【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
産業上の利用分野
本発明はストレプトミセス属に属する微生物が
産生する化合物KS−619−１を含有してなる血管
拡張剤に関する。
従来の技術
有用な新規生理活性物質を提供するという目的
のもとに、天然界より入手した数多くの微生物の
生産物について研究を行つた結果、新たに分離し
た微生物の培養物中に血管拡張作用を有する生理
活性物質が生産される事実を見い出した。つい
で、該培養物から該物質を単離、精製し、その理
化学的性質を調べたところ新規生理活性物質であ
ることが判明した。以下、該物質をKS−619−１
と称する。
微生物によつて製造される血管拡張剤として
は、ストレプトミセス・オーレオフアシエンスの
菌株を培養することによつて生産されるWS−
1228A及びＢが知られている〔J.Antibiotics35
151〜156（1982）、同35，157〜163（1982）〕。
発明が解決しようとする問題点
有用な血管拡張剤は常に求められている。
問題点を解決するための手段
KS−619−１は血管拡張作用を有し動脈を拡張
し、末梢血流を増加させ総括的な血圧を降下させ
ることができる薬物である血管拡張剤として有用
である。すなわち、KS−619−１は高血圧、狭心
症、末梢循環不全等の予防治療もしくは処置のた
めに有用である。すなわち、本発明はKS−619−
１単独もしくは有効量のKS−619−１と少なくと
も１種の医薬用補助剤を含有してなる血管拡張剤
に関する。
これらの目的のための投与量は目的とする治療
効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等によつ
て異なるが、通常経口もしくは非経口投与（例え
ば注射、塗布、吸入等）の場合大人に対し１日あ
たり0.1〜４mg／Kgである。KS−619−１はその
まま投与することもできるが、通常錠剤、丸剤、
粉末剤、粒剤、カプセル剤、坐剤、注射等の形態
で投与する。
常用の製剤上許容される補助剤を本発明の医薬
組成物のために用いることができる。かかる補助
剤は水、ラクトース、デキストロース、シユクロ
ース、ソルビトール、マニトール、グルコース、
セルロース、シクロデキストリン、タルク、スタ
ーチ、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴ
ム、ポリエチレングリコール、カルボキシメチル
セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、安
息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ステ
アリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウ
ム、鉱物油、植物油、白色ワセリン、液体パラフ
イン等を包含し、製剤の種類によつて適当に選択
する。本組成物は通常KS−619−１を0.01〜85重
量％含有する。
KS−619−１のマウスにおける急性毒性
（LD50）は300mg／Kgpo及び100mg／Kgipである。
KS−619−１は下記式（）で示される化合物
であり、以下の理化学的性質を有する。
性状：橙色粉末
融点：198〜200℃（分解）。198℃付近から褐変し
始め、明瞭な融点を示さない。
比旋光度：〔α〕20 DはKS−619−１の強い可視部吸
収がナトリウム−Ｄ線と重なるため測定で
きなかつた。
溶解性：酢酸に易溶、メタノール、エタノール、
アセトン、酢酸エチル、ブタノールに可
溶、クロロホルム、水に難溶。
呈色反応：塩化第二鉄，ヨウ素およびアニスアル
デヒドの各反応に陽性。
可視部吸収スペクトル：第１図
λmax（Ｅ％）は83％（Ｖ／Ｖ）メタノール水
中（中性）で470（339）nm、
0.08N HC−83％（Ｖ／Ｖ）メタノール水中
で450−475（330）nm、
0.08N NaOH−83％（Ｖ／Ｖ）メタノール水
中で390−410（250），515（340）nm
紫外部吸収スペクトル：第２図
λmax（Ｅ％）は83％メタノール水中（中性）
で225（816），302（587），317（542）nm、
0.08N HC−83％（Ｖ／Ｖ）メタノール水中
で240（761），265（491），300（681），345（236）
nm、
0.08N NaOH−83％（Ｖ／Ｖ）メタノール水
中で242（877），298（540），330（721）nm
赤外部吸収スペクトル（KBr）
3380，2960，2900，2840，1697，1664，1618，
1594，1490，1476，1428，1401，1390，1358，
1340，1319，1260，1216，1168，1105，1065，
1029，1021，998，980，921，860，823，772，
757，643，592，575cm-1
マススペクトル：本物質のマススペクトルは次の
ようなイオンを与える。
457（M+−17，ベース・ピーク），431，388
分子量：474
元素分析：（実測値）Ｈ：3.68，Ｃ：65.52，Ｎ：
０％
（計算値）C26H18O9として
Ｈ：3.79，Ｃ：65.82，Ｏ：30.38，
Ｎ：０％1
H−NMRスペクトル（400MHz，DMSO−d6，
δ）
12.51（1H，br.s），12.17（1H，br.s），9.08（1H，
ｓ），7.15（1H，ｄ，Ｊ＝2.2），6.58（1H，ｄ，Ｊ
＝2.2），6.38（1H，ｓ），4.01（2H，ｓ），ca.2.8
（2H，ｍ），ca.2.7（2H，ｍ），2.14（3H，ｓ）13
C−NMRスペクトル（100MHz，DMSO−d6，
δc）
189.4，181.6，172.3，165.6，164.7，164.4，
157.8，142.1，141.4，140.5，135.4，131.4，
130.0，120.1，119.9，118.3，116.5，112.4，
109.0，108.7，107.7，49.9，29.8，28.2，20.2
以上のデータよりKS−619−１は新規化合物で
あることが判明した。
次に各種展開剤によるKS−619−１の薄層クロ
マトグラフイーのRf値を第１表に示す。検出は
ヨウ素反応により行つた。
INDUSTRIAL APPLICATION FIELD The present invention relates to a vasodilator containing the compound KS-619-1 produced by a microorganism belonging to the genus Streptomyces. Prior Art With the aim of providing useful new physiologically active substances, we conducted research on the products of numerous microorganisms obtained from the natural world, and as a result, we found that a culture of newly isolated microorganisms had a vasodilatory effect. We have discovered the fact that physiologically active substances with Subsequently, the substance was isolated and purified from the culture, and its physicochemical properties were investigated, and it was found to be a new physiologically active substance. Hereinafter, the substance will be referred to as KS-619-1.
It is called. Vasodilators produced by microorganisms include WS- produced by culturing strains of Streptomyces aureofaciens.
1228A and B are known [J. Antibiotics 35
151-156 (1982), 35 , 157-163 (1982)]. Problems to be Solved by the Invention There is a continuing need for useful vasodilators. Measures to solve the problem KS-619-1 is useful as a vasodilator, a drug that has vasodilatory effects and can dilate arteries, increase peripheral blood flow, and lower overall blood pressure. be. That is, KS-619-1 is useful for the preventive treatment or treatment of hypertension, angina pectoris, peripheral circulatory failure, and the like. That is, the present invention relates to KS-619-
The present invention relates to a vasodilator comprising KS-619-1 alone or an effective amount of KS-619-1 and at least one pharmaceutical adjuvant. Dosages for these purposes vary depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but are usually administered orally or parenterally (e.g. by injection, application, inhalation, etc.) to adults. On the other hand, it is 0.1 to 4 mg/Kg per day. KS-619-1 can be administered as is, but it is usually administered in tablets, pills,
It is administered in the form of powder, granules, capsules, suppositories, injections, etc. Conventional pharmaceutically acceptable adjuvants can be used for the pharmaceutical compositions of the invention. Such adjuvants include water, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, glucose,
Cellulose, cyclodextrin, talc, starch, methylcellulose, gelatin, gum arabic, polyethylene glycol, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, sodium benzoate, sodium bisulfite, aluminum stearate, magnesium stearate, mineral oil, vegetable oil, white petrolatum, These include liquid paraffin and the like, and are appropriately selected depending on the type of preparation. The composition usually contains 0.01 to 85% by weight of KS-619-1. The acute toxicity ( LD50 ) of KS-619-1 in mice is 300 mg/Kgpo and 100 mg/Kgip. KS-619-1 is a compound represented by the following formula () and has the following physical and chemical properties. Properties: Orange powder Melting point: 198-200℃ (decomposed). It starts to turn brown around 198℃ and does not show a clear melting point. Specific optical rotation: [α] 20 D could not be measured because the strong visible absorption of KS-619-1 overlapped with the sodium-D line. Solubility: Easily soluble in acetic acid, methanol, ethanol,
Soluble in acetone, ethyl acetate, and butanol, sparingly soluble in chloroform and water. Color reaction: Positive for ferric chloride, iodine, and anisaldehyde reactions. Visible absorption spectrum: Fig. 1 λmax (E%) is 470 (339) nm in 83% (V/V) methanol water (neutral), 450 nm in 0.08N HC-83% (V/V) methanol water 475 (330) nm, 0.08N NaOH-83% (V/V) in methanol water 390-410 (250), 515 (340) nm ultraviolet absorption spectrum: Figure 2 λmax (E%) in 83% methanol water (neutral)
225 (816), 302 (587), 317 (542) nm, 240 (761), 265 (491), 300 (681), 345 (236) in 0.08N HC-83% (V/V) methanol water
nm, 0.08N NaOH-83% (V/V) methanol in water 242 (877), 298 (540), 330 (721) nm Infrared absorption spectrum (KBr) 3380, 2960, 2900, 2840, 1697, 1664, 1618,
1594, 1490, 1476, 1428, 1401, 1390, 1358,
1340, 1319, 1260, 1216, 1168, 1105, 1065,
1029, 1021, 998, 980, 921, 860, 823, 772,
757, 643, 592, 575cm -1 mass spectrum: The mass spectrum of this substance gives the following ions. 457 (M + -17, base peak), 431, 388 Molecular weight: 474 Elemental analysis: (actual value) H: 3.68, C: 65.52, N:
0% (calculated value) as C 26 H 18 O 9 H: 3.79, C: 65.82, O: 30.38,
N:0% 1H -NMR spectrum (400MHz, DMSO- d6 ,
δ) 12.51 (1H, br.s), 12.17 (1H, br.s), 9.08 (1H,
s), 7.15 (1H, d, J = 2.2), 6.58 (1H, d, J
=2.2), 6.38 (1H, s), 4.01 (2H, s), ca.2.8
(2H, m), ca.2.7 (2H, m), 2.14 (3H, s) 13 C-NMR spectrum (100MHz, DMSO-d 6 ,
δc) 189.4, 181.6, 172.3, 165.6, 164.7, 164.4,
157.8, 142.1, 141.4, 140.5, 135.4, 131.4,
130.0, 120.1, 119.9, 118.3, 116.5, 112.4,
109.0, 108.7, 107.7, 49.9, 29.8, 28.2, 20.2 From the above data, KS-619-1 was found to be a new compound. Next, Table 1 shows the Rf values of thin layer chromatography of KS-619-1 using various developing agents. Detection was performed by iodine reaction.
【表】
次にKS−619−１の製造法について説明する。
KS−619−１はストレプトミセス属に属し、
KS−619−１生産能を有する微生物を培地に培養
し、培養物中にKS−619−１を生成蓄積させ、該
培養物からKS−619−１を採取することによつて
製造される。
KS−619−１生産性微生物としてはストレプト
ミセス属に属し、KS−619−１生産能を有するも
のであればいずれの微生物でも用いることができ
る。具体的に好適な例は、ストレプトミセス・カ
リフオルニカスATCC3312株である。該菌株の形
態的特徴および生理的性質は
Waksman，S.A.and R.E.Curtis（1916）
Soil Science １巻99〜134頁および
Waksman，S.A.and A.T.Henrici（1984 in
Breed.R.S.，E.G.D.Murray and A.P.Hitc
henseds.）
Bergey's Mannual of Determinative
Bacteriology ６巻（The williams and wil
kins Co.，Baltimore）929〜980頁
に記載されている。
微生物の培養に際しては放線菌の培養に用いら
れる通常の培養方法が適用される。用いられる培
地は菌の資化しうる炭素源、窒素源、無機物等を
程よく含有する培地であれば天然培地、合成培地
いずれでも用いうる。
炭素源としてはグルコース、フラクトース、シ
ユクロース、スタビロース、澱粉、デキストリ
ン、マンノース、マルトース、糖密等の炭水化
物、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、フマール酸など
の有機酸、メタノール、エタノール等のアルコー
ル、メタン、エタン、プロパン、ｎ−パラフイン
等の炭化水素、グルタミン酸等のアミノ酸あるい
はグリセロール等が用いられる。
窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等のアンモニウム塩、アスパラギン酸、グルタミ
ン、シスチン、アラニン等のアミノ酸、尿素、ペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コー
ン・スチープ・リカー、大豆粉、綿実粕、大豆カ
ゼイン、カザミノ酸、フアーマメデイア等が用い
られる。
無機物としてはリン酸二水素カリウム、リン酸
水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガン、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、パ
ントテン酸カルシウム、モリブデン酸アンモニウ
ム、硫酸アルミニウムカリウム、炭酸バリウム、
炭酸カルシウム、塩化コバルト、食塩等が用いら
れる。
その他必要に応じて培地にビタミン、サイアミ
ン等菌体の増殖あるいはKS−619−１の生産を促
進する物質を加えることができる。
用いられる微生物が特定の物質を要求する場合
は勿論生育に必要な物を加えることが必要であ
る。
培養は振盪培養法、通気攪拌培養法等により、
20〜40℃の温度で中性付近のPHで行われる。
３〜15日の培養によつてKS−619−１の蓄積が
最大に達し、培養は完了する。
培養物中に、蓄積したKS−619−１を培養液か
ら単離採取するに際しては、通常の生理活性物質
の培養液から採取する方法が適用される。
即ち、濾過、遠心分離等による菌体除去、吸着
樹脂、シリカゲル、シラナイズドシリカゲル、ア
ルミニウム、セルロース、珪藻土、珪酸マグネシ
ウム、ゲル濾過剤等を用いるカラムクロマトグラ
フイーもしくは薄層クロマトグラフイーによる活
性物質の吸脱着処理等によつてKS−619−１は単
離される。
培養液からKS−619−１を単離する１例は次の
通りである。
培養液を濾過もしくは遠心分離することによつ
て菌体を除去する。得られた濾液もしくは上澄液
を吸着樹脂、ダイヤイオンHP−10（三菱化成工
業(株)製）で処理して活性物質を樹脂に吸着する。
ついで、メタノール等の適当な溶剤にて溶出し、
溶出液を減圧濃縮することにより溶剤をとばし水
溶液とする。ついで、この水溶液に水と混和しな
い溶媒たとえば酢酸エチル、酢酸ブチル等を添加
して抽出する。
抽出液を減圧下濃縮し、シリカゲルカラムクロ
マトグラフイーをくり返し行うことによつて精製
する。展開溶媒としては最初はクロロホルム：メ
タノール＝９：１（Ｖ／Ｖ）を用いて溶出し、次
回のクロマトグラフイーの溶媒としてはブタノー
ル：エタノール：クロロホルム：濃アンモニア水
＝４：５：２：２（Ｖ／Ｖ）を用いて溶出する。
更に３番目のシリカゲルカラムクロマトグラフイ
ーの溶媒としてはクロロホルム：メタノール：エ
タノール：水＝10：４：４：２（Ｖ／Ｖ）を用い
て溶出する。KS−619−１を含有する区分を減圧
下濃縮し、メタノールを展開溶媒として用いる
LH−20（フアルマシア社製）カラムクロマトグ
ラフイーを行う。KS−619−１を含む画分を集め
減圧下で濃縮し、KS−619−１の橙色粉末を得
る。
上記精製工程中のKS−619−１の検出は、シリ
カゲル薄層クロマトグラフイー、ついでヨウ素反
応により行つた。
以下に実施例、実験例、参考例を示す。
実施例１ 錠剤
10％ヒドロキシプロピルセルロース溶液をKS
−619−１ 100g、ラクトース40g、コーンスタ
ーチ18g及びカルボキシメチルセルロースカルシ
ウム10gよりなる混合物に加え、混合物を練合す
る。練合物をついで1.0mmの網目を有する押出造
粒機で造粒し、造粒物を60℃で乾燥する。乾燥造
粒物を16メツシユの篩で篩分けし、ついでステア
リン酸マグネシウムを加えて錠剤用粒状物を調製
する。
ついで常法により直径８mmで１錠（170mg）中
KS−619−１を100mgを含有する錠剤を調製する。
実施例２ カプセル剤
10％ヒドロキシプロピルセルロース溶液をKS
−619−１ 50g、ラクトース80g及びポテトスタ
ーチ38gよりなる混合物に加え、混合物を練合す
る。練合物を実施例１と同様にして造粒し、ステ
アリン酸マグネシウムを加えたあと、常法により
１カプセル（170mg）あたりKS−619−１ 50mg
を含有するカプセルを調製する。
実施例３ ソフトカプセル剤
KS−619−１ 10gを大豆油100gに溶解し、溶
液を常法によつてカプセルにみたし、１カプセル
あたりKS−619−１ 10mgを含有するソフトカプ
セルを調製する。
実験例
KS−619−１の血管拡張作用を摘出血管標本を
用いる収縮抑制実験例で説明する。
１ 表面潅流摘出腸間膜動脈標本
白色雑系ウサギ（雄、２〜３Kg）の腹部正中線
を切開し、上腸間膜動脈を腹部大動脈分岐部から
約２〜2.5cmの長さで切り出し、巾３〜４mmのラ
セン状条片を作成した。両端を絹糸で結紮し、下
端は固定棒、上端は強力トランスデユーサー（日
本光電製、SB−1T）につなぎ、初期張力1.5gで
懸垂した。標本はペリスタポンプ（Peristaltic
pump）（Harbard 1210）を用いて、37±１℃に
保ち、95％O2、５％CO2ガスを通じた。クレブ
ス・ハンゼライト（Krebs−Henseleit）液〔組
成（ｇ／）、NaC6.92 ，KC0.35，
MgSO4・7H2O0.29，CaC20.28，KH2PO40.16，
NaHCO32.1，グルコース2.0〕を用い10ml／min
の速度で表面潅流を行つた。標本は１〜２時間安
定化させた後、実験に供した。血管収縮物質とし
て塩化カリウムを終濃度20mMになるように標本
の直前に留置したカニユーレから、潅流路内に注
入した。惹起された収縮反応は、張力トランスデ
ユーサーを介して等尺性にポリグラフ（日本光
電；RM−45）に記録した。KS−619−１をエタ
ノールに20mg／mlになるように溶解し、栄養液で
適宜希釈したものを、収縮薬適用の10分前から収
縮反応の終了前まで持続潅流した。
２ 実験成績[Table] Next, the manufacturing method of KS-619-1 will be explained. KS-619-1 belongs to the genus Streptomyces,
It is produced by culturing a microorganism capable of producing KS-619-1 in a medium, allowing KS-619-1 to be produced and accumulated in the culture, and collecting KS-619-1 from the culture. As the KS-619-1 producing microorganism, any microorganism belonging to the genus Streptomyces and having the ability to produce KS-619-1 can be used. A specifically preferred example is Streptomyces californicus ATCC3312 strain. The morphological characteristics and physiological properties of the strain are described in Waksman, SA and RECurtis (1916) Soil Science, Vol. 1, pp. 99-134 and Waksman, SA and ATHenrici (1984 in Breed.
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology Volume 6 (The williams and wil
kins Co., Baltimore), pages 929-980. When culturing the microorganism, the usual culture method used for culturing actinomycetes is applied. The medium used may be either a natural medium or a synthetic medium as long as it contains a suitable amount of carbon sources, nitrogen sources, inorganic substances, etc. that can be assimilated by the bacteria. Carbon sources include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, stabilose, starch, dextrin, mannose, maltose, and molasses, organic acids such as citric acid, malic acid, acetic acid, and fumaric acid, alcohols such as methanol and ethanol, methane, Hydrocarbons such as ethane, propane, and n-paraffin, amino acids such as glutamic acid, glycerol, and the like are used. Nitrogen sources include ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, and ammonium phosphate, amino acids such as aspartic acid, glutamine, cystine, and alanine, urea, peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, corn steep liquor, Soybean flour, cottonseed meal, soybean casein, casamino acids, firma media, etc. are used. Inorganic substances include potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, cobalt sulfate, zinc sulfate, calcium pantothenate, ammonium molybdate, potassium aluminum sulfate, barium carbonate,
Calcium carbonate, cobalt chloride, salt, etc. are used. Other substances that promote the growth of bacterial cells or the production of KS-619-1, such as vitamins and thiamine, can be added to the medium as necessary. If the microorganism used requires specific substances, it is of course necessary to add substances necessary for growth. Culture is carried out by shaking culture method, aeration agitation culture method, etc.
It is carried out at a temperature of 20-40°C and a pH around neutrality. After 3 to 15 days of culture, the accumulation of KS-619-1 reaches its maximum and the culture is completed. When KS-619-1 accumulated in a culture is isolated and collected from a culture solution, a conventional method for collecting physiologically active substances from a culture solution is applied. That is, removal of bacterial cells by filtration, centrifugation, etc., removal of active substances by column chromatography or thin layer chromatography using adsorption resins, silica gel, silanized silica gel, aluminum, cellulose, diatomaceous earth, magnesium silicate, gel filtration agents, etc. KS-619-1 is isolated by adsorption/desorption treatment or the like. An example of isolating KS-619-1 from a culture fluid is as follows. The bacterial cells are removed by filtering or centrifuging the culture solution. The obtained filtrate or supernatant is treated with an adsorption resin, Diaion HP-10 (manufactured by Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.), to adsorb the active substance to the resin.
Then, elute with a suitable solvent such as methanol,
The eluate is concentrated under reduced pressure to remove the solvent and form an aqueous solution. Next, a water-immiscible solvent such as ethyl acetate or butyl acetate is added to this aqueous solution for extraction. The extract is concentrated under reduced pressure and purified by repeated silica gel column chromatography. The developing solvent was initially chloroform:methanol = 9:1 (V/V) for elution, and the solvent for the next chromatography was butanol:ethanol:chloroform:concentrated aqueous ammonia = 4:5:2:2. Elute using (V/V).
Furthermore, as a solvent for the third silica gel column chromatography, chloroform:methanol:ethanol:water=10:4:4:2 (V/V) is used for elution. Concentrate the section containing KS-619-1 under reduced pressure and use methanol as the developing solvent.
Perform LH-20 (manufactured by Pharmacia) column chromatography. Fractions containing KS-619-1 are collected and concentrated under reduced pressure to obtain an orange powder of KS-619-1. Detection of KS-619-1 during the above purification process was performed by silica gel thin layer chromatography followed by iodine reaction. Examples, experimental examples, and reference examples are shown below. Example 1 Tablet KS 10% hydroxypropyl cellulose solution
-619-1 100g, lactose 40g, cornstarch 18g and carboxymethylcellulose calcium 10g, and the mixture is kneaded. The kneaded product is then granulated using an extrusion granulator having a mesh size of 1.0 mm, and the granulated product is dried at 60°C. The dry granulation is sieved through a 16 mesh sieve and then magnesium stearate is added to prepare the granulation for tablets. Next, one tablet (170 mg) with a diameter of 8 mm was prepared using a conventional method.
Tablets containing 100 mg of KS-619-1 are prepared. Example 2 Capsules 10% hydroxypropyl cellulose solution
-619-1 50g, lactose 80g and potato starch 38g, and the mixture is kneaded. The kneaded product was granulated in the same manner as in Example 1, magnesium stearate was added, and then 50 mg of KS-619-1 was added per capsule (170 mg) using a conventional method.
Prepare capsules containing. Example 3 Soft capsules 10 g of KS-619-1 is dissolved in 100 g of soybean oil, and the solution is filled into capsules by a conventional method to prepare soft capsules containing 10 mg of KS-619-1 per capsule. Experimental Example The vasodilatory effect of KS-619-1 will be explained with an experimental example of contraction inhibition using a removed blood vessel specimen. 1 Surface perfusion isolated mesenteric artery specimen A white hybrid rabbit (male, 2-3 kg) was incised in the abdominal midline, and the superior mesenteric artery was cut out at a length of approximately 2-2.5 cm from the abdominal aortic bifurcation. A spiral strip with a width of 3 to 4 mm was prepared. Both ends were ligated with silk thread, the lower end was connected to a fixed rod, and the upper end was connected to a strong transducer (SB-1T, manufactured by Nihon Kohden), and suspended with an initial tension of 1.5 g. The specimen is a peristaltic pump.
The temperature was maintained at 37±1° C., and 95% O 2 and 5% CO 2 gas was passed through using a vacuum pump (Harbard 1210). Krebs-Henseleit liquid [composition (g/), NaC6.92, KC0.35,
MgSO 4・7H 2 O0.29, CaC 2 0.28, KH 2 PO 4 0.16,
10ml/min using NaHCO 3 2.1, glucose 2.0]
Surface perfusion was performed at a rate of . The specimens were allowed to stabilize for 1-2 hours before being subjected to experiments. Potassium chloride as a vasoconstrictor was injected into the perfusion channel through a cannula placed just before the specimen to a final concentration of 20 mM. The evoked contractile response was isometrically recorded on a polygraph (Nihon Kohden; RM-45) via a tension transducer. KS-619-1 was dissolved in ethanol to a concentration of 20 mg/ml, appropriately diluted with a nutrient solution, and the solution was continuously perfused from 10 minutes before application of the contractile agent until before the end of the contractile reaction. 2 Experimental results
【表】
〓 縮度 〓
第２表に示すようにKS−619−１は濃度依存的
にウサギ腸間膜動脈の収縮を抑制した。
参考例
種菌として、ストレプトミセス・カリフオルニ
カスATCC3312、第１種培地として、グルコース
1.0g／dl、溶性デンプン1.0g／dl、肉エキス
0.3g／dl、酵母エキス0.5g／dl、バクトトリプト
ン（デイフコ社製）0.5g／dl、炭酸カルシウム
0.2g／dl、PH7.2〜7.4の組成を有する培地を用い
る。種菌１白金耳を50ml太型試験管に入れた上記
種培地14mlに植菌し、30℃で１日間振盪培養す
る。
この種培養液４mlを300ml容エルレンマイヤー
フラスコに入つた40mlの第２種培地に植菌する。
第２種培地の組成は第１種培地の組成と同じであ
る。第２種培養は30℃で１日間行う。この種培養
液40mlを２容バツフル付きエルレンマイヤーフ
ラスコに入つた300mlの第３種培地に植菌する。
第３種培地の組成は第１種培地の組成と同じであ
る。第３種培養は30℃で１日間行う。この第３種
培養液900mlを30容のステンレス製ジヤーフア
ーメンター中の主醗酵培地18に植菌する。主醗
酵培地としては、デキストリン3.0g／dl、ソイビ
ーンミール2.0g／dl、コーンスチープリカー
0.25g／dl、リン酸２カリウム0.05g／dl、硫酸マ
グネシウム・７水塩0.05g／dl、塩化カリウム
0.03g／dl、炭酸カルシウム0.3g／dl、PH7.8の組
成を有するものを用いた。
培養は28℃、３日間通気攪拌下に行う。培養後
の培養液中に0.32μg／mlのKS−619−１が蓄積す
る。培養終了後、培養液を遠心分離（15000rpm）
する。上澄液36をダイヤイオンHP−10を充填
した２カラムに通塔し、KS−619−１を吸着さ
せた後、30％（Ｖ／Ｖ）メタノール６で洗浄
し、メタノール６で溶出する。溶出液全てを集
めて濃縮して500mlとし、酢酸エチル1.5で抽出
する。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水
後、濃縮乾固すると、2.0gの油状物が得られる。
これをクロロホルムを用いて充填した150mlのシ
リカゲルカラム（ワコーゲル：和光純薬社製）の
上端に供給する。クロロホルム750mlで洗浄後、
クロロホルム：メタノール＝９：１（Ｖ／Ｖ）450
mlの溶媒を用いて溶出する。溶出液全てを集めて
減圧下で濃縮乾固すると122.8mgの油状物質が得
られる。この油状物をブタノール：エタノール：
クロロホルム：濃アンモニア水＝４：５：２：２
（Ｖ／Ｖ）を用いて充填した100mlのシリカゲルカ
ラム（ワコーゲル）の上端に供給し、展開溶媒と
して充填溶媒と同一組成の溶媒を用いて溶出す
る。溶出画分を7gずつ分取するとフラクシヨン
番号12〜18にKS−619−１が溶出される。この画
分を集め減圧下で濃縮乾固すると約70.7mgの油状
物質が得られる。この油状物をクロロホルム：メ
タノール：エタノール：水＝10：４：４：２
（Ｖ／Ｖ）を用いて充填した90mlのシリカゲルカ
ラム（ワコーゲル）の上端に供給し、展開溶媒と
して充填溶媒と同一組成の溶媒を用いて溶出す
る。溶出画分を7gずつ分取するとフラクシヨン
番号２〜22にKS−619−１が溶出される。この画
分を集め減圧下で濃縮乾固すると約60mgの油状物
質が得られる。この油状物を約５mlのメタノール
に溶解し、メタノールを用いて充填した300mlの
セフアデツクスLH−20（フアルマシア社製）カ
ラムの上端に供給する。メタノールを用いて展開
を行い5gずつ分取すると、フラクシヨン番号24
〜57にKS−619−１が溶出される。この画分を集
め減圧下濃縮乾固すると9.7mgのKS−619−１で
ある橙色粉末が得られる。なお上記工程中のKS
−619−１の検出はシリカゲル薄層クロマトグラ
フイー、ついでヨウ素反応により行つた。
発明の効果
KS−619−１は血管拡張作用を有する。[Table] 〓 Degree of contraction 〓
As shown in Table 2, KS-619-1 inhibited the contraction of rabbit mesenteric artery in a concentration-dependent manner. Reference example Streptomyces californicus ATCC3312 was used as the inoculum, and glucose was used as the first type medium.
1.0g/dl, soluble starch 1.0g/dl, meat extract
0.3g/dl, yeast extract 0.5g/dl, Bactotryptone (manufactured by Difco) 0.5g/dl, calcium carbonate
A medium having a composition of 0.2 g/dl and pH 7.2 to 7.4 is used. Inoculate 14 ml of the above-mentioned seed medium in a 50 ml wide test tube with a platinum loopful of seed culture, and culture with shaking at 30°C for 1 day. 4 ml of this seed culture is inoculated into 40 ml of second seed medium in a 300 ml Erlenmeyer flask.
The composition of the second type medium is the same as that of the first type medium. Type 2 culture is carried out at 30°C for 1 day. Inoculate 40 ml of this seed culture into 300 ml of third seed medium in a 2-volume Erlenmeyer flask with a baffle.
The composition of the third type medium is the same as that of the first type medium. Type 3 culture is carried out at 30°C for 1 day. 900 ml of this third type culture solution is inoculated into main fermentation medium 18 in a 30 volume stainless steel jar fermenter. Main fermentation media include dextrin 3.0g/dl, soy bean meal 2.0g/dl, and corn steep liquor.
0.25g/dl, dipotassium phosphate 0.05g/dl, magnesium sulfate heptahydrate 0.05g/dl, potassium chloride
The composition used was 0.03 g/dl, calcium carbonate 0.3 g/dl, and pH 7.8. Culture is carried out at 28°C for 3 days with aeration and agitation. 0.32 μg/ml of KS-619-1 accumulates in the culture solution after culturing. After culturing, centrifuge the culture solution (15000 rpm)
do. The supernatant liquid 36 is passed through two columns packed with Diaion HP-10 to adsorb KS-619-1, washed with 30% (V/V) methanol 6, and eluted with methanol 6. All eluates are collected, concentrated to 500 ml, and extracted with 1.5 mL of ethyl acetate. The ethyl acetate layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and then concentrated to dryness to obtain 2.0 g of oil.
This is supplied to the upper end of a 150 ml silica gel column (Wakogel, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) packed with chloroform. After washing with 750ml of chloroform,
Chloroform:methanol = 9:1 (V/V) 450
Elute using ml of solvent. All the eluate is collected and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 122.8 mg of oil. This oil is converted into butanol:ethanol:
Chloroform: concentrated ammonia water = 4:5:2:2
(V/V) to the top of a 100 ml silica gel column (Wakogel), and elute using a solvent with the same composition as the filling solvent as a developing solvent. When the eluted fraction is separated into 7 g portions, KS-619-1 is eluted in fraction numbers 12 to 18. The fractions are collected and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain about 70.7 mg of an oily substance. This oil was mixed with chloroform: methanol: ethanol: water = 10:4:4:2
(V/V) to the top of a 90 ml silica gel column (Wakogel), and elute using a solvent with the same composition as the filling solvent as a developing solvent. When the eluted fraction is separated into 7 g portions, KS-619-1 is eluted in fraction numbers 2 to 22. The fractions are collected and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain about 60 mg of an oily substance. This oil was dissolved in about 5 ml of methanol and fed to the top of a 300 ml Sephadex LH-20 (manufactured by Pharmacia) column packed with methanol. When developed with methanol and separated into 5g portions, fraction number 24 was obtained.
KS-619-1 is eluted at ~57. The fractions were collected and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 9.7 mg of KS-619-1 as an orange powder. In addition, KS during the above process
-619-1 was detected by silica gel thin layer chromatography followed by iodine reaction. Effects of the Invention KS-619-1 has a vasodilatory effect.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図はKS−619−１の可視部吸収スペクトル
である。実線は0.08N HC−83％（Ｖ／Ｖ）メ
タノール水中、点線は83％（Ｖ／Ｖ）メタノール
水中（中性）、一点鎖線は0.08N NaOH−83％
（Ｖ／Ｖ）メタノール水中で測定した結果を表す。
第２図はKS−619−１の紫外部吸収スペクトルで
ある。各線の意義は上記と同様である。
Figure 1 shows the visible absorption spectrum of KS-619-1. The solid line is 0.08N HC-83% (V/V) methanol in water, the dotted line is 83% (V/V) methanol in water (neutral), the dashed line is 0.08N NaOH-83%
(V/V) represents the results measured in methanol water.
Figure 2 shows the ultraviolet absorption spectrum of KS-619-1. The meaning of each line is the same as above.