JPH0564598A - Ｎａｄｈ及びｎａｄｐｈの測定法 - Google Patents
Ｎａｄｈ及びｎａｄｐｈの測定法Info
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- JPH0564598A JPH0564598A JP3254272A JP25427291A JPH0564598A JP H0564598 A JPH0564598 A JP H0564598A JP 3254272 A JP3254272 A JP 3254272A JP 25427291 A JP25427291 A JP 25427291A JP H0564598 A JPH0564598 A JP H0564598A
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- C12Q2326/32—3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate, i.e. MBTH
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 体液中の生化学物質や酵素活性を間接的に測
定するための高感度且つ高精度な NADH 及び NADPH の
測定法を提供する。 【構成】 NADH 及び NADPH を測定する際に、NAD(P)H
オキシダーゼの作用により過酸化水素を発生させる工程
と、酸化系発色剤を用いて過酸化水素を測定する工程と
を同時進行的に行う。酸化系発色剤としてはペルオキシ
ダーゼと、アニリン及びその誘導体から選択された物質
と、3-メチル-2-ベンゾチアゾリン-ヒドラゾン及びその
誘導体から選択された物質とを組み合わせて用い、必要
であればスーパーオキサイドディスムターゼを反応系に
共存させる。
定するための高感度且つ高精度な NADH 及び NADPH の
測定法を提供する。 【構成】 NADH 及び NADPH を測定する際に、NAD(P)H
オキシダーゼの作用により過酸化水素を発生させる工程
と、酸化系発色剤を用いて過酸化水素を測定する工程と
を同時進行的に行う。酸化系発色剤としてはペルオキシ
ダーゼと、アニリン及びその誘導体から選択された物質
と、3-メチル-2-ベンゾチアゾリン-ヒドラゾン及びその
誘導体から選択された物質とを組み合わせて用い、必要
であればスーパーオキサイドディスムターゼを反応系に
共存させる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は NADH (還元型ニコチン
アミドアデニンヌクレオチド) 及び NADPH (還元型ニコ
チンアミドアデニンヌクレオチド燐酸) の測定法に係
り、本質的には酵素反応により生成する過酸化水素を測
定する方法であり、主として体液、例えば血清や尿を検
体とし種々の生化学物質や酵素活性等を定量する臨床検
査に利用される。
アミドアデニンヌクレオチド) 及び NADPH (還元型ニコ
チンアミドアデニンヌクレオチド燐酸) の測定法に係
り、本質的には酵素反応により生成する過酸化水素を測
定する方法であり、主として体液、例えば血清や尿を検
体とし種々の生化学物質や酵素活性等を定量する臨床検
査に利用される。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】現在、生化学的研究や臨床
検査等においては体液を検体として生化学物質や酵素活
性の測定が行われている。この場合に大部分の被測定物
質は、直接的に定量することが困難であるために、被測
定物質に酵素を作用させ、この酵素反応によって定量的
に生成する物質を測定することにより、問題の被測定物
質を間接的に定量する方法が主として利用されている。
この酵素反応によって定量的に生成する物質の主たるも
のは、(1) 酸化酵素反応の生成物である過酸化水素、
(2) 脱水素酵素反応における補酵素であるNADH及び NAD
PH である。従って、これらの物質を良好な精度を以っ
て測定できれば、本来の測定対象である特定の生化学物
質や酵素活性を高精度で測定できることになる。
検査等においては体液を検体として生化学物質や酵素活
性の測定が行われている。この場合に大部分の被測定物
質は、直接的に定量することが困難であるために、被測
定物質に酵素を作用させ、この酵素反応によって定量的
に生成する物質を測定することにより、問題の被測定物
質を間接的に定量する方法が主として利用されている。
この酵素反応によって定量的に生成する物質の主たるも
のは、(1) 酸化酵素反応の生成物である過酸化水素、
(2) 脱水素酵素反応における補酵素であるNADH及び NAD
PH である。従って、これらの物質を良好な精度を以っ
て測定できれば、本来の測定対象である特定の生化学物
質や酵素活性を高精度で測定できることになる。
【０００３】上記 (1) の酸化酵素反応において生成す
る過酸化水素の測定法であって簡便且つ比較的高感度な
測定法としては、ペルオキシダーゼの存在下において 4
-アミノアンチピリン (以下においては「4-AA」と略記
する) とフェノール類又はアニリン誘導体を酸化発色試
薬とする方法が一般的である。この場合にフェノール類
としては、例えばフェノール、2,4-ジクロロフェノー
ル、2,4-ジブロムフェノール及び 3,5-ジクロロ-2-ヒド
ロキシベンゼンスルホン酸等を例示することができ、ア
ニリン誘導体としては N,N-ジメチルアニリン、N,N-ジ
エチルアニリン，N-エチル-N-(2-ヒドロキシエチル)-m-
トルイジン、N-エチル-N-(3-メチルフェニル)-N'-アセ
チルエチレンジアミン、N,N-ジメチル-m-アニシジン、
アルキルスルホン酸やヒドロキシアルキルスルホン酸に
よるアニリンの N-置換体等のアニリン誘導体を例示す
ることができる。一方、上記の 4-AA の代わりに 3-メ
チル-2-ベンゾチアゾリノン-ヒドラゾン (以下「MBTH」
と略記する) を用いることもできる。
る過酸化水素の測定法であって簡便且つ比較的高感度な
測定法としては、ペルオキシダーゼの存在下において 4
-アミノアンチピリン (以下においては「4-AA」と略記
する) とフェノール類又はアニリン誘導体を酸化発色試
薬とする方法が一般的である。この場合にフェノール類
としては、例えばフェノール、2,4-ジクロロフェノー
ル、2,4-ジブロムフェノール及び 3,5-ジクロロ-2-ヒド
ロキシベンゼンスルホン酸等を例示することができ、ア
ニリン誘導体としては N,N-ジメチルアニリン、N,N-ジ
エチルアニリン，N-エチル-N-(2-ヒドロキシエチル)-m-
トルイジン、N-エチル-N-(3-メチルフェニル)-N'-アセ
チルエチレンジアミン、N,N-ジメチル-m-アニシジン、
アルキルスルホン酸やヒドロキシアルキルスルホン酸に
よるアニリンの N-置換体等のアニリン誘導体を例示す
ることができる。一方、上記の 4-AA の代わりに 3-メ
チル-2-ベンゾチアゾリノン-ヒドラゾン (以下「MBTH」
と略記する) を用いることもできる。
【０００４】一方、上記 (2) の脱水素酵素反応におい
て生成する NADH 及び NADPH の測定法は数種類ある
が、操作が簡便且つ低コストな測定法としては、a) NAD
H 及び NADPH の最大吸収波長である 340nm における吸
収を直接測定する方法、b) テトラゾリウム塩の存在下
でジアホラーゼを作用させてジホルマザンを生成させて
比色定量する方法、c) 下記に示される反応式における
ように、NAD(P)H オキシダーゼを用い NADH 及び NADPH
を特異的に酸化することにより生成する過酸化水素の
量を測定する方法が用いられている。
て生成する NADH 及び NADPH の測定法は数種類ある
が、操作が簡便且つ低コストな測定法としては、a) NAD
H 及び NADPH の最大吸収波長である 340nm における吸
収を直接測定する方法、b) テトラゾリウム塩の存在下
でジアホラーゼを作用させてジホルマザンを生成させて
比色定量する方法、c) 下記に示される反応式における
ように、NAD(P)H オキシダーゼを用い NADH 及び NADPH
を特異的に酸化することにより生成する過酸化水素の
量を測定する方法が用いられている。
【０００５】
【化１】
【０００６】上記の NADH 及び NADPH を直接測定する
方法は、NADH 及び NADPH のモル吸光係数が共に約 620
0 であり、例えば体液中の微量成分の測定目的で利用す
るには感度の上で不充分である。一方、比色定量する方
法は、生成するホルマザンが水に難溶であるために反応
セルを汚染し易い点に課題がある。
方法は、NADH 及び NADPH のモル吸光係数が共に約 620
0 であり、例えば体液中の微量成分の測定目的で利用す
るには感度の上で不充分である。一方、比色定量する方
法は、生成するホルマザンが水に難溶であるために反応
セルを汚染し易い点に課題がある。
【０００７】尚、NAD(P)H オキシダーゼを用い過酸化水
素の生成量を測定することは、既述の酸化発色試薬を使
用することにより可能であり、例えば特開昭 63 - 4488
2 公報及び特開平 1 - 257499 公報に開示されている。
しかしながら、これらの公報に記載されている方法は、
NADH 及び NADPH を良好な精度を以って測定するには、
下記の理由で、不充分である。被検液中に生成した過酸
化水素を精度良好に測定するためには、過酸化水素が不
安定なので、NAD(P)H オキシダーゼの作用によって過酸
化水素が生成すると同時に酸化発色試薬により呈色体に
導くことが好ましい。呈色体へのこのような誘導方法
は、特に被測定物質が低濃度である場合に有効である。
しかしながら、上記の公報に開示されている方法は、こ
れを可能としていない。即ち、上記の公報における開示
によれば、4-AA とフェノールとアニリン誘導体とが用
いられるが、この組み合わせでは呈色体が被検液中の N
ADH 及び NADPH により還元され発色しないために、酵
素反応によって生成した被検液中の NADH 及び NADPH
を NAD(P)H オキシダーゼにより完全消費させた後に呈
色反応を行わなければならないのである。換言すれば、
上記の公報に開示されている方法は、所謂 2 段階法で
あり、従って血清等の体液を検体とする場合に、脱水素
酵素反応により生成した過酸化水素の少なくとも一部が
体液中の成分と反応して分解してしまう可能性があり、
従って高精度な測定法とは云えないのである。
素の生成量を測定することは、既述の酸化発色試薬を使
用することにより可能であり、例えば特開昭 63 - 4488
2 公報及び特開平 1 - 257499 公報に開示されている。
しかしながら、これらの公報に記載されている方法は、
NADH 及び NADPH を良好な精度を以って測定するには、
下記の理由で、不充分である。被検液中に生成した過酸
化水素を精度良好に測定するためには、過酸化水素が不
安定なので、NAD(P)H オキシダーゼの作用によって過酸
化水素が生成すると同時に酸化発色試薬により呈色体に
導くことが好ましい。呈色体へのこのような誘導方法
は、特に被測定物質が低濃度である場合に有効である。
しかしながら、上記の公報に開示されている方法は、こ
れを可能としていない。即ち、上記の公報における開示
によれば、4-AA とフェノールとアニリン誘導体とが用
いられるが、この組み合わせでは呈色体が被検液中の N
ADH 及び NADPH により還元され発色しないために、酵
素反応によって生成した被検液中の NADH 及び NADPH
を NAD(P)H オキシダーゼにより完全消費させた後に呈
色反応を行わなければならないのである。換言すれば、
上記の公報に開示されている方法は、所謂 2 段階法で
あり、従って血清等の体液を検体とする場合に、脱水素
酵素反応により生成した過酸化水素の少なくとも一部が
体液中の成分と反応して分解してしまう可能性があり、
従って高精度な測定法とは云えないのである。
【０００８】
【発明の目的】）従って、本発明の主たる目的は，高感
度に且つ高精度を以って NADH 及び NADPH の測定が可
能な方法を提供することにある。本発明の附随的な目的
は、自動分析装置への適用が可能な NADH 及び NADPHの
測定方法を提供することにある。
度に且つ高精度を以って NADH 及び NADPH の測定が可
能な方法を提供することにある。本発明の附随的な目的
は、自動分析装置への適用が可能な NADH 及び NADPHの
測定方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決し目的を達成するための手段及び作用】本
発明者等は、従来の NAD(P)H オキシダーゼを用いた NA
DH 及び NADPHの測定法が有している課題を解決するた
めに鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。本
発明によれば、NADH 及び NADPH を測定する際に、NAD
(P)H オキシダーゼの作用により過酸化水素を発生させ
る工程と、酸化系発色剤を用いて過酸化水素を測定する
工程とを同時に行うことを特徴とする、NADH 及び NADP
H の測定法が提供される。即ち、本発明方法では上記の
両工程が同時に行われるために、過酸化水素の測定精度
が向上し、その結果として NADH 及び NADPH を高感度
に且つ高精度を以って測定することが可能となるのであ
る。
発明者等は、従来の NAD(P)H オキシダーゼを用いた NA
DH 及び NADPHの測定法が有している課題を解決するた
めに鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。本
発明によれば、NADH 及び NADPH を測定する際に、NAD
(P)H オキシダーゼの作用により過酸化水素を発生させ
る工程と、酸化系発色剤を用いて過酸化水素を測定する
工程とを同時に行うことを特徴とする、NADH 及び NADP
H の測定法が提供される。即ち、本発明方法では上記の
両工程が同時に行われるために、過酸化水素の測定精度
が向上し、その結果として NADH 及び NADPH を高感度
に且つ高精度を以って測定することが可能となるのであ
る。
【００１０】本発明による測定法を実施する場合に、使
用する NAD(P)H オキシダーゼの種類は限定されず、NAD
H 及び NADPH を特異的に酸化して過酸化水素を生成さ
せるものであれば、任意のものを用いることができる。
酸化系発色剤のカップラーとしては汎用されている 4-A
A ではなく、MBTH 又はその誘導体が用いられる。何故
ならば、MBTH 及びその誘導体は NADH 及び NADPH によ
る還元作用を受けないからである。MBTH の誘導体とし
てはスルホン基、アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ
基、カルボキシル基等の置換基を導入したものが有利で
ある。
用する NAD(P)H オキシダーゼの種類は限定されず、NAD
H 及び NADPH を特異的に酸化して過酸化水素を生成さ
せるものであれば、任意のものを用いることができる。
酸化系発色剤のカップラーとしては汎用されている 4-A
A ではなく、MBTH 又はその誘導体が用いられる。何故
ならば、MBTH 及びその誘導体は NADH 及び NADPH によ
る還元作用を受けないからである。MBTH の誘導体とし
てはスルホン基、アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ
基、カルボキシル基等の置換基を導入したものが有利で
ある。
【００１１】上記の本発明による NADH 及び NADPH の
測定法を実施した処、検量線が直線でなく二次曲線に近
い形を呈することが判明した。このような現象は、NAD
(P)Hオキシダーゼを用いる従来の 2段階測定法では見ら
れないことである。そこで本発明者等は、その課題を解
決するために鋭意検討を行った。その結果、検量線が直
線性を呈しないのは、NAD(P)H オキシダーゼが過酸化水
素の生成だけではなく、スーパーオキシドアニオンの生
成をも行うことを突き止めるに至った。即ち、本発明方
法を実施する場合に、反応系にスーパーオキサイドディ
スムターゼ (以下「SOD」と略記する) を共存させれ
ば、検量線に直線性をもたらし得るのである。尚、SOD
とは下記の式にて示される反応において触媒的な作用を
する酵素であって、スーパーオキシドアニオンを過酸化
水素に変換する作用を有している。但し、この反応は非
酵素的にも比較的迅やかに起こる反応である。本発明方
法において、使用される SOD の種類に格別な限定はな
く、ウシ赤血球由来の SOD 等を用いることができる。
一般に SOD は pH 約 5 - 10 の範囲内で充分な活性を
示し、安定性も良好なので使用に好適であり、その添加
量は反応液中の濃度で 10- 200mg/l に設定するのが好
ましい。
測定法を実施した処、検量線が直線でなく二次曲線に近
い形を呈することが判明した。このような現象は、NAD
(P)Hオキシダーゼを用いる従来の 2段階測定法では見ら
れないことである。そこで本発明者等は、その課題を解
決するために鋭意検討を行った。その結果、検量線が直
線性を呈しないのは、NAD(P)H オキシダーゼが過酸化水
素の生成だけではなく、スーパーオキシドアニオンの生
成をも行うことを突き止めるに至った。即ち、本発明方
法を実施する場合に、反応系にスーパーオキサイドディ
スムターゼ (以下「SOD」と略記する) を共存させれ
ば、検量線に直線性をもたらし得るのである。尚、SOD
とは下記の式にて示される反応において触媒的な作用を
する酵素であって、スーパーオキシドアニオンを過酸化
水素に変換する作用を有している。但し、この反応は非
酵素的にも比較的迅やかに起こる反応である。本発明方
法において、使用される SOD の種類に格別な限定はな
く、ウシ赤血球由来の SOD 等を用いることができる。
一般に SOD は pH 約 5 - 10 の範囲内で充分な活性を
示し、安定性も良好なので使用に好適であり、その添加
量は反応液中の濃度で 10- 200mg/l に設定するのが好
ましい。
【００１２】
【化２】
【００１３】次に、従来技術方法との関連において、本
発明を説明する。例えば、検体として血清を用い 3-ヒ
ドロキシ酪酸を定量する場合には、下記に示される 3
段階の反応が利用される。
発明を説明する。例えば、検体として血清を用い 3-ヒ
ドロキシ酪酸を定量する場合には、下記に示される 3
段階の反応が利用される。
【００１４】
【化３】
【００１５】従来法によれば、上記の (1) 及び (2) の
反応を予め行った後に、(3) の呈色反応が行われる。従
って、反応 (2) において生成した過酸化水素の一部が
血清中の共存物質等と反応して分解してしまう可能性が
ある。しかしながら、本発明方法によれば、反応 (1)、
(2) 及び (3) が同時進行的に行われるので過酸化水素
が、延いては NADH 及び NADPH が、更には 3-ヒドロキ
シ酪酸が高精度を以って測定し得るのであって、この本
発明方法は被測定物質が低濃度の場合に、即ち微量成分
の場合にも有効性を発揮する。尚、本発明方法は 1 段
階操作なので、極めて簡便であり、測定所要時間も短縮
し、又多数の検体を処理するための汎用自動分析装置へ
の適用も可能となる。更に、本発明方法において使用さ
れる試薬の形態としては溶液状であっても、凍結乾燥状
であっても差し支えなく、殊に本発明方法は 1 段階法
なので、担体に全試薬を含浸させた上で乾燥させた形態
のものとすることもできる。
反応を予め行った後に、(3) の呈色反応が行われる。従
って、反応 (2) において生成した過酸化水素の一部が
血清中の共存物質等と反応して分解してしまう可能性が
ある。しかしながら、本発明方法によれば、反応 (1)、
(2) 及び (3) が同時進行的に行われるので過酸化水素
が、延いては NADH 及び NADPH が、更には 3-ヒドロキ
シ酪酸が高精度を以って測定し得るのであって、この本
発明方法は被測定物質が低濃度の場合に、即ち微量成分
の場合にも有効性を発揮する。尚、本発明方法は 1 段
階操作なので、極めて簡便であり、測定所要時間も短縮
し、又多数の検体を処理するための汎用自動分析装置へ
の適用も可能となる。更に、本発明方法において使用さ
れる試薬の形態としては溶液状であっても、凍結乾燥状
であっても差し支えなく、殊に本発明方法は 1 段階法
なので、担体に全試薬を含浸させた上で乾燥させた形態
のものとすることもできる。
【００１６】本発明方法により NADH 及び NADPH を測
定することにより、NADH 及び NADPHを生成する酵素反
応における基質量、酵素活性を測定することができ、酵
素を作用させて最終的に NADH 及び NADPH を生成する
反応迄導き得るならば、種々の生化学物質等の定量に本
発明方法を利用することができ、例えば次のような反応
系を例示することができる。
定することにより、NADH 及び NADPHを生成する酵素反
応における基質量、酵素活性を測定することができ、酵
素を作用させて最終的に NADH 及び NADPH を生成する
反応迄導き得るならば、種々の生化学物質等の定量に本
発明方法を利用することができ、例えば次のような反応
系を例示することができる。
【００１７】
【化４】
【００１８】
【実施例等】次に試験例及び実施例により本発明を更に
詳細に且つ具体的に説明する。試験例 1 (A) 目的 酸化酵素の内には、例えばキサンチンオキシダーゼに代
表されるようにスーパーオキシドアニオンの生成能を有
しているものがある。そこで、ニトロテトラゾリウムブ
ルーの存在下で NADH に NAD(P)H オキシダーゼを作用
させ、ジホルマザンの生成量を測定することによって、
NAD(P)Hオキシダーゼがスーパーオキシドアニオンの生
成能を有しているか否かを調べる。 (B) 試液 a) 試液 1 NADH 200μM 燐酸緩衝液 (pH 7.5) 50mM b) 試液 2 FAD 0.1mM 燐酸緩衝液 (pH 7.0) 50mM c) 試液 3 ニトロテトラゾリウムブルー 1.2mM NAD(P)H オキシダーゼ 2300 U/l 燐酸緩衝液 (pH 7.0) 50mM (C) 操作 試液 1 を 40μl 採取して、これに試液 2 を 700μl
混和後，37℃ で 5 分間インキュベートする。この溶液
に試液 3 を 100μl 添加して，37℃ で 5 分間反応を
行い、550nm での吸光度を測定する。この測定は、試液
1 の代わりに上記の燐酸緩衝液を用いた試薬盲検を対
象として行った。その結果、550nm における吸光度は
0.096 であった。更に、試液 2 に SOD を 20mg/l 含有
させて上記と同様の操作を行った処、吸光度は 0.013
であった。このことから、NAD(P)H オキシダーゼは過酸
化水素の生成能だけではなく、スーパーオキシトアニオ
ンの生成能をも有していることが確認された。
詳細に且つ具体的に説明する。試験例 1 (A) 目的 酸化酵素の内には、例えばキサンチンオキシダーゼに代
表されるようにスーパーオキシドアニオンの生成能を有
しているものがある。そこで、ニトロテトラゾリウムブ
ルーの存在下で NADH に NAD(P)H オキシダーゼを作用
させ、ジホルマザンの生成量を測定することによって、
NAD(P)Hオキシダーゼがスーパーオキシドアニオンの生
成能を有しているか否かを調べる。 (B) 試液 a) 試液 1 NADH 200μM 燐酸緩衝液 (pH 7.5) 50mM b) 試液 2 FAD 0.1mM 燐酸緩衝液 (pH 7.0) 50mM c) 試液 3 ニトロテトラゾリウムブルー 1.2mM NAD(P)H オキシダーゼ 2300 U/l 燐酸緩衝液 (pH 7.0) 50mM (C) 操作 試液 1 を 40μl 採取して、これに試液 2 を 700μl
混和後，37℃ で 5 分間インキュベートする。この溶液
に試液 3 を 100μl 添加して，37℃ で 5 分間反応を
行い、550nm での吸光度を測定する。この測定は、試液
1 の代わりに上記の燐酸緩衝液を用いた試薬盲検を対
象として行った。その結果、550nm における吸光度は
0.096 であった。更に、試液 2 に SOD を 20mg/l 含有
させて上記と同様の操作を行った処、吸光度は 0.013
であった。このことから、NAD(P)H オキシダーゼは過酸
化水素の生成能だけではなく、スーパーオキシトアニオ
ンの生成能をも有していることが確認された。
【００１９】試験例 2 (スーパーオキシドアニオンと検
量線との関係) (A) 試液 a) 試液 1 MBTH 0.5mM SOD 20mg/l FAD 0.1mM 燐酸緩衝液 (pH 7.0) 50mM b) 試液 2 N-エチル-N-スルホプロピル-3,5-ジメチルアニリン 5.0mM ペルオキシダーゼ 72000 U/l NAD(P)H オキシダーゼ 2300 U/l 燐酸緩衝液 (pH 7.0) 50mM (B) 操作及び結果 0、20、50、100 又は 200μM の NADH 溶液 20μl に、
試液 1 を 350μl 添加して 37℃ で 5 分間インキュベ
ートした。この溶液に試液 2 を 50μl 添加して 37℃
で反応を行い、570nm における１分間当たりの吸光度変
化量を測定した。更に、試液 1 中の SOD を含有しない
試液を用いて上記と同様の操作を行い、SOD の有無に起
因する、吸光度変化量と NADH 濃度との関係を求めた。
結果は図１に示されている通りであり、SOD を含有して
いない場合には NADH 濃度と吸光度変化量の関係に直線
性が認められないのに対して、反応系に SOD を共存さ
せると両者が直線的な関係を呈するようになることが判
明した。
量線との関係) (A) 試液 a) 試液 1 MBTH 0.5mM SOD 20mg/l FAD 0.1mM 燐酸緩衝液 (pH 7.0) 50mM b) 試液 2 N-エチル-N-スルホプロピル-3,5-ジメチルアニリン 5.0mM ペルオキシダーゼ 72000 U/l NAD(P)H オキシダーゼ 2300 U/l 燐酸緩衝液 (pH 7.0) 50mM (B) 操作及び結果 0、20、50、100 又は 200μM の NADH 溶液 20μl に、
試液 1 を 350μl 添加して 37℃ で 5 分間インキュベ
ートした。この溶液に試液 2 を 50μl 添加して 37℃
で反応を行い、570nm における１分間当たりの吸光度変
化量を測定した。更に、試液 1 中の SOD を含有しない
試液を用いて上記と同様の操作を行い、SOD の有無に起
因する、吸光度変化量と NADH 濃度との関係を求めた。
結果は図１に示されている通りであり、SOD を含有して
いない場合には NADH 濃度と吸光度変化量の関係に直線
性が認められないのに対して、反応系に SOD を共存さ
せると両者が直線的な関係を呈するようになることが判
明した。
【００２０】実施例 (３ーヒドロキシ酪酸の測定) (A) 試液 a) 試液 1 NAD+ 0.7mM MBTH 0.5mM SOD 20mg/l FAD 0.1mM 燐酸緩衝液 (pH 7.0) 50mM b) 試液 2 3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ 3320 U/l N-エチル-N-スルホプロピル-3,5-ジメチルアニリン 50mM ペルオキシダーゼ 72000 U/l NAD(P)H オキシダーゼ 2300 U/l 燐酸緩衝液 (pH 7.0) 50mM (B) 標準検量線 濃度が既知の 3-ヒドロキシ酪酸標準液 20μl に、試液
1 を 350μl 添加して37℃ で 5 分間インキュベートし
た。この溶液に試液 2 を 50μl 添加して 37℃ で反応
を行い、570nm における 1 分間当たりの吸光度変化量
を測定し、この吸光度変化量と、用いた 3-ヒドロキシ
酪酸標準液の 3-ヒドロキシ酪酸濃度との関係を求めて
標準検量線を作成した。この標準検量線は図２に示され
ている。 (C) 血清中の 3-ヒドロキシ酪酸濃度の測定 上記の標準検量線作成のための操作と同様にして、但し
3-ヒドロキシ酪酸標準液の代わりに血清を検体として
用いることにより、吸光度変化量を測定し、この変化量
を図２に示される標準検量線と照合して血清中の 3-ヒ
ドロキシ酪酸濃度を求めた。この方法で血清中の 3-ヒ
ドロキシ酪酸を同時に 10 回測定した場合における同時
再現性は、20μM 付近で標準偏差 0.50、変動係数 1.93
% であり、良好な同時再現性を示した。
1 を 350μl 添加して37℃ で 5 分間インキュベートし
た。この溶液に試液 2 を 50μl 添加して 37℃ で反応
を行い、570nm における 1 分間当たりの吸光度変化量
を測定し、この吸光度変化量と、用いた 3-ヒドロキシ
酪酸標準液の 3-ヒドロキシ酪酸濃度との関係を求めて
標準検量線を作成した。この標準検量線は図２に示され
ている。 (C) 血清中の 3-ヒドロキシ酪酸濃度の測定 上記の標準検量線作成のための操作と同様にして、但し
3-ヒドロキシ酪酸標準液の代わりに血清を検体として
用いることにより、吸光度変化量を測定し、この変化量
を図２に示される標準検量線と照合して血清中の 3-ヒ
ドロキシ酪酸濃度を求めた。この方法で血清中の 3-ヒ
ドロキシ酪酸を同時に 10 回測定した場合における同時
再現性は、20μM 付近で標準偏差 0.50、変動係数 1.93
% であり、良好な同時再現性を示した。
【００２１】
【発明の効果】本発明によれば、NADH 及び NADPH の高
感度な且つ高精度な測定が可能となる。従って、本発明
による測定法は、例えば体液中に存在する種々の生化学
物質、酵素等を高精度を以って測定する必要のある臨床
検査試薬に効果的に利用することができる。尚、本発明
方法は 1 段階法であるために、操作が極めて簡便であ
り、従って汎用自動分析装置に適用の可能性をもたら
す。
感度な且つ高精度な測定が可能となる。従って、本発明
による測定法は、例えば体液中に存在する種々の生化学
物質、酵素等を高精度を以って測定する必要のある臨床
検査試薬に効果的に利用することができる。尚、本発明
方法は 1 段階法であるために、操作が極めて簡便であ
り、従って汎用自動分析装置に適用の可能性をもたら
す。
【図１】反応系に SOD が共存している場合と存在して
いない場合とにおける NADH 濃度と吸光度との関係を示
すグラフである。
いない場合とにおける NADH 濃度と吸光度との関係を示
すグラフである。
【図２】本発明による測定法を用いて 3-ヒドロキシ酪
酸濃度を測定するために作成された標準検量線としての
グラフである。
酸濃度を測定するために作成された標準検量線としての
グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 澤井 喜一 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社三和化学研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】 NADH 及び NADPH を測定する際に、NAD
(P)H オキシダーゼの作用により過酸化水素を発生させ
る工程と、酸化系発色剤を用いて過酸化水素を測定する
工程とを同時に行うことを特徴とする、NADH 及び NADP
H の測定法。 - 【請求項２】 NAD(P)H オキシダーゼの作用によって N
ADH及び NADPH から発生させた過酸化水素を測定するに
際して、酸化系発色剤としてペルオキシダーゼと、アニ
リン及びその誘導体から選択された物質と、3-メチル-2
-ベンゾチアゾリノン-ヒドラゾン及びその誘導体から選
択された物質とを組み合わせて用いることを特徴とす
る、請求項１に記載の NADH 及び NADPH の測定法。 - 【請求項３】 NAD(P)H オキシダーゼの作用により生成
する過酸化水素を測定するに際して、スーパーオキサイ
ドディスムターゼを NAD(P)H オキシダーゼと同時に反
応させることを特徴とする、請求項１又は２に記載の N
ADH 及び NADPH の測定法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3254272A JPH0564598A (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | Ｎａｄｈ及びｎａｄｐｈの測定法 |
| AT92114870T ATE146224T1 (de) | 1991-09-06 | 1992-08-31 | Verfahren zur messung von nadh und nadph |
| EP92114870A EP0530732B1 (en) | 1991-09-06 | 1992-08-31 | Method of measuring NADH and NADPH |
| DE69215797T DE69215797T2 (de) | 1991-09-06 | 1992-08-31 | Verfahren zur Messung von NADH und NADPH |
| ES92114870T ES2097843T3 (es) | 1991-09-06 | 1992-08-31 | Metodo para la medicion de nadh y nadph. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3254272A JPH0564598A (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | Ｎａｄｈ及びｎａｄｐｈの測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0564598A true JPH0564598A (ja) | 1993-03-19 |
Family
ID=17262669
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3254272A Pending JPH0564598A (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | Ｎａｄｈ及びｎａｄｐｈの測定法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0530732B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0564598A (ja) |
| AT (1) | ATE146224T1 (ja) |
| DE (1) | DE69215797T2 (ja) |
| ES (1) | ES2097843T3 (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3236388A1 (de) * | 1982-10-01 | 1984-04-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur selektiven herstellung reduzierter sauerstoffspezies und hierfuer geeignete reagentien |
| DE3725851A1 (de) * | 1986-08-12 | 1988-02-18 | Takara Shuzo Co | Nad(p)h-oxidase, verfahren zu ihrer isolierung und anwendung |
| JP2719709B2 (ja) * | 1988-11-28 | 1998-02-25 | 丸金醤油株式会社 | 胆汁酸硫酸サルファターゼ、その製造法及び胆汁酸の定量法 |
-
1991
- 1991-09-06 JP JP3254272A patent/JPH0564598A/ja active Pending
-
1992
- 1992-08-31 ES ES92114870T patent/ES2097843T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-31 AT AT92114870T patent/ATE146224T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-08-31 EP EP92114870A patent/EP0530732B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-31 DE DE69215797T patent/DE69215797T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69215797T2 (de) | 1997-05-07 |
| EP0530732A1 (en) | 1993-03-10 |
| ATE146224T1 (de) | 1996-12-15 |
| ES2097843T3 (es) | 1997-04-16 |
| EP0530732B1 (en) | 1996-12-11 |
| DE69215797D1 (de) | 1997-01-23 |
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