JPH0687793B2 - 酵素酸化によるアナライトの比色定量方法および試剤、およびそのための還元発色性電子受容体 - Google Patents

酵素酸化によるアナライトの比色定量方法および試剤、およびそのための還元発色性電子受容体

Info

Publication number
JPH0687793B2
JPH0687793B2 JP1204927A JP20492789A JPH0687793B2 JP H0687793 B2 JPH0687793 B2 JP H0687793B2 JP 1204927 A JP1204927 A JP 1204927A JP 20492789 A JP20492789 A JP 20492789A JP H0687793 B2 JPH0687793 B2 JP H0687793B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
analyte
electron acceptor
glucose
reagent
reduced
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP1204927A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH02174695A (ja
Inventor
ヨアヒム・ヘネス
Original Assignee
ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング filed Critical ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Publication of JPH02174695A publication Critical patent/JPH02174695A/ja
Publication of JPH0687793B2 publication Critical patent/JPH0687793B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01R—ELECTRICALLY-CONDUCTIVE CONNECTIONS; STRUCTURAL ASSOCIATIONS OF A PLURALITY OF MUTUALLY-INSULATED ELECTRICAL CONNECTING ELEMENTS; COUPLING DEVICES; CURRENT COLLECTORS
    • H01R13/00—Details of coupling devices of the kinds covered by groups H01R12/70 or H01R24/00 - H01R33/00
    • H01R13/73—Means for mounting coupling parts to apparatus or structures, e.g. to a wall
    • H—ELECTRICITY
    • H05—ELECTRIC TECHNIQUES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H05K—PRINTED CIRCUITS; CASINGS OR CONSTRUCTIONAL DETAILS OF ELECTRIC APPARATUS; MANUFACTURE OF ASSEMBLAGES OF ELECTRICAL COMPONENTS
    • H05K7/00—Constructional details common to different types of electric apparatus
    • H05K7/02—Arrangements of circuit components or wiring on supporting structure
    • H05K7/12—Resilient or clamping means for holding component to structure
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01R—ELECTRICALLY-CONDUCTIVE CONNECTIONS; STRUCTURAL ASSOCIATIONS OF A PLURALITY OF MUTUALLY-INSULATED ELECTRICAL CONNECTING ELEMENTS; COUPLING DEVICES; CURRENT COLLECTORS
    • H01R13/00—Details of coupling devices of the kinds covered by groups H01R12/70 or H01R24/00 - H01R33/00
    • H01R13/46—Bases; Cases

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microelectronics & Electronic Packaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、電子受容体の存在においてアナライト（Anal
yten）を酵素酸化し、アナライトの量の尺度として還元
された電子受容体を発色により定量することによるアナ
ライトの比色定量方法に関する。
さらに、本発明は、オキシドレダクターゼおよび発色性
電子受容体を含有する、アナライトの酵素酸化によるア
ナライトの比色定量試剤に関する。
本発明は、殊にアナライト／オキシダーゼ系またはアナ
ライト/NAD（Ｐ）非依存性デヒドロゲナーゼ系の直接電
子受容体として、芳香族ニトロソ化合物群からの物質の
使用にも及ぶ。
〔従来の技術〕
酵素酸化は、分析術において種々の試料中の物質の検出
および定量が可能となる。この場合、酸化酵素は酸化反
応の電子を収容する受容体の存在で相応する酵素基質に
対して作用する。電子受容体の還元は、酵素基質の存在
を指示する。この場合、還元された電子受容体を発色に
より検出しうるのが、従来とくに有利であることが立証
されている。それというのもこれは必然的に高価な測定
装置を用いた場合にだけ可能ではなく、場合によつては
視覚により行なうこともできるからである。
酸化酵素を用いる物質の公知比色定量法は、オキシダー
ゼまたはデヒドロゲナーゼを使用する。双方の酵素群
は、オキシドレダクターゼの主族に属する（Roempps Ch
emie-Lexikon,Franckh出版代理店、ストツトガルト、８
版（1985年）、第４巻、第2952頁;Lexikon Biochemie,H
rsg.H.D.Jakubke,Chemie出版、ワインハイム、第２版
（1981年）、第194頁）、その構成員はその天然の電子
受容体に従つて区別することができる。分析物の比色定
量のためオキシダーゼ使用の先行技術の代表的なもの
は、クンスト（A.Kunst）等により“メソーズ・イン・
エンチマテイツク・アナリシス（Methods in enzymatic
analysis）”（Hrsg.H.U.Bergmeyer,Chemie出版、ワイ
ンハイム）、第３版（1984年）、第６巻、第178〜185頁
に引用されている。ここでは、血清、血漿または脱タン
パク血液中のグルコースが、水溶液中でのグリコース・
オキシダーゼとの反応および空気酸化によつて、この反
応の際酸素の還元により生成した過酸化水素がペルオキ
シダーゼの存在で、同様に反応混合物中に存在するフエ
ノールおよび４−アミノフエナゾンに対して酸化的、従
つて発色的に作用することにより検出される。この文献
自体には、誤差源として、アスコルビン酸、尿酸または
グルタチオンのような還元作用物質の存在が挙げられ
る。さらに、遷移金属イオン、または血液からの試料中
に容易に出現しうるヘムおよびヘムタンパク質も不利な
作用をする。それというのもこれらは過酸化水素を分解
するからである。過酸化水素およびペルオキシダーゼお
よび場合により検出試薬中に含有されている他の物質、
たとえばフエノールまたは４−アミノフエナゾンで発色
する試料内容物も、不正な結果を生じうる。かかる物質
は、たとえばビリルビンまたはα−メチルドーパのよう
な医薬であつてもよく、これらは完全に血液から誘導さ
れた試料または尿中に出現しうる。
ジーデル（J.Siedel）等は、“メソーズ・イン・エンチ
マテイツク・アナリシス（Methods in enzymatic analy
sis）”（Hrsg.H.U.Bergmeyer,Chemie出版、ワインハイ
ム）、第３版（1984年）、第８巻、第139〜第148頁に、
血清または血漿中の全コレステリンの比色定量を、まず
エステル結合しているコレステリンをコレステリンエス
テラーゼで遊離させるように記載している。次いで、コ
レステリンを、コレステリンオキシダーゼおよび空気中
酸素と水溶液中で反応させて定量し、この反応の際に生
成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在で、同様
に、反応混合物中に存在するフエノールおよび４−アミ
ノアンチピリンに対して酸化的、それと共に発色的に作
用する。発色は試料中の全コレステリン量の尺度であ
る。
オキシダーゼを用いてグルコースを定量する上記の方法
につき記載されたすべての欠点は、同程度に、記載され
たコレステリン定量法にも該当する。これらの欠点は、
検出反応を、たとえばヨーロツパ特許出願公開第001638
7号、西ドイツ国特許出願公開第3247608号、ヨーロツパ
特許出願公開第0262445号またはヨーロツパ特許出願公
開第0256806号から公知であるようなキユベツト中また
は乾式試薬担体上で実施するか否とは無関係である。殊
に、上記定量法をいわゆる乾式試験で固形担体上で実施
する場合、酸素必要量が付加的に不利であると立証され
た。なかんずく、高濃度の酵素基質の酸化のために多量
の酸素が使用されるときは、空気から反応媒体中への酸
素の拡散が速度決定工程になりかつ長い反応時間を生じ
るか、または殊に動的測定法の場合には不正な結果を生
じうる。
デヒドロゲナーゼは全く一般的に、酵素基質の酸化にニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（NAD）また
はニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・リン酸
（NADP）を自然の直接電子受容体として必要とするよう
なものと、NAD−またはNADP−非依存性であつて、酵素
酸化反応の際に自然の直接電子受容体以外の物質を使用
するものとに分けることができる。
比色測定にデヒドロゲナーゼを使用することは、たとえ
ば西ドイツ国特許出願公開第2147466号から公知であ
る。ここには、ラクテートをラクテート・デヒドロゲナ
ーゼの触媒作用下にニコチンアミド・アデニン・ジヌク
レチオドと反応させて、ピルベートおよび還元されたニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドにすることが
記載されている。生成したNADHは、次いでたとえば酵素
ジアホラーゼの存在でテトラゾリウム塩と、NADおよび
有色ホルマザンの生成下に反応させ、その濃度を光度測
定によつて定量することができる。ジアホラーゼの代り
に、NADHからテトラゾリウム塩への電子の移動のための
還元触媒としてＮ−メチルフエナジニウム・メトサルフ
エートも挙げられている。
この方法の欠点は、NADHの代りに、場合によりたとえば
血液、血清、血漿または尿のような生物試料中に出現す
る、グルタチオンのような他の還元性物質またはメチル
ドーバまたはドベスレート（Dobesylat）のような薬
を、ジアホラーゼまたはＮ−メチルフエナジニウム・メ
トサルフエートテトラゾリウム塩のような還元触媒の存
在で相応するホルマザンに変え、こうしてプラスの不正
な結果を生じる点に認められる。
さらに、アナライトの酸化によつて遊離する電子をアナ
ライト／酵素系から発色に役立つ電子受容体の系に伝達
するために、ジアホラーゼまたはフエナジニウムメトサ
ルフエートのような還元触媒が必要であることも、これ
により他は同じ条件下で還元されず、マイナスの不正な
結果を生じる他の試料随伴物質も還元されるという欠点
を内包する。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は、上述した先行技術の欠点の救済策を講じる。
殊に、本発明の課題は、殊に生物学的液体の分析のた
め、電子受容体の存在でアナライトを酵素酸化し、アナ
ライトの量の尺度として発色により電子受容体を定量す
る、アナライトの比色定量法であつて、試料、殊に血液
により同伴される液体、たとえば血清のような生物学的
試料中または尿中の、殊に過酸化水素を分解する還元性
同伴物質が妨害せず、ジアホラーゼまたはＮ−メチルフ
エナジニウムメトサルフエートのような還元触媒の使用
を回避し、その代りに酸素を必要とせず、かつこれによ
つて高い基質濃度において迅速な発色最終値を可能にす
る方法を提供することである。
さらに、オキシドレダクターゼおよび発色電子受容体を
含有する、前記方法の実施に適当な、アナライトの比色
定量試剤も利用されるべきである。
詳細には課題は、上記のような改良された定量法および
定量試剤用の発色性電子受容体として使用することので
きるような物質の選択にも及ぶ。
〔課題を解決するための手段〕
この課題は、特許請求の範囲に記載された発明によつて
解決される。
これによれば、アナライトを電子受容体の存在で酵素酸
化し、アナライトの量の尺度として発色により還元され
た電子受容体を定量する、アナライトを還元発色性電子
受容体としての芳香族ニトロソ化合物または互変異性体
の等価オキシムの存在でフラビン依存性オキシダーゼま
たはPQQ依存性デヒドロゲナーゼを用いて酸化すること
を特徴とするアナライトの比色定量法が見出された。
さらに、フラビン依存性オキシダーゼまたはPQQ依存性
デヒドロゲナーゼおよび還元発色性電子受容体を含有す
るアナライトの酵素酸化によるアナライトの比色定量試
剤であって、発色性電子受容体がアナライト／酵素系と
直接に反応する芳香族ニトロソ化合物であることを特徴
とするアナライトの比色定量試剤が見出された。
殊に、フラビン依存性オキシダーゼまたはPQQ依存性デ
ヒドロゲナーゼを含有するアナライト／酵素系の還元発
色性電子受容体として芳香族ニトロソ化合物の使用がと
くに適当であることが見出された。
本発明によれば、“アナライト”とは酵素により酸化さ
れるような物質を表わす。多くの場合、アナライトは、
検査すべき試料中で直接に検出または定量されるような
物質である。たとえば、グルコースは直接にグルコース
オキシダーゼで酸化し、比色法で定量することができ
る。しかし、アナライトを、他の物質から前接された１
つまたは幾つかの反応によつてはじめて生成させ、こう
してアナライトの存在および濃度から間接的に出発物質
の存在および濃度を推論することも可能である。たとえ
ばグリセリンは、最初の反応でグリセリンをグリセリン
キナーゼおよびアデノシン三リン酸を用いてグリセリン
−３−リン酸とアデノシン二リン酸とに変え、引き続き
第二反応でグリセリン−３−リン酸をグリセリン−３−
リン酸オキシダーゼで酸化するようにして検出し、定量
することができる。この場合、グリセリン−３−リン酸
はアナライトであつて、その濃度は定量すべき物質、つ
まりグリセリンの濃度に一致する。しかし、アナライト
はこの場合でも、比色定量されるような化合物である。
本発明においてアナライトは、それぞれの酸化酵素の基
質として受容されるような物質である。アナライトを酸
化するためには、酵素の共同作用下にアナライトから電
子を受け取る電子受容体が同時に添加されていなければ
ならない。
発色性電子受容体における“発色”とは、電子受容体が
還元後に直接にそれ自体がアナライトの酵素酸化前と異
なる色で存在するか、または還元された受容体自体が直
接に色素を生成しないが、連続または逐次反応で因果的
に反応混合物の変色を生じることを表わす。この場合変
色は、無色から有色への変換ならびに１つの色から他の
色への変換を包含する。連続反応による発色には専門家
に多数の方法が公知であり、それから条件に応じて選択
することができる。たとえば、還元された電子受容体自
体が有色化合物の部分になるような反応、たとえば酸化
的カツプリング反応が挙げられる。発色的逐次反応は、
還元された電子受容体が他の物質に対するその還元作用
によつて該物質を変色するようなものであつてもよい。
酸化段階とは、中性の分子または電荷を有する錯イオン
であつてもよい化合物中の特定原子の酸化状態を示す数
値を表わす。専門家には、酸化段階を確かめる手段は公
知である。この数値を確かめるための指針は化学の基本
的教科書、たとえば“アンオルガニツシエ・ヒエミー
（Anorganische Chemie）”（Hofmann ＆ Ruedorff.F.V
ieweg ＆ Sohn出版、ブラウンシユバイク）、第20版（1
969年）、第216〜第218頁；“レールブウフ・デル・ア
ンオルガニツシエン・ヒエミー（Lehrbuchder anorgani
schen Chemie）”（Hollemann-Wiberg,Walter de Gruyt
er ＆ Co.出版、ベルリン）、第71〜第80版（1971
年）、第197〜第199頁、または“アンオルガニクム（An
organikum）”（Hrsg.L.Kolditz,VEB Deutscher科学出
版、ベルリン）、第４版（1972年）、第446頁から認め
られる。
低級アルキルおよび低級アルコキシは炭素原子数１〜５
の基である。とくに望ましいのはメチルないしはメトキ
シである。
低級アルキルカルボニルとは、アルキル基に１〜５個の
炭素原子を有するような基を表わす。とくに望ましいの
はアセチルである。
酵素酸化の際電子受容体として一般式Ｉの上記ベンゾフ
ロキサンを使用する場合、無色化合物は有色化合物に還
元される。大体において、オレンジ色の化合物の生成が
行なわれる。
本発明方法には、アナライトの酵素酸化に対する直接呈
色指示薬として上記の芳香族Ｎ−オキシドを使用するこ
とができる。このためには、酸化酵素を芳香族Ｎ−オキ
シドと一緒に検査すべき試料と接触させる。試料が、酵
素によつて酸化されうるアナライトを含有する場合に
は、該Ｎ−オキシドは、還元によつてその色が変わり、
こうして試料中のアナライトの存在を指示する電子受容
体として使用される。新たに生成した色の濃さから、試
料中のアナライトの濃度を推測することができる。
アナライトを比色定量するための本発明方法に使用でき
る適当なニトロソ化合物は、望ましくは、ニトロソ基を
芳香族基に結合して含有するようなものである。
とくに望ましいのは、ニトロソベンゾールおよびニトロ
ソベンゾール誘導体のような炭素芳香族ニトロソ化合物
である。この場合、ニトロソベンゾール誘導体として
は、還元によつてさきの説明の意味での発色のために使
用することのできるような化合物に変わるすべてのニト
ロソベンゾール誘導体が極めて好適である。
ニトロソベンゾールおよびニトロソベンゾール誘導体は
一般に僅かに有色の、黄、緑または褐色に着色してお
り、還元状態では着色されてない物質である。従つてこ
のものは、アナライトを比色法で検出できるようにする
ためには、逐次反応で発色させねばならない。これはた
とえば、還元されたニトロソ化合物を他の物質と反応さ
せ、還元されたニトロソ化合物を部分構造として含有す
る有色物質が得られるようにすることによつて達成する
ことができる。
酸化カツプリング反応は、この種の発色の１方法であ
る。それ故、本発明方法にとり、酸化酵素の電子受容体
として作用するだけでなく、還元状態でも酸化カツプリ
ング反応に使用しうるようなニトロソベンゾール誘導体
が適当である。
とくに望ましいのは一般式Ｉのニトロソベンゾール誘導
体である： 式中、Ｒはヒドロキシ基またはアミノ基を表わし、その
際アミノ基は１個または２個の低級アルキルによつて置
換されていてもよく、低級アルキル基それ自体は１個の
ヒドロキシ基、１個または数個の低級アルキルによつて
置換されたアミノ基、PO3H2、SO3HまたはCO2Hによつて置
換されていてもよい。
好適なのは、殊に弱揮発性であるような一般式Ｉのニト
ロソベンゾール誘導体である。
上記の定義において低級アルキルは、炭素原子数１〜５
のアルキル基を表わす。とくに望ましいのはメチルおよ
びエチルである。
酸残基PO3H2、SO3HおよびCO2Hは、そのものとしてまたは
塩の形でアンモニウム塩、アルカリ金属塩またはアルカ
リ土類金属塩として存在しうる。アンモニウム塩は、非
置換のアンモニウムカチオンNH4 +を含有するもの、また
は１個または数個の低級アルキル、アリールまたは／お
よび低級アルキルアリールによつて置換されたアンモニ
ウムカチオンを含有するものである。低級アルキルはそ
れぞれ炭素原子数１〜５のアルキル基を表わす。アリー
ル基は、炭素原子数６〜10の芳香族環系である。
低級アルキルとしてはメチルおよびエチルが有効に使用
される。望ましいアリール基はフエニルであり、この場
合ベンジルは望ましい低級アルキルアリール基である。
本発明方法の電子受容体としては、ｐ−ヒドロキシ−ニ
トロソベンゾール、ｐ−ジメチルアミノ−ニトロソベン
ゾール、ｐ−ジエチルアミノ−ニトロソベンゾールおよ
びｐ−ジヒドロキシエチルアミノ−ニトロソベンゾール
がとくに好適である。
上述したように、本発明方法にとり望ましくは、窒素が
＋１の酸化段階にあるニトロソベンゾールまたはニトロ
ソベンゾール誘導体を、検出すべき試料および酸化酵素
と接触させる。酵素基質として受容される試料中にアナ
ライトが存在する場合、ニトロソベンゾールまたはニト
ロソベンゾール誘導体は電子受容体として働き、これに
より相応するアミンに還元される。一般に、ニトロソ化
合物単独の還元はアナライトの比色定量には十分ではな
い。それというのも減色が生じるだけかまたは変色が弱
く認めうるにすぎないからである。還元された電子受容
体は酸化カツプリング反応の出発物質として使用でき、
この場合カツプリング成分の選択により極めて種々の色
を得ることができる。
酸化カツプリング反応は専門家に公知であり、たとえば
ヨーロツパ特許出願公開第0175250号またはヒユニヒ
（H.Huenig）等（“Angewandte Chemie"第70巻、第215
〜第222頁（1958年））に記載されている。一般に、酸
化カツプリングはしばしば染料の製造のために適用され
る。この点で酸化カツプリングは、電子富有芳香族化合
物と酸化可能カツプリング成分との間の反応で、たとえ
ばヘキサシアノ鉄（III）酸ナトリウムまたは−カリウ
ム、銅塩、水銀塩、塩化鉄（III）、二酸化鉛、過酸化
水素、テトラ酢酸鉛、過硫酸のナトリウム塩またはカリ
ウム塩、過酢酸、過ヨウ素酸またはクロラミンＴのよう
な酸化剤の存在で経過する反応と把握することができ
る。西ドイツ国特許出願公開第3331588号によれば、酸
化剤としてオキシダーゼも使用できる。上記のニトロソ
ベンゾールは、その還元状態では、酵素酸化における電
子受容体として作用した後に、酸化カツプリング反応の
酸化性カツプリング成分として利用される化合物であ
る。このためには、還元によつて生じたアミンを、上記
に例示したような酸化剤により酸化して、同時に反応混
合物中に存在する電子富有カツプリング成分と共に染料
を生成させることができる。
専門家にとり多数の電子富有カツプリング成分が利用で
きる。これらのカツプリング成分は、カツプリング生成
物の所望の色により選択しうる。例は芳香族アミン、フ
エノールまたはメチレン活性化合物である。とくに望ま
しい化合物は、アニリン群、たとえばＮ−メチルアント
ラニル酸およびヨーロツパ特許出願公開第0175250号に
挙げられているアニリノホスホン酸から選択することが
できる。
発色により還元された電子受容体を定量するためのもう
１つの方法は、ニトロソ化合物の場合、還元されたニト
ロソ化合物を、それ自体酸化された形から還元された形
へのこの移行に基づき発色する他の物質によつて酸化す
ることであり、その際ここでも発色とは１つの色から他
の色へ、同様に無色状態から有色状態への変移を表わす
ものとする。かかる発色反応の例は、たとえば還元され
た電子受容体の金属塩による酸化であり、この場合該金
属塩は低い酸化段階の金属を有する有色金属塩または場
合により全部が中性の金属に還元される。銅（II）塩
は、たとえば赤色の銅（Ｉ）塩に変え、銀塩は金属の銀
に変えることができる。リンモリブデン酸塩をモリブデ
ンブルーに還元することも可能である。
芳香族ニトロソ化合物の代りに、本発明方法には、酵素
酸化の電子受容体として芳香族オキシムを使用すること
もできる。ニトロソ化合物は、オキシムと互変異性体平
衡にあることができる。これは殊に、このためにニトロ
ソ基に対してα位にある１個の水素原子が利用しうるか または電子および陽子の相応する非局在化が可能である
ときである。
酵素酸化反応において電子受容体として働くニトロソ化
合物と共に、ニトロソ／オキシムの互変異性体平衡にあ
ることのできるオキシムも同様に本発明方法において使
用しうることが見出された。これは殊に、一般式IIのオ
キシムにあてはまる： 式中、Ｒ′は酸素、別のオキシム基または正電荷を有す
るアミノ基を表わし、その際アミノ基は１個または２個
の低級アルキル基によつて置換されていてもよく、低級
アルキル基自体はヒドロキシ基、１個または２個の低級
アルキル基によつて置換されたアミノ基、PO3H2、CO2Hま
たはSO3Hによつて置換されていてもよい。
上記の定義において、低級アルキル基は炭素原子数１〜
５のアルキル基を表わす。とくに望ましいのはメチルお
よびエチルである。
酸基PO3H2、SO3HおよびCO2Hはそのものとしてまたは塩の
形でアンモニウム塩、アルカリ金属塩またはアルカリ土
類金属塩として存在しうる。
アンモニウム塩は、非置換のアンモニウムカチオンNH4 +
を含有しているものまたは１個または数個の低級アルキ
ル、アリールまたは／および低級アルキルアリールによ
つて置換されたアンモニウムカチオンを含有しているも
のである。低級アルキルはそれぞれ炭素原子数１〜５の
アルキル基を表わす。アリール基は炭素原子数６〜10の
芳香族環系である。低級アルキルとしては、メチルおよ
びエチルが望ましい。望ましいアリール基はフエニルで
あり、この場合ベンジルが望ましい低級アルキルアリー
ル基である。
かかるオキシム中の窒素は酸化段階−１を有する。
ニトロソベンゾールと同様に、一般式IIのオキシムも無
色の物質であるかまたは還元された状態では着色してな
い着色物質である。本発明方法において電子受容体とし
てのニトロソベンゾールにつき上述したように、芳香族
オキシムも電子受容体としてのその機能に従い発色させ
ることもできる。ニトロソ化合物ならびにオキシムも、
還元し尽された場合にはアミンを生じる。本発明方法に
おいて、電子受容体としてのオキシムに対し、ニトロソ
化合物と同じ逐次反応を発色のために使用できる。
意外にも、これらの物質は、酸化酵素としてオキシダー
ゼまたはPQQ依存性デヒドロゲナーゼを使用する場合に
有利であることが見出された。かかる酵素をアナライト
の酸化に使用する場合、アナライト／酵素系から上記の
発色性電子受容体への電子伝達は直接に、つまり還元触
媒を一緒に使用することなく行なうことができる。この
点で、アナライト／酵素系とは、酸化反応に必要な、ア
ナライトと酸化酵素、ならびに場合により酸化に通常必
要な、酵素と協同作用する補酵素および／または補因
子、たとえば金属塩からなる組合せと解される。
本発明方法にはフラビン依存性オキシダーゼがとくに望
ましい。例はＬ−およびＤ−アミノ酸オキシダーゼ、コ
レステリンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グ
リセリン−３−リン酸オキシダーゼ、ラクテートオキシ
ダーゼおよびピルベートオキシダーゼである。本発明に
よりとくに適当なオキシダーゼは、グルコースオキシダ
ーゼ、グリセリン−３−リン酸オキシダーゼ、ラクテー
トオキシダーゼおよびピルベートオキシダーゼである。
PQQ依存性デヒドロゲナーゼのうち、ピロロキノリン・
キノン（PQQ）依存性デヒドロゲナーゼが本発明方法に
とくに有利に使用できる。殊にグルコースデヒドロゲナ
ーゼが、発色性電子受容体として芳香族ニトロソ化合物
および互変異性体の等価オキシムの存在でのグルコース
の比色定量のために好適である。同様に、エタノールの
ようなアルコールの定量のためにNAD（Ｐ）非依存性ア
ルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。
本発明方法は、検査すべき試料を、適当なオキシドレダ
クターゼおよび上記の発色性電子受容体の１つまたは幾
つかと接触させるように実施される。試料が、オキシド
レダクターゼにより酸化されるアナライトを含有する場
合には、発色性電子受容体は還元される。還元された電
子受容体がそれの酸化された形の、もとの電子受容体と
異なる色を有するか、または電子受容体が酵素酸化過程
によつて無色状態から着色状態に変わる場合には、生成
した色の濃さを直接に視覚により、場合によつては比較
色によるかまたは光度測定により試料中のアナライトの
濃度と相関させることができる。還元された電子受容体
の色が大体においてはじめに使用された電子受容体の色
と同じであるか、または退色または完全な脱色が生じる
場合には、酵素酸化反応に、濃さを視覚によるかまたは
光度測定により同様に試料中のアナライトの濃度を確か
めることのできる色を生じる逐次反応を接続する。
本方法は、いわゆる湿式試験として、たとえばキユベツ
ト中で、またはいわゆる乾式試験として相応する試薬支
持体上で実施することができ、この場合必要な試験試薬
は固形支持体、殊に吸収性または膨潤可能材料上に存在
する。かかる試薬支持体はたとえばヨーロツパ特許出願
公開第0016387号、西ドイツ国特許出願公開第3247608
号、ヨーロツパ特許出願公開第0262445号またはヨーロ
ツパ特許出願公開第0256806号から公知である。
特許請求の範囲に記載されているような、本発明方法を
実施するためのアナライトの比色定量試剤も、同様に本
発明の対象である。かかる試剤は、定量すべきアナライ
トの酵素酸化に必要なオキシドレダクターゼのほかに、
酸化の際に遊離する電子を直接にアナライト／酵素系か
ら引受ける発色性電子受容体を含有する。酸化酵素およ
び発色性電子受容体としては上記に本発明方法につき記
載した物質が使用される。
本方法の実施に適当なpH値（殊に使用すべき酵素によ
る）を維持するために、本発明による試剤は緩衝系を含
有する。さらに、たとえば湿潤剤、安定剤等のような、
かかる試剤に通常使用される他の適当な添加剤を含有し
うる。電子受容体の酸化が測定可能な変色を生じない場
合には、本発明によるアナライトの比色定量試剤はもち
ろん逐次反応に必要な試薬を含有する。
本発明による試剤は、溶液の形で存在するかまたは吸収
性または膨潤可能な支持体上に塗布されて存在していて
もよい。溶液の形では、試剤は望ましくは本発明方法に
必要な全試薬を含有する。溶媒としては、水、水溶性有
機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、アセトンま
たはジメチルホルムアミド、または水とこれら有機溶媒
からなる混合物が挙げられる。保存上の理由からは、試
験に必要な試薬を２つまたは幾つかの溶液に分け、本来
の検査の際にはじめて混合するのが有利である。これは
殊に、アナライトの酸化後、還元された電子受容体を逐
次反応、たとえば酸化カツプリング反応でさらに反応さ
せる場合がこれに該当する。本発明による試剤中で使用
される電子受容体の代表的濃度は、0.01〜100ミリモル/
l、望ましくは0.1〜25ミリモル/lである。逐次反応用試
薬は、電子受容体に対し少なくとも化学量論的割合で、
望ましくは過剰に、殊に２〜10倍過剰に使用される。
本発明による試剤は、試験細片の形で存在しうる。かか
る試験細片は多種の構成が、たとえばヨーロツパ特許出
願公開A0016387号、ヨーロツパ特許出願公開A3247608
号、ヨーロツパ特許出願公開Ａ−0262445号、またはヨ
ーロツパ特許出願公開Ａ−0256806号から公知である。
すべてに共通なのは、定量法の実施に必要な試薬が固形
の支持層上に存在することである。支持層としては、殊
に検査すべき試料液により濡らされる吸収性および／ま
たは膨潤可能材料が挙げられる。例はゼラチン、セルロ
ースまたは人造繊維フリースである。これら支持体材料
中または材料上に、試薬は固形で存在する。
試験細片上に試料液を塗布するかまたは試薬細片を試料
液中へ浸漬する場合に、細片中に液体環境が構成し、そ
の内部で検出反応が経過する。反応によつて惹起される
発色は視覚によるかまたは光度計、たとえば反射光度計
で評価することができる。
本発明の特殊な対象は、アナライト／オキシドレダクタ
ーゼ系の直接電子受容体として、芳香族ニトロソ化合物
および互変異性体の等価オキシム群からの物質を使用す
ることに関する。この点で、アナライト／オキシドレダ
クターゼ系と認められるのは、アナライトと酸化酵素な
らびに場合により酸化に当然必要な、酵素と協同作用す
るフラビンまたはPQQのような補酵素または／およびた
とえば金属塩のような補因子からなる、酵素酸化反応に
必要な組合せである。ニトロソ化合物、Ｎ−オキシドお
よびオキシムの群からの物質は、一般にオキシドレダク
ターゼによるアナライトの酸化の際に使用しうることが
見出された。
本発明は、発色電子受容体の還元のためにジアホラーゼ
またはＮ−メチルフエナジニウムメトスルフエートのよ
うな還元触媒を必要としないという利点を提供する。そ
の還元は、直接にアナライト／酵素系によつて行なうこ
とができる。こうして場合により不利な副反応をさける
ことができる。
殊に、アナライトの酵素酸化のためオキシダーゼを使用
する場合に、本発明による化合物の使用によつて、比色
定量法の前駆物質としての過酸化水素の生成がさけられ
る。これにより、還元作用を有する化合物の不利な影響
が除去または減少される。
最後に、本発明により使用される化合物は、空中酸素の
進入が制限されているかまたは不所望のところでは何処
でも真の二者択一性を提供する。酸素は、酵素酸化にお
ける電子受容体としてこれらの化合物によつて代えるこ
とができる。これは、試験細片の形の本発明による試剤
の場合に極めて有利である。これは従来殊に高いアナラ
イト濃度の場合、オキシダーゼによる酵素酸化の際に空
気中酸素が試験細片上に塗布された試薬混合物に進入す
るように構成されていなければならなかつたが、今や試
験細片はとくに迅速かつ確実に働くように構成すること
ができる。従来フイルム試験細片においてはしばしば試
料は試験細片に塗布した後、酵素がそもそも試験細片中
へ拡散進入しうるようにするため特定時間再び拭き取ら
ねばならなかつたが、この手段は本発明による電子受容
体を利用する場合には不要である。試験細片中に酸素が
時間に依存して拡散するのを防ぐことにより、動的測定
の場合アナライト濃度に依存する反応速度、および終点
測定の場合終点においてアナライト濃度とは独立の、従
来可能であつたよりも迅速、確実かつ簡単な定量法が可
能となる。
次例は、酵素酸化によりアナライトを比色定量するため
の可能な方法の若干を示すものである。
〔実施例〕
例１ オキシダーゼないしはNAD（Ｐ）非依存性デヒドロゲナ
ーゼおよびその基質によるＮ−オキシドの還元 Ａ）ポリビニルプロピオネート 40g （たとえばPropiofan70D、BASF社製品、ルードウイヒス
ハーフエン、ドイツ連邦共和国） アルギン酸ナトリウム 45g （たとえばKelco社のAlgipon,Merck ＆Coの部門、クラ
ーク、ニユージヤージイ、米国）、水中1.7重量％ タンパク加水分解物 2.5g （たとえばCrotein C,Croda GmbH,ネツテタール、ドイ
ツ連邦共和国） トリス緩衝剤0.1M,pH7.5 10ml グリコースオキシダーゼ（EC1.1.3.4） 750IU レゾアズリン 水中0.1M 1ml を攪拌して均質な材料にし、片側に艶消しポリカーボネ
ートシート（たとえばPokalon,Lonza社、ラインフエル
デン、ドイツ連邦共和国）厚さ140μｍをドクターで貼
付け（ドクター間隙200μｍ）、50℃で30分間乾燥し
た。
かかるフイルム上にグルコース含有溶液（40mg/dl）を
塗布する際、試薬層は１分以内に青から赤に変色した。
尿酸20mg/dlおよびグルタチオン20mg/dlの存在は呈色反
応に何の障害も生じなかつた。グルコースを含有してい
ない溶液を塗布する場合、試薬層は、試料塗布前に有し
ていた色を保持した。これは青色のままであつた。
グルコースおよびグルコースオキシダーゼを用いる代わ
りに、 ピルベートおよびピルベートオキシダーゼ （EC1.2.3.3） ラクテートおよびラクテートオキシダーゼ （EC1.1.3.2） グリセリン−３−リン酸およびグリセリン−３−リン酸
オキシダーゼ（EC1.1.3.21） を用いても同じ色結果が得られた。
Ｂ）上記フイルムの製造の際にレゾアズリンの代りに次
のベンゾフロキサン ａ）R1＝R2:H ｂ）R1:H;R2:CO−CH3（製造はN.R.Ayyangov,“Synthesi
s"1987号、第616頁による） ｃ）R1:H;R2:CHO（製造はM.L.Edwards,“J.Het.Chemist
ry",第13巻、第653頁（1976年） ｄ）R1＝R2：CH3（製造はJ.A.Usta等、 J.Het.Chemistory",第18巻、第655頁（1981年） を、フイルムバツチにつき250mgの濃度で使用した場
合、検査試料中にグルコースの存在する際、色はそれぞ
れ無色からオレンジに変色した。グルコース濃度の増加
につれて色の濃さは増加した。
尿酸20mg/dlの存在は呈色反応に何の障害も生じなかつ
た。
基質／酵素の組： ピルベート／ピルベートオキシダーゼ （EC1.2.3.3） ラクテート／ラクテートオキシダーゼ （EC1.1.3.2） グリセリン−３−リン酸／グリセリン−３−リン酸オキ
シダーゼ（EC1.1.3.21） は、同様に上記のベンゾフロキサンで検出することがで
きた。
例２ グルコースオキシダーゼおよびグルコースによるニトロ
ソ化合物の還元 Ａ）0.1Mクエン酸/NaOH緩衝液、pH6.0 2000μｌ ｐ−ニトロソ−N,N−ジメチルアニリン、エタノール中
0.1M 200μｌ グルコースオキシダーゼ（EC1.1.3.4）（2500IU/ml）ま
たはグルコースデヒドロゲナーゼ 100μｌ （EC1.1.99.10） 既知グルコース含量を有する試料 200μｌ ａ） 5mM ｂ） 10mM ｃ） 15mM ｄ） 20mM ｅ） 50mM 水中 を混合し、２分25℃で温置した。次いで Ｎ−メチルアントラニル酸 250μｌ ヘキサシアノ鉄（II）酸カリウム、 水中0.2M 125μｌおよび ヘキサシアノ鉄（III）酸カリウム、 水中0.2M 125μｌ を加えた。さらに１分後、25倍に希釈し、グルコースの
存在で緑に着色する反応混合物の吸光を710nmで空値
（グルコースなしの上記反応混合物）に対して測定し
た。
ε710＝24000M-1cm-1の吸光係数を、溶液中の未知グル
コース濃度の測定のために利用することができる。
Ｂ）Ａ）の上記試験においてｐ−ニトロソジメチルアニ
リンを ａ）ｐ−ニトロソフエノール ｂ）ｐ−ニトロソ−N,N−ジエチルアニリン ｃ）ｐ−ニトロソ−N,N−ジエタノールアニリン （製造はＤ′Amico等、“J.Amer.Chem.Soc.",第81巻、
第5957頁（1959年）による） によつて代えた場合、グルコースの存在において、Ｎ−
メチルアントラニル酸とのカツプリングによつて ａ）褐色から青色へ ｂ）黄色から緑色へ ｃ）黄色から緑色へ の変色が観察された。
Ｃ）Ａ）の上記試験においてＮ−メチルアントラニル酸
を ａ）Ｎ−メチル−Ｎ−メチレンホスホン酸アニリン ｂ）１−ヒドロキシ−ナフタリン−２−カルボン酸 ｃ）アニリン−２−スルホン酸 によつて代えた場合、グルコースの存在において、ｐ−
ニトロソ−N,N−ジメチルアニリンとのカツプリングに
よつて ａ）λmax＝735nm ｂ）λmax＝590nm ｃ）λmax＝640nm を有する色が観察された。
ｐ−ニトロソ−N,N−ジメチルアニリンおよびＮ−メチ
ル−Ｎ−メチレンホスホン酸アニリンを使用する場合、
第１図に表わした、735nmにおける吸光変化のグルコー
ス濃度との依存性が見出された。このためには、吸光を
クエン酸塩緩衝液（pH6）中（1:24）希釈した後に測定
し、試験バツチ中のグルコース濃度に対してプロツトし
た。
例３ 金属銀の生成によるグルコースの検出 例2Aにおけるようなクエン酸塩緩衝液、ｐ−ニトロソ−
N,N−ジメチルアニリン、グルコースオキシダーゼおよ
び試料からなるバツチを、25℃で２分温置し、水中の硫
酸銀100ミリモルの溶液250μｌならびに水中の金ゾル25
0μｌを加えた。（金ゾルの製造は次の規制に従つて行
なつた：沸騰した蒸留水100mlに、順次に水0.4ml中のHA
uCl40.4mg;水中NaSCN0.1M0.2mlおよび水中K2CO30.1M0.5
mlを加える。10分後放冷する。） 中間希釈なしに得られた成績物を用い、700nm、850nmお
よび1300nmにおいて、第２図に示した曲線が得られた。
該曲線は、溶液中の未知グルコース含量を確かめるため
の較正曲線として使用することができる。
例４ モリブデンブルー生成によるグルコースの検出 0.1Mのクエン酸/NaOH緩衝液（pH5）920xμｌ中の2,18−
リンモリブデン酸〔製造はたとえばブラウアー（G.Brau
er）（“Handbuch der praeparativen Anorganischen C
hemie",Enke出版，ストツトガルト、第1278頁（1954
年）またはローゼンハイム（A.Rosenheim）、トラウベ
（A.Traube）、“Z.Anorg.Chemie",第65巻、第99頁（19
10年）により可能〕200mgの溶液に0.1Mp−ニトロソ−N,
N−ジメチルアリニン（エタノール中）40μｌならびに
グルコースオキシダーゼ（6250IU/ml水）40μｌを加え
た。既知グルコース含量（１モル）のグルコース含有試
料ｘμｌ（ｘ＝0,1,2,3,5,7,10）を添加してから１分
後、50mlに希釈し、820nmにおける吸光変化（ΔＥ）を
測定した。結果として、第３図に示した曲線が得られ
た。該曲線は、溶液の未知グルコース含量を確めるため
の曲線として使用でき、その際ｃは測定のために実施し
た希釈前の試料中のグルコースの濃度を表わす。
例５ NAD（Ｐ）非依存性グルコーステヒドロゲナーゼを用い
るグルコースの動的定量 次の溶液を製造した： 試験緩衝液:0.1Mトリス／塩酸（pH7.5; 牛の血清アルブミン１％含有） 電子受容体：エタノール中0.1Mp−ニトロ ソ−N,N−ジメチルアニリン 指 示 薬:2,18−リンモリブデン酸、 100mg/ml水 酵 素：グルコース−デヒドロゲナーゼ （EC1.1.99.17）、試験緩 衝液50IU/ml グルコース溶液： ａ） 36mgグルコース/dlヒト血漿 ｂ） 72mgグルコース/dlヒト血漿 ｃ） 144mgグルコース/dlヒト血漿 ｄ） 360mgグルコース/dlヒト血漿 ｅ） 720mgグルコース/dlヒト血漿 ｆ）1440mgグルコース/dlヒト血漿 ｇ）3600mgグルコース/dlヒト血漿 1cmのキユベツト中に、緩衝液1740μｌ、電子受容体250
μｌ、指示薬250μｌおよびグルコースデヒドロゲナー
ゼ10μｌを入れ、混合物を25℃に温度調節し、次いでグ
ルコース溶液250μｌを加えた。出発点としてグルコー
ス溶液の添加により、820nmにおける毎分の吸光変化
（ΔE/min）を記録した。次の値が得られた： グルコース濃度 ΔE/min（試験バツチ中の最終濃度） 3.6mg/dl 0.20 7.2mg/dl 0.38 14.4mg/dl 0.57 36mg/dl 1.00 72mg/dl 1.60 144mg/dl 2.24 360mg/dl 3.13 例６ モリブテンブルー生成によるグルコース検出のための試
験細片 アルギン酸ナトリウム 1g （たとえばKelco社のAlgipon,Merck ＆Coの分割会社、
クラーク、ニユージヤージイ、米国） ポリビニルプロピオン酸 45g （たとえばBASF社のPropiophan70D、ルードウイツヒス
ヘーフエン、ドイツ連邦共和国） ノニル硫酸ナトリウム 0.75g リン酸二水素カリウム 10.15g 蒸留水 58.5g アエロジルCOK84 （デグツサ、ハナウ、ドイツ連邦共和国） を攪拌して均一な混合物にし、10Nの苛性ソーダでpH5.5
に調節する。
引き続き、グルコースオキシダーゼ（250IU/mg）65mg、
ｐ−ニトロソ−N,N−ジメチルアニリン260mg、2,18−リ
ンモリブデン酸1.3gを加えた。
混合物を厚さ1mmのポリスチロールシート上にドクター
で320μｍの層厚に塗布し、60℃で１時間乾燥した。グ
ルコース含有溶液の１滴を加えると、１分以内に明らか
な縁着色が生じる。着色の強さはグルコース濃度の増加
につれて濃くなり、比較目盛につき視覚によるかまたは
反射光度測定により評価することができる。
電子受容体ｐ−ニトロソ−N,N−ジメチルアニリンの代
りに、Ｐ−ベンゾキノン−ジオキシムまたはｐ−ニトロ
ソ−N,N−ジエタノールアニリンを使用することもでき
る。
室温で暗所に保存する場合、着色は数週間にわたつて安
定である。
上記例においてｐ−ニトロソ−N,N−ジメチルアニリン
をペルオキシダーゼ（100mg;200IU/mg）に代え、リンモ
リブデン酸を3,3′,5,5′−テトラメチルベンチジン（3
00mg）に代えると、原則的に技術水準から公知である酸
素依存性グルコース試験が得られる。この場合、上記例
とは異なり、試料溶液を試験細片に塗布した後、酸素が
拡散進入でき、そもそも着色が起きるようにするために
拭きとらねばならない。この欠点に対して付加的に、最
終着色の到達がグルコース濃度が高くなるにつれて次第
に遅くなり、生じる色はあまり貯蔵安定でない。従つ
て、本発明による電子受容体による酸素置換の利点は次
のとおりである： −試験細片への塗布後の試料の拭取りが不要 −迅速な反応 −動的測定の場合、アナライト濃度依存性反応速度 −終点測定の場合、終点におけるアナライト濃度非依存
性反応速度 −安定な色素 例７ NAD（Ｐ）非依存性グルコースデヒドロゲナーゼとレゾ
アズリンによるグルコースの検出 キユベツト中の試験緩衝液（クエン酸0.2M、アルブミン
１重量％、pH7.0）2050μｌおよび電子受容体溶液（水
中のレゾアズリン10ミリモル）100μｌに、試料溶液
（ｃグルコース＝０〜0.5ミリモル）250μｌおよび酵素
溶液（試験緩衝液中グルコースデヒドロゲナーゼ（EC1.
1.99.17）200U/ml）100μｌを加えた。２分後、酵素溶
液の代りに試験緩衝液100μｌを有する、同じ処理され
た空値に対して、530nmにおける吸収を測定した。次の
結果が得られた： 試料濃度0.5mMに到るまでは試験は線形である。この範
囲内で、キユベツト中の濃度は吸光係数ε530＝4350M-1
cm-1から計算することができる。より高い試料濃度で
は、中間希釈または小さい試料容積を使用することがで
きる。低い試料濃度は、生成物レゾルフインの螢光につ
き敏感に測定できる。
同様に、試験はベンゾフロキサンおよび例1Bに挙げたベ
ンゾフロキサン誘導体ならびに例２によるニトロソ化合
物を用いて実施できる。
NAD（Ｐ）非依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（EC1.
1.99.8）を用い同様にアルコールを検出できる。
例８ ラクテートオキシダーゼおよび電子受容体としてニトロ
ソ化合物を用いるラクテートの定量 キユベツト中で、試験緩衝液（クエン酸0.2モル／水酸
化ナトリウム、pH6.35）2240μｌ、電子受容体（エタノ
ール中N,N−ジメチル−ｐ−ニトロソアニリン0.1モル）
５μｌおよび既知ラクテート濃度を有する試料250μｌ
を混合し、25℃の恒温に保つた。試験を、酵素溶液（ラ
クテートオキシダーゼ（pediococcus sp.）200U/ml試験
緩衝液）５μｌで開始し、390nmにおける吸光変化ΔE/m
inを記録した。次の結果が得られた： この場合、Ｃラクテートは、キユベツト中で測定を実施
する際に存在するラクテート濃度である。
試験は、電子受容体濃度、酸素濃度、測定波長および温
度を変えることによつて早めるかまたは遅くすることが
できた。電子受容体として、N,N−ジエチル−ｐ−ニト
ロソアニリン、N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル）−
ｐ−ニトロソアニリン、ベンゾフロキサンおよびレゾア
ズリンも使用することができた。
【図面の簡単な説明】
添付図面は本発明による電子受容体としてのニトロソ化
合物使用の効果を示すもので、 第１図はニトロソ化合物の還元によりグルコースを検出
する場合のグルコース濃度による735nmにおける光吸収
の変化を示す曲線図であり、 第２図は金属銀生成によりグルコースを検出する場合の
グルコース濃度による光吸収の変化を、中間希釈の有無
の場合につき示す曲線図であり、 第３図はモリブデンブルー生成によりグルコースを検出
する場合のグルコース濃度と820nmにおける光吸収の変
化を示す曲線図である。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】電子受容体の存在においてアナライトを酵
    素酸化し、アナライトの量の尺度として還元された電子
    受容体を発色により定量することによるアナライトの比
    色定量方法において、アナライトを、還元発色性電子受
    容体としての芳香族ニトロソ化合物または互変異性体の
    等価オキシムの存在でフラビン依存性オキシダーゼまた
    はPQQ依存性デヒドロゲナーゼで酸化することを特徴と
    する酵素酸化によるアナライトの比色定量方法。
  2. 【請求項２】芳香族ニトロソ化合物として式Ｉ ［式中Ｒはヒドロキシ基またはアミノ基を表わし、アミ
    ノ基は１個または２個の低級アルキル基によって置換さ
    れていてもよく、低級アルキル基自体は１個のヒドロキ
    シ基、１個または数個の低級アルキル基によって置換さ
    れたアミノ基、PO3H2、SO3HまたはCOOHによって置換され
    ていてもよい］によって示される化合物を使用する、請
    求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】芳香族ニトロソ化合物がｐ−ヒドロキシニ
    トロソベンゾール、ｐ−ジメチルアミノニトロソベンゾ
    ール、ｐ−ジエチルアミノニトロソベンゾールまたはｐ
    −ジヒドロキシエチルアミノニトロソベンゾールであ
    る、請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】還元された電子受容体を、酸化カップリン
    グ反応による発色により検出する、請求項１から３まで
    のいずれか１項記載の方法。
  5. 【請求項５】還元された電子受容体を、酸化形から還元
    形へ移行する際に発色する物質の還元により検出する、
    請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
  6. 【請求項６】フラビン依存性オキシダーゼまたはPQQ依
    存性デヒドロゲナーゼおよび還元発色性電子受容体を含
    有する、アナライトの酵素酸化によるアナライトの比色
    定量試剤において、発色性電子受容体がアナライト／酵
    素系と直接に反応する芳香族ニトロソ化合物であること
    を特徴とする酵素酸化によるアナライトの比色定量試
    剤。
  7. 【請求項７】芳香族ニトロソ化合物が式Ｉ ［式中Ｒはヒドロキシ基またはアミノ基を表わし、アミ
    ノ基は１個または２個の低級アルキル基によって置換さ
    れていてもよく、低級アルキル基自体はヒドロキシ基、
    １個または数個の低級アルキル基によって置換されたア
    ミノ基、PO3H2、SO3HまたはCO2Hによって置換されていて
    もよい］で示される化合物である、請求項６記載の方
    法。
  8. 【請求項８】付加的に、還元された電子受容体の酸化カ
    ップリング試薬を含有する請求項６または７記載の試
    剤。
  9. 【請求項９】付加的に、酸化形から還元形に移行する際
    に発色する物質を含有する請求項６または７記載の試
    剤。
  10. 【請求項１０】芳香族ニトロソ化合物を使用する、フラ
    ビン依存性オキシダーゼまたはPQQ依存性デヒドロゲナ
    ーゼを含有するアナライト／酵素系の還元発色性電子受
    容体。
JP1204927A 1988-08-09 1989-08-09 酵素酸化によるアナライトの比色定量方法および試剤、およびそのための還元発色性電子受容体 Expired - Lifetime JPH0687793B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3826922A DE3826922A1 (de) 1988-08-09 1988-08-09 Verfahren zur kolorimetrischen bestimmung eines analyten mittels enzymatischer oxidation
DE3826922.8 1988-08-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH02174695A JPH02174695A (ja) 1990-07-06
JPH0687793B2 true JPH0687793B2 (ja) 1994-11-09

Family

ID=6360464

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1204927A Expired - Lifetime JPH0687793B2 (ja) 1988-08-09 1989-08-09 酵素酸化によるアナライトの比色定量方法および試剤、およびそのための還元発色性電子受容体

Country Status (12)

Country Link
US (2) US5206147A (ja)
EP (1) EP0354441B1 (ja)
JP (1) JPH0687793B2 (ja)
KR (1) KR920001449B1 (ja)
AT (1) ATE122726T1 (ja)
AU (1) AU614405B2 (ja)
CA (1) CA1339058C (ja)
DD (1) DD284050A5 (ja)
DE (2) DE3826922A1 (ja)
ES (1) ES2074457T3 (ja)
HK (1) HK173796A (ja)
RU (1) RU2015513C1 (ja)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3940010A1 (de) * 1989-12-02 1991-06-06 Boehringer Mannheim Gmbh Verwendung eines schwer loeslichen salzes einer heteropolysaeure zur bestimmung eines analyts, entsprechendes bestimmungsverfahren sowie hierfuer geeignetes mittel
DE4003194A1 (de) * 1990-02-03 1991-08-08 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und sensorelektrodensystem zur elektrochemischen bestimmung eines analyts oder einer oxidoreduktase sowie verwendung hierfuer geeigneter verbindungen
ES2141172T3 (es) * 1992-09-28 2000-03-16 Roche Diagnostics Corp Reactivo estable para sistemas indicadores de complejos de ion ferrico.
DE4311460A1 (de) * 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mittels Benzylalkoholdehydrogenase und einem chromogenen Redoxindikator
DE4311464A1 (de) * 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mit einer PQQ-abhängigen Dehydrogenase
US5620579A (en) * 1995-05-05 1997-04-15 Bayer Corporation Apparatus for reduction of bias in amperometric sensors
US5989845A (en) 1996-04-05 1999-11-23 Mercury Diagnostics, Inc. Diagnostic compositions and devices utilizing same
US5776719A (en) * 1997-07-07 1998-07-07 Mercury Diagnostics, Inc. Diagnostic compositions and devices utilizing same
US6040151A (en) * 1998-03-10 2000-03-21 Mercury Diagnostics, Inc. Diagnostic compositions and devices utilizing same
IL121279A (en) * 1996-07-16 2001-05-20 Roche Diagnostics Gmbh An analytical system with means for testing samples with too small volumes
DE19628562A1 (de) 1996-07-16 1998-01-22 Boehringer Mannheim Gmbh Analysesystem mit Mitteln zur Erkennung von Unterdosierungen
DE69809391T2 (de) 1997-02-06 2003-07-10 Therasense, Inc. Kleinvolumiger sensor zur in-vitro bestimmung
US6391645B1 (en) 1997-05-12 2002-05-21 Bayer Corporation Method and apparatus for correcting ambient temperature effect in biosensors
US6428974B1 (en) * 1998-04-03 2002-08-06 Kanto Kagaku Kabushiki Kaisha Microplate for drug susceptibility testing containing a drug, a color reagent, and color suppressant
US6030802A (en) * 1998-05-29 2000-02-29 Roche Diagnostics Corporation Liquid reagent set for L-lactate determination
US5902731A (en) * 1998-09-28 1999-05-11 Lifescan, Inc. Diagnostics based on tetrazolium compounds
US6656697B1 (en) * 1998-09-28 2003-12-02 Lifescan, Inc. Diagnostics based on tetrazolium compounds
JP3694424B2 (ja) 1998-09-29 2005-09-14 松下電器産業株式会社 グルコースセンサ
US6338790B1 (en) 1998-10-08 2002-01-15 Therasense, Inc. Small volume in vitro analyte sensor with diffusible or non-leachable redox mediator
DE19945828B4 (de) 1999-09-24 2011-06-01 Roche Diagnostics Gmbh Analysenelement und Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Flüssigkeit
US7005048B1 (en) 1999-10-05 2006-02-28 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Glucose sensor
DE10001529A1 (de) * 2000-01-15 2001-07-19 Roche Diagnostics Gmbh Stabilisierte Coenzym-Lösungen und deren Verwendung zur Bestimmung von Dehydrogenasen bzw. deren Substrate
US6420128B1 (en) * 2000-09-12 2002-07-16 Lifescan, Inc. Test strips for detecting the presence of a reduced cofactor in a sample and method for using the same
EP1416851B1 (en) * 2001-06-08 2006-08-09 Roche Diagnostics GmbH Bodily fluid sampling device and test media cassette to be used with such a device
US7163616B2 (en) * 2001-09-14 2007-01-16 Bayer Corporation Reagents and methods for detecting analytes, and devices comprising reagents for detecting analytes
US6982152B2 (en) * 2002-04-17 2006-01-03 Promega Corporation Cytotoxicity assay
US6759190B2 (en) * 2002-06-15 2004-07-06 Acon Laboratories, Inc. Test strip for detection of analyte and methods of use
DE10248555B4 (de) * 2002-10-18 2004-12-02 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren und Analysesystem zur Ermittlung der Konzentration eines Analyten in einer Probe, die aus dem Analyten und der Probenmatrix besteht und Testelement dafür
US7572237B2 (en) 2002-11-06 2009-08-11 Abbott Diabetes Care Inc. Automatic biological analyte testing meter with integrated lancing device and methods of use
DE10304448A1 (de) 2003-02-04 2004-08-12 Roche Diagnostics Gmbh Fluorimetrische Bestimmung von Analyten durch Amin-N-Oxide als Redoxindikatoren
DE10346863A1 (de) * 2003-10-09 2005-05-04 Roche Diagnostics Gmbh On-Board-Kontrolle für Analyseelemente
JP4839219B2 (ja) 2003-10-24 2011-12-21 バイエル・ヘルスケア・エルエルシー 酵素的電気化学的バイオセンサ
CN1914331A (zh) * 2004-02-06 2007-02-14 拜尔健康护理有限责任公司 作为生物传感器的内部参照的可氧化种类和使用方法
BRPI0509296A (pt) 2004-03-31 2007-09-18 Bayer Healthcare Llc método e aparelho para implementar funções corretivas baseadas em limiares para biossensores
US20060024835A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-02 Matzinger David P Analytical test strip with control zone
DE602006015295D1 (de) * 2005-04-04 2010-08-19 Facet Technologies Llc Lanzettenvorrichtung mit schmalem profil
WO2007013915A1 (en) 2005-07-20 2007-02-01 Bayer Healthcare Llc Gated amperometry
WO2007040913A1 (en) 2005-09-30 2007-04-12 Bayer Healthcare Llc Gated voltammetry
US7955484B2 (en) * 2005-12-14 2011-06-07 Nova Biomedical Corporation Glucose biosensor and method
DE102006043718B4 (de) 2006-09-18 2014-12-31 Alexander Adlassnig Bestimmung von Wasserstoffperoxidkonzentrationen
EP3543348B1 (en) 2006-09-22 2020-11-18 Ascensia Diabetes Care Holdings AG Biosensor system having enhanced stability and hematocrit performance
EP3753481B1 (en) 2006-10-24 2024-07-17 Ascensia Diabetes Care Holdings AG Transient decay amperometry device
EP1964927A1 (de) * 2007-02-27 2008-09-03 F. Hoffmann-La Roche AG Chinone als Mediatoren für photometrische Teste
CA2716603A1 (en) * 2007-03-05 2009-09-12 Advanced Liquid Logic, Inc. Hydrogen peroxide droplet-based assays
WO2009076302A1 (en) 2007-12-10 2009-06-18 Bayer Healthcare Llc Control markers for auto-detection of control solution and methods of use
JP5856371B2 (ja) 2007-12-10 2016-02-09 バイエル・ヘルスケア・エルエルシーＢａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅＬＬＣ 分析対象物を検出するための試薬及び方法
EP3187866B1 (en) 2007-12-10 2019-04-17 Ascensia Diabetes Care Holdings AG Electrochemical test sensor
WO2009076268A1 (en) * 2007-12-10 2009-06-18 Bayer Healthcare Llc Process of making 3-phenylimino-3h-phenothiazine or 3-phenylimino-3h-phenoxazine mediator
US20090219509A1 (en) * 2008-02-29 2009-09-03 Hiroshi Nomura Optical sensor with enhanced reflectance
US8008068B2 (en) * 2008-02-29 2011-08-30 Light Pointe Medical, Inc. Nonhemolytic optical sensor with enhanced reflectance
US8008037B2 (en) 2008-03-27 2011-08-30 Roche Diagnostics Operations, Inc. Matrix composition with alkylphenazine quaternary salt and a nitrosoaniline
WO2011012754A2 (es) 2009-07-30 2011-02-03 Fundacion Cidetec Sensor electroquímico para la detección de analitos en medios líquidos
EP2287295A1 (en) 2009-08-03 2011-02-23 Roche Diagnostics GmbH Mutant Fructosyl amino acid oxidase
EP2281900A1 (en) 2009-08-03 2011-02-09 Roche Diagnostics GmbH Fructosyl peptidyl oxidase and sensor for assaying a glycated protein
JP6055236B2 (ja) * 2011-08-17 2016-12-27 株式会社三和化学研究所 測定方法
EP2562251B1 (en) 2011-08-25 2016-08-17 Roche Diagnostics GmbH Cholesterol oxidase
WO2013026575A2 (en) 2011-08-25 2013-02-28 Roche Diagnostics Gmbh Glucose oxidase
KR101609083B1 (ko) * 2011-09-28 2016-04-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 아조 매개체
US9572922B2 (en) 2012-12-21 2017-02-21 Larry Leonard Inventive diabetic systems, tools, kits, and supplies for better diabetic living and mobility
KR101728597B1 (ko) 2012-04-19 2017-04-19 에프. 호프만-라 로슈 아게 혈액 내 분석물 농도를 결정하는 방법 및 디바이스
CN104870982B (zh) 2012-12-20 2019-02-15 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于评估医学测量曲线的方法
KR101750638B1 (ko) 2012-12-20 2017-06-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 체액의 샘플을 분석하는 방법
JP6427110B2 (ja) 2013-01-28 2018-11-21 エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト アスペルギルスニガー由来の新規グルコース酸化酵素
EP2781919A1 (en) 2013-03-19 2014-09-24 Roche Diagniostics GmbH Method / device for generating a corrected value of an analyte concentration in a sample of a body fluid
EP2796547B1 (en) 2013-04-24 2016-09-14 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel glucose oxidase variants
EP3406732B1 (en) * 2016-01-22 2020-11-04 National Agriculture and Food Research Organization Method for measuring oxidoreductase activity
CA3035874C (en) 2016-10-05 2025-09-09 F. Hoffmann-La Roche Ag DETECTION REAGENTS AND ELECTRODE ARRANGEMENTS FOR MULTI-ANALYTICAL DIAGNOSTIC TEST ELEMENTS, AS WELL AS THEIR METHODS OF USE
EP3339431A1 (en) 2016-12-22 2018-06-27 Roche Diabetes Care GmbH Glucose dehydrogenase variants with improved properties
DE102017208461A1 (de) 2017-05-18 2018-11-22 Diabetes.Online Ag Multianalytmessung
EP3759231B1 (en) 2018-02-28 2023-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Biocompatibility coating for continuous analyte measurement
JPWO2020122231A1 (ja) 2018-12-13 2021-10-21 キッコーマン株式会社 エタノールアミンリン酸の定量方法、定量用のオキシドレダクターゼ、定量用組成物、定量用キット及び定量用センサー
KR102178443B1 (ko) * 2018-12-17 2020-11-13 주식회사 포스코 글로우 방전 광학 방출 분광법의 다변량 분석을 이용한 철강 표면 산화철의 정량 분석 방법
US12116610B2 (en) 2021-01-26 2024-10-15 The University Of North Carolina At Chapel Hill Glycerol 3-phosphate oxidase mutants, compositions, devices, kits and uses thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4105800A (en) * 1976-07-26 1978-08-08 Board Of Regents For Education Of The State Of Rhode Island Immobilized enzyme method to assess fish quality
US4645760A (en) * 1982-07-30 1987-02-24 Health Research Inc. Activated aminoglycosides and aminoglycoside-aminocyclitols pharmaceutical compositions and method of use
DE3311027A1 (de) * 1983-03-25 1984-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Nad(p)-unabhaengige glycerindehydrogenase, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung von glycerin und triglyceriden
AU1469983A (en) * 1983-05-19 1984-11-22 Imperial Chemical Industries Plc Glucose determination using glucose d.h. and reducible cpd to change e.m. radiation
US4629689A (en) * 1984-08-29 1986-12-16 Allied Corporation Binding assay with amplified read-out and gas-phase detection
JPS62239999A (ja) * 1986-04-11 1987-10-20 Arinobu Fujimura Ｎａｄ（ｐ）ｈの半定量法
DE3820404A1 (de) * 1987-06-15 1988-12-29 Toyo Boseki Pyruvat-dehydrogenase und ihre verwendung in einem analytischen verfahren
DE3720506A1 (de) * 1987-06-20 1988-12-29 Draegerwerk Ag Verfahren zum nachweis gasfoermiger stoffe mittels einer enzymatischen redox-reaktion
US5000815A (en) * 1988-12-19 1991-03-19 Ncr Corporation Apparatus for applying a correction sticker to a document

Also Published As

Publication number Publication date
EP0354441A3 (de) 1992-04-08
AU3922289A (en) 1990-02-15
RU2015513C1 (ru) 1994-06-30
ATE122726T1 (de) 1995-06-15
DE3826922A1 (de) 1990-02-22
ES2074457T3 (es) 1995-09-16
US5206147A (en) 1993-04-27
EP0354441B1 (de) 1995-05-17
US5334508A (en) 1994-08-02
DE58909232D1 (de) 1995-06-22
EP0354441A2 (de) 1990-02-14
KR900003378A (ko) 1990-03-26
AU614405B2 (en) 1991-08-29
KR920001449B1 (ko) 1992-02-14
HK173796A (en) 1996-09-20
DD284050A5 (de) 1990-10-31
JPH02174695A (ja) 1990-07-06
CA1339058C (en) 1997-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0687793B2 (ja) 酵素酸化によるアナライトの比色定量方法および試剤、およびそのための還元発色性電子受容体
Fossati et al. Use of 3, 5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid/4-aminophenazone chromogenic system in direct enzymic assay of uric acid in serum and urine.
CA1155737A (en) Process and diagnostic agents for the detection of redox reactions
US5521060A (en) Use of a sparingly soluable salt of a heteropoly acid for the determination of an analyte, a corresponding method of determination as a suitable agent therefor
JPH0577399B2 (ja)
JPS6258718B2 (ja)
EP0223977B1 (en) Colour developing method in clinical examinations
JPH0334920B2 (ja)
JPS6134799B2 (ja)
EP0124909B1 (en) Process for determining reduced form coenzymes
EP0606296B1 (en) Reagents and assay methods including a phenazine-containing indicator
EP0206316B1 (en) Method and test composition for determination of hydrogen peroxide
US4801538A (en) Process for determining superoxide dismutase activity
WO1989005356A1 (en) Assay of salicylates or reduced pyridine nucleotides
EP0285998B1 (en) Method and reagent for determination of dehydrogenase or its substrate
US5250420A (en) Method and reagent for determination of dehydrogenase or its substrate
US4695539A (en) Process for quantitative determination of substrate treated with oxidase
Kayamori et al. Enzymatic method for assaying uric acid in serum with a new tetrazolium salt produces water-soluble formazan dye
JPS5818077B2 (ja) グリセリンを測定する方法及び試薬
US5707820A (en) Reagent and assay methods including a phenazine-containing indicator
CA1206077A (en) Sensitive enzymatic creatinine assay
JPS63248397A (ja) Ｄ−マンノ−スの定量法
JPH0249600A (ja) Ｎａｄ（ｐ）ｈの定量法
JPS6219100A (ja) 胆汁酸の定量法
JP3690754B2 (ja) 試料中の成分の定量法

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071109

Year of fee payment: 13

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081109

Year of fee payment: 14

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091109

Year of fee payment: 15

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091109

Year of fee payment: 15