JPH03142361A - イムノアッセイ装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫対の構成員（ｍｉｐ）を測定するための
、クロマトグラフィーによらない新規アッセイ装置及び
このような装置を使用するアッセイ方法に関する。

問題の化合物の存在を分析する際に特定の化合物に指向
する天然レセプターまたは抗体を使用できることによシ
創作されたイムノアッセイは萌芽しつつある。イムノア
ッセイに釦いては、いずれの場合にも、リガンド及びレ
セプター（抗リガンド）を含む対応分子対、通常免疫対
が関与し、免疫対の構成員（以下ｍｉｐと記す）の一方
を、検知しうるシグナルを生じる標識で標識付けする。

イムノアッセイ法はｎｉｐの複合体に結合したシグナル
標識と未結合シグナル標識との間のシグナル標識の分布
に基づく。結合シグナル標識と未結合シグナル標識とは
、未結合シグナル標識から結合シグナル標識の物理的分
離または結合シグナル標識と未結合シグナル標識との間
の検知しうるシグナルの変化の結果として区別すること
ができる。

イムノアッセイは大部分、比較的精巧な装置及び注意深
い技術を必要とする臨床研究室において広範な有用化合
物、特に薬剤の定量的測定に関するものであった。半定
量的または定性的結果が求められる場合及び測定が家庭
または診療所におけるように非研究者によってなされる
場合には、イムノアッセイは商業的にばあ″！シ広く応
用されなかった。臨床試験室でさえ、未熟練者の採用し
うる簡単かつ迅速なスクリーニングテストがあれば、著
しく経費節約に役立つであろう。

イムノアッセイの発展には、考慮すべきことが多々ある
。その１つは、結合した場合にシグナル標識から生じる
観察されるシグナルを未結合の場合と実質的に区別する
ことである。もう１つは、問題の化合物を含むと思われ
る試料中の内因性物質からの干渉をできるだけ少なくす
ることである。

更に別の考慮事項は、観察されるシグナルを検出でき且
つそれによシ問題の濃度範囲で濃度を区別しうる容易さ
である。他のファクターは、試薬製造の容易さ、試料及
び試薬溶液を調整測定する精度、試薬の貯蔵安定性、プ
ロトコルに要求される工程数、並びに各工程を実施する
熟練度及び正確さである。従って、家庭や法医学におい
て、また開業医等によって行なわれる検定のように、未
熟練者の利用しうるアッセイ法を開発する際には、観察
結果はプロトコルを実施する方法における変動に極めて
少ししか影響されるべきではなく、或いは種々の工程を
実施するため簡単な技術を準備すべきである。

米国特許筒４，１６８，１４６号明細書は、イムノア１
．セイ試験ストリフ７″を記載している。米国特許筒３
，９９０，８５０号及び同第４，０５５，３９４は診断
試験紙を記載している。種々の特許及び特許出願はイム
ノアッセイにおける検知しうるシグナルを生ずるための
種々の技術の広範な文献を提供している。本発明に使用
しうるこれらの技術の若干を説明するため以下に若干の
特許を列挙する。米国特許及び特許出願ならびに関係す
る標識の種類の一般的表示のリストを以下に示す。

米国特許筒３，６４６，３４６号明細書、放射性標識：
米国特許筒３，６５４，０９０号、同第３，７９１，９
３２号及び同第３，８１７，８３８号明細書、酵素標識
；米国特許筒３，９９６，３４５号明細書、螢光物質−
消光物質標識；米国特許筒４，０６２，７３３号明細書
、放射性標識；米国特許筒４，０６７，９５９号明細書
、螢光物質管たは酵素標識；米国特許筒４，１０４，０
２９号明細書、化学発光標識：及び米国特許筒４．１６
０，６４５号明細書、非酵素触媒標識。抗体帯域を使用
する電気泳動技術については米国特許筒３．９６６，８
９７号明細書を、標識分析物を最初に抗体を介して固体
担体に結合させるＲＩＡについては米国特許筒４，１２
０，９４５号明細書を参照されたい。

１９７８年４月５日に出願された米国特許出願第８９３
．６５０号明細書は酵素対標識を使用し：１９７８年４
月５日に出願された米国特許出願第８９３．９１０号明
細書は化学誘発螢光標識を使用し、そして：１９７９年
８月２６日に出願された米国特許出願第６１，０９９号
明細書は酵素陰イオン電荷標識を使用している。

本発明は、免疫対の構成員（ｍｉｐ）を測定するための
、クロマトグラフィーによらない新規アッセイ装置及び
このような装置を使用するアッセイ方法に関する。装置
は、ｍｉｐが拡散運動に対抗して固定される免疫吸着帯
域を有する。免疫吸着帯域は試料及び試薬溶液の入口と
して役立つ。

液体吸収帯域は、免疫吸着帯域とは直接または間接的に
肢体を受理する関係にあシ、免疫吸着帯域から通常横方
向に伸び、免疫吸着帯域を通って液体を吸引し且つ液体
を貯蔵するのに役立ち、また、液体が免疫吸着帯域を通
って吸引される速度を調節するのに役立ちうる。

この装置と共に本発明方法には、ｍｉｐに結合したシグ
ナル標識構成員を有するシグナル発生系を使用する。免
疫吸着帯域はシグナル発生系の成分を１種またばそれ以
上含んでいてよく、該成分は免疫吸着帯域に、シグナル
発生系成分の拡散運動を許容または抑制するように結合
されている。この方法プロトコルによれば、免疫吸着帯
域において検出帯域に結合したシグナル標識の量は試料
中の分析物の量に関係する。

この方法は、アッセイ装置を液体試料（シグナル発生系
の成分を１積重たはそれ以上添加したものでもよい）と
接触させ、次いで、シグナル発生系の残ジの成分を含み
且つ免疫吸着帯域を洗浄して非特異的に結合したシグナ
ル標識を除去するため使用する１積重たはそれ以上の溶
液と順次接触させることからなる。シグナル発生系は免
疫吸着帯域に訃いて、既知量の分析物を含む標準に基づ
〈シグナルレベルと比較しうる検出可能のシグナルを提
供する。

本発明の方法及び装置はイムノアッセイを実施するため
のものである。この方法及び装置は、比較的多量の流体
が比較的均一な流れで通過する狭い帯域を生ずるように
工夫されている。この帯域は、試料中の少量の分析物及
び検出可能のシグナルを生ずる試薬を濃縮すると同時に
、その際媒体中の分析物の量に無関係なバックグラウン
ドシグナルの発生に帰因する、非特異的に結合した物質
の局在化を抑制するのに役立つ。詳述すれば、液体試料
及び液体溶液を受理し、溶液を免疫対の構成員（ｍｉｐ
）が結合する免疫吸着帯域を通って送り、液体及び非特
異的に結合した物質を貯蔵帯域に吸引するアッセイ装置
を提供する。試薬溶液は免疫吸着帯域において、試料中
の特定量の分析物に関する標準と比較しうる検出可能の
シグナルを発生する。

イムノアッセイ法は、他の均質及び不均質イムノアッセ
イに従来便用された種々の試薬の組合せに適合できる。

これらの他のアッセイを実施した条件を、通常、本発明
方法に適用しうる。即ち、本発明の装置は先行技術の方
法に比べて簡単なプロトコルを可能にし、先行技術の方
法と同様な定性また定量的結果を生ずる。検出可能のシ
グナルを発生する成分を適切に選択することによって、
検出可能のシグナルを肉眼でオたは種々の装置、例えば
分光光度計、螢光計、シンチレーション計数計等によっ
て観察することができる。

測定すべき分析物はｍｉｐである。対応ｍｉｐの特異性
が問題の分析物と試料中に存在しうる他の物質とを識別
する手段を生ずる。即ち、免疫吸着帯域のｍｉｐを適当
に選択することによって、免疫吸着帯域への成分の特異
的結合を生じ、これにより検出可能のシグナルを発生す
ることができる。免疫吸着帯域におけるこのような成分
の量を、試料中の分析物の量に対応させることができる
。

アッセイ装置の他に、シグナル発生系を含んで嘔翳 なる試薬を１積重たはそれ以上使用する。

生糸中のキー試薬は、シグナル標識として作用し且つｍ
ｉｐに結合する試薬である。プロトコルの選択は、シグ
ナル標識と免疫吸着帯域に特異的に結合したｍｉｐとの
結合体の量の増加がアッセイ媒体中の分析物の量を決定
するか、該結合体の量の減少が分析物の量を決定するか
を決めるであろう。

定義 分析物とは、測定すべき化合物または組成物でｈ−ｚて
、ｍｉｐであり、モノ−或いはポリエピドーグ性（即ち
、１個または複数の決定部位を有する）ハプテンｌたは
抗原性のリガンド、単一化合物、または少なくとも１個
の共通のエピトープ部位若しくは決定部位を共有する複
数の化合物、！たはレセプターであってよい。

ｍｉｐとは、免疫対の一構成員であって、２種の異なる
分子から成シ、一方の分子は表面上型たは空所中に他の
分子の特定の空間的及び極性構造に特異的に結合する領
域を有する。免疫対の構成員はりがンド及・びレセプタ
ー（抗リガンド）と言われ、特異的対の構成員は対応分
子対と言われる。

ａ）　　リガンドとは、そのレセプターが天然に存在す
るか寸たは製造されうる任意の有機化合物である。

ｂ）レセプタ−（抗リガンド）とは、分子の特定の空間
的及び極性構造、即ち、エビ）−７’ｔたは決定部位を
識別しうる（該部位に高い結合親和力を有する）任意の
高分子化合物である。レセプターとしては、例えば、天
然に存在するレセプタ、例工ばチロキシン結合性グロブ
リン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レクチン等が
挙げられる。抗体なる用語は、本明細書においてレセプ
ターの例示として、またレセプターをよう一般的に示す
ため使用する。

Ｃ）抗レセプターとは、若干の状況において、リガンド
に結合し且つレセプターに対するリガンド（抗しセグタ
ー）として作用する二重の機能を示すレセプターであう
、リガンド及び抗しセノターは互に直接には結合できな
いが、レセプターによって結合されて免疫結合を生じる
。抗レセプターは屡々抗体、プロティンＡ１　リウマチ
因子、０１％等であってよい。

リガンドアナローブとは、レセプターに対して類似のり
ガントと競合しうる変性リガンドであり、リガンドの変
性が別の分子にリガンドアナローブを結合する手段を与
えているか、またはリガンドが別の分子に直接結合する
ため使用される官能性を有する場合には、結合体のリガ
ンド部分をリガンドアナローブと言う。リガンドアナロ
ーブは通常、別の分子、例えば、標識またはハブ（ｈｕ
ｂ）にリガンドアナローブを結合する結合によう水素を
置換する以上に、リガンドとは異なるであろう。

複数のりガントアナミーグが特に中心核、例えばハブに
結合することによって一緒に結合する場合に、生ずる集
合体をポリ（りがンドー７ナローグ）と言う。

アッセイ装置とは、少なくとも１個の吸収性層、通常２
以上の層を有し、これらの層は問題の物質に対して非特
異的吸着性を比較的有しない。この装置は一要素として
、ｎｉｐを非拡散性に固定させる比較的小さい免疫吸着
帯域を有する。ｍｉｐは、アッセイの経過中、吸収性固
体支持体上に実質的に固定される。！た、この装置は第
二要素として直接または間接的に免疫吸着帯域と液体受
理関係にある貯蔵帯域を有する。

ａ）免疫吸着帯域は、ｍｉｐを非拡散的に結合する吸収
性固体フィルム、層重たはシートである。

免疫吸着帯域はアッセイ装置の全容量に比して比較的小
さい流体容量を有する。シグナル発生系の１種またばそ
れ以上の構成員を直接または間接的に免疫吸着帯域に結
合することができる。免疫吸着帯域は対応ｍｉｐに対し
て特異的結合性を有する。

免疫吸着帯域内に１個またはそれ以上の帯域が縦列で筐
たは重複して存在してもよい。免疫吸着帯域内には検出
帯域が含壕れ、検出帯域はｍｉｐを結合する帯域と同一
または異なっていてよい。

ｂ）液体吸収帯域は、免疫吸着帯域と液体を受理する点
で直接または間接的に関係する吸収性固体物質であシ、
免疫吸着帯域よう著しく大きい液体容量を貯蔵しうる貯
蔵帯域として作用する。この帯域は液体を免疫吸着帯域
を通して吸引し、そこから流出させるポンプとして作用
する。

シグナル発生系は１種またはそれ以上の成分を含み、少
なくとも１種の成分はｍｉｐに結合する。

シグナル発生系は、外部手段、通常電磁線の測定によっ
て検出しうる測定可能のシグナルを生じ、そのシグナル
は免疫吸着帯域における検出帯域で生じる。シグナル発
生系は放射性物質、酵素及び色原体物質、及び発色物質
（発色物質とは紫外または可視領域の光を吸収する染料
を含む）、燐光物質、螢光物質及び化学発光物質を含む
。シグナルは多くの場合、通常紫外塘たは可視範囲で電
磁線を吸収會たは放出することができるが、他の検出可
能のシグナルを特別の場合に適用してもよい。

シグナル発生体は検出可能のシグナルを発生する化合物
である。シグナル発生体はアッセイの間に生成するか、
または初めから存在し、何ら化学変化を受けることなく
シグナルを発生するものであってよい。化学反応を伴な
う場合には、反応してシグナルを発生する化合物をシグ
ナル発生体前駆物質と言う。

標識とは　別の分子捷たは支持体に結合する任意の分子
であってよく、自由に選択することができる。本発明に
おいて、標識は、支持体としてのアッセイ装置に結合し
たｍｉｐであシ、ｍｉｐに結合しようと、支持体として
のアッセイ装置に結合しようとシグナル発生系の構成員
である。

ｍ１ｐ−支持体結合体とは、免疫吸着帯域において、ア
ッセイ装置支持体に結合したｍｉｐで、ｌ、共有結合捷
たは非共有結合によう、直接または間接的に結合してい
てよい。ｍｉｐは、試料及び試薬溶液が免疫吸着帯域を
通って移動する間に泳動しないように実質的に永久に支
持体に結合される。

ｍｉｐはその対応構成員を免疫吸着帯域に結合するよう
に作用する。

シグナル標識−ｍｉｐ結合体とは、ｍｉｐに直接筐たは
間接的に結合しているシグナル発生系の一構成員であシ
、ｍｉｐは免疫吸着帯域に結合しているか、または後に
結合して、検出帯域で検出可能のシグナルを発生する。

シグナル標識−支持体結合体とは、免疫吸着帯域に共有
結合または非共有結合によう直接または間接的に結合し
たシグナル発生系の一構成員でありて、７グナル標識−
ｍｉｐ結合体と共に検出帯域においてシグナルを発生す
る作用をする。

方法 本発明方法は、試料溶液及び通常１種才たはそれ以上の
試薬筐たは洗浄溶液と共にアッセイ装置を使用する。こ
の方法は免疫吸着帯域を試料溶液と接触させることを含
み、この場合免疫吸着帯域の液体保有能は試料の容量並
びに免疫吸着帯域を通過する試買智よシ著しく小さい。

免疫吸着帯域は固体支持体に固定されたｍｉｐを有し、
そこでｍｉｐはその帯域から拡散するのを抑制されてい
る。免疫吸着帯域を通過する試料溶液中の分析物は、ｍ
１ｐ−支持体結合体のｍｉｐに結合され、免疫吸着帯域
に濃縮される。

シグナル標識−ｍｉｐ結合体は、多くの方式で含１れて
いてよい。即ち、（１）免疫複合体形成によシ（２）試
料と共に存在し、そして分析物と競合するかまたは分析
物と一緒に作用する；（３）後から添加する。

試料を接触させた後に、免疫吸着帯域をシグナル発生系
の残りの構成員及び適当な場合には、洗浄溶液と接触さ
せ、媒体中の分析物の量に対応して検出帯域に検出可能
のシグナルを発生させる。

はとんどのプロトコルにおいて、試薬溶液は洗浄溶液と
しても作用し、プロトコルにおける工程数を最小にする
。

本発明方法は、液体中に浸漬した層へまたその層から拡
散する溶質の拡散を伴なう先行技術の方法とは異なる。

従って溶質が層に、結合するかまたは液体中に溶解する
ので、層は連続的に変化する溶液組成物に遭遇する。本
発明においては、溶液と接触しているｍｉｐ含有量は、
溶液が層を通って拡散するので、実質的に同じ溶液組成
物と接触する。即ち、ｍｉｐ含有層における溶液中の溶
質の濃度は、免疫吸着帯域と溶液との接触の間、比較的
一定にとど壕る。

入口として作用する免疫吸着帯域を有するアッセイ装置
の構造は、多様に設計することができる。

免疫吸着帯域を除いてアッセイ装置は、溶液が液体吸収
帯域によって吸収される前に免疫吸着帯域よう吸収され
るように、通常非透過性バリヤーによって絶縁しなけれ
ばならない。免疫吸着帯域は、非透過性バリヤーの開口
部によって露出される。

この構造により１アツセイ装置を好適に溶液中に浸漬す
ることができる。

また、溶液を水平位置の免疫吸着帯域に、滴下によシ、
緩徐に流れる液流として、または免疫吸着帯域を包囲す
る容器中で適用することができる。

試料は前処理に付しても、付さなくてもよいが、通常は
処理しない。前処理を使用する場合には、シグナル生成
系の成分または他の試薬の１種ｌたはそれ以上を含むか
、ｌたは含壕ない緩衝液を使用してもよい。試料溶液が
サンプリング準備済みである場合には、アッセイ装置の
免疫吸着帯域を試料と接触させ、試料の少なくとも１部
を吸収させる。その結果、試料溶液のかなうの部分は免
疫吸着帯域より入り、この帯域を通過し、貯蔵帯域中に
達する。本発明の装置を用いる場合、溶液の容量を予め
測定することは通常必要ではない。吸収される溶液の量
を、液体が液体吸収帯域を通過する距離によって管理す
ることができる。

この方法で、比較的多量の試料を免疫吸着帯域に導通さ
せて限定量の免疫吸着帯域中で分析物を実質的に濃縮す
ることができる。液体吸収帯域の容量及び対応ｍｉｐの
結合定数が小さい場合には、多量の試料を免疫吸着帯域
に吸収させ、通過させることによって比較的低い濃度の
分析物を検出子ることができる。

該当する分析物は広範な環境中に存在しうる。

該当する分析物は薬剤、ホルモン、高分子物質及び微生
物（これらは生理学的液体、例えば血液−全血清または
血奨−尿、脳を髄液、眼水（ｏｃｕｌａｒｌｅｎｓ　１
ｉｑｕｉｄ　）及び唾液中に存在してもよい）；合成化
学品；水及び空気中の汚染物質；微量化合物、毒素並び
に食物、例えば牛乳、肉、家禽及び魚中の微生物等を包
含する。事実、リガンドまたはリガンドが得られろレセ
プターとして作用しうる任意の有機物質は、このような
分析物を液体系中に、対応ｍｉｐに結合しうる形で導入
しうる限シ、測定することができる。

プロトコルに応じて、試料溶液中の分析物と共にシグナ
ル発生系の成分１種またはそれ以上が存在してもよい。

シグナル標識−ｎｉｐ結合体を含む溶液に続いて少なく
とも１種の付加的溶液を通過させて、免疫吸着帯域にお
けるシグナル標識−ｍｉｐ結合体の非特異的結合の除去
を確実にし、そしてまたはシグナル発生系の残すの成分
を導入することができる。シグナル発生系に１種よう多
くの成分が金型れる場合に、シグナル標識−ｍｌｐ結合
体溶液を、その後の試薬溶液中のシグナル発生系の残シ
の成分を添加する前に免疫吸着帯域に有利に吸着させる
ことができる。この場合、その後の試薬溶液は、非特異
的に結合したシグナル−ｍｉｐ結合体を除去するための
洗剤として作用する。

或いは、初めに接触させる試料に何も添加せず、次にシ
グナル標識−ｍｉｐ結合体及びシグナル発生系の他の成
分を含む付加的溶液を１種またはそれ以上添加する。

種々のプロトコルを利用でき、特別の構造は分析物の性
質、即ち、モノもしくはポリエビトーノ性リガンドであ
るか筐たはレセプターであるか：シグナル標識−ｍｉｐ
結合体の性質；並びにシグナル発生系の成分の性質及び
数による。従って、多くのプロトコルの例を挙げるが、
それが全部ではなく、むしろ変更の多くの機会を示すプ
ロトコルの実施態様である。

以下余白 下記の第１表には、分析物と、分析物の量に関連して免
疫吸着帯域でシグナルを生ずるための本発明に使用しう
る試薬との種々の組合せを示す。

第　　■　　表 −Ｈ −Ｈ −ＡｂＨ −Ａｇ −Ａｂ Ｌ−ＡｂＡ。

−ＡｂＨ −ＡｂＨ −ＡｂＡｂ −Ｈ −Ｈ −ＡｂＡｇ −Ａｇ Ｌ−Ａｂ　Ａ。

−Ａｇ −ＡｂＡｂ −ＡｂＡｂ グロトコルエ：シグナル発生系の他の部分と接触させる
前に試別及びアッセイ 装置を接触させる。

プロトコル２ニア、セイ装置と接触させる前に、筐たは
それと同時にシグナル発 生糸のｍｉｐ成分と試別を合する。

Ｈ−モノエピトープ性リガンド Ａｇ−ポリエピドーグ性りがンド Ａｂ−レセグター、通常抗体：サブスクリプトは対応ｍ
ｉｐを示す。

Ｌ−標識。

２つの基本プロトコルを含む種々の組合せが可能である
。プロトコル２は試別及びシグナル発生系のｍｉｐ成分
を合し、生じる溶液とアッセイ装置を接触させることを
含む。若干の用途には、次にアッセイ装置のストリップ
を、場合によシグナル発生系の他の成分を含む洗浄溶液
と接触させて非特異的結合ｍｉｐの完全な除去を確実に
する。また、プロトコルｌにおいて、アッセイ装置を試
別と接触させ、次にシグナル発生系のｍｉｐ成分と接触
させ、場合によシ、使用する場合には通常シグナル発生
系の他の成分を含む洗浄溶液と接触させることができる
。更に、１及び７の場合には、Ｌ−ｍｉｐを初めにｍ１
ｐ−支持体結合体に結合させて、試料中に浸漬したとき
にＬ−ｍｉｐをハゲテン分析物で置換させることができ
る。シグナル標識が放射性標ｍ−ｚたは螢光物質である
場合には別の工程は必要ではない。

組合せ２及び８には、試別をシグナル標識ｍｉｐと他の
ｍｉｐとの混合物と合し、アッセイ装置を生じる溶液と
接触させる。

シグナル標識及びシグナル発生系の性質に応じて、螢光
物質を光で照射し、螢光のレベルを観察するか；または
染料を肉眼或いは分光光度計で観察でき、螢光物質を肉
眼或いは螢光計で観察できる場合には、染料、螢光物質
若しくは化学発光物質を生成する触媒系を加えるか：ま
たは化学発光或いは放射性標識の場合には放射線カウン
ターを使用することによって、シグナルを観察する。適
切な装置を入手できない場合には、通常、可視の色を生
ずる発色団を生成させるのが望筐しい。精巧な装置を使
用する場合には、任意の技術を適用しうる。

試薬をそれぞれ結合させた後、インキュベーション工程
を設けることができる。各溶液を結合させるインキュベ
ーション工程は約５秒〜１６時間以上、一般に約１分〜
１時間、更に一般には約５分〜３０分であることができ
る。これに対して、アッセイ装置を各溶液と接触させる
時間は、吸着すべき溶液の容量及び溶液が液体吸収帯域
中に拡散する速度に左右される。この時間は、溶液中の
ｍｉｐの濃度、免疫吸着帯域の領域におけるｍｉｐの濃
度、対応ｍｉｐの結合定数、シグナルの生成速度度に応
じて調節する。免疫吸着帯域を通って溶液が拡散する時
間を調節しうる方法は、免疫吸着帯域及び液体吸収帯域
の組成、構造、寸法及び形、温度、溶媒等に関係する。

本発明方法及び装置を使用する機会の広範さを考慮すれ
ば、本発明による特殊な時間範囲は重要ではないであろ
う。

多くの場合、アッセイ装置と溶液を接触させる種々の溶
液の結合、及び読み取シを約０〜５０℃の範囲、更に普
通には約１５〜４０℃の範囲の温度で実施する。種々の
試薬の結合及びインキュベーション工程には、温度は一
般に約１５〜５０℃鷹々２０〜３５℃、好１しくは室温
である。測定が定性、半定量約１たは定量的であるか否
かに応じて、温度を調節しても筐た調節しなくてもよく
、周囲温度を使用するのが有利である。周囲温度を使用
する場合には屡々、試料ス）ＩＪツブからの観察シグナ
ルと比較するために１個またはそれ以上の対照ストリッ
プを使用することができる。

使用する溶液を通常、約５〜１１．更には５〜ｌＯ１好
１しぐは約６〜９０−に緩衝する。−は、シグナル発生
効率を最適にしながら、ｍｉｐによる特異的結合の有意
なレベルを保持するように選択する。種々の溶液を用い
て種々の−を使用しうろことは明らかである。所望の−
を達成し、測定・の間所望の−を保持するために種々の
緩衝液を使用することができる。緩衝液としては、例え
ば、硼酸塩、燐酸塩、炭酸塩、トリス、バルピタール等
が挙げられる。使用する特定の緩衝液は本発明には重要
でないが、個々のアッセイにおいて最も好ましい緩衝液
があろう。

測定しうる分析物の濃度は、一般に約１０−４〜１０−
１５４更に普通には約１０−’〜１０−１３Ｍである。

アッセイが定性的、半定量的筐たは定量的であるか、特
定の検出技術及び問題の分析物の濃度等を考慮して、他
の試薬の濃度を決定するのが普通である。

種々の試薬の濃度は、どのプロトコルを使用するか、分
析物の性質、免疫吸着帯域中のｍｉｐ　、アッセイの必
要な感度等に応じて変動する。若干の場合には、ｍｉｐ
の一方または他方の大過剰を使用することができ、若干
のプロトコルではアッセイの感度ばｎｉｐの比の変動に
応答する。

例えば、分析物がポリエピトープ性抗原である場合には
、抗りがンドー支持体結合体として及びングナル標識−
抗リガント結合体として過剰の抗りがンドを、アッセイ
の感度に重大な影響を及ぼすことなく使用することがで
きるが、その場合にはアッセイ装置を壕ず試料と接触さ
せ、次にシグナル発生系溶液と、好１しくは次に洗浄溶
液と接触させる。抗リガンドが分析物であシ、且つプロ
トコルが抗原−支持体結合体を接触させる前に、分析物
と触媒−抗リガント結合体との結合を含む場合には、ア
ッセイの感度は分析物と触媒−抗りがンド濃度との比に
関係する。

プロトコルに関する考慮すべき事について記載したが、
更に試薬の濃度は抗リガンドの結合定数または抗血清を
使用する場合には結合定数グロフィル、及び必要なアッ
セイ感度に左右されるであろう。可能な場合には、シグ
ナル標識−ｍｉｐの濃度を充分低くして、免疫吸着帯域
、特に検出帯域内での非特異的結合または吸蔵を最小に
するのが望せしい。

種々の試薬の性状及び性質の変動から比に大幅な差が生
じるため、モル比については極めておお壕かにしか述べ
ることができない。例えば、問題の分析物範囲に基づい
て、免疫吸着帯域に吸引されるシグナル標ｔｔｃ−ｍｉ
ｐ結合体の分子数は通常、結合部位に基づく分析物の最
小モル数の約０．１倍以上、免疫吸着帯域に吸引される
結合部位に基づく分析物の最大モル数の約１０００倍以
下、更に普通の場合には結合部位に基づく分析物のモル
数の約０．１〜１００倍であろう。ｍ１ｐ−支持体結合
体のｍｉｐに関する限シ、通常、免疫吸着帯域に吸引さ
れる結合部位に基づく分析物の最小モル数の約０．００
１倍以上であろう。前記のように、プロトコルによって
化学量論量よシ大過剰であってもよい。免疫吸着帯域に
おけるｎｉｐの量は、シグナル標識−ｍｉｐ結合体によ
って完全に結合された場合に検出可能のシグナルを生ず
るのに少なくとも充分な程度である。（試料または分析
物を引用した前記の数値は、免疫吸着帯域を通過する容
ｉ−ｔたは数であって、アッセイ装置に接触させる試料
溶液の総ｔまたは分析物の総量ではない）。

方法のプロトコルを作る際には、基本的事柄が試薬の添
加順序及び組合せを支配する。大過剰のシフナル標識−
ｍｉｐ結合体を使用する場合には、通常、分析物をアッ
セイ装置と結合させる前にシグナル標識−ｍｉｐ結合体
を分析物と結合させない。

シグナル標識が触媒である場合には、シグナル標１−ｍ
１ｐと試験装置との結合前に反応が起る条件下でシグナ
ル標識−ｍｉｐをングナル標識基質と結合させないのが
普通である。化学発光には触媒標識の場合と同様の考慮
をする。

プロトコルによって複雑さの程度は異なる。複雑さに影
響する事項は、容量測定、工程数、副時精度及びバック
グラウンドの干渉の可能性である。

通常、予備測定を回避し、装置をただ１種の溶液と接触
させることもできるが、通常、少なくとも２種の溶液と
接触させる。通常、装置をシグナル標識−ｍｉｐ結合体
と接触させた後に、試薬、例えば酵素基質を含む洗浄溶
液との後続接触を屡々使用する。この方法で、免疫吸着
帯域に釦ける非特異的結合及び吸蔵が実質的に存在しな
いように確実にすることができる。従って、本発明方法
は、触媒、特に酵素を使用する場合に、特別の利点を示
す。従来方法では、別に洗浄工程が必要であった。本発
明では、試薬の添加工程が洗浄工程として作用する。

免疫吸着帯域にりがンドを準備するかまたはレセプター
を準備するかの選択は多数のファクターに依存する。ポ
リエピドーグ性りがンドが分析物である場合には、ｍｉ
ｐがレセプターに対する抗体である触媒−ｍｉｐ結合体
を使用すると（ｆロトコル１６及び１７）、免疫吸着帯
域に釦いて分析物の各分子に多くの触媒が結合するので
アッセイの応答が高くなる。しかしながら、通常は次い
で、アッセイ装置を試料、抗体、シグナル標Ｆｔ−ｍｔ
ｐの順序で少なくとも３種の別々の溶液と接触させなけ
ればならない。りがンドまたはレセプターの純度も重要
であろう。ｎ１ｐ−支持体結合体の製造に使用する抗原
または抗体中の夾雑物はアッセイににあ壕り影響しない
が、極めて不純な抗原または抗体をシグナル標識で機能
（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）させるのは好
捷しくない。しかしながら、本発明はｍｉｐ以外のもの
に結合したシグナル標識を免疫吸着帯域から除去するメ
カニズムを提供する。

前記のように、プロトコルの簡単さを更に考慮する。本
発明においては、アッセイの結果に著しい影響を及ぼし
うる測定の回数を最小にするのが望ましい。アッセイ装
置を１ず試料とだけ接触させる場合には、測定を全く回
避できる。試料を他の溶液と合する場合には、必要な測
定を試料の量及び適切ならば、アッセイ試料を作るその
後の希釈に限定するのが望ましい。特に、半定量的また
は定性的な結果を得るため、残シの試薬を添加するとき
にアッセイの結果に影響することなく、容量及び濃度の
かなりの変動は許されるべきである。

免疫吸着帯域に抗体を有するアッセイ装置を使用する場
合について説明する。シグナル標識ｍｉｐも抗体を使用
し、試料は抗原である。吸蔵されそして非特異的に結合
したシグナル標識−ｎｉｐを減少するためその後の工程
を使用する場合には、２工程を使用することによって、
即ち、１ずアッセイ装置を試料と接触させ、次にアッセ
イ装置をシグナル標識−ｍｉｐ結合体と接触させること
によって、所定の最小量よシ多量のシグナル標識−ｎｉ
ｐ結合体を使用してもアッセイの結果はあ寸シ影響され
ない。これに対して、試料及びシグナル標識−抗体結合
体を初めに合した場合に、大過剰のシグナル標識−抗体
が存在すると、免疫吸着帯域における抗体−支持体結合
体への抗原の結合が抑制されることになろう。

本発明を更に説明するため、モノエピドーグ性分析物、
ポリエピトー／性分析物筐たはレセプター分析物を使用
し、シグナル標識として、シグナルの発生のため他の化
学試薬の添加を必要としないシグナル標識、シグナルの
発生のため付加的試薬を必要とするシグナル標識、及び
シグナルの発生のため付加的試薬を必要とし、アッセイ
装置の免疫吸着帯域に初めに存在するシグナル発生系の
成分と反応するシグナル標識を使用するプロトコルの例
を説明する。シグナル標識−ｎｉｐ結合体が免疫吸着帯
域に初めに存在する場合には、複雑な免疫吸着帯域を必
要とするプロトコルも記載する。

第一のプロトコル例は、分析物として・・ブテン（モノ
エピトープ性りがンド）、シグナル標識トして螢光物質
を使用し、その際螢光物質は・・ブテンアナローブに結
合する。このプロトコルに釦いて、−・ブテンを含むと
思われる検体を・・ブテン−螢光物質試薬の緩衝溶液と
混合して所定の容量にする。免疫吸着帯域に抗ノ・ブテ
ンを含むアッセイ装置を試料中に浸漬し、アッセイ試料
溶液を液体吸収帯域の所定の距離寸で吸収させる。次に
アッセイ試料溶液からアッセイ装置を取シ出し、これを
緩衝剤溶液中に導入し、その際、緩衝剤溶液は免疫吸着
帯域を通過して、免疫吸着帯域において非特異的に結合
したー・ブテン−螢光物質試薬の完全な除去を確実にす
る。試薬溶液中の・・ブテン−螢光物質の濃度が、正の
結果を得るため結合する・・ブテン−螢光物質の量に比
べて充分低い場合には、洗浄工程を省くことができる。

次に、アッセイ装置を螢光計に導入し、螢光を測定する
ことができる。

望１しくは、検体用アッセイ装置と同じ工程により実施
することのできる標準アッセイ装置を使用する。積率ア
ッセイ装置は、免疫吸着帯域に所定量の抗体を有し、・
・ブテン分析物の存在しない試薬溶液中に導入する場合
には−・ブテンの特定濃度に対応する量の−・ブテン−
螢光物質試薬を吸収する。標準を検体と比較することに
よって、−・ブテンの量が所定のレベルよシ高いかまた
は低いかを決定することができる。また、分析物と接触
させうるが、分析物の量とは無関係の標準応答を生ずる
標準アッセイ装置を使用することができる。

本発明のアッセイ装置に使用する洗浄≠は浸漬スティ、
りまたは試験ストリップを使用する他のアッセイに使用
する洗浄≠とは異なることを注意すべきである。他の洗
浄巷の場合には、試験ストＩＪ、７’を試薬を貴重ない
溶液中に入れ、非特異的に結合した物質を試験ストリッ
プから溶液中に拡散させる。その後、試験ス）　リップ
を洗浄液から除去しなければならない。これに対して、
本発明においては、免疫吸着帯域を通過する溶液は非特
異的に結合した物質を一緒に液体吸収帯域中に運び、そ
の結果、免疫吸着帯域を非特異的に結合するシグナル標
識を含壕ない新鮮な溶液と連続的に接触させる。即ち、
少量で免疫吸着帯域から非特異的に結合したシグナル標
識を充分に除去でき、その際溶液を汚染しない。

第二のプロトコルでは、抗原を使用し、その際、抗原は
免疫吸着帯域の抗りがンドと抗体に結合したシグナル標
識（この場合、酵素）との間の架橋として作使してもよ
い。このプロトコルでハ、抗りがンドを有するアッセイ
装置を、リガンドを含むと思われる試料（通常希釈され
ていない）中に浸漬する。所定量のアッセイ試料溶液は
免疫吸着帯域よシ液体吸収帯域中に拡散し、その際アッ
セイ試料溶液中の抗原は溶液中の抗体の濃度に比例して
免疫吸着帯域中の抗リガンドに結合するようになる。ア
ッセイ装置を取シ出し、緩衝試薬溶液中に浸漬するが、
この試薬溶液は試薬として大過剰の酵素−抗リガントを
含んでいてよい。

試薬溶液が免疫吸着帯域を通って拡散する−ので、酵素
−抗リガントは免疫吸着帯域において結合したりがンド
に結合する。吸収される液体の容量は、溶媒先端が移動
する距離によって決定することができる。本発明方法は
比較的高い試薬濃度で免疫吸着帯域に試薬を連続的に補
充するので、免疫吸着帯域にかいて抗原に酵素−抗りが
ンド試薬を結合させるのに必要なインキュベーション時
間は比較的短い。アッセイ装置によって所定の容量を吸
収した後、アッセイ装置を取シ出し、基質溶液中に導入
する。酵素触媒作用によシ、免疫吸着帯域に沈着しうる
有色生成物に基質を変換する。再度、液体吸収帯域にお
ける溶媒先端を追跡することによって免疫吸着帯域を通
過する基質溶液の容量を制御することができる。

免疫吸着帯域に存在する抗体の代わシに所定量の抗原を
含むアッセイ装置を標準アッセイ装置とすることができ
る。この標準アッセイ装置を同じ方法で処理する。

第三のプロトコルでは、抗体は分析物であシ、／グナル
発生系は２種の酵素を含む。シグナル標識−ｍｉｐ試薬
は酵素であう、その基質は免疫吸着帯域に結合した酵素
の生成物である。アッセイ装置は免疫吸着帯域にｍｉｐ
として抗体を有する。試料を所定量の酵素−抗原試薬と
混合し、酵素−抗原試薬と試料中の抗体との実質的に完
全な結合を確実にするのに充分な時間の間インキュベー
トする。次に、アッセイ装置を分析試料溶液中に導入し
、溶液を免疫吸着帯域よシ吸収さぜる、残シの未結合の
酵素−抗原を免疫吸着帯域に結合させる。

免疫吸着帯域よシ所定量が移動した後（液体吸収帯域に
おける溶媒先端の移動によって判る）、アッセイ装置を
取シ出し、基質溶液中に入れる。

基質溶液は、アッセイ装置に結合した酵素に対する基質
、及び装置に結合した酵素の生成物である酵素−抗原試
薬の基質を除く、２種の酵素に必要な任意の付加的試薬
を含む。基質溶液は酵素−抗原：抗体複合体を全く含寸
ない免疫吸着帯域を洗浄するので、この方法では洗浄は
通常必要ではない。所定量の基質溶液が免疫吸着帯域よ
シ移動し、免疫吸着帯域に有色生成物を生じる。また、
洗浄が必要でない場合には、基質溶液を試料及び酵素−
抗原溶液と混合し、次にこの混合液中にアッセイ装置を
浸漬する。

最後に、複数の重複層または縦列層を有する複雑な免疫
吸着帯域を使用することもできる。分析物が・・ブテン
である場合には、溶液と最初に接触する第−層は、抗・
・ブテンを酵素−・・ブテン結合体と結合させる。第三
層から第−層への化合物の移動を阻止するため中間層を
設けてもよい。第三層はこの層上にシグナル発生物質を
生成させる試薬を例えば酵素、抗（シグナル標識）、抗
酵素等として含む。

この場合に、第−層でのシグナル発生を防止するために
、第三層に結合する第二の酵素を用意する。第二の酵素
は、酵素−・・ブテン結合体の酵素に対する基質である
生成物を生じることを特徴とする。中間層は第二の酵素
生成物が第−層へ泳動するのを阻止する。

説明のために、第二の酵素をグルコースオキシダーゼで
、酵素−・・ブテン結合体の酵素を西洋わサヒノソーオ
キシダーゼ（ＨＲＰ　）で説明する。ＨＲＰ　−・・ブ
テンを免疫吸着帯域の第−層の抗−・ブテンに結合させ
、グルコースオキシダーゼ及ヒ抗−ＨＲＰを第三層に共
有結合させる。カタラーゼは中間層に存在させるか、寸
たはただ２つの層を使用する必要がなく、カタラーゼを
第−層に存在させてもよい。カタラーゼは、第三層から
第−層へ泳動するかもしれない偶然の過酸化水素を破壊
する作用をする。

他の層上に重ねた第−層に試料溶液を加えて、溶液を下
方に泳動させることによってアッセイを実施する。試料
中の−・ブテンは第−層におけるＨＲＰ−ハプテンを置
換し、ＨＲＰ−ハゲテンは第三層へ向って下方に泳動し
、抗−ＨＲＰによって捕捉される。試料溶液をグルコー
ス及び染料前駆物質を含む試薬溶液と合するか、または
試料溶液に続いてグルコース及び染料前駆物質を含む試
薬溶液と接触させる。グルコース及び染料前駆物質は第
三層に泳動し、初めの２層に非特異的に結合したＨＲＰ
−ハプテンを第三層へ運ぶ。第三層において、グルコー
スは過酸化水素を生成する作用をし、過酸化水素はＨＲ
Ｐによる触媒作用で染料前駆物質と反応して染料を生成
する。第三層（検出帯域）に生じた色強度は試料中の−
・ブテンの量に関係する。

アッセイ装置は、第三層が見える背面から観察される。

本発明のアッセイ装置を用いて、使用する標準を広く変
動することができる。若干の場合には、アッセイ装置に
生ずる色と比較しうる段階的色列を準備すれば充分であ
る。よシ定量的な結果を得るには、所定量のｍｉｐを存
在させるアッセイ装置を１個またはそれ以上使用し、そ
のアッセイ装置を検体と共に使用するアッセイ装置と実
質的に同じ方法で処理するのが望捷しい。アッセイ装置
上のｍｉｐが分析物と同じである場合には、アッセイ装
置を同じ方法で使用することができる。アッセイ装置上
のｍｉｐが分析物に対する対応ｍｉｐである場合には、
通常、標準アッセイ装置と検体との組み合わせを回避す
る。

種々の免疫対からの複数のｍｉｐを有するアッセイ装置
に複数の通路を設けることによって多数の異なる分析物
について同時試験を実施することができる。免疫吸着帯
域を種々のりがンド捷たは種方法及び試薬は同じである
。

材料 本発明に使用する構成要素はアッセイ装置、分析物、シ
グナル標識−ｍｉｐ結合体を含むシグナル発生系、及び
適当ならば、他方のｍｉｐの一方である。

アッセイ装置は２つの部分、即ち溶液の入口として独特
に作用する免疫吸着帯域及び免疫吸着帯域よシ溶液を吸
引しそして適当ならば、溶液を貯蔵する液体吸収帯域を
有する。アッセイ装置は多くの構造を有することができ
る。その１つは同一平面内に液体吸収帯域及び狭い領域
として、筐た好ましくは免疫吸着帯域として作用する隣
接層として長い吸収性ストリップを含む試験ストリップ
である。

試験ストリップは２つの主要部分、即ち比較的小さい免
疫吸着帯域及び比較的大きい液体吸収帯域を有する長い
装置である。免疫吸着帯域は通常免疫吸着帯域はその第
一の特徴としてその境界内にｍｉｐ及び場合によシグナ
ル発生体の１種またはそれ以上の構成員を有する。

試験ストリ、ｆの寸法は広範に変動しうるが、長さは通
常、幅より著しく大きい、即ち幅よシ少なくとも２倍大
きく、幅よシ１０倍以上大きくてよく、幅及び厚さは均
一または不均一であってよい。ストリップは、各帯域が
隣接帯域と液体受理関係にある限シ、単一の材料、また
は複数の材料から成っていてよい。材料は、通常著しい
吸着層たはクロマトグラフィー効果を伴わずに、吸収に
よって液体を吸収することができる。即ち含１れるｍｉ
ｐを除いて、すベーでの物質は比較的均一かつ自由に帯
域を流れる。

種々の天然または合成材料を使用でき、これらは単独の
材料または材料の組合せであってよく、有機、無機また
はその組合せであってよい。１層よシ多くの層が含１れ
る場合には、異なる層が異なる機能のための異なる性質
を有してもよ−。免疫吸着層は、液体吸収剤と１層票−
家　高い液体保有能を有する必要はない。電磁線を検出
するためには、検出帯域は不透明、または半透明または
好１しくは透明であってよい。

以下余白 使用しうる材料には、多糖類、例えば紙及び酢酸セルロ
ースのようなセルロース材料、シリカ、無機物質、例え
ば不活化アルミナ、珪藻土、Ｍｇ５ｏ４、ｔたハ塩化ビ
ニル、塩化ピニルーグロピレンコポリマー及び塩化ビニ
ル−酢酸ビニルコポリマーのようなポリマーを用いて、
多孔性ポリマーマトリックス中に好壕しくはほぼ均一に
分散された他の無機微細物質、天然繊維、例えば木綿布
及び合ｅ、繊維、例えばナイロン布、多孔性グル、例え
ばシリカケ９ル、アガロース、デキストラ／及びゼラチ
ン、ポリマーフィルム、例えばポリアクリルアミド等が
金管れる。アッセイ装置材料の重要な特徴は、アッセイ
に使用される溶質の移動を実質的に妨げることなく、液
体、特に水溶液を吸収しうろことである。要するに、材
料は吸収性であシ、多孔性で、溶液を流動させることが
でき、免疫吸着層の材料は非クロマトグラフィー性であ
るのが好ましい。これらは適切な強度を有するか、強度
を支持体によって与えることができ、シグナル発生体に
よるシグナルの発生を妨害しない〇液体吸収帯域を試料
及び試薬溶液との直接接触から保護する。このことは、
免疫吸着帯域を試験ス）リップの唯一の露出部分として
設けるか、筐たは免疫吸着帯域の周りの領域を閉鎖して
試料または他の試薬溶液と液体吸収帯域との接触を防止
することによって達成するのが都合よい。

免疫吸着帯域の１つの機能は、種々の溶液を接触させ、
溶液を試験ストリップに吸引させることである。免疫吸
着帯域は試験ス）ＩＪツブの端部であるか、または試験
ス）　ＩＪツブの面上の露出帯域であってよく、或いは
不透過性保護カバーを越えてのびるか、若しくは該カバ
ーと一列に配置するか、若しくは該カバーに対して内側
に配置する。

構造上の重要なファクターは、露出面からの溶液の流通
がかなシ均一であることである。

免疫吸着帯域の露出面は一般にその最小寸法で少なくと
も約１１１以上であシ、通常その最小寸法で少なくとも
約１．５ｍｍ５更に普通には少なくとも約２關である。

免疫吸着帯域は通常、その最大寸法で約２ｃｒｒＬ以下
、一般にその最大寸法で約０．２〜１のである。免疫吸
着帯域の厚さは一般に約ｌＯμ〜５ｍ＋１１、最も普通
には５０μ〜約３ｍｍ、好壕しくは約０２ｕ〜１　ｉｌ
ｌである。

免疫吸着帯域は任意の形状、例えば円形、楕円形、正方
形、長方形ｔＡは不規則な形であってよい。重要なファ
クターは、検出帯域の表面をシグナルに対して走査でき
ることである。表面は通常平坦または約６００以下の弧
を有する凹面若しくは凸面に僅かに湾曲する。

免疫吸着帯域は単一層重たは複数の層であってよく、免
疫吸着帯域の上部筐たは下部（上部及び下部とは液体の
流れに対して上流及び下流を指す）にシグナルを発生じ
うる。免疫吸着帯域は単一層または上層としてｍ１ｐＴ
ｈ吸収性支持体に結合して含む。若干のプロトコルでは
、シグナル標識−ｍｌｐ結合体ｔｍｉｐ−支持体結合体
と複合させることができる。

多重層であり、検出帯域が別個の層である場合には、下
層は抗（シグナル標識）または吸収性支持体に非拡散性
に結合したシグナル発生系の成分を含む。下層の結合体
はシグナル標識−ｍｌ、結合体またはｍ１ｐ−支持体結
合体層から泳動する、シグナル標識−ｍｉｐ結合体によ
って発生した生成物を捕捉する作用をする。シグナル標
識及び抗（シグナル標識）は、抗（シグナル標識）が下
層に釦けるシグナルの発生をあ捷シ妨害しないように選
択する。容易に検出可能のシグナルを発生するように試
薬を選択する。

特に、ｍ１ｐ−支持体結合体層と下層との間に１層、ま
たはそれ以上の付加的層を含んでいてよい。

これらの付加的層ば、下層から上層へのシグナル発生系
の成分の泳動を防止する遮断層として、筐たはフィルタ
ーとして或いは流動制御のため等に役立つ。

免疫吸着帯域を通る流動は適切に均一であるべきである
。多くの吸収性材料は不均一でろ、ｐ、ｍｉｐを含む入
口帯域よりの流動は領域ごとに変動してよい。免疫吸着
帯域に訃ける層の均質性を補うために、種々の複合構造
を使用することができる。

構造の１例を挙げると、第一の吸収性層にｍｉｐを結合
させ、この層が層を横切る方向へ著しい圧力差を生じて
液体の流通に抵抗するようにする。

この層の後に流れに対して最小の抵抗を生ずる比較的あ
らい層を設ける。この第二の層は第一の層と液体吸収帯
域の中間にある。

別の構造では、３層を設け、第一のｍｉｐ含有層は液体
の流通に対して比較的低い抵抗金有するが、第一の層と
均一に接触する第二層によって裏打ちされて釦り、この
第二層は液体の流通に対して著しく抵抗性である。その
結果、ｍｉｐ含有量の１以上の領域を通る急速な流通が
妨げられ、第−層からの一層均一な流れが生じる。第二
層に続いて、流通に抵抗しない多孔性層を設ける。

各層を均一に一緒に圧縮して流路の形成を避ける。複合
構造体を構成するため、公知の流動特性の種々の組成物
を使用することができる。

筐た、流動抵抗を低くするため、免疫吸着帯域の後、の
領域を限定するスイーサｆ：使用し、免疫吸着層表面に
対して垂直及び横の方向への流動を可能にしてもよい。

低い流動抵抗のため使用しうる材料は紙、ナイロン針金
、ガラス寸たはポリオレフィンメツシュ筐たはマット、
または木綿等を含む。形を、境界層との良好な均一接触
を確保するように変動させるべきであシ、形は平坦、凹
面ｔｆｃは凸面状であム　２つの対向表面は同一または
異なっていてもよい。

上層及び／または下層は検出可能のシグナルを決定する
ための検出帯域として作用する。必要に応じ、検出可能
のシグナルを両層に生成させて、内部チエツクを得るた
め分析物の量に関係する２つの数値を測定することがで
きる。

液体吸収帯域は免疫吸着帯域と接触して液体を受理する
。液体吸収帯域は複数の機能を生ずる。

第一の機能は免疫吸着帯域によって吸収された流体用の
貯蔵容器筐たは貯蔵領域として作用することである。役
立ちうるが、必要ではない第二の機能は流体が免疫吸着
帯域を通過する速度を調節することである。液体吸収帯
域が小さい寸法を有するか、筐たは免疫吸着帯域からの
種々の物質を含む場合に、液体吸収帯域は液体が免疫吸
着帯域を通過する速度を制御する作用をしうる。液体吸
収帯域は、不規則な寸法ｔｉすることによって、更に試
料を吸収するか、試薬溶液を吸収するかＣ（応じて異な
る速度を生じる作用をなしうる。

液体吸収帯域の別の機能は、吸収される液体の量を測定
することである。免疫吸着帯域から液体吸収帯域に沿っ
てのびる連続位置に目盛を設けることによって、溶媒の
先端が一定の位置にあるときを決定し、試験スト１１ツ
ｆｆ溶液から取シ出すことができる。また、溶媒に溶解
または溶媒先端と接触したときに発色する染料を加えて
、試験ストリップを取り出すべき明瞭なシグナルを生じ
ることができる。例えば、−指示薬を使用することがで
きる。溶媒先端の存在を明瞭に示す任意の技術を使用す
ることができる。

試験ス）　ＩＪ　、、　７’に釦いて、液体吸収帯域は
一般に少なくとも約１．５ｃＭＬｓ通常約２７ｍで、約
３０Ｃｒ／Ｌ以下、通常約２０ｃｒｒＬ以下の長さを有
する。幅は約０、１　ｍｍ〜約３ｃＴＩＬであってよい
。これらの寸法は第一に、吸収される溶液の速度及び量
の調節並びに取扱いの便利さ及び溶媒先端の観察の容易
さのためである。厚さは一般に約０．１〜５朋、通常約
０５〜３　ＩＩＮである。

液体吸収帯域は、保護ケーシング、軽層しくは澄明な筐
たは部分的に若しくは若干の状況では全部透明なケーシ
ング中に一部分またはほぼ全部封入されていてよい。液
体吸収帯域を全部封入する必要はないが、液体吸収帯域
が試料溶液と直接接触するのを防止するため、充分な部
分を被覆すべきである。はとんどすべての場合に、均一
な量の試料溶液を免疫吸着帯域に流通することが必要で
ある。このことは、液体吸収帯域とアッセイ試料溶液と
の接触を回避することによって最も良く達成することが
できる。

使用する個々のプロトコル及び試験ストリップの構造に
応じて、封入容器は着脱可能渣たは不可能であってよく
、１個以上の窓を有してもよく、通常、種々の帯域を含
む吸収性材料の機械的保護を与え、アッセイの実施？妨
害しない、強靭で、不活性な不透過性材料から成る。通
常、封入容器内に空気の閉じ込みを防止するため通気口
を設ける。

以下余白 次に図面に基づいて本発明を詳述する。図面に訃いて、
第１図はアッセイ装置の平面図、第２図は第１図のアッ
セイ装置の２−２線拡大断面図、第３図は試料試験スト
リップ及び標準試験ス）　ＩＪッデを有するアッセイ装
置の平面図、第４図は第３図のアッセイ装置の４−４＠
断面図、第５図は本発明の別の実施態様の部分断面正面
図である。

第１図及び第２図には、シャペル形吸収性ストリッｆ１
４を封入するグラスチック製封入容器１２を有する試験
ストリッグ装置１０を示す。ストリップの接触端部１６
はプラスチック製封入容器１２の少し内側にあシ、機械
的接触及び劣化から保護されている。接触端部（ｂｕｔ
ｔ　ｅｎｄ）　ｌ　６は免疫吸着帯域として作用し、シ
グナル標識によるシグナルの発生を容易に検出できるよ
うに充分な深さに接触端部１６にｍｉｐ　ｋ結合して含
む。ストリッ７’１４は２０及び２２のところに目盛を
有し、免疫吸着帯域１６を通過する試料溶液及び試薬溶
液の容量を正確に測定できるようになっている。

ストリップ１４は、試薬溶液の流速を調節する細長スト
リッグ２４を有する。ストリスグ２４は、グラスチック
製封入容器１２の開口２６に向がってのび、この開口は
溶液がストツク７’１４を上昇するに従って空気を逃出
させる。封入容器１２は前面シート３０及び背面シート
３２を含み、澄明な前面シート３０によシ吸収性ストリ
ッ７’１４を通る流体の上昇運動を観察することができ
る。

アッセイを実施する際には、ストリップは試料溶液中に
浸漬し、試料の浸透先端が目盛２ｏに達したときに取り
出しさえ丁ればよい。試験ストリップ装置１０を試料溶
液から取シ出し、試薬溶液中に導入し、溶媒の先端が目
盛２２に達する士で試薬溶液中に保持する。次に、試験
ストリップ装置を試験溶液から取シ出し、充分量の洗浄
溶液が免疫吸着帯域を通過する壕で（溶媒の先端が細長
ストリ、７’２４に沿って移動することで判る）、洗浄
溶液中に導入する。

次に免疫吸着帯域接触端部１６を、分析物が試料中に存
在することを示す検出可能のシグナルの発生について観
察することかできる。

第３図及び第４図には、２個のストリップ、即ち試料試
験ストツクｆ５２及び標準ストリップ５４を有する試験
ストリップ装置５０を示す。開口５６及び６０はグラス
チック製封入容器６２の開口である。免疫吸着ディスク
６４は抗体（文字Ａｂで示す）を結合して有し、標準ス
トリップ５４の免疫吸着−ｒ；４　、ｘり、６６は抗原
（文字Ａｇで示す）を、抗原濃度に対応するシグナルレ
ベルを生ずるため所定量で結合して有する。吸収性スト
リップ７０及び７２、例えばセルロースまたは紙ストリ
ップは、それぞれ免疫吸着帯域６４及び６６から封入容
器６２を越えて封入容器６２の開ロア４及び７６（封入
容器から空気を逃出させる）へのびる。７０及び７２の
底端は溶液から保護されている。

免疫吸着ディスク６４及び６６はそれぞれ多孔性スペー
サ８０及び８２上に載置されている。多孔性スペーサは
不活性であシ、はぼ無抵抗に流体を流動させる。免疫吸
着帯域ディスク６４及び６６と多孔性スペーサ８０及び
８２の表面８４及び８６とを実質的に均一に接触させる
。従って、免疫吸着帯域ディスク６４及び６６から流出
する溶液は抵抗に実質的に合うことなく流動する。

スペーサ８０及び８２は、液体吸収ストリップ７０及び
７２によって下流で境界づけられ、これらのストリップ
はそれぞれスペーサ８０及び８２から液体を吸収し、ス
ペーサが液体で満されたときに液体を排出するポンプと
して作用する。試料及び標準に関する前記構造物は、グ
ラスチックホルダー中に入れられ、このホルダーは１個
またば２個以上の部材から作られ、試験ス）　ＩＪッデ
の種々の部分を一線にかつ液体受理関係に保持するよう
に組立てられている。

第５図には、本発明の試験ストリップ装置の別の実施態
様を示す。この実施態様には、免疫吸着帯域及び液体吸
収帯域の一部を示す。封入容器１００には窓１０２を設
ける。ｍｉｐを結合して含む吸収性免疫吸着ディスク１
０４は、試料、及び溶液の入口として作用する。吸収性
ディスクはその液体吸収作用にかいて比較的均一であっ
て、ディスクを通る液体の流れに対して比較的無抵抗で
あるべきである。免疫吸着ディスク１０４のすぐ後には
、吸収性液体流動抵抗性ディスク１０６があシ、このデ
ィスクは液体流動に対して免疫吸着ディスク１０４よシ
大きい抵抗を有する。２個のディスク１０４及び１０６
は界面１１０で相互に均一に押し合っている。

流動抵抗ディスク１０６の後には、流動抵抗ディスク１
０６と液体吸収ストツクｆ１１４との間に液体を自由に
流動させるリングであるスペーサ１１２がある。

装置を試料または試薬溶液中に入れると、免疫吸着ディ
スク１０４はそのディスクを通って移動し、よジ抵抗性
のディスク１０６に出合う液体を迅速に吸収する。ディ
スク１０６は流速を制御する。従って、免疫吸着ディス
ク１０４に不均一部分が存在しても１個以上のホットス
ポットを通って急速な流れは生じず、免疫吸着ディスク
１０４を通る液体流動の均一さの欠除を抑制する。溶液
が流動抵抗ディスク１０６を通過した後、リング１１２
の空所１１６を通過し続け、液体吸収ストリッ７６１１
４によって吸収される。

分析物 本発明のリガンド分析物は、モノエピトープ性またはポ
リエビドーグ性であることを特徴とする。

ポリエピトープ性リガンド分析物は通常ポリ（アミノ酸
）、即ちポリー！！グチド及び蛋白質、多糖類、核酸及
びその混合物である。集合物のこのような組合せは細菌
、ウィルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細
胞膜等を含む。

本発明に使用されるポリエピドーグ性リガンド分析物は
大部分、少なくとも約５，０００、更に普通には少なく
とも約１０，０００の分子量を有する。

ポリ（アミノ酸）の範ちゅうに訃いて、該当するポリ（
アミノ酸）は一般に約５，０００〜５ｏｏｏ、ｏｏ。

の分子量、更に普通には約２０，０００〜１，０００，
０００分子量を有する。該当するホルモンの分子量は一
般に約ｓ、ｏｏｏ〜６０，０００である。

同様の構造的特徴を有する蛋白質、特定の生物学的特徴
を有する蛋白質、特殊な微生物に関す□る蛋白質、特に
病原微生物に関する蛋白質等の族に関して広範な蛋白質
が考えられる。

下記のものは構造によって関連した蛋白質類である： プロタミン類 ヒストン類 アルブミン類 グロブリン類 硬蛋白質類 燐蛋白質類 ムコ蛋白質類 色素蛋白質類 リポプロティン類 核蛋白質類 糖蛋白質 プロテオグリカン類 人の血漿中に存在する多数の蛋白質は臨床的に重要であ
り、下記のものを含む： プレアルブミン アルブミン α、−リポプロティン α、−酸グリコプロテイン α、−アンチトリプシン α、−糖蛋白質 トランスコルチア　（Ｔｒａｎｓｃｏｒｔｉｎ）４．６
Ｓ−ボストアルブミン トリブトファンに乏しいα１−糖蛋白質α、χ−糖蛋白
質。

チロキシン−結合グロブリン Ｇｃ−グロブリン （Ｇｅｌ−１） （Ｇｅ２１） （Ｇｅ２−２） ハグトグロビン （’ＩＰＩ−１） （叫２−２） セルロプラスミン コリンエステラーゼ α２−リポプロティン ミオグロビン Ｃ−反応性蛋白質 α２−マクログロブリン α２−Ｈ３−糖蛋白質 Ｚｎ−α２−糖蛋白質 α２−ノイラミノー糖蛋白質 エリスロポイエチン β−リポプロティン トランスフェリン ヘモベキシン フィブリノ−ダン グラス□ノーダン β２−糖蛋白質！ β２−糖蛋白質■ イムノグロブリンＧ （ＩｇＧ）捷たはγＧ−グロプリン 分子式： γ２に２捷たはγ２λ２ イムノグロブリンＡ　（ＩｇＡ）’またはγＡ−グロブ
リ／分子式。

（α２に２）ｎ　′または（α２λ２）ｎイムノグロブ
９７Ｍ （ＩｇＭ）筐たはγＭ−グロブリン 分子式： ％式％） イムノグロブリンＤ　（ＩｇＤ）　’ｔたはγＤ−グロ
ブリン（ｒＤ） 分子式： ％式％） イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）またはγＥ−グロブリン
（ｒＥ） 分子式： ％式％） 重要な血液凝固因子は下記のものを包含する：以下余白 血液凝固因子 ｌｌ フィプリノーケ゛ン プロトロンビン トロンビン 組織トロンボプラステン グロアクセレリン、促進グロプリン グロコンベルチン 抗血友病グロブリン（ＡＨＧ） クリスマス因子、血漿トロンボグラス チン成分（ＰＴＣ） スチュアートープラウアー因子 （Ｓｔｕａｒｔ−Ｐｒｏｗｅｒ　　ｆａｃｔｏｒ）オー
トグロトロンビン■ 血漿トロンボグラスチン前駆体（ＰＴＡ）バーｒマン因
子 重要な蛋白質ホルモンは下記のものを含む：以下余白 ペグチド及び蛋白質ホルモン 甲状線ホルモン（）ぞラトロモン） チロカルシトニン インシュリン グルカゴン リラクシン エリスロポイエチン メラノトロピン （黒色細胞刺激ホルモン：インターメ・シン）ソマトト
ロピン（成長ホルモン） コルチコトロピン（副腎皮質ホルモン）テロトロピン Ｆ胞刺激ホルモン 黄体形成ホルモン（間質細胞刺激ホルモン）黄体刺激ホ
ルモン（ルテオトロピン、プロラクチン） コ゛ナトトロピン（絨毛ゴナドトロピン）組織ホルモン セクレチン がストリン アンギオテンンン！及び■ プラノキニン ヒト胎盤ラクトヶ９ン オキシトノン バノグレ、シン 放出因子（ＲＦ） ＣＲＦ、　ＬＲＦ、　ＴＲＦ’、ンマトトロピンーＲＦ
、　ＧＲＦ。

ＦＳＨ−ＲＦ、　ＰＩＦＩＭＩＦ 該当する他のポリマー物質はムコ多糖類及び多糖類であ
る。

微生物から誘導される詳細な抗原性多糖類は下記のとお
りである： ノグロコッカス・ニー ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ） 髄膜炎菌 （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ） 多糖類 アクチノバチルス・マレ イ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｉｌｅｔ） 粗抽出物 アクチノバチルス・ホワ イトそり （Ａｃ　ｔ　ｉ　ｎｏｂａｃ　ｉ　１１ｕｓｗｈｉｔｅ
ｍｏｒｉ） ノぐスツレラ・マルトサイ ダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ） 莢膜抗原 以下余白 インフルエンザ菌 （Ｈａｅｍｏｐｈ　ｉ　Ｉｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ） 多糖類 百日咳菌 （Ｈａｅｍｏｐｈ　ｉ　１ｕｓ ｐｅｒｔ　ｕｓｓ　ｉｓ　） 粗製 リステリア・モノサイ 胞の多糖類フラクンヨ ン及びツベルクリン クレブシェラ・アエログ ネス（Ｋｌｅｂｓ　ｉｅ　ｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ） 多糖類 ｔｙｐｈｉ−ｍｕｒｉｕｍ） サルモネラ・デルビイ （Ｓ　、　ｄｅｒｂｙ） サルモネラ・グロラム （Ｓ　、ｐｕｌｌｏｒｕｍ） ｄｙｓｅｎｔｅｒｊａｅ） ７レクスナー赤痢菌 （Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ）分析する微生
物は、その１１でもよいし、溶解してもよいし、すりつ
ぶしてもよいしあるいは破砕してもよい。例えば抽出に
よって得られた組成物または部分を分析する。該当する
微生物としては下記のものを挙げることができる： コリネバクテリウム属 ノツチリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉ
ｐｈｔｈｅｒｉａｅ）肺炎双球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃ
ｃ　ｉ）肺炎双球菌（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ）連鎖球菌 化膿連鎖球菌（Ｓｔｅｐｔｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎ
ｓ）唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　５ａ
ｌｉｖａｒｕｓ）ブドウ球菌 黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕ
ｒｅｕｓ）白色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ　ａｌｂｕｓ）ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｅ 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄ
ｉｓ）淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａ
ｅ）腸内細菌科 志賀赤痢菌 緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ）アルカリグ０ネス・フェカーリス （Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）ビブリ
オ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）インフ
ルエンザへモフィラス （Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ノユ
クレへモフィラス（Ｈ，ｄｕｃｒｅｙｉ　）へモフィラ
ス・ヘモフィラス （Ｈ，ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ） ヘモフィラス・エジグティクス （Ｈ，ａｅｇｙｐｔｉｃｕｓ） 非溶血性インフルエンザ菌 （Ｈ，ｐａｒａｉｎｆ　１ｕａｎｚａｅ）百日咳菌（Ｂ
ｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）／’Ｐスツ
レラ・ペスチス （Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｐｅｓｔｉｓ）ノぞスツレ
ラ・ツラレウシス （Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　　ｔｕｌａｒｅｕｓｉｓ）
プルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌ　ｌａｅ　）マルタ熱菌（Ｂ
ｒｕｃｅｌ　ｌａ　ｍｅｌｉｔｅｎｓｊｓ）ウシ流産菌
（Ｂｒｕｃｅ　ｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ）ブタ流産菌（
Ｂｒｕｃｅｌｌａ　５ｕｉｓ）好気性芽胞形成細菌 炭痕菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ）枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）巨大菌（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）バシラス・セ
レラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）嫌気性芽胞
形成細菌 ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌ　
ｉｎｕｍ）破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ’ｔｅｔ
ａｎｉ）ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅ
ｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）クロストリジウム・ノビイ （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｎｏｖｙｉ）セグチック菌
（Ｃｌｏｓｔｒｉｕｍ　ｓｅｐｔｉｅｕｍ）ヒストリチ
フス菌 （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ
）クロストリジウム・テルチウム （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　　ｔｅｒｔｉｕｍ）クロス
トリノウム・パインアーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ　ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）スポロダネス菌（
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）ミコ
バクテリウム属 結核菌％ｃｏｂａｃｔｅｒｉＩＪＴＩｔｕｂｅｒｃｕｌ
ｏｓｉｓ　ｈｏｍｉｎｉｓ）ウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ）ミコバクテリウム・アビ
ウム （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｊｕｍ）癩菌（Ｍ
ｙｃｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ　１ｅｐｒａｅ）パラ結核菌
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ）放線菌（画状細菌） アクチノマイセス・イスラエリイ （Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　１ｓｒａｅｌｉｉ）ウシ放
線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｂｏｖｉａ）アクチノ
マイセス・ネスランディイ （Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄ口）ノカ
ルノア・アステロイデス （Ｎｏｃａｒｄｉａ　ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ノカルジ
ア・プラジリエンス （Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）スペ
ロヘータ 梅毒トレポネ？　（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄ
ｕｍ）、　　）レポネマ０ノぞ一テニュエ（Ｔｒｅｐｏ
ｎｅｍａ　ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、トレポネ７−カラテウ
ム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　、ｃａｒａｔｅｕｍ）、回帰
熱ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉ
ｓ）、ワイル病菌（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ　ｉｃｔｅｒ
ｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、イヌレグトスピラ（Ｌ
ｅｐｔｏｓｐｉｒａ　ｃａｎｉｃｏｌａ）、最小螺旋菌
（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｍ１ｎｕｓ）　、ストレグドパ
チル７モニリフオルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉ　ｌ
ｌｕｓｍｏｎｉ口ｆｏｒｍｉｓ） マイコプラズマ 肺炎マイコグラズ？　（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ）他の病原菌 リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏ
ｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ　） 豚丹毒菌（Ｅｒｙｍｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ　ｒｈｕｓｉ
ｏｐａｔｈｉａｅ）モニリア様連鎖状杆菌 （Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｏｎｉｌｉｆｏ
ｒｍｉｓ）ドンパニア・クラニュロマチス （Ｄｏｎｖａｎｉａ　ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）バル
トネラ・パチリホルミス （Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ　ｂａｃｉ１口ｆｏｒｍｉｓ）
リケッチア（細菌様寄生虫） 発疹チフスリケッチア（Ｒ４ｃｋｅｔｔｓ　ｉａｐｒｏ
ｗａｚｅｋｉ　ｉ） リケッチア・モーセリ （Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｍｏｏｓｅｒｉ）リケッチア
・リケッティ （Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）地中
海熱リケッチア （Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｃｏｎｏｒｉ）リケッチア・
オーストラ−リス （Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ）リケッ
チア・シビリクス （Ｒｉ　ｅｋｅ　ｔｔｓｉａ　５ｉｂｉｒｊｃｕｓ）リ
ケッチア・アカリ （Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ａｋａｒｊ）リケッチア・ツ
ツガムシ （Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ
）リケッチア・ブルネティ （Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｂｕｒｎｅｔｉｉ）リケッチ
ア・フィンターナ （Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｑｕｉｎｔａｎａ）クラミジ
ア（分類不可能の寄生生物、細菌／ウィルス） クラミジア・エージェンシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ａｇ
ｅｎｔｓ）（４係不確定） 菌類 クリプトフッカス・ネオフォルマンス （Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）
プラストマイセス・デルマティジス （Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ）ヒ
ストフラスマ・カブスラーツム （Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）コ
クシジオイデス・イミティス （Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ　１ｍｍ１ｔｉｓ）ノソラ
コクシジオイデス・ブラジリエンシス−（Ｐａｒａｃｏ
ｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）カ
ンジダ・アルビカンス （Ｃａｎｄｉｄａ　　ａｌｂｉｃａｎｓ）アスペルギラ
ス・フミガーツス （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ムコ
ール・コリムビフ７一 （Ｍｕｃｏｒ　ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒ）　［アグシジア
・コリムビフエラ（Ａｂｓｉｄｉａ　ｃｏｒｙｍｂｉｆ
ｅｒａ）］］スポロトリクムジエンキイ （Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ　５ｃｈｅｎｋｉｉ）フォ
ンセカエ・ペドロソイ （Ｆｏｎｓｅｃａｅａ　ｐｅｄｒｏｓｏｉ）フォンセカ
エ・コンノソクタ （Ｆｏｎｓｅｃａｅａ　　ｃｏｍｐａｃｔａ）フォンセ
カエ・デルマティノス （Ｆｏｎｓｅｃａｅａ　ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ）クラド
スポリウム・カリオニイ （Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｃａｒｒｉｏｎｉｉ）フ
ィアロフィーラ・ヴエルコサ （Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ　ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）アス
にルギルス・ニデユランス （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）マズ
レラ・□セトミ （Ｍａｄｕｒｅｌ　ｌａ　ｍｙｃｅｔｏｍｉ　）マズレ
ラ・グリセア （Ｍａｄｕｒｅｌｌａ　ｇｒｉｓｅａ）アンシュリア・
ポイディ （ＡＩｌｅｓｃｈｅｒｉａ　ｂｏｙｄｉｉ）フィアロス
フォーラ・クィーンセルメ （Ｐｈｉａｌｏｓｐｈｏｒａ　ｊｅａｎｓｅ１ｍｅ＋）
石膏状小胞子菌 （Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ　ｇｙｐｓｅｕｍ）毛厘白鮮
菌 （Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙ
ｔｅｓ）ケラチノマイセス・アノロイ （Ｋｅｒａｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ａｊｅｌｌｏｉ）イヌ
小胞子菌（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ　ｃａｎｉｓ）イ 紅色白癖菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｒｕｂｒｕｍ
）ミクロスポルム・オーズイニイ （Ｍｉｅｒｏｓｐｏｒｕｍ　ａｕｄｏｕｉｎｉ）ウィル
ス 単純庖疹（Ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ）水痘（Ｖａ
ｒｉｃｅｌｌｍ）（Ｃｈｉｃｋｅｎ　ｐｏｘ）帯状庖疹
（Ｈｅｒｐｅｓ　ｚｏｓｔｅｒ）（Ｓｈｉｎｇｌｅｓ）
ウィルスＢ サイトメガロウィルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｕｓ
）」ＩじＬＬ５Ｌ 痘厘（Ｖａｒｉｏｌａ）（ｓｍａｌｌｐｏｘ）牛痘（Ｖ
ａｃｅｉｎｉａ） ポックスウィルス・ボビス （Ｐｏｘｖｉｒｕｓ　ｂｏｖｉｓ） 種痘疹（Ｐａｒａｖａｃｃ　ｉｎ　ｉａ）モルスカム・
コンタギオスム （Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ　ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ）以下
示白 ３ミテタニしＬ−と ポリオウィルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）コックスサラ
キーウィルス （Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ） エコーウィルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）リノウィルス（
Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）インフルエンザ（Ａ、Ｂ及びＣ
） ノやラインフルエンデ（１−４） 流行性耳下腺炎ウィルス （Ｍｕｍｐｓ　Ｖｉｒｕｓ） ニューキャッスル病ウィルス 麻疹ウィルス（Ｍｅａｓｌｅｓ　Ｖｉｒｕｓ）キペスト
ウィルス （Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ　Ｖｉｒｕｓ）犬ノステン／４
′−ウィルス 呼吸ノンシチウムウィルス （Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　５ｙｎｃｙｔｉａｌ　Ｖｉ
ｒｕｓ）風疹ウィルス （Ｒｕｂｅｌｌａ　Ｖｉｒｕｓ） アルポウ４　／ｌｚス（Ａｒｂｏｖｉｒｕｓｅ）イース
タン・イクイン・エンセファリチス・ウィ／ｌ／ス（Ｅ
ａｓｔｅｒｎ　Ｅｑｕｉｎｅ　Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉ
ｓＶ　ｉ　ｒ　ｕ　ｓ　） ウェスタン・イクイン・エンセファリチス・ウィルス（
Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｅｑｕｊｎｅ　ＥｎｃｅｐｈａｌｉＮ
ｓＶｉ　ｒｕｓ　） シンドビス・ウィルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）
チクグンヤ（Ｃｈｉｋｕｇｕｎｙａ）ウィルスセムリキ
・フォレスト（Ｓｅｍｌｉｋｉ　Ｆｏｒｅｓｔ）ウィル
ス メヨーラ（Ｍａｙｏｒａ）ウィルス セント・ルイス・エンセ７アリチス（Ｓｔ　、Ｌｏｕ　
１ｓＥｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウィルス カリフォルニア・エンセファリチス （Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）
ウィルスコロラド・チック・フィーバ− （Ｃｏｌｏｒａｄｏ　Ｔｉｃｋ　Ｆｅｖｅｒ）ウィルス
黄熱病ウィルス（Ｙｅｌｌｏｗ　Ｆｅｖｅｒ　Ｖｉｒｕ
ｓ）デング熱ウィルス（Ｐｅｎｇｕｅ　Ｖｉｒｕｓ）レ
オウィルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ） レオウィルス　１−３型 肝炎ウィルス 肝炎Ａウィルス 肝炎Ｂウィルス 腫瘍ウィルス ラウシャー白血病（Ｒａｕｓｃｈｅｒ　Ｌｅｕｋｅｍｉ
ａ）ウィルスグロス病つ４　／Ｌ／ス（Ｇｒｏｓｓ　Ｖ
ｉｒｕｓ）マロニイ白血病（Ｍａｌｏｎｅｙ　Ｌｅｕｋ
ｅｍｉａ）ウィルスモノエピトープ性リガンド分析物は
一般に約１００〜２，０００の分子量、更に普通には１
２５〜１，０００の分子量を有する。該当する分析物は
薬剤、代謝産物、有害生物防除剤、汚染物等を包含する
。該当する薬剤にはアルカロイドが金管れる。アルカロ
イドのウチには、モルフインアルカロイド（モルヒネ、
ファイン、ヘロイン、デキストロメトルファン、これら
の誘導体及び代謝産物を含む）：コカインアルカロイド
（コカイン及びペンゾイルエクゴニン、これらの誘導体
及び代謝産物を含む）：麦角アルカロイド（リセルグ酸
のクエチルアミドを含む）：ステロイドアルカロイド：
イミナゾイルアルカロイド：キナゾリンアルカロイド：
インキノリンアルカロイド：キノリンアルカロイド（キ
ニン及びキニジン）：ノテルペンアルカロイド：これら
の誘導体及び代謝産物がある。

以下余白 薬剤の次のグループはステロイド（エストロケ゛ン、ゲ
ストデン、アンドロケ９ン、副腎皮質ステロイドを含む
）、胆汁酸、強心配糖体及びアグリコン（ジゴキシン及
びジゴキシダニン、サポニン及びサポグニンを含む）、
これらの誘導体及び代謝産物を包含する。更に、ノエチ
ルステルベストロールのようなステロイド擬似物質が含
まれる。

薬剤の次のグループは、５〜６環員を有するラクタムで
あり、これにはパルピッレート、例えばフェノパルビタ
ール及びセコパルビタール、ジフェニルヒ〆ントニン、
ピリミドン、エトスフシイミド及びこれらの代謝産物が
ある。

更に薬剤は炭素原子数２〜３個のアルキル基を有するア
ミノアルキルベンゼンであう、これにはアンフェタミン
、カテコールアミン（エフェドリン、Ｌ−ドーパ、エピ
ネフリンを含む）、ナルセイン、ノ９・ぐベリン、これ
らの代謝産物及び誘導体がある。

薬剤としては更にベンズヘテロ環式化合物があり、これ
にはオキシアゼ・ぞム、クロル７’　Ｏ？　ノン、テグ
レトール、イミグラミン、これらの誘導体及びフェノチ
アジンである。

薬剤の次のグループはプリンであシ、これにはテオフィ
リン、カフェイン、これらの代謝産物及び誘導体がある
。

薬剤グループは更にマリシュアナ（ｍａｒｉ　ｊｕａｎ
ａ）から誘導されたものを包含し、これにはカンナビノ
ール及びテトラヒドロカンナビノールがある。

薬剤グループは更にビタミン類、例えばＡ、　Ｂ例えば
Ｂ　　　Ｃ，ＤｌＥ及びに１葉酸、チアミ１２″ ンである。

薬剤グループは更に、ヒドロキシル化及び不飽和の程度
及び位置によって異なるプロスタグランノン類である。

薬剤グループは更に抗生物質であシ、これにはペニン１
１ン、クロロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラ
サイクリン、テトラマイシン、これらの代謝産物及び誘
導体がある。

［１グルーグは更にヌクレオシド及びヌクレオチドでア
シ、これには適切な糖及びホスフェート置換基を有する
ＡＴＰ、ＮＡＤ％　ＦＭＮ　、アデノシン、グアノシン
、チミジン及びシチジンがある。

薬剤グループは更に種々の個々の薬剤であシ、これには
メサトン、メプロパメート、セロトニン、メペリジン、
アミトリグチリン、ノルトリグチリン、＋１ドカイン、
プロカインアミド、アセチルグロ力インアミド、グログ
ラノロール、グリセオフルビン、パルプロ酸（ｖａｌｐ
ｒｏｉｃ　ａｃｉｄ）、ブチロフェノン、抗ヒスタミン
剤、抗コリン作働薬、例えばアトロピン、これらの代謝
産物及び誘導体がある。

化合物グループは更にアミノ酸及び小さいペゾチドであ
シ、これらにはポリョードチロニン、例えばチロキシン
、及びトリョードチロニン、オキシトシン、ＡＣＴＨ，
アンギオテンシン、ｍｅｔ　−及Ｄｌｅｕ−エンケファ
リン、これらの代謝産物及び誘導体がある。

病気の状態に関係する代謝産物はスペルミン、ガラクト
ース、フェニルピルビン酸及びポルフィリン１型を包含
する。

薬剤グループは更にアミノグリコシド、例えばゲンタマ
イシン、カナマイシン、トブラマイシン及びアミカシン
である。

該当する有害生物防除剤には、ポリハ０グン化ビフェニ
ル、ホスフェートエステル、チオホスフェート、カルバ
メート、ホリハログン化スルフェンアミド、これらの代
謝産物及び誘導体がある。

レセゾター分析物に関しては、分子量は一般に１０．０
００〜２×１０、更に普通には１０，０００〜１０　で
ある。免疫グロブリン、ＩｇＡ、　　ＩｇＧ。

ＩｇＥ及びＩｇＭに関しては、分子量は一般に約１６０
．０００〜約１０’である。酵素の分子量は通常的１０
．０００〜６，０００．０００であろう。天然レセプタ
ーは、アビジン、チロキシン結合グロブリン、チロキシ
ン結合プレアルブミン、トランスコルチン等を含めて広
範に及び、一般に少なくとも約２５．０００の分子量を
有し、１０−ｊたはそれ以上の分子量を有していてもよ
い。

リガンドアナローブ リガンドアナローブは、水素捷たは官能基が、結合重た
は活性官能基含有する別の分子に共有結合を形成する官
能性を有する結合基、例えばヒドロキシル基、アミノ基
、アリール基、チオ基、オレフィン基等で置換されてい
る点でりがントとは異なシ、共有結合を形成する場合に
は生じる化合物：ま、結合する分子による水素の置換よ
り多くの点でりがントとは異なる。結合基は通常水素以
外の原子を１〜２０個有し、水素以外の原子は炭素酸素
、硫黄、窒素及び原子番号１７〜３５のノ・ロケ９ンで
ある。関係する官能基はカルボニル基、オキソ基、非才
キン基、活性ハ０グン、ジアゾ基、メルカプト基、エチ
レン基、特に活性エチレン基、アミノ基等でるる。異種
原子の数は一般に約０〜６個、更に普通には約１〜６個
、好寸しくは約１〜４個である。結合基の説明は米国特
許第３．８１７８．３７号明細書に見られ、その開示″
ｆ参考として本明細書に含める。

結合基は大部分脂肪族であるが、ジアゾ基を有する場合
には芳香族基が該当する。一般に、結合基は連鎖中に約
１〜１０個、更に普通には約１〜６１固の原子を有する
２価の連鎖である。酸素は通常オキソまたはオキシとし
て存在し７、炭素及び水素に結合し、好１しくは炭素に
だけ結合するが、窒素は通常アミノ基として存在し、炭
素にだけ結合するか、またはアミド基として存在し、硫
黄は酸素と同様である。

結合基と結合すべき分子との間に共有結合を形成する普
通の官能成分はアルキルアミン、アミド、アミノン、チ
オアミド、尿素、チオ尿素、グアニジノ及びジアゾであ
る。

ポリペプチドに結合させる場合に特に使用される結合基
はカルボン酸を包含する基であシ、これらの基はジイミ
ドと共に、または炭酸モノエステルとの混成無水物とし
て、または活性カルボン酸エステル、例えばＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド、筐たはｐ−ニトロフェニルとして
使用することができる。窒素アナローブはイミドエステ
ルとして１更用することができる。還元性アミノ化条件
下でイミンを形成するため、例えば硼水素化物の存在で
アルキルアミンを生成させるため、アルデヒドを使用す
ることができる。使用しうる他の非オキソカルボニル基
はインシアネート及びインチオシアネートである。更に
、活性ハロゲン化物、特にブロモアセチル基を使用しう
る。

多くの場合、りがンドは結合基を結合する部位として使
用しうる官能基を１個以上有する。特に、ヒドロキシ基
、アミノ基及びアリール基、特に活性アリール基が使用
される。１ｆｃ、オキソ官能基及びカルボキシメチル基
のような結合基に結合する部位として使用されるヒドロ
キシル基からオキシムを使用することができる。

リガンド、或いはりがンドが結合すべき化合物中に存在
する官能基、所望の結合基の性質及び長さ等に応じて、
結合基の選択は広く変動する。

シグナル発生系 シグナル発生系は少なくとも１個の構成員を有し、２個
以上の構成員を有してもよい。シグナル発生系は、検出
可能のシグナルを試料中の分析物の量またはその量に関
連したレベルで生じる生成物を生成させる。シグナルは
通常固体支持体上に生じ、固体支持体から通常測定され
る。測定は、通常、電磁線の吸収または放出に関係する
。

広範な種々のシグナル発生系を使用しうる。更に、各シ
グナル発生系に関して、シグナル発生系の種々の成分を
、シグナル標識−ｍｉｐ結合体捷たはシグナル標識−支
持体結合体として使用しうる。

更に、シグナル標識−ｍｉｐ結合体は溶解して準備する
か、またはｍ１ｐ−支持体結合体に複合させることがで
きる。

種々の結合体を共有結合または非共有結合で、直接寸た
は間接的に結合させることができる。共有結合する場合
には、個々の結合基は結合すべき２個の基の性質及びこ
れらの基の各作用に左右される。多数の結合基及び結合
方法が文献に開示されている。リガンドアナローブに関
する部分にかなシの数の結合基が示されている。

レセプターを使用して結合を達成することもできる。例
えば、抗原をレセプター、例えば抗原に対する抗体を介
して支持体に結合させることができる。レセプターは共
有結合または非共有結合、例えば吸着により支持体に結
合させることができる。

シグナル発生系は、任意に下記のカテゴｌ−即ち色原体
、触媒反応、化学発光及び放射性標識に分けられる。

色原体 色原体は、特殊な範囲で光を吸収して色を観察できるが
１．または特定の波長若しくは波長範囲の光で照射する
場合に光、例えば螢光を発する化合物を包含する。

シグナル標識として光の吸収によって測定される染料を
使用しても、所望の感度は得られない。

複数の吸光性官能基を含むシグナル標識を使用すること
もできるが、一般に濃度は充分なエステルを生ずるには
不充分である。しかしながら、実質的に透明な免疫吸着
帯域と共に、シグナル標準の免疫結合を適切な深さにし
、ｍｉｐに結合した発色官能基を充分な数にすることに
よって、シグナル標識として可視範囲の光を吸収する染
料を使用することもできる。

複数のりがノド及びシグナル標識が結合している可溶性
ハブ核を使用することによって系の感度を著しく高める
ことができる。本発明の系は免疫吸着帯域を極めて完全
に洗浄しうるので、パックグラウンド値を最小にするこ
とができる。

染料の選択は広く変動でき、第一に免疫吸着帯域支持体
による吸収の最小の強い色を生ずるように選択される。

染料の種類は例えば、キノリン染料、トリアリールメタ
ン染料、アクリジン染料、アリザリン染料、フタレイン
、昆虫染料、アゾ染料、アントラキノイド染料、シアニ
ン染料、ツェナブチオニウム染料及びフェナザオキソニ
ウム染料である。

広範な螢光物質を単独で筐たは消光物質分子と共に使用
することができる。

該当する螢光物質は一次官能性化合物を含む広範なカテ
ゴリーに入る。これらの−次官能性化合物は１−及び２
−アミノナフタレン、ｐ、ｐ−ジアミノスチルベン、ピ
レン、第四フェナントリジン塩、９−アミノアクリジン
、ｐ、ｐ′−ジアミノベンゾフェノンイ□ン、アントラ
セン、オキサカルボシアニン、メロシアニン、３−アミ
ノエクイレニン、ペリレン、ビス−ベンズオキサゾール
、ビス−ｐ−オキｆ　：、／’　ＩＪルベンゼン、１．
２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス−３−アミノ
ピリジニウム塩、ヘレブリグニン、テトラサイクリン、
ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフェニルアミン
、２−オキソ−３−クロメン、インドール、キサンチン
、７−ヒドロキシクマリン、フェノキサジン、サリチレ
ート、ストロファンチノン、ポルフィリン、トリアリー
ルメタン及びフラビンである。

結合のための官能基を有するか、捷たはこのような官能
基を含むように変性しうる個々の螢光性化合物はダンシ
ルクロリド、フルオレセイン、例えば３，６−ジヒドロ
キシ−９−フェニルキサントヒトロール、ローダミンイ
ンチオシアネート、Ｎ−フｘ＝ルｌ−アミノー８−スル
ホナトナフタリン、Ｎ−フェニル２−アミノ−６−スル
ホナトナフタリン、４−アセトアミド−４−インチオシ
アナトスチルベン−２，２’−ノスルホン酸、ピレン−
３−スルホン酸、２−トルイジノナフタレン−６−スル
ホネート、Ｎ−フェニル、Ｎ−メチル２−アミノ−ナフ
タレン−６−スルホネート、エチノウムブロミド、アナ
プリン、オークミン−０１２−（９’−アントロイル）
ハルミテート、タンシルホスファチノルエタノールアミ
ン、Ｎ、？／−ジオクタデシルオキサカルボシアニン、
Ｎ、！’／−ノへキシルオキサカルがシアニン、メロシ
アニン、４−（了−ピレニル）ブチレート、ｄ−３−ア
ミノデスオキシエクイレニン、１２−（Ｃｊ−７ン）ロ
イル）ステアレート、２−メチルアントラセン、９−ビ
ニルアントラセン、２．２’−（ビニレン−ｐ−フェニ
レン）−ビス−ベンゾオキサゾール、ｐ−ビス（２−（
４−メチル−５−フェニルオキサシリル刀ベンゼン、６
−ノメチルアミノー１，２−ペンゾフエナジン、レチノ
ール、ビス（３′−アミノピリジニウム）１．１０−デ
カンノイルジョーノド、ヘレプリｒニンのスルホナフチ
ルヒドラゾン、クロルテトラサイクリン、Ｎ−（７−ノ
メテルアミノー４−メチル−２−オキソ−３−クロメニ
ル）マレイミド、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾイミダゾイル
）−フェニルコマレイミド、Ｎ−（４−フルオルアンチ
ル）マレイミド、ビス（ホモバニリン酸）、レサザリン
、４−クロロ−７−ニト””２＋　１１３−ペンツオキ
サノアゾール、メロシアニン５４０．　レソルフィン、
ローズベンガル及び２，４−ノフェニルー３（２Ｈ）−
フラノンでるる。

螢光物質は約３００ｎｍ以上、好壕しくは３５０ｎｍ以
上、更に好筐しくは約４００　ｎｍ以上の光を吸収すべ
きでアシ、通常、吸収した光の波長よシ１０　ｎｍ以上
高い波長で発光するのが好筐しい。

免疫吸着帯域に存在する蛋白質が干渉しないことが第一
に重要なことである。

結合した染料の吸収及び発光特性が未結合であることに
注意すべきである。従って、染料の種々の波長範囲及び
特性について言及する場合には、使用した染料を示すも
のでｈ？）、結合しておらず、任意の溶媒中で特性を示
す染料ではない。

螢光物質は、単一の螢光物質がシグナルを増加しうる程
度１で吸収性染料よシ好ましい。光で螢光物質を照射す
ることによって複数の発光を受ることかできる。従って
、単一のラベルが複数の測定可能の結果を生じうる。

他の種々の組合せ及びプロトコルを分析物の性質に応じ
て使用することができる。

触媒作用 前記のように、酵素触媒及び非酵素触媒を使用すること
ができる。酵素触媒は屡々、−層迅速な反応及び反応の
種類にむける１筐しい多様性を生じ、良好な特性を有す
るので、酵素触媒を使用するのが好筐しい。

酵素を選択する際には、該当する反応に伴なう事の他に
、多くのことが考えられる。これらの考慮事項は酵素の
安定性、高い代謝回転率の望筐しさ、物理的環境にかけ
る変化に対する回転基の感受性、基質及び生成物の性質
、酵素の入手可能性及び酵素の性質に対する酵素の結合
の作用を包含する。

次に、国際生化学連盟（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＵ
ｎｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の分類に
より示された酵素のカテゴリイを挙げる。

以下余白 第Ｕ表 １、酸化還元酵素群 １１　供与体のＣＨ−ＯＨ基に働く １、１．　Ｉ　　ＮＡＤ　ｉたはＮＡＤＰ金受体とする
１、　１．２　　チトクロームを受体とする１、１．３
　０２を受体とする １、　１．９９　　その他を受体とする１、２　　供与
体のアルデヒドまたはケト基に働く１．２．Ｉ　　ＮＡ
ＤまたはＮＡＤＰを受体とする１、　２．２　　チトク
ロームを受体とする１、２．３　０２を受体とする １、　２．４　　リポエイトを受体とする１、２．９９
　　その他を受体とする １３　供与体のＣＨ−ＣＨ基に働く １．３．Ｉ　　ＮＡＤまたはＮＡＤＰを受体とする１、
　３．２　　チトクロームを受体とする１、３．３　０
２を受体とする １、　３．９９　　その他を受体とする１４　供与体の
ＣＨ−ＮＨ２基に働く １４、ｌ　受体としてＮＡＤ−ｉたはＮＡＤＰを有する
１、　４．３　　受体として０２を有する１、５　　供
与体のＣ−ＮＨ基に働く １．５．ｌ　　ＮＡＤまたはＮＡＤＰを受体とする１、
５．３　０２を受体とする １、６　　供与体としての還元型ＮＡＤまたはＮＡＤＰ
に働く １．６．ｌ　　ＮＡＤまたはＮＡＤ　Ｐを受体とする１
、　６．２　　チトクロームを受体とする１、　６．４
　　ジスルフィド化合物を受体とする１、　６．５　　
キノンまたは関連化合物を受体とする １、　６．６　　窒素含有基を受体とする１、　６．９
９　　その信金受体とする１、７　　供与体としての他
の窒素含有基化合物に働く １．７．３　０２を受体とする １、　７．９９　　その他を受体とする１、８　　供与
体の硫黄基に働く １．８．ｌ　　ＮＡＤまたはＮＡＤＰを受体とする１、
＆３　０２を受体とする １．８４　ジスルフィド化合物を受体とする１、８５　
キノン筐たは関連化合物を受体とする １、　８．６　　窒素含有基金受体とする１９　供与体
のヘム基に働く １．９．３　０２を受体とする １９６　窒素含有基を受体とする １、　１０　　供与体としてのジフェノール及び関連物
質に働く １゜１０．３　０２を受体とする １、１１　　受体としてのＨ２Ｏ２に働く１．１２　　
供与体としての水素に働く１．１３　　単一の供与体に
働いて酸素を取シ込筐せる（酸素酵素） １、１４　　供与体対に働いて一方の供与体に酸素を取
り込ませる（ヒドロキシラーゼ） １、１４．１　　還元型ＮＡＤ筐たはＮＡＤＰを一方の
供与体として用いる １１４２　アスコルビン酸塩を一方の供与体として用い
る １、　１４．３　　還元型ゾテリノンを一方の供与体と
して用いる ２、転移酵素群 ２．１　−炭素基の転移 ２、１．１　　メチルトランスフェラーゼ２、１．２　
　ヒドロキシメチル−、ホルミル−及ヒ関連のトランス
フェラーゼ ２、１．３　　カルがキシル−及ヒカルバモイルトラン
スフェラーゼ ２１．４　アミジノトランスフェラーゼ２．２　　アル
デヒド筐たはケトン基の転移２．３　　アシル基転移酵
素 ２、３．１　　アシルトランスフェラーゼ２、３．２　
　アミノアシルトランスフェラーゼ２．４　　グリコジ
ル基転移酵素 ２、４．１　　ヘキソジルトランスフェラーゼ２、４．
２　　ペントジルトランスフェラーゼ２．５　　アルキ
ルまたは関連の基の転移２．６　　窒素含有基の転移 ２．６１７ミノトランスフエラーゼ ２．６３　オキシミノトランスフェラーゼ２．７　　燐
含有基の転移 ２７．１　アルコール基を受体とするホスホトランスフ
ェラーゼ ２、７．２　　カルボキシル基を受体とするホスホトラ
ンスフェラーゼ ２、７．３　　窒素含有基を受体とするホスホトランス
フェラーゼ ２、７．４　　ホスホ基を受体とするホスホトランスフ
ェラーゼ ２．７．５　　見かけ上は分子内へのホスホトランスフ
ェラーゼ ２、７．６　　ピロホスホトランスフェラーゼ２．７．
７　ヌクレオチジルトランスフェラーゼ２、７．８　　
その他の置換されたホスホ基に関するトランスフェラー
ゼ′ ２．８　　硫黄含有基の転移 ２、８．１　　硫黄トランスフェラーゼ２．８２　スル
ホトランスフェラーゼ ２．８．３　　ＣｏＡ−トラ７ス７　’ｚ　ラーゼ３、
加水分解酵素詳 ３．１　　エステル結合に働く ３１．１　カルボン酸エステルヒドロラーゼ３、１．２
　　チオールエステルヒドロラーゼ３．１．３　　燐酸
モノエステルヒドロラーゼ３．１．４　　燐ｅノエステ
ルヒドロラーセ３．１．５　　三燐酸モノエステルヒド
ロラーゼ３．１．６　　硫酸エステルヒトロラー　−ｈ
”３．２　　グリコジル化合物に働く ３２、ｌ　グリコシドヒドロラーゼ ３．２．２　　Ｎ−グリコジル化合物を加水分解する ３、２．３　８−グリコジル化合物を加水分解する ３、３　　エーテル結合に働く ３．３１　チオエーテルヒドロラーゼ ３．４　　ペプチド結合に働く（ペプチド加水分解酵素
） ３．４１　α−アミノアシルーペプチドヒド口ラーゼ ３．４．２　　ペグチジルーアミノ酸ヒドロラーゼ３．
４．３　　ジペプチドヒドロラーゼ３、４．４　　ペグ
チジルーペグチドヒドロラーゼ３５　イグチド結合以外
のＣ−Ｎ結合に働く３、５．１　　直鎖アミド中 ３５．２　環状アミド中 ３５３　直鎖アミノン中 ３．５．４　　ｍ状アミジン中 ３．５５　シアン化物中 ３、５．９９　　その他の化合物中 ３６　酸無水物結合に働く ３６．１　ホスホリル含有無水物中 ３．７０−Ｃ結合に働く ３、７．１　　ケトン物質中 ３．８　　ハロゲン化物結合に働く ３．８．Ｉ　　Ｃ−ハロゲン化物化合物中３．８．２　
　Ｐ−ハロゲン化物化合物中３．９　　Ｐ−Ｎ結合に働
く ４、分解酵素群 ４１　炭素−炭素分解酵素 ４、１．１　　カルボキシ−リアーゼ ４、１．２　　アルデヒド−リアーゼ ４、１．３　　ケト酸−リアーゼ ４．２　　炭素−酸素分解酵素 ４、２．１　　ヒドロ−リアーゼ ４、２．９９　　その他の炭素−酸素分解酵素４．３　
　炭素−窒素分解酵素 ４．３１　アンモニア−リアーゼ ４．３．２　アミノン−リアーゼ ４．４　炭素−硫黄分解酵素 ４．５　　炭素−・・ログン化物分解酵素４．９９　　
その他の分解酵素 異性体化酵素群 ５．１　　ラセマーゼ及びエピマーゼ ５、１．１　　アミノ酸及びその誘導体に働く５、１．
２　　ヒドロキシ酸及びその誘導体に働く５．１．３　
　炭水化物及びその誘導体に働く５、１．９９　　その
他の化合物に働く５．２　　シスートランスインメラー
ゼ５．３　　分子内酸化還元酵素 ５３８１　アルドース及びケトースの相互変換５３２　
ケト及びエノール基の相互変換５、３．３　　Ｃ＝　Ｃ
結合の転位 ５４　分子内トランスフェラーゼ ５、４．　ｌ　　アシル置の転移 ５、４．２　　ホスホリル基の転移 ５、４．９９　　その他の基の転移 ５．５　　分子内リアーゼ ５９９　その他の異性体化酵素 結合酵素または合成酵素 ６、ｉ　　Ｃ−０結合の生成 ６１．１　アミノ酸−ＲＮＡリガーゼ ６．２　　Ｃ−８結合の生成 ６２．１　酸−チオールリガーゼ ６．３　　Ｃ−Ｎ結合の生成 ６３．１　酸−アンモニアリガーゼ（アミドシンテター
ゼ） ６３．２　酸−アミノ酸りが−ゼ（ペプチドシンテター
ゼ） ６３．３　シクロ−リガーゼ ６、３．４　　その他のＣ−Ｎリガーゼ６、３．５　　
グルタミンをＮ−供与体とするＣ−Ｎリガーゼ ６．４０−Ｃ結合の生成 特に重要なのばクラスｌの酵素である。酸化還元酵素及
びクラス３の加水分解酵素、ならびにクラス２の酵素で
ある転移酵素、クラス４の分解酵素及びクラス５の異性
体化酵素もまた、特別な状況では重要である。

次の表に、酵素の特定のサブクラス及び特に重要なサブ
クラス内の特定の酵素を示す。酸化還元酵素の中ではＮ
ＡＤもしくはＮＡＤＰ、酸素または過酸化水素を含むも
のが特に重要であシ、加水分解酵素の中ではホスフェー
ト及びグリコシドを含むものが特に重要である。

第■表 １、酸素還元酵素群 １．１　　供給体のＣＨ−ＯＨ基に働く１、１．　Ｉ　
　ＮＡＤ　ｉたはＮＡＤＰを受体とする１、　アルコー
ルデヒドログナーゼ ６　グリセロールデヒドロゲナーゼ ２７．　　ラクテートデヒドロゲナーゼ３７、　　マレ
ートデヒドロゲナーゼ ４９、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ １．１．３　０２を受体とする ４、グルコースオキシダーゼ ガラクトースオキシダーゼ １２　供与体のアルデヒドまたはケト基に働く１、２．
１　　ＮＡＤ　！またはＮＡＤＰを受体とする１２、　
　グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼ １．２．３　０２を受体とする ２、キサンチンオキシダーゼ ルシフェラーゼ １．４　　供与体のＣＨ−ＮＨ２基に働く１．４．３　
０□を受体とする ２、　　Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ ３、　　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ １．６　　供与体としての還元型ＮＡＤまたばＮＡＤＰ
に働く １、６．９９　　その他を供与体とするジアフォラーゼ １．７　　供与体としてのその他の窒素含有化合物に働
く １．７．３　．０２を受体とする ３、尿素分解酵素 １．１１　　受体としてのＨ２Ｏ２に働く１、１１．１ ６　カタラーゼ ７、過酸化酵素 ２　転移酵素群 ２．７　　燐含有基の転移 ２．７．Ｉ　　ＣＨ−ＯＨを受体とするホスホトランス
フェラーゼ １、　ヘキソキナーゼ ２、　グルコキナーゼ １５、　　リボキナーゼ ２８、トリオキナーゼ ４０、　　ピルベートキナーゼ ２．７５ １、　ホスホグルコムターゼ 加水分解酵素群 ３．１　　エステル結合に働く ３、１．１　　カルボン酸エステルヒドロラーゼ７、　
コリンエステラーゼ ８　擬コリンエステラーゼ ３．１．３　　燐酸モ／エステルヒドロラーゼ１、　ア
ルカリホスファターゼ ２、酸ホスファターゼ ９、　グルコース−６−ホスファターゼ１１、　　フル
クト−スジホスファターゼ３．１．４　　燐酸ジエステ
ルヒドロラーゼ１、　ホスホジェステラーゼ ３、ホスホリノぞ−ゼＣ ３，２グリコジル化合物に働く ３２．１　グリコシドヒドロラーゼ １、　α−アミラーゼ ２、　β−アミラーゼ ４、　セルラーゼ １７、ムラミダーゼ １８、ノイラミニダーゼ ２１、　　β−グルコシダーゼ ２３、β−ガラクトシダーゼ ３１、　　β−グルクロニダーゼ ３５、　　ヒアルロニダーゼ ３．２．２　　Ｎ−グリコジル化合物の加水分解５、　
　ＤＰＮアーゼ ４、分解酵素 ４．１　炭素−炭素分解酵素 ４、１．２　　アリデヒドリアーゼ １３、　　アルドリアーゼ ４、２．１　　ヒドロ−リアーゼ １、炭酸脱水素酸素 ５、異性体化酵素 ５．４　　分子内トランスフェラーゼ ５．４２　ホスホリル基の転移 対の触媒、通常２種以上の酵素を使用することは本発明
に特に有利であシ、その場合一方の酵素の生成物は他方
の酵素の基質として作用する。１種以上の酵素が表面に
結合するが、１種の酵素は必らずｍｉｐに結合している
。また、２種の酵素をｍｉｐに結合させ、付加的酵素を
表面に結合させることができる。

溶質は任意の１種の酵素、好１しくは表面に結合した酵
素の基質である。酵素反応は、溶質を変性して別の酵素
の基質である生成物を生じるか、または酵素基質として
作用する溶質を多量に含捷ない化合物を製造することが
できる。第一の状態は、グルコース−６−ホスフェート
がアルカリホスファターゼによってグルコースに触媒加
水分解されることで説明され、この場合グルコースはグ
ルコースオキシダーゼの基質である。第二の状態は、グ
ルコース−６−ホスフェートから形成したグルコースが
グルコースオキシダーゼニヨって酸化されて過酸化水素
が生じ、この過酸化物はシグナル発生体前駆物質及び過
酸化物と酵素により反応してシグナル発生体を生じる。

対の触媒は酵素と非酵素触媒であってもよ−。

酵素が非酵素触媒によって接触される反応を受ける反応
体を生成しうるか、または非酵素触媒が酵素の基質（補
酵素を含む）を生成する。例えば、Ｇ６ＰＤＨばＮＡＤ
及びＧ６ＰをＮＡＤＨに変換する反応を触媒し、　ＮＡ
ＤＨがテトラゾリウム塩と反応させて不溶性染料を生じ
る。

本発明に使用しうる広範な非酵素触媒は米国特許第４．
１６０，６４５号明細書に見られ、その適切な部分を参
考として本明細書に含める。非酵素触媒は反応体として
、１位の電子移動によって反応する第一の化合物及び２
位の電子移動によって反応する第二の化合物を使用し、
この場合２種の反応体は触媒の不存在では反応するとし
ても徐々に相互に反応しうる。

表面でシグナル発生化合物を生ずるため種々の酵素の組
合せを使用することができる。特に、不溶性シグナル発
生体を作るため、加水分解酵素の組合せを使用すること
ができる。適切な基質を使用することによって単一の加
水分解酵素を酵素対にほぼ同等に作用させることができ
る。また、加水分解酵素及び酸化還元酵素の組合せはシ
グナル発生体を生じうる。酸化還元酵素の組合せを使用
して不溶性シグナル発生体を生成させることもできる。

下記の表には、表面にシグナル発生化合物を優先的に生
成させるため使用しうる種々の組合せを示す。前記のよ
うに、表面の触媒を適切に選択することによって、１つ
の配合物に比較的多数の試薬を組合せうるので、通常、
好ましい触媒は表面に存在するであろう。

下記の表に訃いて、第一の酵素は表面に結合し、第二の
酵素はｍｉｐに結合させるものであるが、特別な場合に
はこれらの位置を逆にするのが好筐しい。

以下余白 相関二酵素系−続き ２．ウリカーゼ ｌ、クレート＋０２→アラントイン＋Ｈ２Ｏ２２、Ｈ２
Ｏ２＋Ｏ−シアニジノン→染料２、Ｈ２Ｏ２＋ビスート
ルイ・ノン→染料２．４−Ｃ１ １−ナフトール→染料 ６、ヘキソキナーゼ １、グルコース＋ＡＴＰ→グルコースー６＝ホスフェー
ト ２、グルコース−６−ホスフェート＋ＮＡＤＰ→ＮＡＤ
ＰＨ →ホルマザン ブルー 本シグナル発生体の前駆物質は固体表面に共有結合して
いてよい。

以下余白 相関酵素及び非酵素触媒系−続き ＮＡＤ＋ホルマザン ２ラクテートデヒ ドロケソーービ １、ラクテート＋ＮＡＤ−＊ピＭベート＋ＮＡＤＨ２、
ＮＡＤＨ＋ペン力レビオロしン→ＮＡＤ十掠１斗前記の
多数の染料を適切な溶解要件を有するか、または本発明
に対して適切な溶解要件を有するように変性しうる他の
染料で代えうろことは極めて明らかである。更に、局部
的に高い濃度の染料を有することによって、染料が表面
に結合しやすくなることを認識すべきである。更に、バ
ルク溶液から表面へ拡散する染料の量が増加しても、表
面上に沈殿する染料の量にあ１シ影響しない。染料の性
質に応じて、染料による光吸収または螢光の場合には発
光を測定することができる。染料の代わシに電気活性化
合物を製造し、表面における電気的性質を測定すること
もできる。

検出帯域においてシグナルを発生するため種々の技術を
使用することができる。例えば、表面に結合したときに
、検出可能のシグナルを生ずるように、シグナル発生体
の環境を選択的に変性することができる。例えば、エス
テルまたはエーテルを加水分解して表面に不溶性のＰＨ
感受性染料を生成させることができる。表面の局部の、
Ｈは、表面上に帯電基を有することによってバルク溶液
とは実質的に異なるものになるであろう。プロトン濃度
に感受性のシグナル発生化合物を使用することによって
、表面に結合した生成物からの観察されるシグナルは、
バルク溶液または液相中の生成物とは著しく異なる。螢
光物質−消光物質の対を使用することもでき、この場合
に溶質が表面に結合する不溶性消光物質分子を生じる。

表面上の消光物質分子の量が増加すると、表面に結合し
た螢光分子から螢光が著しく減少する。

シグナル標識として酵素を使用する代わシに、シグナル
標識として基質を使用することができる。

しかしながら、はとんどの場合に、基質（コファクター
を含めて）がシグナル標識−ｍｉｐ結合体のシグナル標
識である場合、高度の増幅はない。

それにもかかわらず、若干の場合にはそれで充分である
。例えは、種々の色原体、特に螢光物質を、非螢光性の
生成物を生じる、酵素に不安定な官能基によって変性す
ることができる。例えば、フェノール系螢光物質、例え
ばウンベリフェロンまたはフルオレセインの燐酸エステ
ルまたはグリコシノルエーテル（非螢光助剤）を製造す
ることができる。しかし、エステル筐たはエーテル結合
を例えばアルカリンホスファターゼ捷たはグリコシダー
ゼで酵素開裂すると、生じる生成物は螢光性である。こ
の方法では、酵素はシグナル発生体化合物を発現するた
め試薬溶液中に加えられる試薬である。

コファクターを使用する場合、コファクターを循還させ
、表面上に沈殿する色原体生成物を生成させる。この種
の反応については先に記載した。

化学発光物質 検出可能のシグナルとしての別の光源は化学発光源であ
る。化学発光源は、化学反応によって電子的に励起され
、検出可能のシグナルとして作用するか、筐たは螢光受
容体にエネルギーを供与する光を発する化合物に関する
。

種々の条件下で化学発光を生ずるため種々の化合物群が
発見された。その１つの化合物群は２．３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオンである。最も良く知られてい
る化合物は５−アミノ化合物であるルミノールである。

この群は更に５−アミノ−６，７，８−）リメトキシー
及びジメチルアミノ−〔ｃａ〕ペンズアナローグを含む
。これらの化合物はアルカリ性過酸化水素または次亜塩
素酸カルシウム及び塩基により発光性にされる。別の化
合物群は２．４．５−）リフェニルイミダゾール類であ
シ、ロフィンは基本物質の普通名称である。化学発光ア
ナローブは／４’ラージメチルアミノー及び−メトキシ
置換基を含む。化学発光は、塩基性条件下で蓚酸エステ
ル、通常例えばｐ−ニトロフェニルのオキサリル活性エ
ステル及び過酸化物、例えば過酸化水素を用いて得るこ
とができる。また、ルシフェリンはルシフェラーゼまタ
ハルシグニント共に使用することができる。

放射性レベル 種々の放射性同位元素を通常使用する。これらはトリチ
ウム／３Ｈ）、放射性ヨウ素（１２５１）、放射性炭素
（＋４（：）、放射性燐（３２ｐ）等を含む。化合物を
放射性標識で標識する方法は良く知られている。

補助的材料 本発明のアッセイには屡々、種々の補助的材料が使用さ
れる。特に、酵素基質、コファクター活性化剤、未標識
ｍｉｐ等がアッセイ媒体に含壕れていてよい。

更に、緩衝剤及び安定剤が通常存在する。これらの添加
剤と共に屡々、付加的蛋白質、例えばアルブミン、筐た
は界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、例えば♂リ
アルキレングリコール等が含１れていてよい。

組成物 本発明のアッセイを実施するため、アッセイ装置及び組
成物を準備し、アッセイの感度を最高にするように選択
する。

シグナル標識−ｎｉｐミル結合体アッセイに最初に結合
させない場合には、試薬溶液は通常シグナル標識−ｍｉ
ｐ結合体を含む。前記の結合体の他に、必要に応じ他の
物質を含む。試薬の量を予め測定しておき、アッセイの
実施時に精確な測定を必要としないようにするのが１筐
しい。

実験 下記の実施例は説明のために示すものであり、限定的な
ものではない。・や−セント及び部は特に記載しない限
すすべで重量であるが、液体の混合物については容量に
関するものである。溶媒が示されていない場合に１／：
（、水を意味する。下記の略記号を使用する； ＣＭＭ　−０−カルボキシメチルモルフイン；　ＨＲＰ
−西洋わさびパーオキシダーゼ：　ＮＨ８−Ｎ　−ヒ）
”ロキシスクシンイミド；　ＤＭＦ　−Ｎ　、　Ｎ−ツ
メチルホルムアミド；Ｄ伊−テトラヒドロ７ラン：　Ｂ
ＳＡＳクー血清アルブミン：ＨＩｇＧ−ヒト免疫グロブ
リンＧ　：　ＲＴ−室温：ＧＯ−グルコースオキシダー
ゼ：ＥＤＣＩ　−Ｎ−エチル−Ｎ−３−ノメチルアミノ
グロピルカルが・シイミド：ＳＳ−シュレジッヒャ−（
５ｃｈｌｅｓｉｃｈｅｒ　）及びシュネル（５ｃｈｎｅ
ｌｌ　）例１　モルフイン−西洋ワさびＡ−オキシダー
ゼ（ＨＲＰ）結合体 反応フラスコ中に〇−カルボキシメチルモルフイン１０
μモル、Ｎ−ヒドロキンスクシンイミド１１μモル及び
ＥＤＣＩ１２μモルを飄１に溶かして合計約１．２ＩＩ
ｔの容量にして入れた。試薬を合した後、混合物を窒素
で洗浄し、冷室で一夜攪拌した。

５０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ９，５）中のＨＲ
ＰＯ，５ｍ／（２ｍｙ）にＤＭＦ　１５０　ｍｌ、次に
前記エステル溶液３００μｔを加え、混合物を４℃で一
夜放置した。次に、反応混合物をＧ５０ゼ７アデツクス
の２×３０ｃｒｎＯカラムに施し、０．１Ｍ燐酸塩、Ｐ
Ｈ７６，０，１Ｍ　ＫＣｌ及び検査される蛋白質で溶出
した。空隙中のフラクションを集めて、濃度０．２１ｎ
ｆ／／−のフラクション５．０　ｍを得た。放射性トレ
ーサーを使用してモルフイン／　ＨＲＰのモル比が１．
８６であ１皿Ｐの濃度が２００μ、９／ｌｔｌであるこ
とが判った。

例２　円形濾紙に結合する蛋白質 この例は紙支持体に蛋白質を結合させるため使用する実
験プロトコルである。５Ｓ５８９黒リボン円形済紙（厚
さ０．１９３ｍ＋、直径１２．５ｏｎ）を室温で５時間
０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムで活性化した。水で充分
に洗浄した後、０．５５Ｍ硼酸塩、ｐＨ８，５，０，２
Ｍ　ＮａＣ１中の適切な蛋白質溶液２ｄを円形濾紙に加
え、混合物を室温で２時間放置した。

次に、混合物に１１ｎ９　／　ｗｒｌ　ＮａＢＨ４溶液
３．　Ｏｍｌを加え、混合物を室温で３時間放置し、９
．０５５Ｍ硼酸塩（ｐＨ８５）中の円形濾紙を０．２　
Ｍ　ＮａＣ１で充分に洗浄した。円形濾紙に結合した蛋
白質の量を放射線標識トレーサーで測定した。

円形濾紙に結合した蛋白質の総量は１８．２ｔｔｌ／ｃ
ｒｒｒ’であった。

厚さ０．８９５ｍｍ、幅約０３２ｏ−、長さ３５σの５
Ｓ４７０紙のストリップ及び前記のように製造し、スト
リップの一端に置いた直径０．４８ｃｍ（３／１６”）
の円形濾紙を使用してアッセイ装置を製造した。ストリ
、７″を次に円形濾紙上の開口を除いてスコッチ（５ｃ
ｏｔｃｈ）■テープで被覆して溶液との接触を防止する
。合成尿中に種々の濃度のモルフインを含む試料溶液を
製造した（下記の第Ｖ表参照）。装置を試料中に浸漬し
、３０秒間そのま１に保つと、その間に溶媒の浸透先端
は３ｍ上昇した。次に装置を取り出し、０．０５Ｍグル
コースｌ　ｍｌ当り、前記のように製造し、１：１００
に希釈したＨＲＰ−モルフイン接合体６μｔ、０．１Ｍ
燐酸塩でｐ１４７．０に緩衝した４−Ｃｔ−１−ナフト
ール溶液２００　μｉ／　ｒｎｌ、　ＥＤＴＡ及びＮａ
Ｃｔを含む発色溶液中に浸漬した。装置を発色溶液中に
３分間保つと、その間に溶媒の先端は０．５ｏｎ上昇し
た。

区別しうる段階で色の範囲を生ずるため発色染料の反復
希釈により作ったカラーチャートと比較することによっ
て色を測定する。下記の第■表にはモルフイン濃度及び
円形２紙上に生じた色を示す。抗モルフイン３ｍ９ニゲ
ルコースオキシダーゼ５　ｒｎｇの比を使用して濾紙を
調整した。比較のため、ＨＲＰ−モルフイン接合体の濃
度が２５μｌ−／ｌｄの第二の溶液を使用した。

第■表 ０．１ ０．３ １．０ ３．０ １Ｏ，０ ３０，０ １００，０ ３００，０ 前記の結果から、 極めて短い時間でＯｎｌ／ｍｅと １　ｎｌ／ｍｌとの間数値で実質的に区別しうろことは
明らかである。更に、機能的範囲はモルフイン約Ｏｎｌ
／Ｉｌｌからモルフイン約３００ｎθ／ｒｎｌに及ぶ。

次の研究では、免疫吸着帯域及び種々のマトリックスを
変化させながら結果を比較した。各場合に、アッセイ装
置は、モルフインに対する抗体及びグルコースオキシダ
ーゼを種々の比で結合させた０、４８ｃｒｎの円形ディ
スクを長さ０．３２　ｃｍ　ＣＶ８”）の高吸収性スト
リ、７″上に置き、このアセンブリをディスク上に０．
３２　ｏｎの開口を有する疎水性遮断壁中に収納した。

ＨＲＰ−モルフイン接合体の量を変動させた。発色剤溶
液またはシグナル発生系溶液は４−Ｃｔ−１−ナフトー
ル２００μｇ／履ｌ、グルコース０．０５Ｍ％ＥＤＴＡ
を含むｐＨ７，０の燐酸塩緩衝剤及びＮａＣｔを含む。

試料の溶媒浸透先端は３（７Ｆ＋上昇したが、発色溶液
の溶媒先端は更に０．５　ｃｍ上昇した。

Ｍ　′！′ｔ　Ｔ　Ｈｅ　（Ｄ　Ｗ　Ｋ　ｙｒ：“・　
　　　　　　　２、余白第Ｖ表 ＡｂＭ　、ＧＯ２：３ ＨＲＰ−Ｍ　６ｔｔＬ／ｍｌ’ 尿 水 合成尿０ ５５　　　　１８０　　１０ ３５　　　１８０　　　９ ３５　　　１８０　　１０ 第Ｖ表−続き ＡｂＭ：　Ｇｏ”　　３　：５ ＨＲＰ−Ｍ　２５　ｔｔｌ／ａｔ　’ 尿　　　　　　１３　　　　４　　　１３．８水 合成尿ｃ　　１０　　１　　１１．２ ｐ紙の調整に使用したＡｂＭ１ｎ９： 例１の結合体の溶液の濃度 合成尿−ヒトの尿中の主成分 モルフイン　Ｑｎｇ／ａｔ モルフイン　１１００ｎ／ｍｌ 濃度計−光学濃度 ００ｍ９の比 以下余白 下記の研究では、螢光標識を使用した。幅０．４８０の
液体吸収ス）　ＩＪ　、　ｆを含む、長さ９ｃｒｎの前
記の紙を使用して試験ストリップ装置を製造した。

隣接する一端に抗モルフインを保有する直径０．６４ｃ
ｍｃＶ４“）のディスクを置いた。ディスクは液体吸収
ストリップと均一に接触させた。アセンブリ全体を抗モ
ルフイン含有ディスク上の直径０．４８ｍの開口を除い
て疎水性バリヤー中に封入した。

使用したプロトコルは下記のとおシである。モルフイン
を含壕ないか、または５μｆｌ／ｍｌを含む試料中に装
置を浸漬し、溶媒の浸透先端を２ｃｍ上昇させる。次に
試料溶液から装置を取シ出し、０１Ｍ燐酸塩緩衝液（Ｐ
Ｈ７，０）中のフルオレセイン−モルフイン結合体約２
５μｆ／／ｍｌの溶液中に浸漬する。装置を試薬溶液中
に、溶媒の先端が更に３ｃｒｎ移動する壕で保持する。

次に、装置を試薬溶液から取り出し、０．１Ｍ燐酸塩（
ｐＨ７，０）の洗浄液中に置き、溶媒の先端が更に４ｃ
１ｎ移動する壕で洗浄液中に保持する。次に、ディスク
を短波紫外光下に可視下し、モルフインを含１ない試料
とモルフイン５μθ／ｍｅを含む試料との間で螢光強度
の明瞭な差を肉眼で観察した。

次の研究では、０．３２ｃＩｎの液体吸収性ストリップ
及び０．３２ｃｒｎの開口を使用する以外は前記のもの
と本質的に同じ装置を使用して放射性標識を使用した。

２種の異なる操作を使用した。即ち、方は競合結合に関
し、他方は連続結合に関する。

競合結合技術では、５０　ｎｉの　Ｈ−モルフイン及び
種々の濃度（０；１ｏｏｎｙ；及び２．０００ｒ＆）の
モルフインを含む試料１　ｍｌ中に装置を浸漬する。

溶媒の先端が３ｃｒｎ移動した後、装置を取り出し、Ｎ
ａＣｔＯ，２Ｍを含む０．１Ｍ燐酸塩（ｐＨ７，０）洗
浄液中に浸漬し、溶媒の先端が４の上昇するまで保持す
る。ディスクを取シ出し、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ　
（ｐＨ２゜２　）　１　ａｔを含む管中に入れる。３０
分間振盪した後、溶液５００μｔ”ｆ（シンチレーショ
ンカクテル１９ｍｇ中に溶かし、１分間読む。結果はｃ
ｐｍで、モルフインＯについて４８８６１．モルフイン
１００　ｎ＃について１８４４１．モルフイン２．００
０μｇについては１７８１である。

連続試験では、装置を溶媒の先端がストリ、ｆを２ｃｍ
上昇するのに充分な時間試料中に浸漬する。

次に、装置を試料から取シ出し、０．１％トライトン（
Ｔｒｉｔｏｎ　）Ｘ−１０１及び０．２　Ｍ　ＮａＣｔ
ｔ訪０．１Ｍ燐酸塩緩衝１（ｐＨ７，０）中に”　２５
Ｉ　−ＨＲＰモルフイン２０μ１１ｍ１　ｆ含む溶液中
に浸漬し、溶媒の先端が３ｃｒｎ移動する１で維持する
。次に、装置を取シ出し、０１係トライトンＸ−１０１
及び０、２　Ｍ　ＮａＣｔを含む０．１Ｍ燐酸塩緩衝液
（ｐＨ７，０）中に浸漬し、溶媒の先端が４ｃｒｎ移動
する壕で保持する。装置のディスクを有する部分を切断
し、１分間ガンマ線カウンターで読む。結果は下記のと
おシであシ、その第一の数値はモルフインの濃度（ｎ９
７ｍ１　）、第二の数値はｃｐｍである：０．７１８７
；１００，２６９０；２．０００．１７５５゜緩Ｓ蔽中
にトライトンを含捷ないことを除いて試験を繰り返すと
、０．１００及び２．　ＯＯＯｎｇ／ｍｔに対する結果
はそれぞれ６２４０　；２７１７及び２０３０であった
。

前記の結果から、結果を妨害することなく種々のマトリ
、クスを試験しうろことは明らかである。

結果は、肉眼で、または濃度計或いはシンチレーション
カウンターのような装置によって分析することができる
。結果は迅速に得られ、モルフインＯと１ｏｏｎθ／ｒ
ｎｌｉたはそれ以下の間で鮮明に区別しうる。

本発明によれば、簡単な迅速技術が提供され、これによ
りリガンド及びそのレセプターを種々の技術を使用して
定性的または定量的に測定しうる。

１工程を含めて種々の工程数のプロトコルを分析物の測
定に使用することができる。更に、試薬測定数を最小に
し、素人の容易に使用しうる測定手段が得られる。

本発明を、理解を明確にするため説明及び実施例に基づ
いて詳細に記載したが、特許請求の範囲内で変化変更を
行ないうろことは明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図はアッセイ装置の平面図、第２図は第１図のアッ
セイ装置の２−２線拡大断面図、第３図は試料試験スト
リップ及び標準試験スト＋）、７″を有するアッセイ装
置の平面図、第４図は第３図のアッセイ装置の４−４線
断面図、第５図は本発明の別の実施態様の部分断面正面
図である。 １０．５０・・・試験ストリップ装置、１２　、１００
・封入容器、１４．７０．７２，１１４・・・ストリ、
、、ｆ、５２・・・試料試験ス）す、７’、５４・・・
標準ストリップ、６４゜６６．１０４・・・免疫吸着帯
域。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、吸収性支持体の少なくとも１部に免疫対の一構成員
   （ｍｉｐと称する）を非拡散性に結合して含む免疫吸着
   部材、及びイムノアッセイの期間中該免疫吸着部材と固
   定された液体受理関係にありそしてそこから横方向にの
   びる吸収性物質を含んで成る液体吸収部材を有し、前記
   免疫吸着部材の周囲で前記液体吸収部材の少なくとも１
   部が不透過性包囲容器に包まれていて、前記免疫吸着部
   材を通してでなければ各溶液と接触しないようになって
   おり、前記免疫吸着部材が前記液体吸収部材に比べて相
   対的に小さい液体保有能を有することを特徴とするイム
   ノアッセイ装置。 ２、前記免疫吸着部材及び前記液体吸収部材が単一のス
   トリップであり、前記免疫吸着部材がその単一ストリッ
   プの端部にある特許請求の範囲第１項記載の装置。 ３、前記免疫吸着部材が前記の液体吸収部材の一部の上
   の層である特許請求の範囲第１項記載の装置。 ４、前記免疫吸着部材に酵素が含まれている特許請求の
   範囲第１項、第２項または第３項記載の装置。 ５、前記ｍｉｐに対応ｍｉｐの標識型が結合し、前記支
   持体に結合した前記ｍｉｐの結合部を実質的に全部飽和
   する特許請求の範囲第１項、第２項または第３項記載の
   装置。 ６、（１）免疫吸着部材、 （２）液体吸収部材、 （３）非透過性バリヤーを有し、 前記免疫吸着部材が装置への液体入口として作用し、少
   なくとも２つの帯域を有し、第一帯域は吸収性層であっ
   て免疫対の構成員（ｍｉｐと称する）が非拡散性に結合
   しており、そして第二帯域は該吸収層と前記液体吸収部
   材との間にあって、前記吸収層とは異る流動抵抗性を有
   し、 前記液体吸収部材がイムノアッセイ期間中前記免疫吸着
   帯域と固定された液体受理関係にある吸収性層から構成
   されており、そこから横方向に伸びており、前記免疫吸
   着部材が前記液体吸収部材に比べて相対的に小さい液体
   保有能を有し、前記非透過性バリヤーが前記液体吸収部
   材及び免疫吸着部材の周囲の非透過性層を構成し、前記
   免疫吸着部材を通してでなければ液体を装置に侵入させ
   ないことを特徴とするイムノアッセイ用装置。 ７、前記の第二帯域が液体の流動に対して実質的な抵抗
   を示さない特許請求の範囲第６項記載の装置。 ８、吸収性支持体の少なくとも１部に免疫対の一構成員
   （ｍｉｐと称する）を非拡散性に結合して含む免疫吸着
   部材、及びイムノアッセイの期間中該免疫吸着部材と固
   定された液体受理関係にありそしてそこから横方向にの
   びる吸収性物質を含んで成る液体吸収部材を有し、前記
   免疫吸着部材の周囲で前記液体吸収部材の少なくとも１
   部が不透過性包囲容器中に封入されて、前記免疫吸着部
   材を通してでなければ各溶液と接触しないようになって
   おり、前記免疫吸着部材が前記液体吸収部材に比べて相
   対的に小さい液体保有能を有することを特徴とするイム
   ノアッセイ用装置：並びにこのアッセイ装置とは別個の
   標識ｍｉｐ； を有するイムノアッセイキット。 ９、前記標識が酵素であり、蛍光または可視光を吸収す
   る生成物を生じうる酵素基質を組合せて含む特許請求の
   範囲第８項記載のキット。 １０、前記の標識ｍｉｐが放射性標識ｍｉｐである特許
   請求の範囲第９項記載のキット。１１、前記免疫吸着部
   材及び前記液体吸収部材が単一のストリップであり、前
   記免疫吸着部材がその単一ストリップの端部にある特許
   請求の範囲第８項記載のイムノアッセイキット。 １２、前記免疫吸着部材が前記の液体吸収部材の一部の
   上の層である特許請求の範囲第８項記載のイムノアッセ
   イキット。 １３、前記免疫吸着部材に酵素が含まれている特許請求
   の範囲第８項、第１１項または第１２項記載のイムノア
   ッセイキット。 １４、（１）免疫吸着部材、 （２）液体吸収部材、 （３）非透過性バリヤーを有し、 前記免疫吸着部材が装置への液体入口として作用し、少
   なくとも２つの帯域を有し、第一帯域は吸収性層であっ
   て免疫対の構成員（ｍｉｐと称する）が非拡散性に結合
   しており、そして第二帯域は該吸収層と前記液体吸収部
   材との間にあって、前記吸収層とは異る流動抵抗性を有
   し、 前記液体吸収部材がイムノアッセイ期間中前記免疫吸着
   帯域と固定された液体受理関係にある吸収性層から構成
   されており、そこから横方向に伸びており、前記免疫吸
   着部材が前記液体吸収部材に比べて相対的に小さい液体
   保有能を有し、前記非透過性バリヤーが前記液体吸収部
   材及び免疫吸着部材の周囲の非透過性層を構成し、前記
   免疫吸着部材を通してでなければ液体を装置に侵入させ
   ないことを特徴とするイムノアッセイ用装置；並びに このアッセイ装置とは別個の標識ｍｉｐを有するイムノ
   アッセイキット。 １５、前記標識が酵素であり、蛍光または可視光を吸収
   する生成物を生じうる酵素基質を組合せて含む特許請求
   の範囲第１４項記載のキット。 １６、前記の標識ｍｉｐが放射性標識ｍｉｐである特許
   請求の範囲第１４項記載のキット。 １７、前記の第二帯域が液体の流動に対して実質的に非
   抵抗性である特許請求の範囲第１４項記載のキット。