JPH0560059B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の詳細な説明］ 本発明は、被検体を含有する疑いのある試料中
の該被検体を定量するための装置及び該被検体の
定量法に関する。 試料中の被検体の存在を検知し且つ測定するた
め新規で簡単且つ迅速な技術を開発することに
は、連続して興味がもたれている。この被検体は
広い種類の物質、例えば薬剤、天然産の生理学的
化合物、汚染物、化学薬品、不純物などのいずれ
かである。多くの場合、特にある種の生理学的に
活性な物質の場合には、測定の速度が重要であ
る。他の状態においては、簡便さが主に考慮され
る。 広い用途が発見されている１つの簡便で迅速な
技法は、一般に試料中に浸し、続いて元々の試料
中の被検体の量に基づく信号を発しせしめること
のできる固体棒又はフイルムを含んでなる「浸漬
棒（dip stick）」法である。固体表面に結合した
化合物の信号、例えば吸光、反射又は螢光を測定
するには多くの装置がある。また棒浸漬法は、取
り扱い、移動、分離などが簡便である。 そのような技法は、簡便であるけれど、現像時
間、温度、干渉因子、試薬安定性及び観測される
信号の量に影響しうる他の条件に対して非常に敏
感である。観測された信号を標準物と比較する定
量分析の場合には、試験条件を注意深く制御して
標準物の条件を適合させることが必要である。し
かしながら、そのような注意深い制御は、浸漬棒
法の簡便さを減じ、分析を行なう時間及び費用を
増加させ、結果の不安定性を増巾する。更に試料
中の干渉因子の存在及び試薬の不安定性は最大の
注意を払つてさえも克服することが困難である。 それ故に、試料中の被検体の正確な検知を与え
且つ現像時間、温度、試料中の干渉因子、試薬の
安定性などに対して非常に敏感でない新規な分析
法を開発することが望ましい。 種々の固定化試薬及び異なる種類の試験片を用
いることと関連する特許は、米国特許第3993451
号、第4038485号、第4046514号、第4129417号、
第4133639号及び第4160008号；及び独国公開特許
第2636244号を含む。結合した及び結合してない
抗原の分離を含む種々の方法を開示する特許は、
米国特許第Re.29169号、第3949064号、第
3984533号、第3985867号、第4020151号、第
4039652号、第4067959号、第4108972号、第
4145406号及び第4168146号を含む。 本発明では、被検体を含有する疑いのある試料
中の被検体の存在を定量するための装置及び方法
が提供される。この方法及び装置は、測定及び較
正表面として言及される第１及び第２表面を含
む。この各々は望ましくは少くとも１つの触媒及
び１つの基質を有する信号発生系を含む。双方の
系は実質的に同一であり且つ信号発生系の少くと
も１つの共通員を含む。 測定表面は特異的に結合する対複合体の生成手
段による共役体（conjugate）の表面への結合を
含み、一方共役体は特異的結合対の１員に結合す
る信号発生系の員（「sps員」）を含んでなる。表
面に結合する共役体の量は分析媒体中の被検体の
量に関係する。 較正表面は、共有結合的に又は非共有結合的
に、直接に又は特異的結合対複合体の生成を介し
て表面に結合するsps員を有する。この場合、特
異的結合対は測定表面の結合対と異なる。 各表面における信号発生化合物の量を比較すれ
ば、被検体の量が較正表面から発生する信号で示
される予じめ決めた量より多いか、少ないかを決
定することができる。 本発明によれば、少くとも２つの異なる表面を
液体分析媒体中へ一緒に導入することによつて被
検体を含有する疑いのある試料中の被検体を定量
するための方法と装置が提供される。この時１つ
の表面は測定表面と呼ばれ、他の表面は較正表面
として言及される。分析は望ましくは少くとも１
つの触媒、普通酵素、及び少くとも１つの基質を
有する信号発生系の使用を含む。 信号を増巾させるためには、被検体のその同族
結合対員への各結合事象（event）に対して複数
の信号発生事象の存在することが望ましい。この
複数は動的及び静的系の結果として存在していて
よい。動的系では、触媒、普通酵素から使用さ
れ、信号発生系は少くとも１つの基質、普通補酵
素を含む。この場合、酵素又は基質のいずれかは
特異的結合対員に結合していてよい。基質がサイ
クルできない場合、普通複数の基質分子が中心
（hub）に結合して単一の結合事象に関して複数
の基質分子を提供するであろう。 他に、検知しうる信号を中心に与える非触媒的
分子を複数で結合させることができる。そのよう
な分子は普通分光学的に検知できるであろう。光
を吸収する染料はいくつかの場合に有用であるか
も知れないけれど、螢光及び化学発光を、通常存
在する装置でより正確に測定しうる信号を発生す
るものとして使用する。 sps員の共役体及び特異的結合対複合体を通し
て測定表面に結合する特異的結合対員として存在
するsps員の量は、媒体中に存在する被検体の量
に関係する。分析中に較正表面に結合するsps員
の量は少くとも１つ、普通１つの予じめ決められ
た被検体の濃度に対して、有利な範囲の信号量を
与えるようなものであろう。較正表面における
sps員は、試料を含む分析溶液へ浸す前に或いは
分析中に共有又は非共有結合の結果として存在し
うる。但し非触媒的sps員の場合には、結合は非
共有的であり、引き続いて分析溶液へ浸される。 本方法及び装置は、各個々の試験を行なつてい
る際に、分析系の較正を同時に行なう。信号発生
系は、検知しうる信号の２つの表面での発生と関
連し、観測される信号に影響する多くの条件に関
して同一の条件に供される。従つて検知しうる信
号の、条件の変化、試料の内因的物質などによる
変動は、２つの表面での検知しうる信号発生に平
行的に影響し、較正表面の信号量は測定表面の信
号量の評価に対する標準として役立ちうる。 本発明は、それぞれ検知しうる生成物を生成す
る信号発生系を用いる２つの表面を使用すること
に依存する。測定表面に結合するsps員の量は媒
体中の被検体の量に関係する。表面で信号を発生
する検知しうる生成物の生成は測定表面に対する
sps員の量に直接関係するであろう。対照的に較
正表面に対して結合するsps員の量は媒体中の被
検体の量にだけ依存しないであろうし、普通それ
に無関係である。較正表面に対して存在するsps
員の量は、較正表面に予じめ結合してない時でさ
え、普通分析媒体中の被検体の量に無関係である
であろう。 sps員分子が１度表面に結合すると、２つの表
面での信号発生系は同一の環境に供され、従つて
較正表面での検知しうる信号の発生は媒体中の被
検体の濃度の定性的又は定量的分析に対する基準
として使用することができる。多くの部分に対
し、肉眼での分析の場合、較正表面は特異的濃度
を分析するために使用されなく、むしろ意図する
被検体が予じめ決められた量より多い量で存在す
るか又は存在しないかを決定するために使用され
よう。 分析を行なう場合には、多くの測定手順及び組
合せが使用でき、２つの表面に結合する物質を変
化させることができる。２つの表面と関係して、
２つよりも多い表面を使用する、即ち測定及び較
正表面の１方又は両方が装置中に複数で存在して
いてもよいということを理解すべきである。 較正表面は非触媒的系を除いてsps員が表面へ
最初に結合することを含み、この時予じめ決めら
れた量の触媒が表面に結合する。他に、特異的結
合対員はsps員に結合する較正表面に使用でき或
いはsps員に結合した特異的結合対員に使用しう
る。そのような特異的結合対員は、被検体の、被
検体に同族の特異的結合対員への結合に含まれる
決定点（determinant site）以外の決定点に結合
する。 測定及び較正表面は、いずれかの簡便な材料か
ら製造でき、いずれか簡便な構造を有することが
できる。但しその表面は分析中にその構造全体性
を実質的に保持していることができる。２つの表
面は、両表面におけるsps員が実質的に同一の具
合の環境条件に呼応していることを補償するため
に同一の環境条件に供されるように、通常並置さ
れる。 ある被検体又はある状態に即用しうる種々の信
号発生系が使用できる。各々の場合、信号発生系
は検知しうる信号を与えうる少くとも１つの機能
体、望ましくは少くとも１つの触媒、普通少くと
も１つの酵素、及び触媒spsとの少くとも１つの
基質を含有するであろう。この場合、sps員は特
異的結合対員に結合して少くとも測定表面に結合
する共役体を生成するであろうし、測定表面及び
較正表面の双方に結合していてもよい。 ２つの表面を含む装置は、被検体及び共役体が
測定表面に且つ適当としては較正表面に結合する
機会を有していた１つ又はそれ以上の溶液と一緒
に接触せしめられよう。触媒系の場合、必要に応
じて２つの表面は信号発生系に対して必要な基質
及び共因子を有する試薬溶液中へ導入される。し
かしながらある状態においては、例えば２つの触
媒を用いる場合には、信号発生系のすべてを、単
一の分析媒体中において試料と一緒に組合せるこ
とができる。予じめ決めた時間の後、表面を現像
溶液から取り出し、測定表面及び較正表面上の検
知しうる信号を比較する。 今や本発明を更に詳細に記述しよう。しかしな
がら、本発明を詳細に記述する前に、多くの術語
を定義する。 定 義 被検体−配位体であつてよいモノ−又はポリ−
エピトピツク（epitopic）、普通抗原又は付着体
である測定すべき化合物又は組成物。この化合物
の単数又は複数は少くとも１つの共通のエピトピ
ツク点又は決定点或いは受体を分けあう。 特異的結合対（「mip」）−分子の一方が他の分
子の特別な空間的及び極性組織に特異的に結合す
る領域を表面又は空洞中に有する２つの異なつた
分子。特異的結合対の員は配位体及び受体（抗配
位体）として言及される。これらは普通免疫学的
対であるが他の特異的結合対例えばビオチン−ア
ビジン、ホルモン−ホルモン受体などは免疫学的
対ではない。同族体の又は補足の基質は配位体及
び受体であり、一方同類の基質はある状態におい
て区別された、例えば標識をつけた配位体又は受
体のいずれかである。 配位体−受体が天然に存在する又は製造できる
有機化合物。 受体（抗配位体）−分子の特別な空間及び極性
組織、即ちエピトピツク点又は決定点を認識しう
る化合物又は組成物。受体の例は天然に存在する
受体例えばチロキシを結合するグロブリン、抗
体、酵素、Fabフラグメント、レクチン、核酸な
どを含む。 配位体同族体−受体に対して同族体配位体と競
合することのできる修飾された配位体。この修飾
は配位体同族体を他の分子に結合するための手段
を提供する。配位体同族体は普通１つより多い水
素を、配位体同族体を中心又は標識に連結する結
合で置換することによつて配位体と異なるであろ
うが、これを必ずしも必要としない。 ポリ（配位体同族体）−普通中心核に対して一
緒に共有結合する複数の配位体又は配位体同族
体。中心核は普通複数の官能基例えばヒドロキ
シ、アミノ、メルカプト、エチレン基などを結合
点として有する多官能性の、通常重合体の物質で
ある。この中心核は普通水溶性又は少くとも分散
性であり、普通少くとも35000ダルトンであり、
一般に約600000ダルトンを越えないであろう。中
心核の例は、多糖類、ポリペプチド、例えば蛋白
質、核酸、イオン交換樹脂などを含む。 表面−測定及び較正表面は、それぞれ非分散性
であり、普通共通の支持体上に存在して少くとも
約50μm²、一般にそれ以上、しばしば少くとも１
mm²、特に約0.5cm²以下の表面積が存在し、且つ水
に不溶であつて、所望の信号量を与えるmip及び
検知しうる信号発生化合物の結合にとつて必要な
性質を提供するいずれかの物質であつてよい。望
ましくは表面はゼラチン性、透過性、吸湿性、多
孔性であり、或いは一般に全容積と比較して実質
的な空隙容量を有するチヤンネル又は同等物であ
つてよい粗い又は不規則な構造を有するであろ
う。検知しうる信号発生化合物の性質に依存し
て、表面は吸収性又は非吸収性であり、好ましく
は弱い吸収性又は非吸収性である。表面は透明又
は不透明であり、単一の物質又は複数の物質、混
合物又は積層物であつてよい。多種類の物質及び
形態が使用できる。表面は分析の条件下にその全
一性を実質的に保持することができ、従つて表面
に結合する物質は表面に拘束されたままで、溶液
中へ拡散しない。測定及び較正表面の双方の下地
の構造は実質的に同一であることが望ましい。 触媒−結合−mip−mipに共役した触媒、普通
酵素。触媒は信号発生系の１員であり、mipは特
別な工程順序に応じて測定表面に結合するように
選択される。 信号発生系（「sps」）−信号発生系は触媒又は非
触媒的、好ましくは触媒的であり、更に好ましく
は酵素触媒を有しうる；望ましくは、一方の酵素
の生成物が他の酵素の基質である２つの酵素が使
用される；更に触媒的信号発生系には、少くとも
１つの基質、適当なものとして補酵素が包含され
よう。信号発生系は、媒体中に存在する被検定の
量に関連した検知しうるシグナルを測定表面で発
し、一方較正表面において少くとも１つの配位体
−受体対、例えば配位体及び天然受体又は抗体、
酵素及び基質又は酵素を含む。信号発生系は、全
体で又は部分的に、表面に結合し且つ検知しうる
信号を発する「信号発生化合物」によつて検知し
うる信号を較正表面で発する。較正表面における
検知しうる信号の量は被検体の量に関係なく、少
くとも１つの因子に依存する。信号発生系に包含
されうる他の物質は、少くとも２つの酵素が使用
される場合螢光体に対する光、化学発光に対する
反応物及び中間生成物に対する捕捉剤である。 簡略化して、信号発生系の員は「sps員」とし
て言及されるであろう。sps員は基質という術語
が補酵素を含む場合、螢光体、化学発光体、酵素
又は基質であつてよい。 方 法 本分析は水性域又は媒体中で行なわれる。但し
最終分析媒体は、反応物又は反応物の組合せ物の
予じめの各々の添加及び培養、表面の水性媒体か
らの除去及び１つ又はそれ以上の反応物を有する
異なる水性媒体への移行を含む予じめの分離、或
いはこれらの組合せ物の結果のものであつてよ
い。本方法は結合していない標識した共役体を、
１方又は双方の表面にmip複合体を通して結合し
たものから分離する必要がないけれど、多くの工
程においては、結合してない触媒が実質的に存在
しない現像剤溶液が使用されるであろう。分析に
含まれる種々の媒体は、測定及び較正「表面」を
限定する液相及び固相からなる。 分析を行なう場合には、表面を水性媒体中にお
いて試料と、信号発生系と及び補助物質と、同時
に又は段階的に接触させて表面と関連した検知し
うる信号を得る。測定表面での検知しうる信号は
その表面に結合した標識された共役体の量を関連
し、これが試料中の被検体の量に相当する。信号
発生系の性質及び所望の信号の検知法に依存し
て、表面を分析媒体中で読むことができ、或いは
分析媒体から分離して読むことができる。 分析を行なう場合には、普通水性媒体が使用さ
れよう。他の極性溶媒、普通アルコール、エーテ
ルなどを含めて炭素数１〜６、更に普通１〜４の
酸素化有機溶媒も含有せしめうる。普通これらの
共溶媒は約40重量％以下、更に約20重量％以下で
存在するであろう。 媒体に対するPHは普通約４〜11、更に普通には
約５〜10、好ましくは約6.5〜9.5の範囲にあるで
あろう。PHは信号発生系を最適化しつつ、受体に
よる特異的結合のかなりの量を維持しうるように
選択される。いくつかの場合にはこれらの２つの
考慮すべき点の間で妥協が行なわれよう。所望の
PHを達成し、そのPHを分析中に維持するために
種々の緩衝剤が使用できる。緩衝剤の例はホウ酸
塩、燐酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタルなどを
含む。用いる特別な緩衝剤は本発明にとつて厳密
でないが、個々の分析においてある緩衝剤は他の
ものより好適なこともある。 分析を行なうためには、適度な温度が通常使用
される。測定期間中の一定温度は一般に必要でな
いが、急速で大きい変動は望ましくない。分析の
温度は一般に約10〜50℃、更に普通には約15〜45
℃である。 分析しうる被検体の濃度は一般に約10^-4〜
10^-15Ｍ、更に普通には約10^-5〜10^-13Ｍにあるで
あろう。分析が定性的、半定量的又は定量的であ
るかどうかに依存して、用いる検知方法及び問題
の被検体の濃度は通常他の試薬の濃度を決定する
であろう。 種々の試薬の濃度は、用いる工程手順、被検体
の性質、表面に結合したmip及び触媒に結合した
mip、要求される分析感度などに依存して広く変
化する。いくつかの場合にはmipの一方及び他方
を大過剰で使用し、一方他の工程では分析の感度
をmipの比における変化に呼応させるであろう。 本発明の較正された分析を行なう場合、測定及
び較正表面の双方は試料及び信号発生系と同時に
接触させることが必要である。また両表面は、媒
体中の局所的変化に基因するかも知れない相違を
最小にするために互いに近くに位置させることが
望ましい。便宜上、これは両表面を共通の棒又は
支持体上に配置させることによつて達成しうる。
しかしながら、本発明の方法を実施する場合、表
面を共通の支持体上に配置することが必要ではな
くて、表面を信号発生系の種々の成分中に浸し、
これを同時に且つ同一の長さの時間で取りだすと
いうことだけが必要である。さもなければ表面は
分析の性能に悪影響を及ぼさずに独立に取り扱つ
てもよい。 表面に対する共通の支持体は、従来法の棒浸漬
で使用される如き棒又はプラスチツクフイルムが
簡便である。そのような浸漬する棒の正確な性質
及び寸法は厳密でなく、分析系の他の因子、代表
的には種々の試薬容器の寸法と適合するように選
択される。両表面は長い浸漬棒の１端に位置し、
それを比較的少量の、典型的には100μl〜２mlの
試料中に容易に浸することのできることが望まし
い。表面を互いに隣つて位置させれば、最終決定
を行なうための表面の肉眼による比較を容易にす
る。表面は垂直に又は水平に位置していてよい。 すでに示したように、一方又は双方の、複数の
測定表面及び複数の較正表面を含めて２つより多
い表面を使用することができる。例えば、複数の
被検体を同時に分析することができ及び／又は複
数の較正表面を、異なる被検体に対する測定表面
の各々と関連した異なる較正表面或いは更に定量
的結果を与えるために配置してもよい。 １つ又はそれ以上の溶液を用いる種々の工程手
順が用いられる。溶液との接触は攪拌又は接触を
含む。保温工程も含むが、これは一般に約0.5分
〜１時間、更に普通には約２分〜30分間で変わり
うる。 工程手順は、信号発生系並びに被検体の性質、
及び経済性、効率及び精度の考慮と共に変化する
であろう。信号発生系の試薬は別々の溶液として
与えてもよく或いは溶解して非共役的に表面に結
合して試料溶液中へ拡散させてもよい。 信号発生系の試薬を別々に与える場合には、試
薬のすべてを試料と一緒にすることができ；或い
は１つ又は複数のsps員を試料と一緒にし、次い
で信号発生系の残りの員を含む第２の溶液と一緒
にしてもよい。例えば、酵素−標識−mipは試料
溶液と一緒にすることができる。このとき基質及
びいずれかの補酵素は試料溶液及び現像剤溶液と
して言及される第２の溶液或いは第２の溶液とし
て添加されるすべての残りのsps員の間に分布す
る。他にsps員は非共役的に溶解して表面に結合
し、試料溶液との接触時に試料溶液中へ急速に溶
解しうる。 複数の溶液を用いる場合には、表面を溶液から
溶液へ移行させるであろう。普通中間の洗浄工程
は偶発的な特異的結合を除去するために必要とさ
れないであろう。 本発明の方法及び系は検知しうる信号を発する
標識を用いることにより、被検体のいずれかの分
析に関して使用しうる。競争的及び非競争的工程
手順が使用しうる；被検体及びspsで標識した被
検定は測定表面上において同族体mipに対して競
合し或いはそれらは連続的に結合するかもしれな
い。或いは被検体が複数の結合点を有する場合、
それは測定表面に結合したmip及びsps−標識−
mipのmip間の橋かけとして役立ちうる。表面上
の及びsps共役体に含まれる種々のmip並びに表
面が接触する溶液の数及び信号発生系の員を変え
ることにより、所望の定量性の程度、使用者の偽
混、及び存在する装置に依存して工程手順を広く
変えることができる。更に同一の考慮のいくつか
又はすべては較正表面の性質及びsps員が較正表
面に結合している様子に影響するであろう。 信号発生系は非触媒的又は触媒的であつてよ
い。非触媒的系は中心又は粒子に結合した信号発
生標識、例えば螢光体又は化学発光体を複数で含
み、単一結合の場合に単一結合から比較的大きい
信号を得ることができる。被検体の性質に従つて
選択されるmipは中心又は粒子に結合して存在す
るであろう。付着体の被検体の場合、付着体（抗
付着体）に対する抗体は測定表面に結合されてい
てよい。次いでこの測定表面を試料溶液に浸す。
被検体は結合点の部分に結合し、これを満す。こ
の時粒子−付着体共役体は残りの存在する抗付着
体点に結合する。他に、粒子−付着体共役体は試
料溶液と一緒になり、測定表面に存在する結合点
に対して被検体と競合してよい。 触媒系はmipに結合した基質上の触媒を含んで
いてもよい。基質がmipに結合している場合に
は、通常中心（hub）が非触媒系におけるように
多量で、複数の基質及び１種又はそれ以上のmip
と共に使用されよう。基質の１つが補酵素である
場合には、補酵素を、２つの酵素系を用いること
によつて再循環してよい。この場合、結果は単一
の補酵素の存在のために複数の信号発生化合物の
生産をもたらす。これらの系は文献に詳細に報告
されている。基質を循環しないときには、基質は
普通螢光体に対する前駆体であるであろうし或い
は化学発光をもたらそう。 mipに結合した単一の触媒、普通酵素を含む触
媒系において、触媒−結合−mip及び被検体は、
触媒−結合−mipが測定表面において同時に又は
連続して同族体mipに対して競争するような競合
様式で用いることができる。即ち被検体を含有す
る試料を、触媒−結合−mipと組合せて表面と接
触させてもよく、或いは続いて触媒−結合−mip
と接触させることができる。前者の場合、触媒−
結合−mipは比較的限られた量で存在し、測定表
面に対するmip結合点に対して被検体と直接競合
する。後者の場合、触媒−結合−mipは、被検体
の測定表面への結合後に残存する結合点を満し、
それ故に前者の状態におけるよりも大過剰の、問
題の被検体の濃度で存在することができる。mip
が測定表面に結合する十分な時間の後、表面を、
表面に結合し且つ検知しうる信号を与えるであろ
う生成物に帰せられる化合物を含む、共因子を包
含した適当な基質と接触させてよい。 他の具体例においては、特に少くとも１つの酵
素を有する触媒の組合せ物が使用される。この場
合、触媒の１つは他の触媒の基質である生成物を
生成する。これは特に２つの酵素の場合、それが
試薬溶液の必要数及び／又は洗浄必要条件を最小
にし且つ表面における信号発生化合物を急速に生
成するという点で好適な具体例である。この具体
例において、測定表面はmipばかりでなく、２つ
の酵素の１つ、好ましくは系の第一の酵素を含
む。酵素−結合−mipは好ましくは系の第２の酵
素である。第１の酵素の生成物は第２の酵素に対
して必須の基質であり、従つて信号発生系に必要
な種々の基質及び共因子は水性媒体中における予
備熟成反応に関して関係することなしに第２の酵
素と一緒にしてよい。第１の酵素の基質は、表面
と組合わさつた時にだけ繰返して第２の酵素の基
質である生成物を与える。 前述したような同様の工程順序も使用しうる
が、触媒−標識−mipを含有する溶液から分離し
た基質溶液を用いることの所望性は実質的に減ぜ
られる。好適な工程手順は、信号発生系のすべて
の員を試料に添加し；次いで得られた溶液に表面
を導入し；表面において検知しうる信号の変化を
与えるのに十分な時間に亘つて反応を起こさせ；
そして表面を取り出し、次いで表面の各々におけ
る検知しうる信号量を媒体中の被検体の量の尺度
として比較する、ことを含む。 他に、最初に試料を被検体と接触させ、次いで
酵素−結合−mipを基質及び共因子と同時に又は
連続して添加してもよい。前述したように、過剰
の酵素−結合−mipは競争状態で使用することが
できる。この時、被検体は最初に表面上のその捕
捉mipに結合する。被検体が橋かけてとして役立
つ場合には、特に異なるモノクロナルな抗体
（monoclonal antibody）を酵素−結合−mipに
対比される如く表面において使用する場合には、
酵素−結合−mipを被検体と同時に或いは被検体
に連続して添加するかどうかと関係なく、過剰量
の酵素−結合−mipを使用してもよい。基質及び
共因子の濃度は好ましくは酵素の繰返し速度に関
して限界因子となるほど実質的に過剰量で存在す
るであろう。即ち、それは酵素に対するミハエリ
ス定数を越えるであろう。 較正表面は、所望の感度及び較正表面と測定表
面との間で平行化される因子数に依存して変化し
よう。 較正表面は、少くとも１つ、好ましくは２つの
結合事象、即ち同族体mip又は酵素−基質（補酵
素を含む）の結合を含む結合事象において測定表
面に平行であろう。非触媒的信号発生系の場合、
mip測定表面に結合したmipと異なつて、較正表
面に結合しよう。望ましくは、較正表面に結合し
たmipは測定表面に結合したmipと同様の性質の
ものであり、２つの表面は付着体、抗原又は受体
を適当なものとして有するであろう。 触媒的信号発生系の場合、較正表面はmipを含
む必要がない。最も簡単な触媒的較正表面は表面
に共有的に又は非共有的に結合した触媒であり、
この時触媒的活性が予じめ決められた値で付与さ
れる。即ち、分析測定中、触媒は測定表面に結合
した触媒と同一の外来の因子及び条件に較正表面
上で供される。即ち、温度条件、試薬安定性、外
来の非特異的な干渉物、並びに特異的干渉物、条
件及び濃度の局所的変動、などはすべてが２つの
表面において同様に、検知しうる生成物の生成に
影響するであろう。従つて信号発生化合物の生成
における変動の主な原因は測定表面及び較正表面
において平行的に影響されよう。 平行的関係は、較正表面上でmip複合体を形成
させることによつても更に高めることができる。
これは種々の方法で達成できる。１つの方法は、
酵素活性に重大なほど影響しない酵素触媒に対す
る受体を付与することである。酵素−結合−mip
が問題の被検体の濃度範囲において測定表面に結
合する量よりも実質的に過剰量である場合、較正
表面に結合する酵素の量は実質的に一定になるで
あろう。しかしながら、酵素のその受体、特に抗
体に対する結合は、被検体のその同族体mipに対
する結合と同様の具合に影響されよう。 mipを、触媒に結合した被検体と異なる共役さ
せることによつて更に平行にすることができる。
配位体被検体の場合、異なる配位体を触媒に結合
させることができる。このとき、そのような異な
る又は第２の配位体は被検体と同一の触媒分子に
或いは異なる触媒分子に結合していてもよい。２
つの配位体が同一の触媒に結合している場合に
は、触媒−結合−mipに対して測定表面及び較正
表面間で競合が起きよう。触媒−結合−mipが実
質的過剰量で存在する場合、較正表面に結合する
触媒−結合−mipの量は被検体の濃度によつて重
大なほど影響されない。いくつかの事例におい
て、触媒−結合−mipは限られた量で、即ち測定
表面及び較正表面の双方に存在する全結合点より
も実質的過剰量でなくて存在していてよい。較正
表面に結合する触媒の量は被検体の濃度と共に変
化しよう。さもなければ、較正表面に結合した触
媒の量における唯一の変動は、mip複合体の生成
に影響する条件の変動の結果としてであろう。 非触媒的sps員又は基質標識を用いる場合、中
心又は粒子に結合した２つの配位体（被検体及び
較正配位体）を有していてもよい。即ち共役体の
濃度に依存して、２つの配位体が同一の又は異な
る共役体上に存在する及び両配位体が同一の共役
体上にあるとき共役体が限られた量で又は実質的
な過剰量で存在するという競争的又は非競争的様
式が使用しうる。ここに実質的な過剰量とは、共
役体の濃度が分析中に重大なほど変化しないこと
を意味する。 通常、較正表面は、分析媒体中の被検体の量に
実質的依存しないで信号を発する。較正表面に結
合した成分を適当に選択することにより、予じめ
決められた濃度量を与える検知しうる信号が付与
される。測定表面からの検知しうる信号は、測定
表面での検知しうる信号の発生と同一の具合にお
およその影響を受けるであろう。従つて較正表面
で観察される検知しうる信号は被検体の一定の濃
度量を規定しよう。 被検体の量を決定する場合には、測定及び較正
表面での信号量を比較し、その対比を予じめ決め
られた量以上の被検体の存在を支持するものとし
て使用することができる。他に、測定表面での信
号量を較正表面での信号量で割ることによつて半
定量的又は定量的に分析することができる。この
方法では、分析媒体の信号発生に及ぼす非特異的
影響が実質的に消去される。 sps員−結合−mipにおけるmipが受体である場
合には、sps員−結合−受体の受体部分上の抗原
点に結合する較正表面上に受体を付与する更なる
機会を持つことができる。表面上の受体が抗体で
ある場合には、抗体の便宜的な決定点に結合して
いてよい抗（抗体）を用いることができる。この
方法では、sps員−結合−mipのmipは測定表面に
結合した捕捉mipに結合する際の受体として且つ
較正表面に結合した捕捉mipに結合する際の高配
位体として作用しうる。 多くの場合、本発明の装置の使用者はできるだ
け少ない測定とできるだけ少ない移行
（transfer）とを可能にすることが望ましいであ
ろう。即ち、本方法は、試料の測定もさることな
がら、すべてではないが殆んどの試薬の測定を可
能にしよう。第２に、効率を高め且つ誤差の入り
込む余地を減ずるばかりでなく、試験のための全
時間を減ずるために、移行操作の数ができる限り
少ないことが望ましい。 最も簡単な工程では、すべての試薬を表面に供
給し或いは適当な処方物、簡便には凍結乾燥した
粉末処方物中で一緒にする。 試薬を例えば含浸、カプセル化、水溶性接着剤
などによる接着などによつて表面に供給する場
合、装置は試料溶液中に置くことだけが必要であ
る。測定及び較正表面は、溶液の速度が非常に速
い限りにおいて同一の効果に供される。 凍結乾燥した粉末処方物は、試料を含有する測
定量の水性媒体中に溶解せしめられる。溶液が均
一になる十分な時間の後、表面を試料溶液中へ導
入する。非触媒的信号発生系に対しては、mipを
適当に選択することにより、１回だけ表面を浸漬
すればよい。触媒的系の場合には、信号発生系が
２つの酵素を含み、一方の酵素が他の酵素の基質
である生成物を生成するという単一の処方物を使
用することができる。第１の酵素が測定表面及び
較正表面の双方に結合している場合には、予めの
熟成反応と関係なしに第２の酵素を第１の酵素に
対する基質と組合せることができる。その理由
は、第１の酵素が第２の酵素に対して必要な基質
を生成するまで反応が起こらないからである。 信号発生系に１つだけの触媒を用いる場合に
は、溶液の一方が触媒に対する基質を有し且つ他
の溶液が触媒−結合−mipを有する少くとも２つ
の溶液を用いて、表面を２つの溶液と別々に接触
させるか、或いは触媒−結合−mipを表面に溶解
的に結合させ、単一の基質を含む試薬溶液を使用
する。 信号発生化合物は、観察される信号の増減と関
係する。信号発生化合物は触媒によつて発生する
場合表面に優先的に結合し、そして肉眼的に検知
しうる或いは反射光計又は蛍光計により検知しう
る信号を与える。信号発生化合物は通常それが生
成される媒体中に実質的に不溶であり、また触媒
生成物に直接的に又は間接的に由来するであろ
う。信号発生化合物が表面に結合した触媒により
表面に隣つて生成すれば、信号発生化合物の表面
への結合に由来する全信号発生化合物の溶液から
の割合が最小になるであろう。 多くの状態において、捕捉剤が望ましい。例え
ば２つの酵素を信号発生系に用いる場合、第１の
酵素に対する捕捉剤をバルク溶液に用いれば、バ
ルク媒体中での信号発生化合物の生成は更に減ず
ることができる。また信号発生化合物をバルク媒
体中において結合しない酵素−結合−mipの存在
下に生成せしめる場合には、信号発生化合物に対
する捕捉剤がバルク媒体中に有用である。他に、
溶媒中の酵素を選択的に不活性化するが、表面に
結合した酵素に対しては実質的に不活性である酵
素禁止剤を用いてもよい。これは粒子に結合した
禁止剤の、表面に結合した酵素の結合点への接近
を禁止する大きい有孔粒子に結合している可逆的
禁止剤又は自滅禁止剤を用いることによつて達成
することができる。 多くの場合、信号発生化合物は表面において信
号を高めるであろう。しかしながら、表面におい
て信号を減ずる可能性もある。例えば表面が蛍光
性である場合、表面の蛍光を減ずる消光剤を生成
させることができる。他に、異なる染料の表面上
への沈殿時に観察される色が変化するある染料で
着色した表面を使用してもよい。他に、第１の酵
素が信号発生化合物を生成し且つ第２の酵素が信
号発生化合物を破壊する或いは必須の中間体を破
壊するという酵素の組合せを用いてもよい。例え
ばグルコース・オキシダーゼ及び西洋ワサビのペ
ルオキシダーゼを表面に用い、カララーゼをmip
に結合させる場合、表面に結合するカタラーゼが
多くなればなるほど、生成する染料が少なくな
る。即ち第３の酵素が酵素−結合−mipとして存
在することにより、表面に結合する酵素−結合−
mipの量は信号発生化合物の観察される生成を減
ずることと関連しよう。 定量分析のためには、較正表面上の信号量に関
連する如き測定表面上での信号量の比を明確にす
るとよい。即ち信号発生化合物の生成の開始から
信号発生化合物の更なる生成の終了に至る特定の
期間を設定することにより、測定表面及び較正表
面からの信号の比を、被検体の量を定量化するた
めの標準値に関連づけることができる。信号発生
化合物が一定の速度で生成する場合には、測定表
面及び較正表面の両方において信号の十分な変化
が起こる限りにおいて時間は厳密な因子でない
が、信号の変化が表面において最早や観察されな
くなる程時間を長くはしない。即ち比は時間、温
度及び内因的干渉物に対して比較的鈍感な結果を
もたらす。他に、２つの補正表面を用いる場合、
これらの表面における信号の比は時間の測定の代
りに使用することができる。 次のものは、単一の酵素及び組合せ酵素を用い
ることによる２つの工程順序の例である。被検体
は配位体であり、２つの表面は異なる配位体に対
する受体を有する。この時第２の配位体は較正配
位体として言及される。酵素は被検体同族及び較
正配位体の両方と共役する。試料を得、これを予
じめ決められた容量まで水性緩衝媒体に溶解す
る。酵素−結合−ジ配位体（被検体及び較正配位
体）、安定剤、賦形剤、及び随時緩衝剤を含む凍
結乾燥した混合物を試料に添加して、被検体及び
酵素−結合−ジ配位体を含有する溶液を、測定表
面において受体に対して被検体と競争するのに十
分な量であるが、依然限られた程度で較正表面に
結合する量で付与する。２つの表面を同時に溶液
中に導入し、理にかなつた時間に亘つて放置す
る。これによつて被検体は測定表面に結合し、酵
素−結合−ジ配位子は分析媒体中の被検体の量に
関連して測定表面及び較正表面間に分布する。 結合のための十分な時間、一般に約１〜10分の
後、２つの表面を分析媒体から分離し、現像溶液
中へ導入する。十分な信号発生化合物が表面上に
生成する適度の時間の後、表面を取り出し、２つ
の表面上での信号を肉眼で比較する。較正表面に
おけるmipの量を適当に選択することにより、較
正表面からの信号が例えば測定表面からの信号よ
りも大きい。例えば暗いならば、被検体が予じめ
決められた量以下で存在するということがわか
る。２つの表面からシグナルを測定し、次いで比
を決定することにより、この比を存在する被検体
の実際の量を指示する標準物に対して対比するこ
とができる。従つて肉眼的観察によつて半定量的
結果を得ることができ、また定量的結果を望むな
らば２つの表面における信号を注意深く測定し且
つ標準物と比較することにより定量的結果が得ら
れる。 次の工程順序では、酵素の組合せ物が使用さ
れ、信号発生化合物の生成のために、１回の処方
と試料及び試薬溶液の表面との１回の接触を必要
とする。過去の順序と比較する目的で、この場合
には２つの（酵素−結合−配合体）を用い、同一
の酵素と２つの異なる付着体、即ち被検体である
付着体及び較正付着体として言及される他の付着
体とを使用する。測定表面は被検体付着体に対す
る抗体を有し、一方較正表面は較正付着体に対す
る抗体を有するであろう。２つの付着体は交叉反
応すべきでないけれど、それは各々の結合複合体
の生成が条件及び内因的物質における変動に対し
て同様に影響されるように、望ましくは性質が同
様であるべきである。較正表面上の受体は、分析
媒体中の被検体の量に依存しないで信号発生化合
物を生成する予じめ決められた量で存在する。表
面は受体の他に、酵素−結合−配位体の酵素に対
する基質である生成物を生成する第１の酵素も対
比しうる量で有しよう。 工程順序を例示する。２つの酵素−結合−配位
体は各々の測定及び較正表面上において受体に対
して競争しない。それ故に、較正表面に結合する
酵素−結合−較正配位体の量は媒体中の被検体の
量の関数でないであろう。（酵素−結合−配位体）
は表面に結合した酵素の生成物の不存在下に分析
媒体に対して与えられた基質と反応しないであろ
うから、すべての試薬を単一の処方で一緒にで
き、次いでこれを試料と組合せることができる。
測定表面上においてmipに対し、被検体と競争す
る酵素−結合−配位体は、媒体中に存在する被検
体の量と関連して測定表面に結合する酵素−結合
−配位体の量を変化させるために限られた量で存
在する。前述したように、処方物は（酵素−結合
−配位体）及び基質の他に緩衝剤、安定剤、賦形
剤などを含んでいてよい。 処方物を最初に水性媒体に溶解して試薬を適当
な濃度で有する溶液とすることができる。予じめ
決めた容量の溶液の一部分を採取し、試料を溶液
中へ秤り入れる。第１の酵素は酵素反応の進行に
必須である。表面を溶液中に導入し、信号発生化
合物が表面で生成するのに十分な時間をかけ、こ
の時点において表面を取り出し、表面を肉眼的に
観察するか、或いは適当な装置によつて信号発生
量を定量する。 較正表面の信号量は被検体濃度に無関係である
から、測定表面における信号量が較正表面におけ
る信号量よりも小さい場合、被検体は予じめ決め
られた量よりも多量で存在すると言うことができ
る。他に、測定表面及び較正表面の信号量の比を
用い且つこれらを公知の量の被検体を用いて調製
した標準物に対して比べることにより、試料中に
存在する被検体の量を定量化することができる。 本発明の適用と関連する種々の技術に関する記
述に対しては、米国特許第4299916号の第７〜16
欄を参照のこと。この記述は本明細書に参考文献
として引用される。 通常では好適でない更なる別の具体例は、各々
がmipに結合し且つ各々が分析媒体中に存在する
被検体の量に比例して測定表面に結合する酵素の
組合せ物を使用することである。次いで同一の酵
素組合せ物を、最初に或いはmip複合体の結合を
介して較正表面に結合させる。この時mipは２つ
の酵素の各々に対する受体となりうる。或いは２
つの酵素に対して共通の配位体を用いることによ
り酵素組合せ物を結合させてもよい。但しこの場
合には酵素分子は被検体が結合する同一の又は異
なる酵素分子であつてもよい。 材 料 本分析に用いる成分は、被検体、測定及び較正
表面、信号発生系及び適当なものとしてポリ（配
位体同族体）又は多価の受体である。信号発生系
は少くとも１つの触媒−結合−mip及び触媒に対
する基質である溶質を含む。信号発生系はしばし
ば更なる負を含む。 被検体 本発明の配位体被検体はモノエピトピツク又は
ポリエピトピツクであることが特色である。ポリ
エピトピツクな配位体被検体は普通ポリ（アミノ
酸）、即ちポリペプチド及び蛋白質、多糖類、核
酸、及びこれらの組合せ物である。そのような組
合せ物はバクテリヤ、ビールス、クロモゾーム、
遺伝子、ミトコンドリヤ、核、細胞膜などを含
む。 被検体の正確な性質及びその多くの例は
Litmanらの米国特許第4299916号、特に第16〜23
欄に開示されている。この開示は本明細書に参考
文献として引用される。 測定及び較正表面 mip及び／触媒を固定化して測定表面及び較正
表面とするための下地の表面は広く変えることが
できる。一般に下地の構造は、両表面に対して同
一であり、信号発生系を強く吸着しないで分析の
妨害を最小にするように選択される。表面の下地
構造は異なる形体をとり、異なる組成を有するこ
とができ、組成物の混合物又は積層物或いはこれ
らの組合せであつてよい。表面に対して選択され
る材料は、信号発生化合物の不溶化或いは表面に
結合した他の化合物の複合体化反応又は相互作用
によつて信号発生化合物と相互作用できて、信号
発生化合物を生成し、破壊し又はそれと相互作用
しなければならない。 表面は種々の型及び形を取つていてよく、使用
及び測定法に依存して種々の寸法をとることがで
きる。表面の例は、平形、凹形又は凸形であつて
よいパツド、円板又は細片であつてよい。厚さは
厳密でなく一般的に約0.1〜２mmであるが、便宜
的な寸法又は他の寸法であつてよい。典型的に
は、表面は共通の員、例えば棒、管、キヤピラリ
ー、繊維、ストリツプ、円板、平板、キユベツト
（cuvette）などに支持されるが、本発明は各表面
を別々の機械的支持体上に支持することも意図し
ている。表面は支持体の合体部分を形成し又は支
持体からはつきりしていてもよく、典型的には支
持体上に或いは支持体から空間を置き且つ２つ又
はそれ以上のスペーサーで支持させて層を適用す
る。 表面は典型的には有孔である。系の性質に依存
して種々の孔径が使用される。表面は多官能性で
あり或いはmipの共有結合を可能にするために並
びに信号発生系の一部を形成する他の化合物の結
合を可能にするために多官能性化することができ
る。表面の正確な性質は、本明細書に参考文献と
して引用されるLitmanらの米国特許第4299916号
に議論されている。 mipの表面材料への結合による測定及び較正表
面の生成は通常文献に示されている十分公知の技
術であつてよい。参照、例えばIchiro Chibata
著、“Immobilized Enzymes”、Halsted Press、
New York（1978）及びCuatrecases、Ｊ・
Biol・hem.、245、3059（1970）。 天然及び合成の、及びその組合せであつてよい
多種類の有機及び無機重合体が固体表面に対する
材料として使用しうる。重合体の例は、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテ
ン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ
（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロ
ン、ポリ（ビニルブチレート）、シリコーン、ポ
リホルムアミド、セルロース、酢酸セルロース、
ニトロセルロースなどを含む。使用しうる他の材
料は、紙、ガラス、セラミツクス、金属、非金
属、半導体材料、セルメツト、シリケートなどを
含む。更にゲルを形成する物質、例えば蛋白質例
えばゼラチン、リポポリサツカライド、シリケー
ト、アガロース；及びポリアクリルアミド又はい
くつかの水性相を形成する重合体、例えばデキス
トラン、ポリアルキレングリコール（アルキレン
の炭素数２〜３）又は表面活性剤、例えば両性化
合物例えばリン脂質、長鎖（炭素数12〜24）アル
キルアンモニウム塩なども含有させうる。 信号発生系 信号発生系は非触媒的又は触媒的であり、各々
の場合各mip結合事象に対して信号量を増巾す
る。 非触媒的系において、増巾は中心（hub）又は
粒子に結合した信号発生官能基を複数で有しせし
める結果起こる。中心又は粒子がmip結合を通し
て表面に結合するとき、多数の信号発生官能基も
結合されるようになる。従つて一定の増巾比が存
在する。 用いる通常の官能基体は蛍光体及び化学発光体
或いはその前駆体である。その化合物の例は前述
の米国特許に見出すことができる。 中心又は粒子はいずれか簡単な有機又は無機
核、例えばラテツクス粒子、ガラスなどであつて
よい。これらも文献に良く記述されている。粒子
の寸法は一般に直径が約10〜100μで変化しよう。 触媒的信号発生系は、普通には信号発生化合物
である化合物を生成するが、いくつかの場合には
表面に結合した他の化合物と反応して信号発生化
合物を生成し、高性能化し又は分解してもよい。
酵素的及び非酵素的触媒の双方を使用しうるけれ
ど、普通触媒的信号発生系には少くとも１つの酵
素触媒が使用されるであろう。１つの触媒だけが
存在する場合、この触媒は複合体形成によつて測
定表面に結合するためにmipに共役する。触媒の
他に、測定表面において検知しうる信号の変化を
もたらす変形を受ける溶質が存在しなければなら
ない。 多くの場合、触媒−結合−mipによつて接触さ
れた変形に由来する生成物は信号発生化合物であ
るであろう。それ故に、１つの触媒だけ、普通酵
素が存在する場合には、信号発生系は触媒−結合
−mip及びその基質を含有しよう。いくつかの場
合には表面に「カプラー」を結合させることが望
ましく、触媒生成物は「カプラー」化合物と反応
して信号発生化合物を生成する。 好ましくは、２つの触媒、例えば酵素及び非酵
素触媒の組合せ或いは一方の生成物が他方の基質
であるという点で２つの触媒が相互に関係してい
る２つの酵素が使用される。この系においては、
触媒によつて接触される連続的な変化を受ける１
つの溶質又は基質だけが必要であり、検知しうる
信号の生成に包含される化合物が生成する。しか
しながら、多くの場合、通常には系において第１
の酵素に対する基質及び信号の生成に含まれる化
合物に対する前駆体として役立つ、通常信号を与
える化合物を与える第２の化合物が存在するであ
ろう。即ち第１の酵素の生成物は信号発生化合物
に対する前駆体と反応して信号発生化合物を与え
る。 殆んどの場合、包含される反応は加水分解又は
レドツクス反応である。加水分解の場合、２つの
酵素による工程が不溶性染料生成物を与えるのに
必要とされる酵素的に変化しやすい結合で連結さ
れた水に溶解する化合物での染料の置換はこの種
の系の例である。対比して、レドツクス反応の場
合には、第１の酵素が第２の酵素に対する必須の
基質を生成することができ、この時第２の酵素は
第１の酵素の生成物と染料前駆体との間の反応を
接触する。 酵素反応は、他の酵素の基質である生成物に対
する溶質の改変或いは酵素基質として役立つ溶質
の実質的な部分を含まない化合物の生成を含んで
いてよい。第１の状態はアルカリ性ホスフアター
ゼがグルコースに触媒的に加水分解されるグルコ
ース−６−ホスフエートが例であり、この時グル
コースはグルコースオキシダーゼに対する基質で
ある。第２の状態は、信号発生前駆体と酵素的に
反応して信号発生剤を生成する過酸化水素を与え
るグルコースオキシダーゼによつて酸化されたグ
ルコースにより例示しうる。 組合せ触媒は酵素を非酵素的触媒と共に含むこ
とができる。酵素は非酵素的触媒によつて接触さ
れる反応を受ける反応を生成することができ、或
いは非酵素的触媒は酵素に対する基質（補酵素を
含む）を生成しうる。例えばメルドラ青
（Meldola blue）はNAD及びヒドロキノンの
NADHへの転化を接触することができ、これが
長鎖アルデヒドの存在下にFMNオキシドレダク
ターゼ及びバクテリヤ・ルシフエラーゼと反応し
て光を発する。本発明で使用しうる多種類の非酵
素的触媒は、1979年７月10日付けの米国特許第
4160645号に見出される。この特許の関連部分は
本明細書に参考文献として引用される。非酵素的
触媒は１電子移行で反応する第１の化合物及び２
電子移動で反応する第２の化合物反応物として用
いる。この時２つの反応物は触媒の不存在下にお
いて起こつたとしてもゆつくりしか互いに反応す
ることができない。 表面において信号発生化物を付与するために
は、種々の酵素の組合せが使用しうる。特にヒド
ロラーゼの組合せは不溶な信号発生剤を生成する
ため用いることができる。他にヒドロラーゼ及び
オキシドリダクターゼの組合せも信号発生化合物
を与えることができる。またオキシドリダクター
ゼの組合せは不溶な信号発生化合物を生成するた
めに使用しうる。次の表は表面において信号発生
化合物を優先的に生成するために使用しうる種々
の組合せの例である。普通前述したように、表面
において触媒を適当に選択することにより、多数
の試薬が単一の処方法で一緒にすることができ
る。 次の表において第１の酵素は表面に結合される
ことが第２の酵素をmipに結合されることが意図
され、特別は場合にはその位置を保持することが
望ましい。

【表】
エロン
全く明らかなことであるが、上述の染料は適当
な溶解性の必要条件を有する或いは本発明に対し
て適当な溶解性の必要条件を有するように改良す
ることができる他の染料で代替しうる。更に、高
局在化した染料濃度により、染料は急速に表面に
結合するということを理解すべきである。更に、
バルク溶液から表面へ拡散する染料の増加量は表
面上に沈殿する染料の量に重大なほど影響しない
であろう。染料の性質に依存して、染料による光
の吸収或いは蛍光ならば光の発生が測定しうる。 信号発生化合物を製造するための酵素生成物へ
の化学反応の代りに、酵素生成物の環境は信号発
生物を生成するために、表面へ結合する時に選択
的に改変することができる。例えばエステル又は
エーテルを加水分解して電荷に敏感な染料の不溶
性の無色形を表面において生成することができ
る。表面における局所的な電荷は表面に荷電基を
有しせしめることによつてバルク溶液と実質的に
異なるようにしうる。プロトンの濃度に敏感であ
る信号発生化合物を用いることにより、表面に結
合した生成物から観察される信号はバルク溶液又
は液相における生成物のそれと非常に異なる。溶
質が不溶性の消光生成物を生成する場合には、蛍
光体消光剤対も使用しうる。 捕助的材料 本分析には、種々の捕助的材料がしばしば使用
される。特に、分析媒体には酵素基質、共因子、
活性化剤、捕捉剤、禁止剤などが包含せしめう
る。 更に、緩衝剤並びに安定剤も通常には存在しよ
う。しばしばこれらの添加剤の他に、更なる蛋白
質例えばアルブミン或いは表面活性剤、特に非イ
オン性表面活性剤例えばポリアルキレングリコー
ルなども包含せしめうる。 実験結果 次の実施例は例示するものであつて、制限する
ものではない。 すべてのパーセント及び部は断わらない限り重
量によるものとする。但し液体の混合物に対して
は容量部によるものとする。溶媒を指定しない場
合には、それは水である。すべての温度は断らな
い限りセツ氏である。次の略号が使用される：
CMM…O³カルボキシメチルモルヒネ；HRP…
西洋ワサビペルオキシダーゼ；NHS…Ｎ−ヒド
ロキシサクシニミド；EDCI…Ｎ−エチル−N′−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド；DMF…Ｎ，N′−ジメチルホルムアミド；
THF…テトラヒドロフラン；BSA…子牛の血清
アルブミン；GO−AMINE…グルコース・オキ
シダーゼ−アミン；Tvifon QS44…アニオン性
表面活性剤（Rohm and Haas社）；NaAZ…ナ
トリウムアジド；MOPS…３−Ｎ−モルフオリ
ノプロパンスルホン酸（Calbiochem）；CDI…
１，1′−カルボニルジイミダゾール。 実施例 １ 抗モルヒネ紙の製造 次の実験は次のようにバルクで製造した紙支持
体に結合させた抗モルヒネを使用した。
Whatman 1C紙（16フイート×10.63インチ）を、
隣る紙の層を分離して試薬を浸透せしめる２つの
スクリーンを用いて直径１インチの糸巻きに巻き
つけた。得られたカートリツジを反応器に挿入
し、そこでそれを夜通し真空下に凍結乾燥した。
CDI（85g、Polysciences、ロツト番号12087、カ
タログ番号15750）をジクロメタン2.5Lに溶解し
た。この溶液を遠心ポンプにより約4L／分の流
速で２時間反応器中を再循環させた。次いで紙を
ジクロルメタン（2.5L）で３回洗浄し、窒素（約
7L／分）で３時間乾燥し、室温で夜通し乾装し
た。 モルヒネに対する抗体（0.2mg／ml）及びGO−
AMINE（0.1mg／ml）の燐酸塩緩衝剤（2.8L）中
混合物を、24℃で４時間、約2L／分で反応器中
を再循環させた。次いで紙を燐酸塩緩衝剤（4L）
で４回洗浄し、スクローズ（15％）及びBSA（２
mg／ml）を有する溶液2.5Lで安定化させた。過剰
の流体を窒素（40psiで１分間、80psiで15秒間）
で除去した。次いで紙を89.5時間窒素流（250
ml／分）下に真空乾燥した。 実施例 ２ 抗HRP紙の製造 次のようにHRPを用いて２巻きの紙を製造
した： Whatman1C紙（12フイート×10.63インチ）の
第１のロールを隣る層を分離する１対の針金のス
クリーンを用いて直径２インチの糸巻きに巻きつ
けた。Whatman1C紙（16フイート×10.63イン
チ）の第２のロールを、これも隣る層を１対の針
金のスクリーンを用いて分離して直径１インチの
糸巻きつけた。第１のロールを第１の反応器中に
置き、第２のロールを第２の反応器中に置いた。
そして両ロールを窒素を流して水分を除去しなが
ら夜通し真空下に乾燥した。 CDI（170g）をジクロルメタン5.0Lに溶解し、
これをシリーズに連結された反応器中を4L／分
で再循環した。次いで紙をジクロルメタン4.5Lで
３回洗浄し、次いで窒素（6L／分）で３時間及
び200ml／分で夜通し乾燥した。 第２の反応器からの紙を、1.0MNaOHでPH
6.94に調節した燐酸緩衝剤中のHRPに対する抗
体（29.56μg／ml）、非免疫性のひつじのIgG
（22μg／ml）及びQS44（２％、ｗ／ｖ）の混合物
で処理した。この混合物を攪拌しながら夜通し保
温した。この溶液にGO−AMINE（500mg）（製造
法は下記を参照）をNaAZと共に添加した。最終
の容量は2.5Lに等しかつた。GO−アミンの最終
濃度は0.2mg／分であつた。 この溶液を第２の反応器を通して５時間
（2L／分）再循環した。次いで反応器を燐酸塩緩
衝剤（4L）で４回洗浄し、スクローズ（15％）
及びBSA（２mg／ml）の2.5Lで安定化させた。過
剰の液体を加圧下に除去し、紙を窒素流（2.5L／
分）下に真空乾燥した。 グルコース・オキシダーゼ（Sogma、E.
C.1.1.3.4）を、30psi以下の圧力において
AmiconPM10の膜を用いて、360mlから60mlに濃
縮した。このグルコース・オキシダーゼを４℃下
に水4Lに対して２回透析し、過した。これは
分光学的に32mg／mlの濃度を有することがわかつ
た。このグルコース・オキシダーゼ溶液51.5mlに
0.2M過ヨウ素酸ナトリウム5.15mlを滴々に添加
し、反応を25分間起こさせた。生成物を、PH4.5
の2mM酢酸ナトリウムを用いるSephadex Ｇ−
50の2.5×60cmのカラムクロマトグラフイーで処
理し、グルコース・オキシダーゼの主ピークを集
めてアルデヒド誘導体を含有する溶液91.5mlを得
た。この溶液に、PH9.5の0.2M炭酸ナトリウム中
3Mエチレンジアミン６mlを滴々に添加し、反応
を３時間進行させた。次いでこの混合液に10mg／
ml水素化ホウ素ナトリウム約3.9mlを添加し、混
合物を夜通し保温し、次いでクロマトグラフイー
にかけて水素化ホウ素ナトリウムを除去した。 実施例 ３ モルヒネのHRPへの共役 反応フラスコ中において、CMM（35.9mg）、
NHS（12.65mg）及びEPCI（21.12mg）をDMF（1.1
ml）中で一緒にした。次いで混合物を窒素でフラ
ツシユし、室温で夜通し攪拌してCMMの活性化
エステルを製造した。炭酸塩緩衝剤（PH9.5）21
ml中HRPオキシアミン（1.9mg／ml）（製造法は
下記参照）の混合物に、反応混合物を４℃に維持
しながら、活性化エステルを10μlで増量で1.5時
間に亘り、CMM：HRP＝50：１のモル比終点ま
で添加した。次いで反応混合物をG50 Sephadex
の２×30cmのカラムに適用し、0.1M燐酸塩、
0.2M NaCl、PH7.0緩衝剤で流出させ、蛋白質を
監視した。次いで蛋白質画分を集めた。 PH4.5の緩衝剤の酢酸ナトリウム5mM中10mg／
mlHRPの５mlに0.2Mヨウ素酸ナトリウム50mlを
添加し、混合物を30分間攪拌し、次いでＧ−50
Sephadexのカラムクロマトグラフイーにかけ、
PH4.5の2mM酢酸ナトリウム緩衝剤で流出させ
た。蛋白質画分を29mlまで集め、混合物を４℃ま
で冷却し、PH9.5の0.5M炭酸塩緩衝剤中の、４℃
の0.2M2，2′−オキシ−ビス−エチルアミン2.9ml
を添加した。この混合物のPHを、添加される1N
水素化ホウ素ナトリウム−水溶液で9.5に調節し、
混合物を3.5時間反応させ、Sephadex Ｇ−50の
カラムクロマトグラフイーにかけた。 HRP400mg及び２，2′−オキシ−ビス−エチル
アミン3.5gを用いて上記工程を繰返した。元のア
ミンと約４つの更なるアミノ基を有する改変アミ
ンとの間で酵素活性の重大な変化は観察されなか
つた。 実施例 ４ 浸漬棒の製造 分析に用いるために、実施例１の抗モルヒネ紙
及び実施例２の抗HRP紙に1/4インチの円板の孔
をあけた。次いで円板をプラスチツク製の棒の一
端に並行して接着し、浸漬棒とした。 実施例 ５ モルヒネの濃度の関数としての標準曲線 0.1M燐酸塩緩衝剤、0.2M NaCl（２ml、PH7.0）
の標準溶液に、デユプリケート（duplicate）中
０，100，300及び1000ng／mlのモルヒネを添加
した。実施例４における如く製造した浸漬棒を各
溶液に室温で１分間浸した。洗浄せずに、浸漬棒
をそれぞれ現像剤溶液２ml中に置き、５秒間振と
うし、９分間保温した。この現像剤はMOPS
（50mM、PH6.8）、BSA（２mg／ml）、４−Cl−１
−ナフトール（0.2mg／ml）及び実施例３で製造
したHRP−モルヒネ共役体（20ng／ml）を含有
した。９分間保温した後、浸漬棒を取り出し、着
色した紙の円板をMacBethシリーズ1500反射分
光光度計で読んだ。この結果を第１表に示す。こ
こにRCは較正円板の反射に関し、RMはモルヒ
ネの円板の反射に関するものである。RC及び
RMをMacBethの反射分光光度計で与えられる
色差単位で表わす。

【表】 結果は較正円板の示す反射度が試験試料のモル
ヒネの濃度に独立であり、一方モルヒネ円板の反
射度がモルヒネの濃度が増大するにつれて減少す
るるとを示す。測定及び較正円板からの２つの値
の比を用いることにより、モルヒネの定量化のた
めの標準曲線ができた。 実施例 ６ モルヒネの濃度及び現像時間の関数としての標
準曲線 モルヒネ及び燐酸塩緩衝剤の標準溶液を、各濃
度において全体で40の試料に対し８つのレプリカ
を製造する以外、実施例５におけるように製造し
た。浸漬棒を試験試料の各々中に１分間浸し、次
いで表示する時間の現像剤溶液（実施例５）中に
置いた。結果を第２表に要約する。

【表】

【表】 平均
^＊ 平均
10 19.4；20.7
19.9 9.3；9.3 9.3 0.47
15 24.5；25.2
25.0 11.9；10.0 10.9 0.44

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 被検体が配位体及び受体からなる特異的結合
   対の１員である、その被検体の試料中における存
   在を決定するために、 標識した特異的結合対の１員、信号発生系、及
   び標識した特異的結合対の１員に結合し得る特異
   的結合対の１員が結合している測定表面を使用
   し、但し、特異的結合対の１員の複合体が形成す
   る結果として該測定表面に結合する標識した特異
   的結合対の１員の量が分析媒体中の被検体の量と
   関連し、 該測定表面及び該試料を水性分析媒体中で一緒
   にし且つ同時に又は継続的に、該分析媒体中の被
   検体の量に関連したある量の信号発生化合物を該
   測定表面において与える少なくとも該標識した特
   異的結合対の１員を含む該信号発生系の員と、該
   測定表面を一緒にする工程を含んでなる、 該被検体の分析において、 該信号発生系の少なくとも一員又は該信号発生
   系の少なくとも一員を結合しうる特異的結合対の
   １員が結合している較正表面を該分析媒体中に有
   し、該員は該測定表面にも結合し得るものであ
   り、該較正表面は該信号発生化合物からの被検体
   の既知量に対応した信号量を与え、かくして該較
   正表面における信号量と測定表面における信号量
   との対比により被検体の存在量が定められること
   を特徴とする方法。 ２ 該標識した特異的結合対の１員が複数の化学
   発光体又は蛍光体分子に少なくとも１つの特異的
   結合対の１員が結合する中心核を有する特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３ 複数の蛍光体分子が該中心核に結合する特許
   請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 被検体が配位体及び受体からなる特異的結合
   対の１員である場合に、その被検体の試料中にお
   ける存在を決定するために、 特異的結合対の１員に結合した酵素を含む少な
   くとも１つの酵素及び特異的結合対の１員含有の
   測定表面に結合した酵素によつて接触的に転化さ
   れる溶質を用いて、該測定表面に結合する特異的
   結合対の１員に結合した酵素の量に関連して該測
   定表面に検知しうる信号の変化を生成せしめ、そ
   して該測定表面の該試料及び該特異的結合対の１
   員に結合した酵素との接触により、該試料中の被
   検体の量に関連して該特異的結合対の１員に結合
   した酵素を該測定表面に結合させる、 方法において、 該酵素が、該測定表面に結合した該酵素の量に
   対する実質的に予じめ決定した比を与える量で結
   合している較正表面を該分析媒体中に有し、これ
   によつて該較正表面における信号量対該測定表面
   における信号量の対比により被検体の存在量が定
   められることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ５ 酵素が該較正表面に直接結合している特許請
   求の範囲第４項記載の方法。 ６ 媒体が特異的結合対の１員の複合体の形成に
   よつて該接触中に該較正表面に結合する特許請求
   の範囲第４項記載の方法。 ７ 該信号発生系が２種の酵素を含み、但し１つ
   の酵素の生成物が他の酵素の基質であり、また酵
   素の１つが該接触に先立つて該測定表面及び較正
   表面の各々に結合する特許請求の範囲第３，４，
   ５又は６項記載のいずれかの方法。 ８ 該溶質が酵素触媒反応を受けて該表面に結合
   する不溶性の染料を生成する染料前駆体である特
   許請求の範囲第７項記載の方法。 ９ 該特異的結合対の１員に結合した酵素が抗配
   位体に結合した酵素である特許請求の範囲第８項
   記載の方法。 １０ 該特異的結合対の１員に結合した酵素が配
   位体に結合した酵素である特許請求の範囲第８項
   記載の方法。 １１ 被検体が配位体及び受体からなる特異的結
   合対の１員である場合に、その被検体の試料中に
   おける存在を決定するために、 特異的結合対の１員に結合した１つの酵素を含
   む少なくとも２種の酵素及び該酵素の１つが特異
   的結合対の１員を含む測定表面に結合する該酵素
   の１つによつて接触的に不溶性染料に変形される
   溶質染料前駆体を有する信号発生系を使用し、但
   し該不溶性染料が被検体の量に関連して該測定表
   面に検知しうる信号の変化を発生し、また該測定
   表面における該特異的結合対の１員が特異的結合
   対の１員の複合体形成を通して特異的結合対の１
   員に結合した酵素の該測定表面への結合を与え、
   また該測定表面の該試料及び特異的結合対の１員
   に結合した酵素との接触が該試料中の被検体の量
   に関連して特異的結合対の１員に結合した酵素の
   該測定表面への結合をもたらす、該被検体の分析
   法において、 該接触中、該測定表面に結合する該特異的結合
   対の１員に結合した酵素の量に対して実質的に予
   じめ決められた比を与える量で、該特異的結合対
   の１員に結合した酵素の酵素が特異的結合対の１
   員の複合体の形成を通して結合する較正表面を該
   測定表面に隣接して有し、これによつて該較正表
   面における信号量と該測定表面における信号量の
   対比の量が定められる、 ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 １２ 抗酵素受体が該較正表面に予め決められた
   量で結合している特許請求の範囲第１１項記載の
   方法。 １３ 配位体被検体以外の第２配位体が該特異的
   結合対の１員に結合した酵素の該酵素に結合し、
   また抗第２配位体受体が該較正表面に結合してい
   る特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １４ 該第２配位体が特異的結合対の１員に結合
   している酵素以外の酵素分子に共役している特許
   請求の範囲第１３項記載の方法。 １５ 該第２配位体が特異的結合対の１員に結合
   している酵素と同一の酵素分子に共役している特
   許請求の範囲第１３項記載の方法。