JPH0566399B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

種々の理由により、便利で信頼できる方法でヒ
トの黄体形成ホルモン（hLH）およびヒトの絨
毛性性腺刺激ホルモン（hCG）を定性的および／
または定量的に測定できることが非常に望まれて
いる。例えば、女性の体液中のhLH濃度は排卵
直前に非常に増加することが知られている。「家
庭内」使用用のhLH変動の便利で質のよい検知
器は、受精可能性および／または受精調整の問題
をかかえる女性のために排卵時を正確に指摘する
ことができよう。また、診察室における医師によ
り使用できる量的hLH検定もhLH存在および／
または濃度変化を伴つた種々の条件の医学的評価
および観察に有用である。 同様に女性の体液中のhCGの有意な存在は妊娠
を確認する最も信頼できるテストの一つとして受
容されている。hCGは発育する胞胚シストにによ
り分泌され且つ受精後７〜９日の早期に妊娠を検
知できる。さらに、妊娠の最初の２週間以内に信
頼できる定性的「家庭内」妊娠テストも極度に有
用である。また、業としている使用できる便利な
分析操作は例えば子宮外妊娠および突発的な流産
の診断および栄養胞胚病および不妊問題を抱える
患者のフオローアツプのようにhCG量により特徴
づけられた種々の異常な条件の診断および評価の
利点を証明している。 本願の一つの観点は放射性物質を必要としない
hLHおよび／またはhCG測定用の改善された固
層分析システムおよび方法に関する。本発明の一
態様において、酵素の標識が使用される。もう一
つの態様において、直接染料標識が酵素と測定用
の基質との反応工程を省略するために使用され
る。本願のもう一つの観点は、改善された検定シ
ステムおよび方法において使用さるべき材料およ
び試薬に関する。 バン ウイーマン等〔Immunoassay Using
Antigen−Engyme Conjugate、FEBS Letters、
15：232（1971）］は、グルタルアルデヒドにより
hCGを西洋わさびペルオキシダーゼに結合しそし
て次いでhCGの酵素−免疫検定用のその結合体を
使用した。固相検定操作はバン ウイーマン等に
より開示されているが、それはhCG抗体をセルロ
ース性支持体（CnBrにより賦活された再沈殿し
且つジアゾ化したｍ−アミノベンジルオキシメチ
ルセルロースまたは微結晶性セルロース）に付着
するものである。また、同様の検定操作において
バン ウイーマン結合体を使用する米国特許
3654090号を参照のこと。西洋わさびペルオキシ
ダーゼの代わりに、当業上使用されていたもう一
つの酵素はアルカリホスフアターターゼ（ALP）
である。例えば、エングバル等の“Enzyme−
linked Immunoabsorbent Assay（ELISA）、
Quantitative Assay of Immunoglobulin Ｇ”
〔Immunochemistry ８：871（1971）〕を参照のこ
と。カワオイ等〔“An Improve Method of
Conjugation of Peroxidase with Protein”
Fed.Proc.、32Abstract 840（1973）〕もまた酵素
−ホルモン複合体を形成するための方法を開示し
ている。 サクセナ等は〔“Development of ａ Solid−
Phase Centrifugation−free Enzyme Assay
for LH for Ovulation Detection”、
Psychoneuroendocrinology in Reproduction、
ツイチエラ等、エデイターズ、Elsevier／North
Holland（1979）、P.277〕は夫々抗体−結合ガラ
スビーズまたはレセプター結合ガラスビーズ（グ
ルタルアルデヒド賦活アミノプロピルガラスビー
ズ）およびhlH−アルカリホスフアターゼ結合体
（hLHの４−アジドベンゾイル誘導体）を使用す
るhLH用の酵素免疫検定法および酵素レセプタ
ー検定法を記載している。サクセナ等により使用
されたレセプターは相対的に低い収率で且つ安定
性に劣る不利であつた。 カールソン等〔“Protein−Thiolation and
Reversible Protein−Protein Conjugation”、
Biochem.J.、173：723（1978）〕はＮ−スクシン
イミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（SPDP）がジスルフイド結合によりプロテ
イン−プロテイン結合体を形成する場合にヘテロ
２官能性試薬として使用できることを開示してい
る。一例として、カールソン等は西洋わさびペル
オキシダーゼ−兎抗−（ヒトトランスフアリン）
抗体結合体を形成している。一般に、２−ピリジ
ルジスルフイド構造はペルオキシダーゼおよび抗
体の両者にSPDPによるそれらの反応によつて導
入される。２−ピリジルジスルフイド部分のいず
れもがPH4.5においてジチオスレイトルによる特
別の還元により相当するチオール誘導体中へ転換
できるとはいえ、カールソン等はチオール化した
抗体を形成し且つチオールジスルフイド交換によ
りそれらをペルオキシダーゼ２−ピリジルジスル
フイド優等体と反応せしめてペルオキダーゼ酵素
−抗体結合体を生成した。 hLHおよびhCGはαおよびβサブユニツトと
して分類される２種の非共有結合ポリペプチド鎖
からなることもまた知られている。これらグリコ
プロテインホルモンのαサブユニツト並びにその
他のグリコプロテインホルモンのαサブユニツト
は殆ど同一のアミノ酸連鎖を有し且つ実際上免疫
科学的に識別不能である。対照的に、各々のβサ
ブユニツトはそれら自体の明瞭なアミノ酸配列を
有しており、それらをその他のグリコプロテイン
のβサブユニツトから区別している。hCGβ抗血
清のような抗体を調製するためにhCGαサブユニ
ツトによりまた類似のhLHサブユニツトにより、
交差反応性を減少させる方法が知られている。例
えば、ジビキ等の“Ａ Receptor−
Immunoassay for the Determination of the
Specificity of Anti−hCG−β Sera”〔ACTA
Endocrinologica，87、838（1978）〕を参照すれ
ば、hCG−β抗血清はhLHおよびhCG−αで免
疫吸収により精製される。 サイトー等〔“Use of Receptors in the
Prepartion of LH−Free Serum”、J.Clin.
Endocrinol.Metab.43：1186（1976）〕は精製ゴナ
ドトロピンレセプターを使用して血清hLHをそ
れに結合させ、その他の血清プロテインを排除さ
せた。この一般的な技術はレセプターの特性に基
づく一層純粋な血清を提供する。 ガラスビーズは、hLHおよびhCGのようなホ
ルモンの放射免疫検定における固相として使用さ
れている。ポスト等の“Ａ Rapid、
Centrafugation−Free Radioimmunoassay
Specific for Human Chorionic Gonadotropin
Using Glass Beads as Solid Phase”、（〔J.
Clin.Endocrinol.Mesab.、50：169（1980）〕を参
照すれば、６mm直径の固相ガラスビーズは砂吹き
付けされ、次いでγ−アミノプロピルトリエトキ
シシランの存在において加熱されてガラス表面に
反応性アルキルアミノ基を生じさせた。アミノ基
はグルタルアルデヒドで賦活され、そして次に
hCG−β抗体がそこに共有結合される。 最後に、hLHまたはhCGレセプター検定にお
ける主要は試薬はレセプター自体である。これま
で大量のコルポラルテア（黄体）の共通のhLH
およびhCGレセプターは良好な信頼性および正確
性の酵素レセプター検定に使用するのに充分純粋
な形態で得られていない。カーン等の“Use of
Purified Gonadotropin Receptor in the
Deveropment of an Enzyme Receptoassay
（ERA）for Luteinizing Hormone（LH）and
Human Chorionic Gonadretropin（hCG）、
〔Enzyme Labelled Immunoassay of
Hormones and Drugs、S.B.Pal、エデイター、
de Gruyler ＆ Co.（1978）〕を参照のこと。 本発明のレセプター精製システムに使用された
多くの工程、より良好な安定性およびより高い純
度を有するレセプターの良好な収率を与える本発
明は、本発明者によりシンポジウム紙“Func
tional Correlates of Hormne Receotors in
Reproduction”、〔Mahesh et al、エデイター
ズ、P.397、Elsevier North Hollnd（1980）、
1980年10月15日提出〕に開示された。 両者ともサクセナによる米国特許4016250号お
よびその分割出願としての米国特許第4094963号
は体液中のhCGおよび／またはhLH定量のため
のレセプター検定法を開示しており、そこではサ
ンプル中の前記hCGおよひhLHの結合はhCGお
よびhLH用の共通レセプターを所有する種の黄
体から抽出された細胞膜による。本明細書中に開
示する追加の精製工程は、サクセナ特許と比較し
た場合、有意により高純度且つ高結合能力を有す
るレセプター材料の調製を与える。 本発明の目的は、hLHまたはhCGを定性的に
検出するための改善された固相レセプター−ベー
ス検定および抗体−ベース検定を提供することで
ある。 本発明のもう一つの目的は、hLHまたはhCG
を定量的に決定するための改善された固相レセプ
ター−ベース検定および抗体−ベース検定を提供
することである。 本発明のもう一つの目的は信頼でき、便利な方
法で排卵または妊娠を検出するための女性に有用
な「家庭内」テストを提供することである。 本発明のさらにもう一つの目的は、診療室で業
務を行う医師による定量的方法で使用することが
できるhLHおよびhCG用の改善された固相分析
を提供することである。 本発明のもう一つの目的は、改善された実質的
に純粋にhLHおよびhCGレセプターおよびそれ
を得るための方法を提供することである。 本発明のさらに一層の目的は、改善された酵素
−ホルモン結合体およびそれを得るための方法を
提供することである。 本発明によれば、実質的に純粋且つ安定な
hLH−hCGレセプターが新規な連続濃縮および
精製方法の使用により、大きな収率でウシの黄体
から得られる。この新規な実質的に純粋なゴナド
トロピンレセプターは本発明の酵素レセプター検
定態様におけるレセプターとして使用されるのみ
ならず、実質的に純粋なホルモンが本発明の酵素
レセプター検定（以下、“ERA”と言う）および
酵素免疫検定（以下、“EIA”と言う）の両者に
おいて標準試薬として使用される酵素−ホルモン
複合体の調製に使用されるようにhLHおよび
hCGを精製するために使用することもできる。若
干のhLHが患者の体液中にも存在するので、
hCG量に基づく妊娠テストにおいて酵素免疫検定
アプローチ（レセプターの代わりの特別な抗体）
を使用するのが好ましい。酵素レセプター検定
は、hCGが健康な妊娠していない女性に有意な量
で存在すべきものでないので、排卵検知テスト態
様にとつて特別である。勿論、EIAおよびERA
の両者はhCGまたはhLH検知用に使用できる。
妊娠中のhLHは非常に低い量である。 本発明の一つの態様において、既知量のhLH
−酵素結合体は、標準または未知量のhLH下で
ガラスビーズのような固相に結合した反応量のレ
セプターと共にインキユベートされる。レセプタ
ー量は、排卵において期待される変動量と反応す
るに十分な量である。未反応または置換されたホ
ルモン−酵素結合体を含有する上澄み液からの固
相の分離および色彩−形成反応の接触作用による
次の酵素の測定において、固相に結合した結合体
は、その量に比例してhLHと置きかわるので、
色彩が、排卵を示す上澄み中に形成されるかまた
は無色が固相中に形成される。 妊娠についての同様の「家庭内」テストは、
hCG検知に基づくことができる。しかしながら、
妊娠テストにおいて、精製hCGβ抗体をレセプタ
ーの代わりにに使用するのが、レセプターとも反
応する液体中のhLHの存在故に好ましい。 本発明のその他の態様は、以後に明らかにして
ゆく。 添付図面は、本発明のレセプター精製方法の特
別な例のフローダイヤグラムである。 hLHおよびhCGについてのレセプターは同じ
ものであり、ホルモン応答性生殖腺細胞の細胞膜
に位置している。 前に参照した“Functional Correlates of
Hormone Receptors in Reproduction”はこの
分野における先行技術業績の若干を記載してい
る。 本発明のレセプター精製方法は、出発材料とし
て、牛の黄体の使用に関連して述べる。その他の
高知のレセプター源の材料例えばラツトレイデイ
グ細胞、偽妊娠ラツト卵巣などが牛の黄体に代用
できることが期待される。牛の黄体はその他の源
の材料の材料と比較して一層大きな量のレセプタ
ーを提供すべく選択された。 従来技術はレセプターが相対的に水性媒体中で
不溶性であるが、しかし洗浄剤−可溶性であるこ
とを示した。この技術において、牛の黄体ホモゲ
ネートからの上澄み液が出発材料として使用され
た。黄体はその重さ対緩衝液比で１：10（Ｗ：Ｖ）
の15％シユークロースを有するトリスーHC1許
衝液中15〜20秒間均質化されて、ホモジネートを
得、細胞片を除くために1000rpmにて30分間遠心
される。上澄み液は、次いで7000×ｇにて遠心さ
れて、両者ともレセプターを含有する沈殿および
上澄み液を得る。実際において、沈殿は上澄み液
のそれの殆ど５倍の結合能力を持ちそしてワンポ
ール ラボラトリーズ（プリンストン、N.J）に
よりBiocept−Ｇ 放射レセプター検定妊娠テス
トキツトの調製に使用される。さもなくば廃棄さ
れる上澄み液がここでは出発材料として使用され
る。当然に一層活性のある沈殿は清浄剤溶解さ
れ、および／または上澄み液と組み合わされ、お
よび／または1000rpm遠心からの上澄み液はレセ
プター源の材料として用いられる。後述の特別な
例において、7000×ｇ上澄み液が使用されるとは
いえ、明らかにその他の溶解されたフランクシヨ
ンを使用することができ、且つ都合により放射免
疫検定または同様の技術によりレセプターの存在
についてテストすることができた。 ホモゲネートからの分離後、液状フラクシヨン
は、限外濾過により濃縮される。Ｈ−50中空繊維
カートリツジ（分子量50000のカツトオフ量）が
アミコンDC−10ユニツト（Amicon of
Lexington、Massから入手可能）で使用されて、
ホルモン−レセプター結合の阻害剤および分子量
50000以下の不活性プロテインを除いた。この工
程は濃縮された上澄み液を得る。先行技術はレセ
プター分子量を110000〜115000の範囲に見積もつ
ていた。 次に、濃縮された上澄み液を先ず分画して、高
濃度の不活性プロテインと低濃度の脂質とを除去
する。予備のシユークロース線形密度勾配超遠心
は、レセプターから不活性材料を分離するのに有
用な技術であることが見出されている。35％から
10％までのシユークロース線形勾配を使用するこ
とにより、殆どすべての活性レセプターを含有す
るフラクシヨンが18〜28％間のシユークロース勾
配から溶離することが見出された。 シユークロースは除去されるべきであるので、
限外濾過が超遠心分離の後、再度実施されてレセ
プター材料を含有する沈殿を得る。 付随する無用な脂質材料を除くために、一層の
分離精製が、表面活性剤（洗浄剤）の助勢により
水中で沈殿を再分散し、且つ石油エーテルのよう
な有機溶媒で抽出することにより実施される。続
く抽出は、中性脂質および低い親和力−高結合サ
イトを殆ど除去し、水性相が任意の不溶性残留物
から分離される。その他の有機溶媒を石油エーテ
ルの代わりに試みることができ、且つその内の若
干は石油エーテルと同様に作用すると考えられ
る。しかしながら、本発明者等はエタノール、メ
タノール、四塩化炭素およびブタノールは満足す
るようには働かないことを見出している。 本発明者等の初期の研究および報告はhLH−
hCGレセプターが結合サブユニツトおよびアデニ
ルシクラーゼ会合サブユニツトからなること、お
よびこれらのサブユニツトが容易にシユークロー
ス濃度勾配遠心および洗浄剤溶解されたレセプタ
ーのセフアロース−6Bクロマトグラフイーによ
り分離できることの証明を含んでいる（Khan et
al、前記）。レセプターから界面活性剤を分離す
ることおよびさらにレセプターを精製することも
また必要なので、多段階ゲル濾過／クロマトグラ
フイーを実施してアデニレートサイクラーゼ活性
フラクシヨンから、5′−ヌクレオチダーゼ活性か
ら、そして界面活性剤からレセプター画分を分離
した。 次いで追加のプロテイ分離が電気泳動、一層特
には本明細書中の実施例におけるセルロースカラ
ムにおける垂直ゾーン電気泳動を使用して実施さ
れた。セルロースブロツク上のゾーン電気泳動を
使用して実施された。セルロースブロツク上のゾ
ーン電気泳動は幾分の成功をもつて試みられた
が、大規模精製用には有用でない。活性フラクシ
ヨンは、集められ、そして再びクロマトグラフイ
ー処理された。最後に、クロマトグラフイーマト
リツクスに直接結合されたhCG抗体結合−hCG
（hCG−抗−hCGとも記す）における免疫親和力
クロマトグラフイーが実施されてレセプター材料
の精製を終了した。今日までの研究において、免
疫親和力カラムクロマトグラフイーは、僅かに活
性を増加させるのみなので、ゾーン電気泳動は、
実際的なレセプター純度の限度に達するものと考
えられる。直接親和力クロマトグラフイーおよび
間接免疫親和力クロマトグラフイーを電気泳動の
代わりに使用することができるが、しかしプロテ
イン回収率は実際的な立場からは低すぎる。これ
らの操作はゾーン電気泳動から得られたものと近
似の精製レセプタープロテインの調製をもたらす
が、アミノ酸分析では異なる。加うるに親和力ク
ロマトグラフイー操作のいずれかにより得られた
調製品は電気泳動的に均質（“電気泳動的に純
粋”）であるとは言えない。 次に実施例は本発明の改善されたレセプターの
調製を説明している。この実施例において、清浄
剤（Triton Ｘ−100）がレセプタープロテイン
を溶解するために使用された。実験を通じて、本
発明者等は最小濃度として0.35％のトリトンＸ−
100が、240mgプロテイン／mlの濃度において溶解
状態にレセプターを維持するには必要であること
を見出した。 実施例 １ −60℃に貯蔵された1200個の牛の卵巣を溶かし
た。それからの黄体を0.1Mトリス−HCl緩衝液
（CaCl₂、MgCl₂およびジチオスレイトルの各々
を１ｍＭ、0.01％アジ化ナトリウム、10^-6Mフエ
ニルメチルスルホニルフルオリド、100μｇ／ml
大豆トリプシン阻害剤および１：10〔Ｗ（黄体）：
Ｖ〕の緩衝液比で15％シユークロースを含有する
PH7.4の緩衝液）中で15〜20秒間均質化した。ホ
モジネートを1000rpmにて８個の１容量揺動バ
ケツト（Sovall、Newton、Conn）中で30分間遠
心した。上澄み液を45分間7000×ｇにて再遠心し
た。収量はプロテイン100ｇであつた。7000×ｇ
上澄み液は、Ｈ−50中空繊維カートリツジ
（Amicon、Lexington、Mass）を備えたアミコ
ンDC−10ユニツトにより８倍に濃縮され、シユ
ークロース濃度を減少させるために等量のトリス
−HCl緩衝液に懸濁され、元の量に再濃縮され、
且つ−60℃において200mlアリコツト中に貯蔵さ
れた。（本明細書中全ての濃度は、特に述べない
限り摂氏温度である）この段階における収量はプ
ロテイン77ｇであつた。この濃縮物は、緩衝液で
希釈され、且つ再濃縮された。 次に上記の得られた濃縮上澄み液をシユークロ
ース密度勾配遠心により分別した。これは1.6
容量のローター（Ti−50）を使用するベツクマ
ンモデルL2−65B冷蔵超遠心により、前記濃縮
7000×ｇ上澄み液の各200ml（20ｇプロテイン）
のアリコツトを分画した。35％までのシユークロ
ース勾配をベツクマン勾配ポンプ（モデルNo.141）
の助けにより調製した。サンプルをシユークロー
ス勾配の頂部に重ねた。ローターを30000rpmに
加速し、そして遠心を２時間続けた。次いでロー
ターを3500rpm維持に減速した。シユークロース
密度勾配を40％シユークロース溶液で代えること
により溶離し、そして20mlフラクシヨンを0.5分
毎に集めた。フラクシヨンを¹²⁵I−hCGによる特
異的な結合により分析した。18〜28％間のシユー
クロース濃度において溶離した二種のフラクシヨ
ンが殆ど全ての活性レセプターを含有した。シユ
ークロース濃度は、屈折率により測定した。得ら
れたフラクシヨンは計6.2ｇのプロテインであつ
た。 その後、二種のフラクシヨンをHI−50カーロ
リツジを備えたアミコンDC−２ユニツトにより
別々に濃縮した。次いで、サンプルをトリス−
HCl緩衝液で希釈し、そして同じ容器で再濃縮し
た。最後に、精製プロセスのこの段階はレセプタ
ープロテインを沈殿するために55000rpmにて４
時間遠心することにより終了した。二種のフラク
シヨンの回収率は夫々60％および92％であつた。
沈殿物をこの時点で合わせた。0.5％トリトンＸ
−100を含有する10ｍＭトリス−Hl緩衝液をレセ
プターフラクシヨン（25mgプロテイン／ml）に添
加した。１％トリトンＸ−100はより多量のプロ
テインを溶解したが、多分トリトンＸ−100ミセ
ルの形成のためにホルモン結合活性を有意に減少
させた。懸濁液を50ワツトにて４℃で５秒間隔で
４回超音波処理してレセプタープロテイン溶解お
よびホルモン−結合活性の回復を増大させた。中
性脂質を等量の冷却した石油エーテルを用い４℃
で１時間振盪し、そして最後に10000rpmにて１
時間遠心することにより抽出した。有機溶媒、水
性相および不溶性残留物を分離した。水性相は溶
解したレセプターを含有した。 水性相を5000rpmにて遠心、そして943mgのプ
ロテインを回収した。この調製品をセフアロース
−6Bのカラムのゲル濾過によえい精製した。こ
のカラムを13.5ml／時間のフロー速度にて0.5％
トリトンＸ−100含有のトリス−HCl緩衝液で溶
離した。６mlフラクシヨンを集め、そして¹²⁵I−
hCGを使用するレセプターのためにテストした。
これらのフラクシヨンは貯蔵すべく有意なレセプ
ター活性を有しており、そして次いでセフアロー
ス−4Bの多数の2.8×35cmカラムで分別された。
セフアロース−6Bにおける上昇クロマトグラフ
イーはホルモン結合活性（初期プロテインフラク
シヨン）からアデニレートサイクラーゼ活性（後
期プロテインフラクシヨン）を多量分離した。こ
の点においてサンプルはトリス−HCl緩衝液15ml
当たりプロテイン22mgを含有していた。カラム溶
離を８ml／時間のフロー速度にて0.5％トリトン
Ｘ−100を含有するトリス−HCl緩衝液を使用し
て実施した。４mlフラクシヨンを集めた。本質に
おいて、セフアロース−6Bカラムから得たフラ
クシヨンをセフアロース−4Bカラムにより２種
のフラクシヨンに副分割した。一つのフラクシヨ
ンはホルモン結合活性（初期プロテインフラクシ
ヨン）の殆どを含有しており、そしてその他のフ
ラクシヨンは、5′−ヌクレオチダーゼ活性（後期
フラクシヨン）の殆どを含有している。再び、
¹²⁵I−hCGへの特異的結合によるテストを通じて
活性フラクシヨンを貯えた。４本のセフアロース
−4Bカラムからの活性フラクシヨンをアミコン
限外濾過により５倍濃縮し、次いでウルトロゲル
−ACA−34（LKB Instruments）の５×50cmカ
ラムによるゲル濾過を行つた。 ウルトロゲル−ACA−34カラムを0.3Mホウ酸
リチウム緩衝液（１ｍＭ MgCl₂、0.01％NaN₃
および0.5％トリトン）10ml／hrのフロー速度に
てPH7.2により溶離した。４mlフラクシヨンを集
めた。ウルトロゲル−ACA−34はトリトンＸ−
100濃度を有意に、例えば約0.5％から約0.2％ま
で減少した。 この点で、サンプルは、ホウ酸リチウム緩衝液
中73.5mgのプロテインからなつていた。垂直ゾー
ン電気泳動をセルロースの３×42cmカラムで実施
した。セルロース粉末をホウ酸リチウム緩衝液中
で均衡させ、傾潟し、そして次いでカラム中に詰
めた。カラムを電気泳動に先立つて同緩衝液で過
剰に洗浄した。レセプタープロテインを同緩衝液
で透析により平衡化させた。電気泳動の条件は、
60−80ｍＡ、300−315ボルト、72時間であつた。
もう一つの操作において、300ボルトの一定の電
圧および４℃にて５時間60ｍＡが使用された。カ
ラムはホウ酸リチウム緩衝液で溶離された。レセ
プター含有フラクシヨンを限外濾過により濃縮
し、ホウ酸リチウム緩衝液中のウルトロゲル
ACA−34カラムでクロマトグラフイー処理して
過剰のトリトンを除去し、且つより少量へ濃縮し
た。この段階でおいて、精製調製品は6.52mgの重
量であつた。元の7000×ｇ上澄み液、第１のウル
トロゲルフラクシヨンおよびこの段階における調
製品の各結合能力は夫々5.15、310および
2681pMhCG／mgプロテイン（0.76×10^-10lM^-1の
親和力定数（Kd））であり、これらは7000×ｇ上
澄み液中プロテインの11805倍精製を大よそ表し
ており、最終的には536倍のレセプター結合能力
の増大を得た。 更なる精製工程をhCG−抗−hCGセフアロース
4Bマトリツクスにおける免疫親和力カラムクロ
マトグラフイーにより実施した。ゾーン電気泳動
生産物と比較した場合、レセプターの特異的活性
は1.05倍までしか増加しなかつた。 電気泳動的に純粋なレセプターグリコプロテイ
ンの分子量は一層充分に後述するようにゲル濾過
クロマトグラフイーを使用する場合、約5.9百万
であることが見出された。精製はデイスク−ゲル
電気泳動、引き続いての後述する処理によるレセ
プター材料の分析が分子量約240000の単一グリコ
プロテインバンドを与える程度に進んだ。（本明
細書中に開示されたレセプタープロテインおよび
これの成分の全分子量、アミノ酸組成および糖質
組成は開示された値の±10％の通常受け入れられ
る誤差内にあることを理解すべきである。）種々
のマーカープロテインが後で開示する集合体分子
量並びに種々の集合体サブユニツトの分子量も見
積もるために使用された。それ故、本発明の一つ
の態様は、複数のグリコポリペプチド成分からな
る分子量約5.9百万の電気泳動的に均質なhLH−
hCGレセプターグリコプロテイン（以下、5.9百
万集合体という）の発見を含み、該グリコプロテ
イン集合体成分は、デイスク−ゲル電気泳動によ
り決定される単一グリコプロテインバンドとして
現れ、恐らくはジスルフイドにより相互に結合し
ているものと考えられる。 単離したレセプターがhLHおよびhCG用の共
通レセプターを有する種々の種の動物の黄体なら
びに、本明細書中前述したもののようなその他の
レセプター源から得ることができること（そして
またアミノ酸配列のような構造的解析の後、合成
的に製造できること）が考えられるとはいえ、本
発明者等は牛の黄体からそれらを得るのである。
かくして、本発明のこの観点の一層特別な態様は
前に明らかにしたように洗浄剤可溶性の、電気泳
動的に純粋な牛の黄体のhCG−hLHレセプター
グリコプロテインを包含し、且つ少なくとも
200pM hCG／mgプロテイン、好ましくは少なく
とも2500pM hCG／mgプロテインの特異的結合
能力を有している。結合能力は0.25〜20000nｇの
ラベルしないhCGの増大する濃度の存在におい
て、¹²⁵I−hCGの1.25nｇと同等の大よそ50000cpm
を有するプロテインサンプルの均衡化により達せ
られる。慣用のインキユベーシヨン操作はリン酸
緩衝液に溶解した等量の20％（ｗ／ｖ）ポリエチ
レングリコール6000の添加により、ホルモン−レ
セプター複合体を沈殿させるのが常である。その
後、管を振盪し、遠心し、そして上澄み液を吸引
した。沈殿物を緩衝液に再懸濁し、再びポリエチ
レングリコールと混合し、且つ再遠心する。¹²⁵I
−hCGレセプター複合体を表わすペレツトの放射
性を測定した。特異的結合および親和力常数をス
カツチヤード〔Ｇ、Ann.N.Y Acad.Sci.、51、
660（1941）〕の方法に基づいて算出した。 デイスク−ゲル電気泳動を硫酸ドデシルナトリ
ウム（以下、“SDS”と言う）−ポリアシル−アミ
ドゲルデイスク電気泳動を使用して次のように実
施した。 小さな修正を伴うキングおよびラエムリの方法
〔J.Mol.Biol.、62、465（1971）〕により精製hLH
−hCGレセプターフラクシヨンをSDS−ポリアク
リルアミドデイスクゲル電気泳動により分析して
プロテイン成分の最適な分析を得た。hLH−
hCGレセプターの精製フラクシヨン30〜60μｇの
アリコツトを0.5％トリトンＸ−100に溶解し、次
いで凍結乾燥し、そして水100μに溶解した。
次いでサンプルを１ｍＭ EDTA含有PH8.0の
0.125Mトリス−HClに対して48時間透析した。
サンプルを２％SDS単独または２％SDSおよび１
％メルカプトエタノール（M.E.）の存在におい
て沸騰水中で1.5分間加熱した。トリス−HCl緩
衝液に溶解し、且つ２％SDSおよび１％M.E.で
処理した公知分子量のマーカープロテインを充填
したゲルに適用し、そして同時に電気泳動に付し
た。電気泳動は0.1％SDS含有PH8.3の0.025Mトリ
ス−グリシン緩衝液中で行つた。電気泳動の後、
ゲルをガラスカラムから除去し、そしてプロテイ
ンバンドをCoomassieブルーで染色した。マーカ
ープロテインおよび精製レセプターフラクシヨン
の相対的移動度（Rf）を計算し、そしてRfと各
マーカープロテインの分子量のロガリズムとの関
係を確立して精製レセプターサンプルの分子量を
算出した。２％SDSで処理した5.9百万集合体サ
ンプルは、大よそ分子量240000の単一グリコプロ
テインバンドを与えた。SDSプラスM.E.で処理
したサンプルはオリゴマー、恐らくジスルフイド
結合した大よそ分子量160000、57000および44000
の３個のバンドを与えた。 デイスクゲル電気泳動に先立つて、セルロース
ゾーン電気泳動後に得られたレセプタープロテイ
ンをセフアロース−4Bのカラムにおけるゲル濾
過クロマトグラフイーに付して分子量を決定し
た。ゲル濾過の後、レセプタープロテインの初期
フラクシヨンは前述の如く5.9百万集合体を含む。
カラムは１ｍＭ MgCl₂、0.017％NaN₃および
0.5％トリトンＸ−100含有10ｍＭトリス−HCl緩
衝液で溶離した。 一層の実験を5.9百万集合体を形成する成分ま
たは単位を決定するために実施した。各々の場合
に、分子量見積もりは後述する如くゲル濾過クロ
マトグラフイー使用して決定した。 5.9百万集合体をその最大のポリペプチド単位
に分解する試みを行つた。 レセプターグリコプロテインのゲル濾過クロマ
トグラフイーを下記の種々の処理の前後に実施し
た。（大よそ１mg／mlのプロテイン濃度が各処理
に使用された。）夫々の場合に、ゲルカラムを0.5
％トリトンＸ−100含有の適当な溶媒で均衡させ
且つ溶離した。公知分子量（DNA（スーパーコイ
ルしたもの）、ブルーデキストラン、チログロブ
リン、フエリチン、アルドラーゼおよびカタラー
ゼ）の標準をマーカープロテインの分子径の大よ
その範囲を解析できるように選択されたカラムお
よびゲルによりゲル濾過した。各マーカーおよび
各レセプター成分用のKav（ゲルクロマトグラフ
イー中の溶質移動のインデツクス）をその溶離量
から算した。レセプター成分の分子量をKav対公
知マーカープロテインの分子量の標準曲線から決
定した。 1M NaClを用い４℃にて一夜並びに２％SDS
および１％メルカプトエタノールを用い４℃にて
の処理は5.9百万集合体の分子量を変えなかつた。
しかしながら、２％SDSを用いる、100℃にて1.5
分間処理は、ホルモンなしのhLH−hCGレセプ
ターの5.9百万集合体を解離せしめ、セフアロー
ス−6Bカラムで複数の分子量280000の分子種に
分離した。セフアロース−6Bカラムを１ｍＭ
MgCl₂、0.01％ NaN₃、0.1％SDSおよび0.5％ト
リトンＸ−100を含有する0.1M酢酸で溶離した。
分子量280000の分子種を¹²⁵I−hCGでインキユベ
ーシヨンし、そしてセフアロース−6Bカラムに
適用した時、185000の分子量を有する主要ホルモ
ン−結合成分を１ｍＭ MgCl₂、0.01％NaN₃お
よび0.5％トリトンＸ−100含有の10ｍＭ トリス
−HCl緩衝液で溶離することによつて回収した。
分子量185000の分子種からhCGの分子量40000を
減じて得られる分子量145000の分子種は、大よそ
分子量280000の分子種が、その二量体であること
を示していると考えられる。それは分子量280000
の分子種が各々大よそ分子量145000の二種のオリ
ゴマーに分離することである。¹²⁵I−hCGとの結
合または¹²⁵I−hCG単独との共有結合は、分子量
280000二量体の解離を引き起こし、そして分子量
185000のホルモン−レセプター結合分子種を形成
する。 もう一セツトの実験において、ウルトロゲル
ACA−34のカラムにおけるゲル濾過に従つた２
％SDSおよび1.5ｍＭ DTT（ジチオスレイトル）
を用い、100℃にて1.5分間処理による分子量
280000の分子種は、１ｍＭ MgCl₂、0.01％
NaN₃、0.01％SDS、２ｍＭ DDTおよび0.5％
トリトンＸ−100を含有する0.01Mトリス−HCl
緩衝液で溶離することにより、分子量120000の分
子種のhLH−hCGレセプターを得た。 100℃における1.5分間、50ｍＭ DTTによる
分子量120000の分子種の一層の処理および前記
0.01Mトリス−HCl緩衝液中のウルトロゲルACA
−34でのゲル濾過は、分子量85000および38000の
二種のオリゴマーを与えた。これらの成分の各々
はとくに¹²⁵I−hCGを結合し、そして夫々125000
および92000の分子量のホルモン−結合複合体と
して１ｍＭ MgCl₂、0.01％NaN₃および0.5％ト
リトンＸ−100を含有する10ｍＭトリス−HCl緩
衝液によりウルトロゲルACA−34から溶離され
た。 もう一つの実験において、¹²⁵I−hCGを5.9百万
集合体に共有結合し、次いで２％SDSを用い、
100℃にて1.5分間処理によりホルモン結合の分子
量185000の分子種へと分離した。これの3000rpm
上澄み液をセフアロース−6Bのカラムに適用し
た。そしてさらに沈殿物を0.5％トリトンＸ−100
含有の10ｍＭトリス−HCl緩衝液に再び溶解し、
そして次に同形カラムにおけるゲル濾過に従つて
２％SDSを用い100℃にて1.5分間処理した。両者
の例において、１ｍＭ MgCl₂、0.01％NaN₃、
0.1％SDSおよび0.5％トリトンＸ−100含有の10
ｍＭトリス−HCl緩衝液を用いる溶離により分子
量185000の分子種が得られた。50ｍＭ DTTを
用い、100℃にて1.5分間の¹²⁵I−hCG結合種の処
理もまた110000および74000の分子量の¹²⁵I−
hCG結合オリゴマー（hCGの分子量40000を減じ
た後では、各々70000および34000の分子種に相当
する）を得た。２％SDSの存在において、100℃
にて1.5分間、150ｍＭ DTTまでによる分子量
85000および38000の各分子種の処理はこれらの単
位をさらに一層小さな分子量成分に分離しなかつ
た。それ故、分子量70000〜85000および34000〜
38000の各分子種は、恐らく、ジスルフイド結合
して分子量120000〜145000の分子種を構成するサ
ブユニツトであり、そしてhCGおよびhLHと特
異的に結合する最小の完全なポリペプチド単位で
あり得ることが期待される。 前記の実験および検討から、この時点におい
て、天然のレセプターとして認識される二種の最
小分子量単位は、ホルモン単位からのそれらの開
放により、夫々34000〜38000および約70000〜
85000のそれらの分子量範囲、それらのhCGにつ
いての特異的結合能力および前述した種々の処理
条件下のそれらの安定性を定義することができ
る。順に、これらの基本的単位は共有ジスルフイ
ド結合により分子量約120000〜145000の分子種の
繰返し単位になるようである。現在、前記二種の
最小分子量単位（サブユニツト）の各々が分子量
120000〜145000の分子種を構成すべく参加してい
るものと考えられる。分子量決定の変化は使用し
た多数の異なる標準マーカープロテインを包含す
るデイスクゲル電気泳動およびゲルクロマトグラ
フイーシステムの限度に基づくと信じられる。し
かしながら、重要な決定は、各々がhCG特異な結
合能力を有する二種の異なる分子量のサブユニツ
トが、順にレセプターの基本的な繰り返しビルデ
イング群を形成することで存在することである。
分子量120000〜145000の分子種は、ある意味で繰
り返し単量体単位であり、それの二つが分子量
240000〜280000の分子種のオリゴマーを形成すべ
く結合する。複数のこれらオリゴマーは互いに合
わさつて5.9百万集合体を形成する。 アミノ酸および糖質分解を電気泳動的に純粋な
レセプター調製品および部分的に純粋な中間レセ
プターのいくつかにより実施した。アミノ酸分析
を水に対して、一夜レセプターの100μｇアリコ
ツトを透析し、真空乾燥し、そして110℃にて24
時間5.7N HCl100μで加水分解することにより
実施した。加水分解物を真空中で再度乾燥して、
いくらかの残留酸を除去した。サンプルをクエン
酸緩衝液に溶解し、そして自動アミノ酸分析機
（Durrum.Model Ｄ−500）でアミノ酸を分析し
た。 hLH−hCGレセプターの中性糖含量は糖の加
メタノール分解、トリメチルシリル化、およびガ
ス液体クロマトグラフイーにより測定した。ヘキ
ソサミン含量は、5.7N HClによるサンプルの４
時間加水分解後、アミノ酸分析機で測定した。精
製レセプターのシアル酸含量は、チオバルビツー
ル酸法により測定した。 電気泳動的に純粋なレセプター中に見出された
主要なアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミ
ン酸であつた。百分率ベースで、親和力クロマト
グラフイーの代わりにゾーン電気泳動を行つたも
のは、実施例１の連続法により精製されたサンプ
ルと比較して各々若干少ない。電気泳動的に純粋
なレセプターの糖質含量は大よそ10％である。三
種のレセプター材料のアミノ酸および糖質分析を
表１に示す。グリコプロテイン集合体中の各種ア
ミノ酸残基の数は表１から算出できる。 電気泳動的に純粋なグリコプロテインレセプタ
ー集合体は抗血清の生産につき兎のようなテスト
動物に投与した場合、抗原として作用する。前述
したように、集合体の種々のグリコプロテインサ
ブユニツトもまたテスト動物において抗原による
応答を誘起すると考えられる。

【表】

【表】 実施例 ２ この実施例は中間−サイクルhLH変動の検知
を包含する本発明の一態様を説明する。 Ａ ホルモン−酵素複合体の調製 0.1M NaClを含有するPH7.5のナトリウム緩
衝液200μに２mgのhLHを溶解し、そして振
盪器中で、室温にて30分間、エタノール中20ｍ
Ｍ Ｎ−スクシンイミジル３，２−ピリジルジ
チオ−プロピオネート（SPDP）200μと反応
させた。過剰のSPDPをPH8.4の0.01M重炭酸ア
ンモニウム緩衝液においてセフアデツクスＧ−
25（精製）の１×20cmカラム上ゲル濾過により
除去した。このカラムをユビコードレコーダー
を経て冷蔵したフラクシヨンコレクター中で
8.4ml／時間の速度で溶離した。各フラクシヨ
ンを標準放射免疫検定で分析してhLH活性を
位置づけた。２−ピリジル−ジスルフイド−
hLHを含有する親液化したフラクシヨンの0.5
mgプロテインをチオール化アルカリホスフアタ
ーゼの0.25mgプロテイン（2.5μMの50μ）を
有するガラスバイアル中で振盪しながら室温に
て24時間反応させた。インキユベーシヨンした
物をPH8.4の0.01M重炭酸アンモニウム緩衝液
で均衡させたウルトロゲル−ACA−34の0.5×
28cmカラムに適用し、溶出した。カラムから溶
離したフラクシヨンの好適なアルコツトを
hLHの放射検疫検定により分析し、そしてベ
ツクマン分光光度計における420nｍにて光学
密度を測定してhLH−アルカリホスフアター
ゼ結合、並びに未結合アルカリホスフアターゼ
およびhLHを位置ずけた。hLH−アルカリホ
スフアターゼ結合体を含有するフラクシヨンを
使用するまで−20℃にて好適なアリコツトに貯
蔵した。 Ｂ 抗−LH−γ−グロブリンまたは共有結合し
た精製レセプターを有する不活性支持体の調製 ６mm直径の固形ガラスビーズを751b／sqイ
ンチの圧力で10分間60グリツト粒子で砂吹き付
けた。抗−hLH−γ−グロブリンの0.001％溶
液（1.4μｇ／ビーズ）および実施例１の精製
hLH−レセプタープロテインの0.0035％水性溶
液（5μｇ／ビーズ）が反応に使用された。砂
吹き付けたビーズ200ｇのバツチ（大よそ700ビ
ーズ）をドバノフ代謝振盪器中で70℃にて４時
間、トルエン中10％γ−アミノプロピル−トリ
エトキシシラン200ml中で加熱してアルキルア
ミノ基を生じさせた。試薬を傾潟して、そして
ビーズをトルエンのアリコツト200mlで３回洗
浄し、風乾し、そして室温で１時間PH7.0の
0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液中の1.25％グル
タルアルデヒド100mlでインキユベーシヨンし
た。グルタルアルデヒド賦活化ビーズをPH7.0
の0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液のアリコツト
100mlで５〜６回洗浄した。抗−LH−γグロ
ブリンをポスト等（前述）により記載された如
く、共有的にガラスビーズに結合した。同様
に、0.5％トリトンＸ−100を含有するPH7.2の
0.01Mトリス−HCl緩衝液中のhLHレセプター
をガラスビーズに結合した。結合反応の後、ビ
ーズを冷却した0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液
で洗浄して未反応抗体またはレセプターを除去
した。次いでビーズをPH7.0の0.01Mリン酸ナ
トリウム中1Mグリシン溶液100mlで緩く振盪し
ながら４℃にて２時間インキユベーシヨンし
て、遊離アルキルアミノ基をブロツクした。抗
−hLH−γ−グロブリンまたはhLHレセプタ
ーを結合したビーズを、使用するまで−20℃に
て気密器に貯蔵した。 Ｃ 実際の検定操作を慣用の方法、例えばhLH
を定量するために次の操作を使用して実施し
た。 ニセツトの75×100mmポリスチレン検定管、
即ち管内に１個の該抗体結合ガラスビーズを含
有する管−セツトの各管および管内に１個のレ
セプター結合ガラスビーズを含有する管−セツ
トの各管に、(1)〜(3)を添加する。 (1) コントロールサンプルとして（黄体期中か
ら集め、リン酸緩衝液0.01M、PH7.0で１：
10に希釈した）尿を含有する低hLH 100μ
または（１：10希釈）の未知の尿サンプル
100μ、 (2) コントロールとしてhLH標準液または未
知の尿サンプルにリン酸ナトリウム緩衝液
100μ、 (3) (1)または(2)の管へ150nｇプロテイン／管
のLH−アルカリホスフアターゼ結合体100μ
。 800から6.25ｍIU／mlのhLHの２倍希釈が尿の
hLH標準液に含んでいた。管の内容物を混合し、
そしてドバノフ振盪器で室温にて２時間インキユ
ベーシヨンした。インキユベーシヨンの後、試薬
を傾潟し、そしてビーズを0.9％NaCl １mlで２
度洗浄した。基質溶液１ml（6.3ｍＭ Ｐ−ニト
ロフエニルホスフエート−Na₂、0.05Mグリシン
および0.1N NaOH、PH10.5中0.5M MgCl₂）を
各管に添加した。反応を37℃にて30分間実施し、
次いで1N NaOH 0.5mlを各管に添加し、そして
吸収をベツクマン2400分光光度計で420nｍにて
記録した。標準曲線をコントロールから求め、得
られた標準曲線を未知物中のhLHの濃度を測定
するために使用した。 前記はhLHの酵素免疫検定（EIA）および酵素
レセプター検定（ERA）の両者を説明している。
hCGの検定および分析を同様の試薬を使用する同
様の方法で実施する。 テストの感度、11.0〜12.5ｍIU／mlは、正常な
月経サイクルにおける卵胞期と黄体期の間の
hLHレベルからの尿の中間サイクルhLH変動
（75〜100ｍIU hLH／ml）を区別するのに充分で
ある。２つの追加的利点が試薬およびこの実施例
のテスト操作により生じる。第１に、ERAにお
いて、精製レセプターの安定性が不活性支持体に
結合した後に増加する。第２にEIAおよびERA
方法が放射免疫検定方法よりもhLHに関して、
一層高い評価を与える。この“増幅”特性は
hLH増加と共に増大し、且つこの方法において、
EIAおよびERA方法はhLH変動の検知における
“増幅器”として働く。 本発明の好ましい態様において、前記検定、す
なわち、ホルモン−酵素複合体を形成するために
使用されるホルモン（hLHまたはhCG）は、精
製レセプターの使用により、密接に関連したホル
モンおよびサブユニツトが除去され、精製され
る。本明細書中参照して入れたサイトー等（前
記）の操作のような操作をホルモン精製を達成す
るために使用することができる。例えば、ホルモ
ンを前記固相に結合したレセプターにより、イン
キユベーシヨンすることができ、次いで固相およ
び上澄み液を互いに分離し、そしてホルモンを適
当なPHおよび温度における緩衝液、例えば40℃に
て１分間、PH10の0.1Mトリス−HCl緩衝液によ
る処理でレセプターから分離して精製ホルモンを
得る。 前記実施例２において、hLH−ホスフアター
ゼ結合体はＮ−スクシンイミドエステル基により
最初にhLHホルモンをSPDPと反応工程により
hLH−SPDP複合体を形成することにより調製さ
れた。その後、プロテイン結合した２−ピリジル
ジスルフイド構造がチオール化アルカリホスフア
ターゼにより還元された。化学的に得られた分子
は、ジチオプロピオンアミドにより結合したプロ
テイン−プロテイン複合体である。カールソン等
（前記）はこれらのタイプの化学反応工程を詳細
に記載している。 ホルモン−酵素複合体を調製する一層好ましい
方法は、第１に別々にホルモン（この場合には、
hLHまたhCG）および（非チオール性）酵素を
SPDPと反応させてホルモン−SPDP複合体およ
び酵素−SPDP複合体を形成することである。そ
の後、ホルモン−SPDP複合体または酵素−
SPDP複合体のいずれもが、例えば0.1M酢酸ナト
リウム緩衝液中でジチオスレイトルと反応するこ
とによりチオール化される。 最後に、チオール化反応物質は非チオール化反
応物質と反応する。すなわち、hLH−SPDP複合
体はチオール化酵素−SPDP複合体と反応する。
中間チオール化工程を除いて、反応条件は実施例
２と同様である。 前記実施例において、本発明の固相分析に使用
された不活性支持体はガラスビーズにより例示さ
れる。当業上知られたその他の不活性支持体は、
例えば合成および天然ポリマー、その他の無機性
を基礎にした粒子など、一方、ビーズの形態また
はその他の形においては、例えばロツド、細い
片、試験管、水、その他を使用することができ
る。同様に、ホルモン−酵素複合体はアルカリホ
スフアターゼで例示できるが、しかし色彩−形成
するEIAまたはERA反応に使用されるその他の
酵素、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、グル
クロニダーゼ、その他がここでは好適である。 本発明の洗練性および単純性、とくに家庭内排
卵または妊娠テストにおける定性的な適合性は染
料をホルモンに直接結合することである。かくし
て、ホルモン−染料複合体が、ホルモン−酵素複
合体を形成するために前述した操作を使用して、
ホルモン−酵素複合体の代わりに形成される。ホ
ルモン−染料複合体の特別な例は、蛍光塗料
ANSに結合したhLHである。これは色彩−形成
基質の必要性を除く。本発明のこの態様におい
て、ホルモン−染料結合体が着色される。もし、
結合体が、未知のサンプルの中のhLHにより固
相から置き換えられるならば、上澄み液は着色す
るであろう。 本発明の変形として、次のものが挙げられる。 例えば、医師の診療所または家庭において、テ
スト操作を実施するために使用される態様におい
て、抗体またはレセプターはプラスチツク試験
管、例えば当業上知られた操作に使用されるポリ
スチレン管に直接結合することができる。抗体お
よびレセプターは試験管内部表面部分の被覆物と
して存在し得る。ホルモン−酵素結合体の添加
後、インキユベーシヨンおよび傾潟法を実施す
る。酵素の存在下、色彩を形成するための基質を
次いで元の管または上澄み液に添加して排卵およ
び／または妊娠の有無を決定することができる。
本発明のもう一つの変形は、抗体またはレセプタ
ーを結合するためにプラスチツクまたはガラスの
細片またはロツドの使用を包含している。この固
相を、ホルモン−酵素またはホルモン−染料複合
体プラス未知のものが加えられる試験管に入れ
る。標準色彩形成反応が使用される。尿以外の生
物学的液体を試験操作に使用することができる。
例えば、hLHおよび／またはhCGを含有するこ
とが知られた種々の血液フラクシヨンを使用する
ことができる。「家庭内」テスト態様において、
使用に便利な液体は唾液または尿である。 当業上理解されているように、標準および／ま
たは陽性および／または陰性コントロールは、比
較目的のために未知のものと並べて進める。 本発明の変形は当業者には明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のレセプター精製方法の特別な
例のフローダイアグラムである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の特性を有し、かつhLH及びhCGに対す
   る共通レセプターであつて天然物から得られた精
   製グリコプロテイン。 (a) 電気泳動的に均質であり、 (b) 5.9百万±10％の分子量、 (c) 少なくとも2000pM hCG／mgプロテインの
   hLH及びhCGに対する特異的結合能を有し、 (d) 次のようなアミノ酸組成（重量％±10％） アスパラギン酸 9.1 スレオニン 5.3 セリン 5.8 グルタミン酸 12.1 プロリン 5.2 グリシン 4.5 アラニン 4.8 バリン 8.3 システイン ０ システイン酸 2.4別のアリコツトにおける過
   ギ酸酸化により決定された場合 メチオニン 2.3 イソロイシン 4.4 ロイシン 8.7 チロシン 4.9 フエニルアラニン 5.0 リジン 7.0 ヒスチジン 2.8 アルギニン 7.4 100.0 および (e) マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグ
   ルコサミン、Ｎ−アセチルガラコサミンおよび
   シアル酸からなる糖質組成を有する。 ２ 少なくとも2500pM hCG／mgプロテインの
   hLH及びhCGに対する特異的結合能を有する特
   許請求の範囲第１項記載のグリコプロテイン。 ３ 分子量240000〜280000±10％の化合物、分子
   量120000〜145000±10％の化合物、分子量70000
   〜85000±10％の化合物、および分子量34000〜
   38000±10％の化合物からなる群から選択される
   hCG結合性分子種からなることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載のグリコプロテイン。