JPH0731498A - １，５−アンヒドログルシトールの定量用キット及び該キットを使用する定量法 - Google Patents
１，５−アンヒドログルシトールの定量用キット及び該キットを使用する定量法Info
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- JPH0731498A JPH0731498A JP17910793A JP17910793A JPH0731498A JP H0731498 A JPH0731498 A JP H0731498A JP 17910793 A JP17910793 A JP 17910793A JP 17910793 A JP17910793 A JP 17910793A JP H0731498 A JPH0731498 A JP H0731498A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 体液を試料とする 1,5-アンヒドログルシト
ールの定量用キット及び該キットを使用する定量法を提
供する。 【構成】 この定量用キットは凍結乾燥前処理試薬と、
凍結乾燥呈色試薬と、これら両試薬の各溶解用液との組
合せにより構成されている。検出用発色剤の主成分は 2
-ヒドラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メチル-6-ベンゾチアゾー
ルスルホン酸とアニリン誘導体であり、呈色試薬用の酵
素がピラノースオキシダーゼである。試料の前処理も酵
素反応により行なう。 【効果】 前処理により試料中の糖類の構造が変換さ
れ、呈色反応に際してピラノースオキシダーゼと反応し
ない。発色剤を構成する成分の組合せが本定量において
予期せぬ程の感度を発揮するので、市販の自動分析装置
に適用して低濃度域の高精度測定ができ、従って糖尿病
診断のための迅速且つ簡便な臨床検査を可能にする。
ールの定量用キット及び該キットを使用する定量法を提
供する。 【構成】 この定量用キットは凍結乾燥前処理試薬と、
凍結乾燥呈色試薬と、これら両試薬の各溶解用液との組
合せにより構成されている。検出用発色剤の主成分は 2
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ルスルホン酸とアニリン誘導体であり、呈色試薬用の酵
素がピラノースオキシダーゼである。試料の前処理も酵
素反応により行なう。 【効果】 前処理により試料中の糖類の構造が変換さ
れ、呈色反応に際してピラノースオキシダーゼと反応し
ない。発色剤を構成する成分の組合せが本定量において
予期せぬ程の感度を発揮するので、市販の自動分析装置
に適用して低濃度域の高精度測定ができ、従って糖尿病
診断のための迅速且つ簡便な臨床検査を可能にする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は 1,5-アンヒドログルシ
トールの定量用キット及び該キットを使用する定量法に
係り、糖尿病の臨床診断に利用されるものである。
トールの定量用キット及び該キットを使用する定量法に
係り、糖尿病の臨床診断に利用されるものである。
【０００２】
【従来の技術】1,5-アンヒドログルシトールは、糖尿病
に関連して体液、例えば血清、血漿及び尿中における濃
度が低下するために有用な糖尿病診断マーカとして近年
臨床上の重要な検査項目となっており、従って市販の自
動分析装置に適用可能な定量用キットの開発が強く望ま
れている。
に関連して体液、例えば血清、血漿及び尿中における濃
度が低下するために有用な糖尿病診断マーカとして近年
臨床上の重要な検査項目となっており、従って市販の自
動分析装置に適用可能な定量用キットの開発が強く望ま
れている。
【０００３】従来、1,5-アンヒドログルシトールの定量
はガスクロマトグラフィーにより行われていたが、最近
ピラノースオキシダーゼ (EC1.1.3.10)、L-ソルボース
オキシダーゼ (EC1.1.3.11) 等の酵素を作用させ、この
場合に生成する過酸化水素を利用して比色定量する方法
が開発された。上記のような酵素を用い且つ体液、例え
ば血清を試料として 1,5-ア ンヒドログルシトールを定
量しようとする場合に、この種の酵素は基質特異性が低
く、試料中に存在する糖類、主としてグルコースと反応
するために前処理を行って妨害反応を阻止することが必
要である。糖類による妨害を阻止する方法としては、カ
ラムを使用して物理的に除去する方法 (特開昭 63 - 18
5397 公報) と、ピラノースオキシダーゼ、L-ソルボー
スオキシダーゼ等と反応しない構造に糖類を変換する方
法とが提案されている。この後者による糖類の変換処理
は酵素反応を利用するのが一般的であり、変換用酵素と
してグルコースオキシダーゼ (特開平 1 - 320998 公
報)、ヘキソキナーゼ(特開平 2 - 104298 公報) 又はグ
ルコキナーゼ (特開平 3 - 27299 公報) を使用するこ
とが提案されている。
はガスクロマトグラフィーにより行われていたが、最近
ピラノースオキシダーゼ (EC1.1.3.10)、L-ソルボース
オキシダーゼ (EC1.1.3.11) 等の酵素を作用させ、この
場合に生成する過酸化水素を利用して比色定量する方法
が開発された。上記のような酵素を用い且つ体液、例え
ば血清を試料として 1,5-ア ンヒドログルシトールを定
量しようとする場合に、この種の酵素は基質特異性が低
く、試料中に存在する糖類、主としてグルコースと反応
するために前処理を行って妨害反応を阻止することが必
要である。糖類による妨害を阻止する方法としては、カ
ラムを使用して物理的に除去する方法 (特開昭 63 - 18
5397 公報) と、ピラノースオキシダーゼ、L-ソルボー
スオキシダーゼ等と反応しない構造に糖類を変換する方
法とが提案されている。この後者による糖類の変換処理
は酵素反応を利用するのが一般的であり、変換用酵素と
してグルコースオキシダーゼ (特開平 1 - 320998 公
報)、ヘキソキナーゼ(特開平 2 - 104298 公報) 又はグ
ルコキナーゼ (特開平 3 - 27299 公報) を使用するこ
とが提案されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題乃至発明の目的】前者に
よる糖類の除去方法を利用する 1,5-アンヒドログルシ
トール定量用キットは日本化薬株式会社から「ラナ A
G」なる商品名を以って既に市販されている。このキッ
トを用いる方法は糖類、主としてグルコースを除去する
ために専用ディスポーザブル (使い捨て) カラムに試料
(血清又は血漿) を添加し、次いで水を数回通過させて
1,5-アンヒドログルシトールを溶出させ、この溶出液
に発色試薬を添加 して 1 時間反応させた後に比色定量
することにより実施される。この方法は操 作が煩雑で
あり、全操作に約 1 時間 30 分程度を要するために自
動分析装置へ の適用が困難であり、測定作業のルーチ
ン化に課題がある。一方、酵素を利用して糖類の構造変
換を行なう前処理法を利用する方法は自動分析装置への
適用を期待し得ると考えられるが、実際には実用化され
るに至っていない。この原因は、比色定量する場合の検
出感度にあるものと推定される。即ち、血中グルコース
濃度は健常人の場合に約 100mg/dl であり、糖尿病患者
の場合には 1000mg/dl 以上に達するが、1,5-アンヒド
ログルシトールの濃度は健常人の場合に約 14μg/ml 以
上 (グルコースの約 1/100) であり、糖尿病患者ではグ
ルコースの場合と異なり 10μg/ml 以下に低下すると云
う特殊事情が存在する。又、自動分析装置に適用するた
めに酵素処理により一定時間内に多量のグルコースを構
造変換させるには酵素の能力に限界があるので試料の量
を可能な限り少なくしなければならない。しかし、この
ような場合、低濃度域の測定感度が低下する傾向が強
く、酵素を利用して糖類の構造変換を行い妨害反応を阻
止する前処理工程を含む従来の 1,5-アンヒドログルシ
トール定量法は高濃度域 (例えば30 - 50μg/ml 又はそ
れ以上) の場合では機器分析に適用可能であっても、臨
床検査の分野で要求される低濃度域 (例えば 0 - 10μg
/ml) での高精度測定には 適用できなかったからと考え
られる。
よる糖類の除去方法を利用する 1,5-アンヒドログルシ
トール定量用キットは日本化薬株式会社から「ラナ A
G」なる商品名を以って既に市販されている。このキッ
トを用いる方法は糖類、主としてグルコースを除去する
ために専用ディスポーザブル (使い捨て) カラムに試料
(血清又は血漿) を添加し、次いで水を数回通過させて
1,5-アンヒドログルシトールを溶出させ、この溶出液
に発色試薬を添加 して 1 時間反応させた後に比色定量
することにより実施される。この方法は操 作が煩雑で
あり、全操作に約 1 時間 30 分程度を要するために自
動分析装置へ の適用が困難であり、測定作業のルーチ
ン化に課題がある。一方、酵素を利用して糖類の構造変
換を行なう前処理法を利用する方法は自動分析装置への
適用を期待し得ると考えられるが、実際には実用化され
るに至っていない。この原因は、比色定量する場合の検
出感度にあるものと推定される。即ち、血中グルコース
濃度は健常人の場合に約 100mg/dl であり、糖尿病患者
の場合には 1000mg/dl 以上に達するが、1,5-アンヒド
ログルシトールの濃度は健常人の場合に約 14μg/ml 以
上 (グルコースの約 1/100) であり、糖尿病患者ではグ
ルコースの場合と異なり 10μg/ml 以下に低下すると云
う特殊事情が存在する。又、自動分析装置に適用するた
めに酵素処理により一定時間内に多量のグルコースを構
造変換させるには酵素の能力に限界があるので試料の量
を可能な限り少なくしなければならない。しかし、この
ような場合、低濃度域の測定感度が低下する傾向が強
く、酵素を利用して糖類の構造変換を行い妨害反応を阻
止する前処理工程を含む従来の 1,5-アンヒドログルシ
トール定量法は高濃度域 (例えば30 - 50μg/ml 又はそ
れ以上) の場合では機器分析に適用可能であっても、臨
床検査の分野で要求される低濃度域 (例えば 0 - 10μg
/ml) での高精度測定には 適用できなかったからと考え
られる。
【０００５】従って、本発明の基本的な目的は、臨床検
査で要求される低濃度域においても1,5-アンヒドログル
シトールを自動分析装置により高精度で測定することが
できる定量法を確立することであり、更に具体的な目的
は当該定量法を実施するための定量用キットを提供する
ことにある。
査で要求される低濃度域においても1,5-アンヒドログル
シトールを自動分析装置により高精度で測定することが
できる定量法を確立することであり、更に具体的な目的
は当該定量法を実施するための定量用キットを提供する
ことにある。
【０００６】
【課題を解決し目的を達成する手段及び作用】本発明に
よれば、上記の具体的な目的は、体液を試料とする 1,5
-アンヒドログルシトールの定量用キットであって、 a) 凍結乾燥品である前処理試薬と、凍結乾燥品である
呈色試薬と、これら両試薬の各溶解用液とから構成され
ており、 b) 検出用の発色剤が 2-ヒドラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メ
チル-6-ベンゾチアゾールスルホン酸と、アニリン誘導
体と、パーオキシダーゼであり、 c) 呈色試薬用の酵素がピラノースオキシダーゼであ
り、 d) 上記前処理試薬用の酵素が、試料中の糖類を上記の
ピラノースオキシダーゼと反応しない構造に変換する酵
素であり、 e) 上記の発色剤の内の 1 つ又はそれ以上の成分が前処
理試薬又は呈色試薬と合体されている1,5-アンヒドログ
ルシトールの定量用キットにより達成される。
よれば、上記の具体的な目的は、体液を試料とする 1,5
-アンヒドログルシトールの定量用キットであって、 a) 凍結乾燥品である前処理試薬と、凍結乾燥品である
呈色試薬と、これら両試薬の各溶解用液とから構成され
ており、 b) 検出用の発色剤が 2-ヒドラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メ
チル-6-ベンゾチアゾールスルホン酸と、アニリン誘導
体と、パーオキシダーゼであり、 c) 呈色試薬用の酵素がピラノースオキシダーゼであ
り、 d) 上記前処理試薬用の酵素が、試料中の糖類を上記の
ピラノースオキシダーゼと反応しない構造に変換する酵
素であり、 e) 上記の発色剤の内の 1 つ又はそれ以上の成分が前処
理試薬又は呈色試薬と合体されている1,5-アンヒドログ
ルシトールの定量用キットにより達成される。
【０００７】一方、上記の基本的な目的は、上記のキッ
トを用いる 1,5-アンヒドログルシトールの定量法であ
って、前処理試薬をその溶解用液で溶解させて体液に添
加し3 - 10 分間反応させ、次いで呈色試薬をその溶解
用液で溶解させた溶液を添加して更に 3 - 10 分間反応
させ、その間の単位時間当りの吸光度変化量を測定し、
該測定値を標準検量データと照合する、1,5-アンヒドロ
グルシトールの定量法により達成される。
トを用いる 1,5-アンヒドログルシトールの定量法であ
って、前処理試薬をその溶解用液で溶解させて体液に添
加し3 - 10 分間反応させ、次いで呈色試薬をその溶解
用液で溶解させた溶液を添加して更に 3 - 10 分間反応
させ、その間の単位時間当りの吸光度変化量を測定し、
該測定値を標準検量データと照合する、1,5-アンヒドロ
グルシトールの定量法により達成される。
【０００８】本発明による定量用キットは前処理試薬及
び呈色用試薬が共に凍結乾燥品であり、液剤はこれらの
試薬を溶解するための溶液 (緩衝液) のみであり、従っ
て簡便であって保存性に優れている。一方、本発明によ
る定量法は操作が容易であり、所要時間も短いために自
動分析装置へ適用することができ、測定感度も高く、1,
5-アンヒドログルシトール濃度が低い場合にも高精度を
以って測定することができる。従って、既述の課題はす
べて完全に解決される。
び呈色用試薬が共に凍結乾燥品であり、液剤はこれらの
試薬を溶解するための溶液 (緩衝液) のみであり、従っ
て簡便であって保存性に優れている。一方、本発明によ
る定量法は操作が容易であり、所要時間も短いために自
動分析装置へ適用することができ、測定感度も高く、1,
5-アンヒドログルシトール濃度が低い場合にも高精度を
以って測定することができる。従って、既述の課題はす
べて完全に解決される。
【０００９】発色剤の一成分として使用されるアニリン
誘導体としては種々の化合物を使用し得るが、感度の点
から N-エチル-N-(3-スルホプロピル)-3-メトキシアニ
リン(ADPS)、N-エチル-N-(3-スルホプロピル)-3,5-ジメ
チルアニリン (MAPS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-ス
ルホプロピル)-3-メチルアニリン (TOOS)、N-エチル-N-
(3-スルホプロピル)アニリン (ALPS)、N-エチル-N-(2-
ヒドロキシ-3-スルホプロピル)アニリン (ALOS) 又は N
-エチル-N-(3-スルホプロピル)-3-アニリン(TOPS) が好
ましい。発色剤を構成する 3 成分は、これらの全部を
前処理試薬又は呈色試薬と合体させることもできるが、
或る成分を前処理試薬と合体させ且つ他の成分を呈色試
薬と合体させるのが好ましい。この好ましい一例として
は、2-ヒドラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メチル-6-ベンゾチ
アゾールスルホン酸を前処理試薬と合体させ且つアニリ
ン誘導体及びパーオキシダーゼを呈色試薬と合体させる
組合せがある。パーオキシダーゼは反応液中に 5 - 50
U/ml 存在すれば充分である。一方、反応液中のアニリ
ン誘導体濃度は 0.2 - 10mM に且つ 2-ヒドラゾノ-2,3-
ジヒドロ-3-メチル-6-ベンゾチアゾールスルホン酸濃度
は 0.1 - 5mM に設定されるのが好ましい。何故なら
ば、必要以上の高濃度に設定すると試薬ブランクが大き
くなり、一方余り低濃度では感度不足となるからであ
る。
誘導体としては種々の化合物を使用し得るが、感度の点
から N-エチル-N-(3-スルホプロピル)-3-メトキシアニ
リン(ADPS)、N-エチル-N-(3-スルホプロピル)-3,5-ジメ
チルアニリン (MAPS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-ス
ルホプロピル)-3-メチルアニリン (TOOS)、N-エチル-N-
(3-スルホプロピル)アニリン (ALPS)、N-エチル-N-(2-
ヒドロキシ-3-スルホプロピル)アニリン (ALOS) 又は N
-エチル-N-(3-スルホプロピル)-3-アニリン(TOPS) が好
ましい。発色剤を構成する 3 成分は、これらの全部を
前処理試薬又は呈色試薬と合体させることもできるが、
或る成分を前処理試薬と合体させ且つ他の成分を呈色試
薬と合体させるのが好ましい。この好ましい一例として
は、2-ヒドラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メチル-6-ベンゾチ
アゾールスルホン酸を前処理試薬と合体させ且つアニリ
ン誘導体及びパーオキシダーゼを呈色試薬と合体させる
組合せがある。パーオキシダーゼは反応液中に 5 - 50
U/ml 存在すれば充分である。一方、反応液中のアニリ
ン誘導体濃度は 0.2 - 10mM に且つ 2-ヒドラゾノ-2,3-
ジヒドロ-3-メチル-6-ベンゾチアゾールスルホン酸濃度
は 0.1 - 5mM に設定されるのが好ましい。何故なら
ば、必要以上の高濃度に設定すると試薬ブランクが大き
くなり、一方余り低濃度では感度不足となるからであ
る。
【００１０】前処理試薬の主成分を構成する酵素は、既
述のように、試料中に含有されている糖類の構造を変換
して妨害反応を阻止する酵素であり、例えばヘキソキナ
ーゼ及びグルコキナーゼが使用できる。上記の作用を有
する酵素としてはグルコースオキシダーゼやグルコース
デヒドロゲナーゼも存在し、これらの酵素は使用し得な
い訳ではないが、これらの酵素がグルコースに作用して
生成する D-グルコノ-δ-ラクトンが呈色試薬用の酵素
であるピラノースオキシダーゼと僅かではあるが反応す
るので、好ましくない。尚、前処理試薬は酵素反応に必
要な自体周知の補酵素や反応促進剤を含有していること
ができる。
述のように、試料中に含有されている糖類の構造を変換
して妨害反応を阻止する酵素であり、例えばヘキソキナ
ーゼ及びグルコキナーゼが使用できる。上記の作用を有
する酵素としてはグルコースオキシダーゼやグルコース
デヒドロゲナーゼも存在し、これらの酵素は使用し得な
い訳ではないが、これらの酵素がグルコースに作用して
生成する D-グルコノ-δ-ラクトンが呈色試薬用の酵素
であるピラノースオキシダーゼと僅かではあるが反応す
るので、好ましくない。尚、前処理試薬は酵素反応に必
要な自体周知の補酵素や反応促進剤を含有していること
ができる。
【００１１】凍結乾燥品である前処理試薬及び呈色試薬
の調製に使用される溶解用液並びに用時にこれらの試薬
を溶解させるための溶液である緩衝剤は、酵素反応の至
適pH である 5 - 9、好ましくは 6.5 - 8.0 程度に調整
し得るものであれば格別の限定はなく、例えばトリス-
塩酸緩衝液、燐酸緩衝液等を使用することができる。
の調製に使用される溶解用液並びに用時にこれらの試薬
を溶解させるための溶液である緩衝剤は、酵素反応の至
適pH である 5 - 9、好ましくは 6.5 - 8.0 程度に調整
し得るものであれば格別の限定はなく、例えばトリス-
塩酸緩衝液、燐酸緩衝液等を使用することができる。
【００１２】尚、本発明に関連して付言すれば、下記の
通りである。呈色試薬用酵素としてピラノースオキシダ
ーゼを用いた 1,5-アンヒドログルシトールの定量法を
一般に市販されている自動分析装置に適用する場合に
は、この酵素の作用によって生成する過酸化水素を比色
定量するための発色剤の成分として 2-ヒドラゾノ-2,3-
ジヒドロ-3-メチル-6-ベンゾチアゾールスルホン酸とア
ニリン誘導体との組合せを用いることによって初めて高
感度且つ高精度な測定が可能となり、臨床検査目的に供
し得る実用的なものとなる。本発明において用いられる
発色剤は、従来から過酸化水素の比色定量に用いられて
おり、4-アミノアンチピリンとアニリン誘導体の組合せ
よりも、同一条件にて測定した場合に、約2 倍程度測定
感度が高い試薬の組合せとされている。何故ならば、例
えば pH を7 とし且つアニリン誘導体として TOOS を選
択した場合に、4-アミノアンチピリンと TOOS とを組合
わせた場合のモル吸光係数は約 30000 であり、2-ヒド
ラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メチル-6-ベンゾチアゾールス
ルホン酸と TOOS とを組合わせた場合のモル吸光係数は
約 50000 だからである。しかしながら、これらの発色
剤を 1,5-アンヒドログルシトールの定量に適用した
処、2-ヒドラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メチル-6-ベンゾチ
アゾールスルホン酸とアニリン誘導体とを組合わせる
と、4-アミノアンチピリンとアニリン誘導体とを組合わ
せた場合よりも 4 - 5 倍の感度上昇がもたらされると
云う事実が判明した。この感度上昇の程度は全く予期し
得ないものであり、この著しい感度上昇が試料の微量
化、測定妨害物質である糖類の量の減少及びその構造変
換所要時間の短縮 (例えば、ヘキソキナーゼを用いた場
合には 5 分間の反応時間で 2000mg/dl のグルコースを
構造変換可能)、低濃度域での測定精度の向上をもたら
し、これらが相俟って臨床検査目的での自動分析装置に
よる 1,5-アンヒドログルシトールの定量が可能となっ
たのである。尚、本発明方法において 1,5-アンヒドロ
グルシトールの定量は、ピラノースオキシダーゼの作用
により生成する過酸化水素が発色剤を呈色させるので、
当該反応溶液の吸光度を測定するすることにより行われ
るが、この吸光度測定は反応の終点で測定するエンドポ
イント法を用いることも、或いは単位時間、例えば 1分
間当りの吸光度変化量を測定するレート法の何れを用い
ても行うことができる。但し、ピラノースオキシダーゼ
反応を 5 分間行い、エンドポイント法を実施する場合
にはピラノースオキシダーゼが反応液中において 35 U/
ml 以上必要であり、一方レート法を採用する場合には
2 - 20 U/ml で充分な吸光度変化が得られ、又エンドポ
イント法には下記の問題点があるので、本発明において
はレート法が採用される。反応を完結させてから測定す
るエンドポイント法を採用する場合には、1,5-アンヒド
ログルシトールに対するピラノースオキシダーゼの活性
が低いために、当該酵素の所要量が大となり、又反応所
要時間も長くなる。試料中には種々の糖類が含まれてお
り、極く微量に存在する糖類の構造変換まで行うのは極
めて困難であるために酵素量を高めたり、反応時間を長
く設定することは酵素の基質特異性が高くないために測
定値に誤差を招く虞がある。従って、本発明においては
レート法を採用し、少量の酵素を用い且つ短時間で定量
を行うことにより微量糖類が及ぼす影響を最小限に留め
るのである。尚、レート法による比色定量は上記の利点
を有する反面において、エンドポイント法と比較して測
定感度が低くなる傾向があるが、発色剤の感度が既述の
ように極めて高いので、その欠点が充分に補われて高精
度定量が可能となる。
通りである。呈色試薬用酵素としてピラノースオキシダ
ーゼを用いた 1,5-アンヒドログルシトールの定量法を
一般に市販されている自動分析装置に適用する場合に
は、この酵素の作用によって生成する過酸化水素を比色
定量するための発色剤の成分として 2-ヒドラゾノ-2,3-
ジヒドロ-3-メチル-6-ベンゾチアゾールスルホン酸とア
ニリン誘導体との組合せを用いることによって初めて高
感度且つ高精度な測定が可能となり、臨床検査目的に供
し得る実用的なものとなる。本発明において用いられる
発色剤は、従来から過酸化水素の比色定量に用いられて
おり、4-アミノアンチピリンとアニリン誘導体の組合せ
よりも、同一条件にて測定した場合に、約2 倍程度測定
感度が高い試薬の組合せとされている。何故ならば、例
えば pH を7 とし且つアニリン誘導体として TOOS を選
択した場合に、4-アミノアンチピリンと TOOS とを組合
わせた場合のモル吸光係数は約 30000 であり、2-ヒド
ラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メチル-6-ベンゾチアゾールス
ルホン酸と TOOS とを組合わせた場合のモル吸光係数は
約 50000 だからである。しかしながら、これらの発色
剤を 1,5-アンヒドログルシトールの定量に適用した
処、2-ヒドラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メチル-6-ベンゾチ
アゾールスルホン酸とアニリン誘導体とを組合わせる
と、4-アミノアンチピリンとアニリン誘導体とを組合わ
せた場合よりも 4 - 5 倍の感度上昇がもたらされると
云う事実が判明した。この感度上昇の程度は全く予期し
得ないものであり、この著しい感度上昇が試料の微量
化、測定妨害物質である糖類の量の減少及びその構造変
換所要時間の短縮 (例えば、ヘキソキナーゼを用いた場
合には 5 分間の反応時間で 2000mg/dl のグルコースを
構造変換可能)、低濃度域での測定精度の向上をもたら
し、これらが相俟って臨床検査目的での自動分析装置に
よる 1,5-アンヒドログルシトールの定量が可能となっ
たのである。尚、本発明方法において 1,5-アンヒドロ
グルシトールの定量は、ピラノースオキシダーゼの作用
により生成する過酸化水素が発色剤を呈色させるので、
当該反応溶液の吸光度を測定するすることにより行われ
るが、この吸光度測定は反応の終点で測定するエンドポ
イント法を用いることも、或いは単位時間、例えば 1分
間当りの吸光度変化量を測定するレート法の何れを用い
ても行うことができる。但し、ピラノースオキシダーゼ
反応を 5 分間行い、エンドポイント法を実施する場合
にはピラノースオキシダーゼが反応液中において 35 U/
ml 以上必要であり、一方レート法を採用する場合には
2 - 20 U/ml で充分な吸光度変化が得られ、又エンドポ
イント法には下記の問題点があるので、本発明において
はレート法が採用される。反応を完結させてから測定す
るエンドポイント法を採用する場合には、1,5-アンヒド
ログルシトールに対するピラノースオキシダーゼの活性
が低いために、当該酵素の所要量が大となり、又反応所
要時間も長くなる。試料中には種々の糖類が含まれてお
り、極く微量に存在する糖類の構造変換まで行うのは極
めて困難であるために酵素量を高めたり、反応時間を長
く設定することは酵素の基質特異性が高くないために測
定値に誤差を招く虞がある。従って、本発明においては
レート法を採用し、少量の酵素を用い且つ短時間で定量
を行うことにより微量糖類が及ぼす影響を最小限に留め
るのである。尚、レート法による比色定量は上記の利点
を有する反面において、エンドポイント法と比較して測
定感度が低くなる傾向があるが、発色剤の感度が既述の
ように極めて高いので、その欠点が充分に補われて高精
度定量が可能となる。
【００１３】
【実施例等】次に測定感度比較試験、製造例及び試験例
に関連して本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。測定感度比較試験例 発色用化合物として、 本発明 : 2-ヒドラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メチル-6-ベ
ンゾチアゾールスルホン酸 (測定波長 : 570nm)、 従来技術 : 4-アミノアンチピリン (測定波長 : 550nm) を採択し且つ呈色化合物として N-エチル-N-(2-ヒドロ
キシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン (TOOS) を
共通の物質として採択することにより下記の試液 A(上
記のように、発色用化合物は 2 種類存在するので、2
種類) 及び B を調製した。 試液 A : 発色用化合物 1 mM パーオキシダーゼ 20 U/ml トリス-塩酸緩衝液 (pH 7.5) 0.1 M 試液 B : ピラノースオキシダーゼ 80 U/ml TOOS 18 mM 操作及び結果 :1,5-アンヒドログルシトールを 0、20
又は 50μg/ml 含有している水溶液を試料とし、該試料
5μl に試液 A を 175μl 添加し 37℃ において 5 分
間予備加温した。次いで、試液 B を 25μl 添加して 5
分間反応させ、その間の 1 分間当り の吸光度変化量
(ABS/min) を測定した。結果は図 1 に示されている通
りであった。モル吸光係数から導かれる理論上の感度は
本発明方法に使用される発色剤の組合せが従来技術方法
の場合と比較して約 2 倍程度高くなる筈であるが、図
1 に示される結果は約 4.4 倍高いことを示している。
に関連して本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。測定感度比較試験例 発色用化合物として、 本発明 : 2-ヒドラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メチル-6-ベ
ンゾチアゾールスルホン酸 (測定波長 : 570nm)、 従来技術 : 4-アミノアンチピリン (測定波長 : 550nm) を採択し且つ呈色化合物として N-エチル-N-(2-ヒドロ
キシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン (TOOS) を
共通の物質として採択することにより下記の試液 A(上
記のように、発色用化合物は 2 種類存在するので、2
種類) 及び B を調製した。 試液 A : 発色用化合物 1 mM パーオキシダーゼ 20 U/ml トリス-塩酸緩衝液 (pH 7.5) 0.1 M 試液 B : ピラノースオキシダーゼ 80 U/ml TOOS 18 mM 操作及び結果 :1,5-アンヒドログルシトールを 0、20
又は 50μg/ml 含有している水溶液を試料とし、該試料
5μl に試液 A を 175μl 添加し 37℃ において 5 分
間予備加温した。次いで、試液 B を 25μl 添加して 5
分間反応させ、その間の 1 分間当り の吸光度変化量
(ABS/min) を測定した。結果は図 1 に示されている通
りであった。モル吸光係数から導かれる理論上の感度は
本発明方法に使用される発色剤の組合せが従来技術方法
の場合と比較して約 2 倍程度高くなる筈であるが、図
1 に示される結果は約 4.4 倍高いことを示している。
【００１４】製造例 下記の要領で前処理試薬、呈色試薬及びこれら試薬の溶
解用液を調製し、これらを 1 組にセットして 1,5-アン
ヒドログルシトール定量用キットを製造した。このキッ
トは 100 回分の測定用である。 a) 前処理試薬 2-ヒドラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メチル-6-ベンゾチアゾ
ールスルホン酸 6.0mg、パーオキシダーゼ 400 U、ヘキ
ソキナーゼ 400 U、ATP 8.4mg、ホスホエノールピルビ
ン酸三ナトリウム 400mg、ピルビン酸キナーゼ 470 U
及び蔗糖 40mgを 20mM トリス-塩酸緩衝液 (pH 7.5) 2m
l に添加し、溶解させた溶液を褐色瓶に入れ、凍結乾燥
させることにより調製。 b) 呈色試薬 N-エチル-N-(3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン
(MAPS) 16.2mg、ピラノースオキシダーゼ 240 U 及び
蔗糖 20mg を 20mM トリス-塩酸緩衝液 (pH7.5) 1ml に
添加し、溶解させた溶液を褐色瓶に入れ、凍結乾燥させ
ることにより調製。 c) 前処理試薬溶解用液 14.4mM の塩化マグネシウムを含有する 0.1M トリス-塩
酸緩衝液 (pH 7.5) を調製して、容器に 20ml 入れたも
の。 d) 呈色試薬溶解用液 0.1M トリス-塩酸緩衝液 (pH 7.5) を調製して、容器に
4ml 入れたもの。
解用液を調製し、これらを 1 組にセットして 1,5-アン
ヒドログルシトール定量用キットを製造した。このキッ
トは 100 回分の測定用である。 a) 前処理試薬 2-ヒドラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メチル-6-ベンゾチアゾ
ールスルホン酸 6.0mg、パーオキシダーゼ 400 U、ヘキ
ソキナーゼ 400 U、ATP 8.4mg、ホスホエノールピルビ
ン酸三ナトリウム 400mg、ピルビン酸キナーゼ 470 U
及び蔗糖 40mgを 20mM トリス-塩酸緩衝液 (pH 7.5) 2m
l に添加し、溶解させた溶液を褐色瓶に入れ、凍結乾燥
させることにより調製。 b) 呈色試薬 N-エチル-N-(3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン
(MAPS) 16.2mg、ピラノースオキシダーゼ 240 U 及び
蔗糖 20mg を 20mM トリス-塩酸緩衝液 (pH7.5) 1ml に
添加し、溶解させた溶液を褐色瓶に入れ、凍結乾燥させ
ることにより調製。 c) 前処理試薬溶解用液 14.4mM の塩化マグネシウムを含有する 0.1M トリス-塩
酸緩衝液 (pH 7.5) を調製して、容器に 20ml 入れたも
の。 d) 呈色試薬溶解用液 0.1M トリス-塩酸緩衝液 (pH 7.5) を調製して、容器に
4ml 入れたもの。
【００１５】上記の定量用キットを使用する、体液中の
1,5-アンヒドログルシトールの測定操作は下記の通り
である。市販の自動分析装置 (日本ロシュ株式会社から
市販の「COBAS MIRA」) の場合には、試料としての体
液、例えば血清 5μl に前処理試液を 175μl 添加して
37℃ で 5 分間反応させ、次いで呈色試薬を 25μl 添
加して更に 5 分間反応させ、その間の 1 分間当りの吸
光度変化量 (ABS/min) を測定する。試料血清中の1,5-
アンヒドログルシトール濃度は、濃度が既知の 1,5-ア
ンヒドログルシトール標準液を試料として吸光度変化量
を測定することにより予め作成されていた標準検量線
(本製造例による定量用キットの場合とアニリン誘導体
の種類が異なるが、既述の「測定感度比較試験」におけ
る結果を示す添付図面の図 1 も一種の標準検量線であ
る) に照合して求める (勿論、自動分析装置を使用して
測定を行なう場合には、標準検量線に相当するデータを
装置に記憶させておき、試料に関する測定値と自動照合
させる)。
1,5-アンヒドログルシトールの測定操作は下記の通り
である。市販の自動分析装置 (日本ロシュ株式会社から
市販の「COBAS MIRA」) の場合には、試料としての体
液、例えば血清 5μl に前処理試液を 175μl 添加して
37℃ で 5 分間反応させ、次いで呈色試薬を 25μl 添
加して更に 5 分間反応させ、その間の 1 分間当りの吸
光度変化量 (ABS/min) を測定する。試料血清中の1,5-
アンヒドログルシトール濃度は、濃度が既知の 1,5-ア
ンヒドログルシトール標準液を試料として吸光度変化量
を測定することにより予め作成されていた標準検量線
(本製造例による定量用キットの場合とアニリン誘導体
の種類が異なるが、既述の「測定感度比較試験」におけ
る結果を示す添付図面の図 1 も一種の標準検量線であ
る) に照合して求める (勿論、自動分析装置を使用して
測定を行なう場合には、標準検量線に相当するデータを
装置に記憶させておき、試料に関する測定値と自動照合
させる)。
【００１６】試験例 1 (グルコースが及ぼす影響) 1 種類の血清 9 に対して、各種濃度のグルコース水溶
液を 1 の割合で添加して試料血清を作成し、既述の
「製造例」の後段において述べた操作手順に従って吸光
度変化量を測定することにより各試料血清中の 1,5-ア
ンヒドログルシトール濃度値にグルコースが及ぼす影響
を調べた。結果は下記の表 1 に示される通りであり、
試料中にグルコースが 2000mg/dl量迄存在しても、前処
理により構造が変換され測定値に及ぼす影響は殆どない
ことが判明した。
液を 1 の割合で添加して試料血清を作成し、既述の
「製造例」の後段において述べた操作手順に従って吸光
度変化量を測定することにより各試料血清中の 1,5-ア
ンヒドログルシトール濃度値にグルコースが及ぼす影響
を調べた。結果は下記の表 1 に示される通りであり、
試料中にグルコースが 2000mg/dl量迄存在しても、前処
理により構造が変換され測定値に及ぼす影響は殆どない
ことが判明した。
【００１７】
【表１】
【００１８】試験例 2 (同時再現性) 1,5-アンヒドログルシトール濃度が異なる 4 種類の血
清を試料とし、既述の「製造例」の後段において述べた
操作手順に従って吸光度変化量を 5 回測定することに
より各試料血清中の 1,5-アンヒドログルシトール濃度
の同時再現性を求めた。結果は下記の表 2 に示される
通りであり、本発明方法は良好な同時再現性を有してい
ることが判明した。
清を試料とし、既述の「製造例」の後段において述べた
操作手順に従って吸光度変化量を 5 回測定することに
より各試料血清中の 1,5-アンヒドログルシトール濃度
の同時再現性を求めた。結果は下記の表 2 に示される
通りであり、本発明方法は良好な同時再現性を有してい
ることが判明した。
【００１９】
【表２】 表 2 中において、実測値及び平均値に関する単位は μ
g/ml である。
g/ml である。
【００２０】試験例 3 (他の定量法との相関) 30 種類の血清試料につき、既述の製造例による定量用
キットと、日本化薬株式会社から市販の定量用キットで
ある「ラナ AG」とを用いて試料中の 1,5-アンヒドログ
ルシトール濃度を測定した (本発明によるキットを用い
た場合は機器分析であり、市販のキットを用いた場合に
は用手法により測定)。測定結果の対比は図 2 に示され
る通りであり、相関係数は 0.994 であって両方法は高
い相関性を有していることが判明した。
キットと、日本化薬株式会社から市販の定量用キットで
ある「ラナ AG」とを用いて試料中の 1,5-アンヒドログ
ルシトール濃度を測定した (本発明によるキットを用い
た場合は機器分析であり、市販のキットを用いた場合に
は用手法により測定)。測定結果の対比は図 2 に示され
る通りであり、相関係数は 0.994 であって両方法は高
い相関性を有していることが判明した。
【００２１】
【発明の効果】本発明は保存性に優れた、体液中の 1,5
-アンヒドログルシトール定量用キット及び該キットを
用いる定量法を提供する。糖尿病の臨床診断目的で当該
物質を測定するためには 10μg/ml 以下迄と云う低濃度
域測定が要求され、従来、これが機器分析を極めて困難
乃至不可能としてきたが、本発明方法は機器分析で臨床
上の当該要求を満たす。
-アンヒドログルシトール定量用キット及び該キットを
用いる定量法を提供する。糖尿病の臨床診断目的で当該
物質を測定するためには 10μg/ml 以下迄と云う低濃度
域測定が要求され、従来、これが機器分析を極めて困難
乃至不可能としてきたが、本発明方法は機器分析で臨床
上の当該要求を満たす。
【図１】本発明方法と従来法との測定感度の比較を示す
グラフである。
グラフである。
【図２】本発明による定量用キットと、市販の定量用キ
ットとを用いて血清試料中の1,5-アンヒドログルシトー
ルを測定し、測定結果の相関を示したグラフである。
ットとを用いて血清試料中の1,5-アンヒドログルシトー
ルを測定し、測定結果の相関を示したグラフである。
Claims (6)
- 【請求項１】 体液を試料とする 1,5-アンヒドログル
シトールの定量用キットであって、 a) 凍結乾燥品である前処理試薬と、凍結乾燥品である
呈色試薬と、これら両試薬の各溶解用液とから構成され
ており、 b) 検出用の発色剤が 2-ヒドラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メ
チル-6-ベンゾチアゾールスルホン酸と、アニリン誘導
体と、パーオキシダーゼであり、 c) 呈色試薬用の酵素がピラノースオキシダーゼであ
り、 d) 上記前処理試薬用の酵素が、試料中の糖類を上記の
ピラノースオキシダーゼと反応しない構造に変換する酵
素であり、 e) 上記の発色剤の内の 1 つ又はそれ以上の成分が前処
理試薬又は呈色試薬と合体されていることを特徴とす
る、1,5-アンヒドログルシトールの定量用キット。 - 【請求項２】 アニリン誘導体が N-エチル-N-(3-スル
ホプロピル)-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-(3-スル
ホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン、N-エチル-N-(2-ヒ
ドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン、N-エ
チル-N-(3-スルホプロピル)アニリン、N-エチル-N-(2-
ヒドロキシ-3-スルホプロピル)アニリン及びN-エチル-N
-(3-スルホプロピル)-3-アニリンから選択されたもので
あることを特徴とする、請求項 1 に記載の 1,5-アンヒ
ドログルシトールの定量用キット。 - 【請求項３】 前処理試薬及び呈色試薬用の各溶解用液
が緩衝液がであって、その pH が共に 5 - 9 であるこ
とを特徴とする、請求項 1 又は 2 に記載の 1,5-アン
ヒドログルシトールの定量用キット。 - 【請求項４】 体液中の 1,5-アンヒドログルシトール
を定量するためのキットであって、 a) 凍結乾燥品である前処理試薬と、凍結乾燥品である
呈色試薬と、これら両試薬の各溶解用液とから構成され
ており、 b) 検出用の発色剤が 2-ヒドラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メ
チル-6-ベンゾチアゾールスルホン酸と、アニリン誘導
体と、パーオキシダーゼであり、 c) 呈色試薬用の酵素がピラノースオキシダーゼであ
り、 d) 上記前処理試薬用の酵素が、試料中の糖類を上記の
ピラノースオキシダーゼと反応しない構造に変換する酵
素であり、 e) 上記の発色剤の内の 1 つ又はそれ以上の成分が前処
理試薬又は呈色試薬と合体されているキットを用いる
1,5-アンヒドログルシトールの定量法において、 前処理試薬をその溶解用液に溶解させて体液に添加し 3
- 10 分間反応させ、次いで呈色試薬をその溶解用液で
溶解させた溶液を添加して更に 3 - 10 分間反応させ、
その間の単位時間当りの吸光度変化量を測定し、該測定
値を標準検量データと照合することを特徴とする、1,5-
アンヒドログルシトールの定量法。 - 【請求項５】 反応液中のピラノースオキシダーゼ濃度
が 2 - 20 U/ml に設定されることを特徴とする、請求
項 4 に記載の 1,5-アンヒドログルシトールの定量法。 - 【請求項６】 アニリン誘導体が N-エチル-N-(3-スル
ホプロピル)-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-(3-スル
ホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン、N-エチル-N-(2-ヒ
ドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン、N-エ
チル-N-(3-スルホプロピル)アニリン、N-エチル-N-(2-
ヒドロキシ-3-スルホプロピル)アニリン及びN-エチル-N
-(3-スルホプロピル)-3-アニリンから選択されたもので
あり、反 応液中のアニリン誘導体濃度が 0.2 - 10mM
に且つ 2-ヒドラゾノ-2,3-ジヒドロ-3-メチル-6-ベンゾ
チアゾールスルホン酸濃度が 0.1 - 5mM に設定される
ことを特徴とする、請求項 4 又は 5 に記載の 1,5-ア
ンヒドログルシトールの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17910793A JPH0731498A (ja) | 1993-07-20 | 1993-07-20 | １，５−アンヒドログルシトールの定量用キット及び該キットを使用する定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17910793A JPH0731498A (ja) | 1993-07-20 | 1993-07-20 | １，５−アンヒドログルシトールの定量用キット及び該キットを使用する定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0731498A true JPH0731498A (ja) | 1995-02-03 |
Family
ID=16060148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17910793A Pending JPH0731498A (ja) | 1993-07-20 | 1993-07-20 | １，５−アンヒドログルシトールの定量用キット及び該キットを使用する定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0731498A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5776719A (en) * | 1997-07-07 | 1998-07-07 | Mercury Diagnostics, Inc. | Diagnostic compositions and devices utilizing same |
| CN100349105C (zh) * | 2004-10-08 | 2007-11-14 | 株式会社东芝 | 信息处理装置 |
| JP2007300818A (ja) * | 2006-05-09 | 2007-11-22 | Ikeda Shokken Kk | ピラノースオキシダーゼ |
| CN112255219A (zh) * | 2020-10-12 | 2021-01-22 | 中拓生物有限公司 | 一种1,5-脱水山梨醇的测定试剂盒及其制备方法和应用 |
-
1993
- 1993-07-20 JP JP17910793A patent/JPH0731498A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5776719A (en) * | 1997-07-07 | 1998-07-07 | Mercury Diagnostics, Inc. | Diagnostic compositions and devices utilizing same |
| CN100349105C (zh) * | 2004-10-08 | 2007-11-14 | 株式会社东芝 | 信息处理装置 |
| JP2007300818A (ja) * | 2006-05-09 | 2007-11-22 | Ikeda Shokken Kk | ピラノースオキシダーゼ |
| CN112255219A (zh) * | 2020-10-12 | 2021-01-22 | 中拓生物有限公司 | 一种1,5-脱水山梨醇的测定试剂盒及其制备方法和应用 |
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