからなる溶液を用いて、検出は280nm
で行なった。その結果、セファロスポリンＣは検出され
ず、７−β−（５−カルボキシ−５−オキソペンタンア
ミド）セファロスポラン酸12.5mMと、７−β−（４−カ
ルボキシブタンアミド）セファロスポラン酸11.8mMが生
成した。
ァロスポリンＣに作用させた。反応はセファロスポリン
C22.3mM、リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）100mM、酵素
液200μからなる全量1mlの反応液中で37℃で90分行な
い、反応液を高速液体カラムクロマトグラフィーに供
し、生成物を定量した。高速液体カラムクロマトグラム
のカラムはコスモシール（Cosmosil）5C18（半井化学社
製）を用い、移動相としては５％酢酸アンモニウムと1.
4％アセトニトリルからなる溶液を用いて、検出は280nm
で行なった。その結果、セファロスポリンＣは検出され
ず、７−β−（５−カルボキシ−５−オキソペンタンア
ミド）セファロスポラン酸12.5mMと、７−β−（４−カ
ルボキシブタンアミド）セファロスポラン酸11.8mMが生
成した。
実施例において詳述したように、本発明者らはセファロ
スポリンＣを酸化するＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子
をクローニングし、大腸菌内において発現可能な形態に
修飾したDNA断片を取得することによって、飛躍的にす
ぐれたＤ−アミノ酸オキシダーゼの生産とそれの広範な
応用の前提条件を与えることができた。公知の常法によ
って上記DNA断片の蛋白質合成開始部位の前に任意のプ
ロモーターとリボゾーム結合部位を結合させ、酵素蛋白
の生産能を増大させ、かつ調節することも可能である。
また上記において修飾されたDNA断片は、大腸菌の他に
も適当な発現ベクターさえあれば、酵母、枯草菌その他
の細胞内において容易に発現される形態を有しており、
生体内の諸反応と連結してＤ−アミノ酸オキシダーゼの
機能を有益に利用するためのきわめて強力な手段を提供
するものである。
スポリンＣを酸化するＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子
をクローニングし、大腸菌内において発現可能な形態に
修飾したDNA断片を取得することによって、飛躍的にす
ぐれたＤ−アミノ酸オキシダーゼの生産とそれの広範な
応用の前提条件を与えることができた。公知の常法によ
って上記DNA断片の蛋白質合成開始部位の前に任意のプ
ロモーターとリボゾーム結合部位を結合させ、酵素蛋白
の生産能を増大させ、かつ調節することも可能である。
また上記において修飾されたDNA断片は、大腸菌の他に
も適当な発現ベクターさえあれば、酵母、枯草菌その他
の細胞内において容易に発現される形態を有しており、
生体内の諸反応と連結してＤ−アミノ酸オキシダーゼの
機能を有益に利用するためのきわめて強力な手段を提供
するものである。
第１図はトリゴノプシス・バリアビリス由来のＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列およびそれをコードす
るＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
図中、上段は塩基配列を、下段はアミノ酸配列をそれぞ
れ示す。 第２図はプラスミドpDAOC2−12よりEcoR I切断により生
成する約0.6kbの断片の塩基配列の一部を示す。図中で
上段は塩基配列を、下段はこれに対応するアミノ酸配列
を、点線を引いた部分はイントロン様配列を示す。 第３図はプラスミドpDAOC2−12の制限酵素開裂地図を示
す。 第４図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ・クローンよりアミ
ノ酸非コード領域削除の工程の概要を示す。 第５図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ発現用ベクター造成
工程の概要を示す。図中で記号Cmr,Kmr,Aprは各々クロ
ラムフェニコール、カナマイシン、アンピシリンに対す
る耐性遺伝子を、Plac UV5はlac UV5プロモーターを示
す。 第６図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換え
体造成工程の概要を示す。図中で 部分はＤ−アミノ酸オキシダーゼ（DAOの略号で表示）
のアミノ酸配列コード領域を示す。
ノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列およびそれをコードす
るＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
図中、上段は塩基配列を、下段はアミノ酸配列をそれぞ
れ示す。 第２図はプラスミドpDAOC2−12よりEcoR I切断により生
成する約0.6kbの断片の塩基配列の一部を示す。図中で
上段は塩基配列を、下段はこれに対応するアミノ酸配列
を、点線を引いた部分はイントロン様配列を示す。 第３図はプラスミドpDAOC2−12の制限酵素開裂地図を示
す。 第４図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ・クローンよりアミ
ノ酸非コード領域削除の工程の概要を示す。 第５図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ発現用ベクター造成
工程の概要を示す。図中で記号Cmr,Kmr,Aprは各々クロ
ラムフェニコール、カナマイシン、アンピシリンに対す
る耐性遺伝子を、Plac UV5はlac UV5プロモーターを示
す。 第６図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換え
体造成工程の概要を示す。図中で 部分はＤ−アミノ酸オキシダーゼ（DAOの略号で表示）
のアミノ酸配列コード領域を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (3)
- 【請求項１】トリゴノプシス・バリアビリス由来であ
り、かつ Ala−Lys−Ile−Val−Val−Ile−Gly−Ala−Gly−Val−
Ala−Gly−Leu−Thr−Thr−Ala−Leu−Gln−Leu−Leu−
Arg−Lys−Gly−His−Glu−Val−Thr−Ile−Val−Ser−
Glu−Phe−Thr−Pro−Gly−Asp−Leu−Ser−Ile−Gly−
Tyr−Thr−Ser−Pro−Trp−Ala−Gly−Ala−Asn−Trp−
Leu−Thr−Phe−Tyr−Asp−Gly−Gly−Lys−Leu−Ala−
Asp−Tyr−Asp−Ala−Val−Ser−Tyr−Pro−Ile−Leu−
Arg−Glu−Leu−Ala−Arg−Ser−Ser−Pro−Glu−Ala−
Gly−Ile−Arg−Leu−Ile−Asn−Gln−Arg−Ser−His−
Val−Leu−Lys−Arg−Asp−Leu−Pro−Lys−Leu−Glu−
Gly−Ala−Met−Ser−Ala−Ile−Cys−Gln−Arg−Asn−
Pro−Trp−Phe−Lys−Asn−Thr−Val−Asp−Ser−Phe−
Glu−Ile−Ile−Glu−Asp−Arg−Ser−Arg−Ile−Val−
His−Asp−Asp−Glu−Ala−Tyr−Leu−Val−Glu−Phe−
Arg−Ser−Val−Cys−Ile−His−Thr−Gly−Val−Tyr−
Leu−Asn−Trp−Leu−Met−Ser−Gln−Cys−Leu−Ser−
Leu−Gly−Ala−Thr−Val−Val−Lys−Arg−Arg−Val−
Asn−His−Ile−Lys−Asp−Ala−Asn−Leu−Leu−His−
Ser−Ser−Gly−Ser−Arg−Pro−Asp−Val−Ile−Val−
Asn−Cys−Ser−Gly−Leu−Phe−Ala−Arg−Phe−Leu−
Gly−Gly−Val−Glu−Asp−Lys−Lys−Met−Tyr−Pro−
Ile−Arg−Gly−Gln−Val−Val−Leu−Val−Arg−Asn−
Ser−Leu−Pro−Phe−Met−Ala−Ser−Phe−Ser−Ser−
Thr−Pro−Glu−Lys−Glu−Asn−Glu−Asp−Glu−Ala−
Leu−Tyr−Ile−Met−Thr−Arg−Phe−Asp−Gly−Thr−
Ser−Ile−Ile−Gly−Gly−Cys−Phe−Gln−Pro−Asn−
Asn−Trp−Ser−Ser−Glu−Pro−Asp−Pro−Ser−Leu−
Thr−His−Arg−Ile−Leu−Ser−Arg−Ala−Leu−Asp−
Arg−Phe−Pro−Glu−Leu−Thr−Lys−Asp−Gly−Pro−
Leu−Asp−Ile−Val−Arg−Glu−Cys−Val−Gly−His−
Arg−Pro−Gly−Arg−Glu−Gly−Gly−Pro−Arg−Val−
Glu−Leu−Glu−Lys−Ile−Pro−Gly−Val−Gly−Phe−
Val−Val−His−Asn−Tyr−Gly−Ala−Ala−Gly−Ala−
Gly−Tyr−Gln−Ser−Ser−Tyr−Gly−Met−Ala−Asp−
Glu−Ala−Val−Ser−Tyr−Val−Glu−Arg−Ala−Leu−
Thr−Arg−Pro−Asn−Leu であらわされるアミノ酸配列をコードするＤ−アミノ酸
オキシダーゼの遺伝子を担うDNA断片。 - 【請求項２】トリゴノプシス・バリアビリス由来であ
り、かつ Ala−Lys−Ile−Val−Val−Ile−Gly−Ala−Gly−Val−
Ala−Gly−Leu−Thr−Thr−Ala−Leu−Gln−Leu−Leu−
Arg−Lys−Gly−His−Glu−Val−Thr−Ile−Val−Ser−
Glu−Phe−Thr−Pro−Gly−Asp−Leu−Ser−Ile−Gly−
Tyr−Thr−Ser−Pro−Trp−Ala−Gly−Ala−Asn−Trp−
Leu−Thr−Phe−Tyr−Asp−Gly−Gly−Lys−Leu−Ala−
Asp−Tyr−Asp−Ala−Val−Ser−Tyr−Pro−Ile−Leu−
Arg−Glu−Leu−Ala−Arg−Ser−Ser−Pro−Glu−Ala−
Gly−Ile−Arg−Leu−Ile−Asn−Gln−Arg−Ser−His−
Val−Leu−Lys−Arg−Asp−Leu−Pro−Lys−Leu−Glu−
Gly−Ala−Met−Ser−Ala−Ile−Cys−Gln−Arg−Asn−
Pro−Trp−Phe−Lys−Asn−Thr−Val−Asp−Ser−Phe−
Glu−Ile−Ile−Glu−Asp−Arg−Ser−Arg−Ile−Val−
His−Asp−Asp−Glu−Ala−Tyr−Leu−Val−Glu−Phe−
Arg−Ser−Val−Cys−Ile−His−Thr−Gly−Val−Tyr−
Leu−Asn−Trp−Leu−Met−Ser−Gln−Cys−Leu−Ser−
Leu−Gly−Ala−Thr−Val−Val−Lys−Arg−Arg−Val−
Asn−His−Ile−Lys−Asp−Ala−Asn−Leu−Leu−His−
Ser−Ser−Gly−Ser−Arg−Pro−Asp−Val−Ile−Val−
Asn−Cys−Ser−Gly−Leu−Phe−Ala−Arg−Phe−Leu−
Gly−Gly−Val−Glu−Asp−Lys−Lys−Met−Tyr−Pro−
Ile−Arg−Gly−Gln−Val−Val−Leu−Val−Arg−Asn−
Ser−Leu−Pro−Phe−Met−Ala−Ser−Phe−Ser−Ser−
Thr−Pro−Glu−Lys−Glu−Asn−Glu−Asp−Glu−Ala−
Leu−Tyr−Ile−Met−Thr−Arg−Phe−Asp−Gly−Thr−
Ser−Ile−Ile−Gly−Gly−Cys−Phe−Gln−Pro−Asn−
Asn−Trp−Ser−Ser−Glu−Pro−Asp−Pro−Ser−Leu−
Thr−His−Arg−Ile−Leu−Ser−Arg−Ala−Leu−Asp−
Arg−Phe−Pro−Glu−Leu−Thr−Lys−Asp−Gly−Pro−
Leu−Asp−Ile−Val−Arg−Glu−Cys−Val−Gly−His−
Arg−Pro−Gly−Arg−Glu−Gly−Gly−Pro−Arg−Val−
Glu−Leu−Glu−Lys−Ile−Pro−Gly−Val−Gly−Phe−
Val−Val−His−Asn−Tyr−Gly−Ala−Ala−Gly−Ala−
Gly−Tyr−Gln−Ser−Ser−Tyr−Gly−Met−Ala−Asp−
Glu−Ala−Val−Ser−Tyr−Val−Glu−Arg−Ala−Leu−
Thr−Arg−Pro−Asn−Leu であらわされるアミノ酸配列をコードするＤ−アミノ酸
オキシダーゼの遺伝子を担うDNA断片を大腸菌の宿主ベ
クター系で用いられるベクターに組み込んだ組替え体DN
A。 - 【請求項３】トリゴノプシス・バリアビリス由来であ
り、かつ Ala−Lys−Ile−Val−Val−Ile−Gly−Ala−Gly−Val−
Ala−Gly−Leu−Thr−Thr−Ala−Leu−Gln−Leu−Leu−
Arg−Lys−Gly−His−Glu−Val−Thr−Ile−Val−Ser−
Glu−Phe−Thr−Pro−Gly−Asp−Leu−Ser−Ile−Gly−
Tyr−Thr−Ser−Pro−Trp−Ala−Gly−Ala−Asn−Trp−
Leu−Thr−Phe−Tyr−Asp−Gly−Gly−Lys−Leu−Ala−
Asp−Tyr−Asp−Ala−Val−Ser−Tyr−Pro−Ile−Leu−
Arg−Glu−Leu−Ala−Arg−Ser−Ser−Pro−Glu−Ala−
Gly−Ile−Arg−Leu−Ile−Asn−Gln−Arg−Ser−His−
Val−Leu−Lys−Arg−Asp−Leu−Pro−Lys−Leu−Glu−
Gly−Ala−Met−Ser−Ala−Ile−Cys−Gln−Arg−Asn−
Pro−Trp−Phe−Lys−Asn−Thr−Val−Asp−Ser−Phe−
Glu−Ile−Ile−Glu−Asp−Arg−Ser−Arg−Ile−Val−
His−Asp−Asp−Glu−Ala−Tyr−Leu−Val−Glu−Phe−
Arg−Ser−Val−Cys−Ile−His−Thr−Gly−Val−Tyr−
Leu−Asn−Trp−Leu−Met−Ser−Gln−Cys−Leu−Ser−
Leu−Gly−Ala−Thr−Val−Val−Lys−Arg−Arg−Val−
Asn−His−Ile−Lys−Asp−Ala−Asn−Leu−Leu−His−
Ser−Ser−Gly−Ser−Arg−Pro−Asp−Val−Ile−Val−
Asn−Cys−Ser−Gly−Leu−Phe−Ala−Arg−Phe−Leu−
Gly−Gly−Val−Glu−Asp−Lys−Lys−Met−Tyr−Pro−
Ile−Arg−Gly−Gln−Val−Val−Leu−Val−Arg−Asn−
Ser−Leu−Pro−Phe−Met−Ala−Ser−Phe−Ser−Ser−
Thr−Pro−Glu−Lys−Glu−Asn−Glu−Asp−Glu−Ala−
Leu−Tyr−Ile−Met−Thr−Arg−Phe−Asp−Gly−Thr−
Ser−Ile−Ile−Gly−Gly−Cys−Phe−Gln−Pro−Asn−
Asn−Trp−Ser−Ser−Glu−Pro−Asp−Pro−Ser−Leu−
Thr−His−Arg−Ile−Leu−Ser−Arg−Ala−Leu−Asp−
Arg−Phe−Pro−Glu−Leu−Thr−Lys−Asp−Gly−Pro−
Leu−Asp−Ile−Val−Arg−Glu−Cys−Val−Gly−His−
Arg−Pro−Gly−Arg−Glu−Gly−Gly−Pro−Arg−Val−
Glu−Leu−Glu−Lys−Ile−Pro−Gly−Val−Gly−Phe−
Val−Val−His−Asn−Tyr−Gly−Ala−Ala−Gly−Ala−
Gly−Tyr−Gln−Ser−Ser−Tyr−Gly−Met−Ala−Asp−
Glu−Ala−Val−Ser−Tyr−Val−Glu−Arg−Ala−Leu−
Thr−Arg−Pro−Asn−Leu であらわされるアミノ酸配列をコードするＤ−アミノ酸
オキシダーゼの遺伝子を担うDNA断片を組み込んだ組替
え体DNAで形質転換された大腸菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61215878A JPH07108225B2 (ja) | 1986-09-16 | 1986-09-16 | Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61215878A JPH07108225B2 (ja) | 1986-09-16 | 1986-09-16 | Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6371180A JPS6371180A (ja) | 1988-03-31 |
| JPH07108225B2 true JPH07108225B2 (ja) | 1995-11-22 |
Family
ID=16679753
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61215878A Expired - Lifetime JPH07108225B2 (ja) | 1986-09-16 | 1986-09-16 | Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07108225B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108707591A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-10-26 | 东阳市人民医院 | 一种dao蛋白的制备和纯化方法及其应用 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2075056T3 (es) * | 1988-10-13 | 1995-10-01 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Oxidasa de los d-aminoacidos. |
| CA2100987C (en) * | 1992-07-27 | 1999-06-15 | Kaoru Furuya | A transformant capable of producing d-amino acid oxidase |
| CN100342014C (zh) * | 2004-04-08 | 2007-10-10 | 百瑞全球有限公司 | 重组d－氨基酸氧化酶 |
| WO2007015511A1 (ja) | 2005-08-02 | 2007-02-08 | Kaneka Corporation | Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又は環状イミンの製造方法。 |
| EP2371946A1 (en) | 2010-03-30 | 2011-10-05 | Rijksuniversiteit Groningen | Improved methods and host cells for the production and use of D-amino acid oxidase (DAO). |
-
1986
- 1986-09-16 JP JP61215878A patent/JPH07108225B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108707591A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-10-26 | 东阳市人民医院 | 一种dao蛋白的制备和纯化方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6371180A (ja) | 1988-03-31 |
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