JPH0560697A - スーパーオキシドアニオンの定量方法及びスーパーオキシドアニオン消去物質の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 化学発光法によってスーパーオキシドアニオ
ンを定量する方法であって、発光試薬として下式（１）
若しくは下式（２）で表わされるウミホタルルシフェリ
ン誘導体を用いることを特徴とするスーパーオキシドア
ニオンの定量方法及び化学発光法によってスーパーオキ
シドアニオン消去物質を定量する方法であって、未知量
のスーパーオキシドアニオン消去物質と既知量のスーパ
ーオキシドアニオンとを反応させた後のスーパーオキシ
ドアニオンを定量することを特徴とするスーパーオキシ
ドアニオン消去物質の定量方法。 （Ｒ_１〜Ｒ_４は、Ｈ又はＣ_１〜Ｃ_２０のアルキル基、ア
ルケニル基、アルキニル基、フェニル基、ヒドロキシフ
ェニル基、ジメトキシフェニル基、ジメチルアミノフェ
ニル基、トリメトキシフェニル基、ナフチル基、インド
リル基若しくはアラルキル基） （Ｒ_２，Ｒ_３及びＲ_５はＨ、ＯＨ又はＣ_１〜Ｃ_２０のア
ルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基若
しくはアラルキル基。ｎ_１は１〜３の整数、ｎ_２は０〜
４の整数） 【効果】 簡便且つ温和な条件下にて、高感度且つ高精
度にスーパーオキシドアニオンの定量を行え、いずれの
方法も臨床医学分野において診断薬として使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、化学発光法を利用した
スーパーオキシドアニオン及びスーパーオキシドアニオ
ン消去物質の定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】活性酸素であるスーパーオキシドアニオ
ンは、疾病との関係が深いために、臨床医学分野におい
てスーパーオキシドアニオンに関する研究が盛んに行な
われており、このためスーパーオキシドアニオンやスー
パーオキシドアニオン消去物質の定量方法の開発が求め
られている。

【０００３】前記定量方法としては、１）チトクロムＣ
法、２）化学発光法〔戸恒博子著、活性酸素（八木国
夫、中野稔監修）、医歯薬出版、８６〜９２頁（１９８
７）〕等が知られている。しかしながら、１）チトクロ
ムＣ法は、測定は容易であるが、測定条件が限定された
り、測定感度が低いという欠点を有し、また２）化学発
光法の中で、従来のウミホタルルシフェリン誘導体を用
いる方法では、チトクロムＣ法に比べれば測定感度が高
く優れた方法ではあるものの、未だ十分でなく、より高
感度な定量方法が要求されているのが現状である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、高感度、高精度に、簡便かつ温和な条件下で、スー
パーオキシドアニオンの微量定量をすることができるス
ーパーオキシドアニオンの定量方法を提供することにあ
る。

【０００５】また本発明の別の目的は、高感度、高精度
に、簡便かつ温和な条件下で、スーパーオキシドアニオ
ン消去物質の微量定量をすることができる、スーパーオ
キシドアニオン消去物質の定量方法を提供することにあ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、化学発
光法によってスーパーオキシドアニオンを定量する方法
であって、発光試薬として下記一般式化５若しくは下記
一般式化６で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体
（以下ウミホタルルシフェリン１と称す）を用いること
を特徴とするスーパーオキシドアニオンの定量方法が提
供される。

【０００７】

【化５】

【０００８】

【化６】

【０００９】また本発明によれば、化学発光法によって
スーパーオキシドアニオン消去物質を定量する方法であ
って、発光試薬として下記一般式化７若しくは下記一般
式化８で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体を用
い、未知量のスーパーオキシドアニオン消去物質と既知
量のスーパーオキシドアニオンとを反応させた後のスー
パーオキシドアニオンを定量し、算出することを特徴と
するスーパーオキシドアニオン消去物質の定量方法が提
供される。

【００１０】

【化７】

【００１１】

【化８】

【００１２】以下本発明を更に詳細に説明する。

【００１３】本発明のスーパーオキシドアニオンの定量
方法では、発光試薬として、特定のウミホタルルシフェ
リン誘導体を用いることを特徴とする。

【００１４】本発明において用いる前記特定のウミホタ
ルルシフェリン誘導体は、スーパーオキシドアニオンと
反応して発光する成分であり、前記一般式化５若しくは
化６で表わされるウミホタルルシフェリン１である。こ
の際、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄又はＲ₅の炭素数が２０を超
える場合またはｎ₁が４以上の場合には、製造が困難で
ある。

【００１５】前記一般式化５で表わされるウミホタルル
シフェリン１において、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄として
は、具体的には例えば、水素原子、メチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、
ｉ−ブチル基等のアルキル基；グアニジノエチル基、グ
アニジノプロピル基、グアニジノブチル基、グアニジノ
ペンチル基、グアニジノヘキシル基、グアニジノヘプチ
ル基等のヘテロ原子含有アルキル基；ビニル基、１−プ
ロペニル基、２−プロペニル基等のアルケニル基；エチ
ニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基等のアル
キニル基；フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ジメチ
ルアミノフェニル基、ジメトキシフェニル基、トリメト
キシフェニル基、ナフチル基、インドリル基等のヘテロ
原子含有アリール基；ベンジル基、フェネチル基等のア
ラルキル基；ヒドロキシベンジル基等のヘテロ原子を含
むアラルキル基等を好ましく挙げることができる。

【００１６】また前記一般式化６で表わされるウミホタ
ルルシフェリン１において、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₅として
は、具体的には例えば、水素原子、水酸基、メチル基、
エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチ
ル基、ｉ−ブチル基等のアルキル基；グアニジノエチル
基、グアニジノプロピル基、グアニジノブチル基、グア
ニジノペンチル基、グアニジノヘキシル基、グアニジノ
ヘプチル基等のヘテロ原子含有アルキル基；ビニル基、
１−プロペニル基、２−プロペニル基等のアルケニル
基；エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基
等のアルキニル基；フェニル基等のアリール基、ヒドロ
キシフェニル基、メトキシフェニル基、ジメチルアミノ
フェニル基、ジメトキシフェニル基、トリメトキシフェ
ニル基、ナフチル基、アントラニル基、フェナントリル
基、インドリル基等のヘテロ原子含有アリール基；ベン
ジル基、フェネチル基等のアラルキル基；ヒドロキシベ
ンジル基等のヘテロ原子を含むアラルキル基等を好まし
く挙げることができる。

【００１７】前記一般式化５で表わされるウミホタルル
シフェリン１としては、具体的には例えば、３，７−ジ
ヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン、６
−（３−インドリル）−８−（４−ヒドロキシフェニ
ル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジ
ン−３−オン、２−フェニル−３，７−ジヒドロイミダ
ゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン、６−フェニル−
３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３
−オン、２，６−ジフェニル−３，７−ジヒドロイミダ
ゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン、２，６，８−ト
リフェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］
ピラジン−３−オン、２−メチル−３，７−ジヒドロイ
ミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン、２，６−ジ
メチル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラ
ジン−３−オン、２−メチル−６−（２−ヒドロキシフ
ェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピ
ラジン−３−オン、２−メチル−６−（４−ヒドロキシ
フェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］
ピラジン−３−オン、２−メチル−６−（２，４−ジメ
トキシフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２
−ａ］ピラジン−３−オン、２−メチル−６−（２，
４，６−トリメトキシフェニル）−３，７−ジヒドロイ
ミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン、２−メチル
−６−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−３，７
−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オ
ン、２−メチル−６−（４−エトキシフェニル）−３，
７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オ
ン、２−メチル−６−（４−ｎ−プロポキシフェニル）
−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−
３−オン、２−メチル−６−（４−ｎ−ブトキシフェニ
ル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジ
ン−３−オン、２−メチル−６−（２−ナフチル）−
３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３
−オン、２−メチル−６−（３−インドリル）−３，７
−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オ
ン、２，８−ジメチル−６−フェニル−３，７−ジヒド
ロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン、２，８
−ジメチル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３，７
−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オ
ン、２，８−ジメチル−６−（３，４，５−トリメトキ
シフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−
ａ］ピラジン−３−オン、８−ベンジル−２−メチル−
６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−
ａ］ピラジン−３−オン、８−ベンジル−２−メチル−
６−（４−ヒドロキシフェニル）−３，７−ジヒドロイ
ミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン、６−（３−
インドリル）−８−（４−ヒドロキシフェニル）−２−
メチル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラ
ジン−３−オン、２−イソプロピル−８−メチル−６−
フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピ
ラジン−３−オン、２−イソプロピル−８−ベンジル−
６−（４−ヒドロキシフェニル）−３，７−ジヒドロイ
ミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン、２−イソブ
チル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，
２−ａ］ピラジン−３−オン、２−イソブチル−６−
（３−インドリル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，
２−ａ］ピラジン−３−オン、２−イソブチル−６−
（３−インドリル）−８−（１−グアニジノエチル）−
３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３
−オン、２−イソブチル−６−（３−インドリル）−８
−（１−グアニジノプロピル）−３，７−ジヒドロイミ
ダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン、２−イソブチ
ル−６−（３−インドリル）−８−（１−グアニジノブ
チル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラ
ジン−３−オン、２−イソブチル−６−（３−インドリ
ル）−８−（１−グアニジノペンチル）−３，７−ジヒ
ドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン、２−
イソブチル−６−（３−インドリル）−８−（１−グア
ニジノヘキシル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２
−ａ］ピラジン−３−オン、２−イソブチル−６−（３
−インドリル）−８−（１−グアニジノヘプチル）−
３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３
−オン、２−イソブチル−６−（３−インドリル）−８
−（１−アミノプロピル）−３，７−ジヒドロイミダゾ
［１，２−ａ］ピラジン−３−オン、２−イソブチル−
６−フェニル−８−（１−グアニジノプロピル）−３，
７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オ
ン、２−（４−ヒドロキシベンジル）−６−（４−ヒド
ロキシフェニル）−８−ベンジル−３，７−ジヒドロイ
ミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン、２−（４−
ヒドロキシベンジル）−６−（４−ジメチルアミノフェ
ニル）−８−ベンジル−３，７−ジヒドロイミダゾ
［１，２−ａ］ピラジン−３−オン、２−（４−ヒドロ
キシベンジル）−６−（４−ヒドロキシフェニル）−８
−(α−ヒドロキシベンジル）−３，７−ジヒドロイミ
ダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン、２−（４−ヒ
ドロキシベンジル）−５−（１−ヒドロキシエチル）−
６−(４−ヒドロキシフェニル）−８−ベンジル−３，
７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オ
ン等を好ましく挙げることができる。

【００１８】また前記一般式化６で表わされるウミホタ
ルルシフェリン１としては、具体的には例えば、下記構
造式化９、化１０、化１１、化１２で表わされる化合物
等を好ましく挙げることができる。

【００１９】

【化９】

【００２０】

【化１０】

【００２１】

【化１１】

【００２２】

【化１２】

【００２３】前記ウミホタルルシフェリン１の使用量
は、測定試料中に存在するスーパーオキシドアニオン１
モルに対して、好ましくは１〜１０¹⁸モルの範囲、特に
好ましくは１〜１０¹⁰モルの範囲、更には１０²〜１０⁸
モルの範囲が好ましい。前記範囲外の場合には、発光量
が著しく低下するので好ましくない。

【００２４】本発明の定量方法において定量の対象であ
るスーパーオキシドアニオンとしては、「中野稔、浅田
浩二、大柳善彦編：活性酸素、蛋白質核酸酵素臨時増
刊、共立出版、２７１７〜２８７４（１９８８）」にて
報告されているように、マクロファージや好中球等の細
胞・顆粒で産生されたスーパーオキシドアニオン、キサ
ンチンオキシダーゼやＮＡＤＰＨオキシダーゼ等の酵素
系で産生されたスーパーオキシドアニオン、自動酸化に
より産生されたスーパーオキシドアニオン、光増感反応
により産生されたスーパーオキシドアニオン、その他生
体内で産生されるスーパーオキシドアニオン等を挙げる
ことができる。

【００２５】本発明のスーパーオキシドアニオンの定量
方法を行なうには、前記スーパーオキシドアニオンと前
記ウミホタルルシフェリン１との反応による発光を、公
知の化学発光測定装置「光量子計数器（フォトンカウン
ター）」を用いて、発光スペクトルを測定することによ
り容易に定量することができる。

【００２６】前記測定を行なう際のｐＨは、一般にｐＨ
４．０〜１０の範囲が好ましい。前記ｐＨの調整は、公
知のアルカリ性から酸性の溶液または緩衝溶液等により
行なうことができる。前記溶液または緩衝溶液として
は、例えば塩酸、炭酸、酢酸、リン酸、ホウ酸水溶液、
酢酸ナトリウム緩衝液、トリスヒドロキシアミノメタン
緩衝液、コハク酸緩衝液、２−ヒドロキシ−１，２，３
−プロパントリカルボン酸緩衝液、モノフタル酸カリウ
ム緩衝液、２−（Ｎ−モルノホリノ）エタンスルホン酸
緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝
液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、イミダゾール緩衝液等
を挙げることができ、使用に際しては単独若しくは混合
物として用いることができる。

【００２７】また測定温度は一般に０〜５０℃の範囲で
あることが望ましく。特に１５〜４０℃の範囲であるこ
とが望ましい。前記温度範囲以外では、測定が困難とな
るので好ましくない。

【００２８】また本発明のスーパーオキシドアニオン消
去物質の測定方法は、発光試薬として特定のウミホタル
ルシフェリン誘導体を用い、未知量のスーパーオキシド
アニオン消去物質と既知量のスーパーオキシドアニオン
とを反応させた後のスーパーオキシドアニオンを定量
し、算出することを特徴とする。

【００２９】本発明のスーパーオキシドアニオン消去物
質の測定方法において用いる前記特定のウミホタルルシ
フェリン誘導体は、具体的には前記ウミホタルルシフェ
リン１として具体的に列挙した化合物と同様である。

【００３０】本発明のスーパーオキシドアニオン消去物
質の定量方法において、定量の対象であるスーパーオキ
シドアニオン消去物質としては、具体的には「中野稔、
浅田浩二、大柳善彦編：活性酸素、蛋白質核酸酵素臨時
増刊、共立出版、２８７５〜３０２３（１９８８）」に
記載されている、スーパーオキシドディスムターゼ、セ
ルロプラスミン等のスーパーオキシドアニオン消去酵
素、アスコルビン酸、グルタチオン、フラボノイド等を
挙げることができる。

【００３１】また既知量のスーパーオキシドアニオンを
提供するには、予め産生する量を測定したキサンチンオ
キシダーゼ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、ＮＡＤＰＨ−チ
トクロムＰ４５０還元酵素、ＮＡＤＨ脱水素酵素、グル
タチオン還元酵素等の酵素系；自動酸化系；光増感系等
のスーパーオキシドアニオンを産生する系により、提供
することができ、中でも、簡便且つ安定に一定量を提供
することができるので、酵素系が最も好ましい。

【００３２】また前記スーパーオキシドアニオン消去物
質とスーパーオキシドアニオンとを反応させた後のスー
パーオキシドアニオンを定量する方法としては、前述の
スーパーオキシドアニオンの定量方法と同様にして行な
うことができる。該反応を行なう際におけるスーパーオ
キシドアニオンの仕込み量は、測定試料中のスーパーオ
キシドアニオン消去物質に対して、過剰となる様に仕込
み、定量するのが好ましい。

【００３３】本発明のスーパーオキシドアニオン消去物
質の定量方法においては、定量したスーパーオキシドア
ニオンの量と、反応前のスーパーオキシドアニオンの量
との差を求めることにより試料中に存在するスーパーオ
キシドアニオン消去物質量を算出することができる。

【００３４】

【発明の効果】本発明のスーパーオキシドアニオンの定
量方法及びスーパーオキシドアニオン消去物質の定量方
法は、特定のウミホタルルシフェリン誘導体を発光試薬
として用いるので、簡便且つ温和な条件下にて、高感度
且つ高精度にスーパーオキシドアニオン及びスーパーオ
キシドアニオン消去物質の定量を行なうことができ、い
ずれの方法も臨床医学分野において診断薬として使用す
ることができる。

【００３５】

【実施例】以下本発明を実施例により更に詳しく説明す
るが本発明はこれらに限定されるものではない。

【００３６】

【参考例１】１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．８）０．３
ｍｌと、牛血清アルブミン溶液（０．７ｍｇ／ｍｌ）
０．７ｍｌと、ヒポキサンチン（２．５８μｍｏｌ／ｍ
ｌ）を含む０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．８）
０．０５ｍｌとを混合し、次いでこれに２００単位のキ
サンチンオキシダーゼを適当量加えた。更に精製水を加
え最終体積が３ｍｌとなるように調製を行なった。次に
３７℃にて３０分間反応させた後、紫外スペクトルにて
２９０ｎｍにおける吸光度の増加を測定し、この際３０
分間で吸光度を０．００１（２９０ｎｍ）増加させるキ
サンチンオキシダーゼ活性を１単位とした。

【００３７】

【実施例１】０．２Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．
４）中に溶解させたヒポキサンチン（２００ｎｍｏｌ／
ｍｌ）８９０μｌと、下記一般式化１３で表わされる２
−メチル−６−（２，４−ジメトキシフェニル）−３，
７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オ
ンの（１００ｎｍｏｌ／ｍｌ）水溶液１００μｌの混合
溶液に、参考例１において決定した各種単位のキサンチ
ンオキシダーゼ水溶液１０μｌを添加し、測定試料を夫
々調製した。次いで夫々の測定試料について、アロカル
ミネッセンスリーダー商品名「ＢＬＲ−２０１」（アロ
カ（株）製）を用いて、３７℃の温度で発光強度を測定
した。また発光測定時間は３０分に設定した。キサンチ
ンオキシダーゼの濃度と発光強度との関係を図１に示
す。図１の結果から明らかなように、キサンチンオキシ
ダーゼ濃度と発光濃度との間には、相関関係があること
が明らかである。即ち、スーパーオキシドアニオンの発
生量を発光により、容易に検出できることが判る。

【００３８】

【化１３】

【００３９】

【実施例２】２−メチル−６−（２，４−ジメトキシフ
ェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピ
ラジン−３−オンの（１００ｎｍｏｌ／ｍｌ）水溶液を
下記一般式化１４で示される２−メチル−６−（２，
４，６−トリメトキシフェニル）−３，７−ジヒドロイ
ミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オンの（１００ｎ
ｍｏｌ／ｍｌ）水溶液を用いた以外は実施例１と同様に
して発光の測定を行った。キサンチンオキシダーゼの濃
度と発光強度の関係を図１に示す。

【００４０】

【化１４】

【００４１】

【実施例３】２−メチル−６−（２，４−ジメトキシフ
ェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピ
ラジン−３−オンの（１００ｎｍｏｌ／ｍｌ）水溶液を
下記一般式化１５で示されるウミホタルルシフェリン誘
導体の（１００ｎｍｏｌ／ｍｌ）水溶液を用いた以外は
実施例１と同様にして発光の測定を行った。キサンチン
オキシダーゼの濃度と発光強度の関係を図１に示す。

【００４２】

【化１５】

【００４３】

【実施例４】０．２Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．
４）８９０μｌと、２−メチル−６−（２，４−ジメト
キシフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−
ａ］ピラジン−３−オンの（１００ｎｍｏｌ／ｍｌ）水
溶液１００μｌに、未知のリンパ球浮遊液１０μｌを添
加した以外は、実施例１と同様に測定を行なった。また
この際未知のリンパ球浮遊液２０種類の検定を行なっ
た。この検定で得られた発光強度を実施例１において作
成した標準直線よりキサンチンオキシダーゼ単位に換算
した。結果を図２に示す。

【００４４】

【実施例５】２−メチル−６−（２，４−ジメトキシフ
ェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピ
ラジン−３−オンの（１．０μｍｏｌ／ｍｌ）水溶液３
００μｌと、０．２Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．
４）中に溶解させたヒポキサンチン（５００μｍｏｌ／
ｍｌ）３００μｌと、２００単位のキサンチンオキシダ
ーゼを含む水溶液５０μｌと、０．３Ｍトリス−塩酸バ
ッファー（ｐＨ７．８，０．６ｍＭ ＥＤＴＡ）５００
μｌとの混合溶液に予め調製した各種濃度のスーパーオ
キシドディスムターゼ水溶液を加え、実施例１と同様に
して発光強度の測定を行なった。またこの際の最終の体
積は、精製水を加えて調製を行ない、３ｍｌとした。ス
ーパーオキシドディスムターゼの濃度と発光強度との関
係を図３に、またスーパーオキシドディスムターゼの濃
度と阻害効率との関係を図４に示す。

【００４５】

【比較例１】２−メチル−６−（２，４−ジメトキシフ
ェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピ
ラジン−３−オンを、下記化学式化１６で表わされるウ
ミホタルルシフェリン誘導体に代えた以外は、実施例１
と同様に測定した。結果を図１に示す。この結果から明
らかなように、本発明の測定方法は、感度、精度ともに
優れていることが判る。

【００４６】

【化１６】

【００４７】

【実施例６】スーパーオキシドディスムターゼの代わり
にセルロプラスミンを用いた以外は、実施例５と同様に
測定を行なった。セルロプラスミンの濃度と発光強度と
の関係を図５に、セルロプラスミンの濃度と阻害効率と
の関係を図６に示す。

【００４８】

【実施例７】スーパーオキシドディスムターゼの代わり
にアスコルビン酸を用いた以外は、実施例５と同様に測
定を行なった。アスコルビン酸の濃度と発光強度との関
係を図７に、アスコルビン酸の濃度と阻害効率との関係
を図８に示す。

【００４９】

【実施例８】２−メチル−６−（２，４−ジメトキシフ
ェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピ
ラジン−３−オンの水溶液の代わりに、下記化学式化１
７で表わされる２−メチル−６−（２，４，６−トリメ
トキシフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２
−ａ］ピラジン−３−オンの水溶液を用いた以外は、実
施例５と同様に測定を行なった。スーパーオキシドディ
スムターゼの濃度と発光強度との関係を図９に示す。

【００５０】

【化１７】

【００５１】

【実施例９】２−メチル−６−（２，４−ジメトキシフ
ェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピ
ラジン−３−オンの水溶液の代わりに、下記化学式化１
８で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体の水溶液
を用いた以外は、実施例５と同様に測定を行なった。ス
ーパーオキシドディスムターゼの濃度と発光強度との関
係を図９に示す。

【００５２】

【化１８】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１，２，３及び比較例１におけるキサン
チンオキシダーゼ濃度と発光強度との関係を示すグラフ
である。

【図２】実施例４におけるキサンチンオキシダーゼ濃度
と発光強度との関係を示すグラフである。

【図３】実施例５におけるスーパーオキシドディスムタ
ーゼの濃度と発光強度との関係を示すグラフである。

【図４】実施例５におけるスーパーオキシドディスムタ
ーゼの濃度と阻害効率との関係を示すグラフである。

【図５】実施例６におけるセルロプラスミンの濃度と発
光強度との関係を示すグラフである。

【図６】実施例６におけるセルロプラスミンの濃度と阻
害効率との関係を示すグラフである。

【図７】実施例７におけるアスコルビン酸の濃度と発光
強度との関係を示すグラフである。

【図８】実施例７におけるアスコルビン酸の濃度と阻害
効率との関係を示すグラフである。

【図９】実施例８及び９におけるスーパーオキシドディ
スムターゼの濃度と発光強度との関係を示すグラフであ
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 化学発光法によってスーパーオキシドア
   ニオンを定量する方法であって、発光試薬として下記一
   般式化１若しくは下記一般式化２で表わされるウミホタ
   ルルシフェリン誘導体を用いることを特徴とするスーパ
   ーオキシドアニオンの定量方法。 【化１】 【化２】
2. 【請求項２】 化学発光法によってスーパーオキシドア
   ニオン消去物質を定量する方法であって、発光試薬とし
   て下記一般式化３若しくは下記一般式化４で表わされる
   ウミホタルルシフェリン誘導体を用い、未知量のスーパ
   ーオキシドアニオン消去物質と既知量のスーパーオキシ
   ドアニオンとを反応させた後のスーパーオキシドアニオ
   ンを定量し、算出することを特徴とするスーパーオキシ
   ドアニオン消去物質の定量方法。 【化３】 【化４】