JPS59112923A - グリコプロテイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 種々の理由により、便利で信頼できる方法でヒトのルテ
ィン化ホルモン（ｈＬＨ）およびヒトの卵膜の・性腺刺
激（ｈｃＧ）　　を質的および／または量的に測定でき
ることが非常に望まれている。例えば、女性の体液中の
ｈＬＨ濃度は排卵直前に非常に増加することが知られて
いる。「家庭内」使用用のｈＬＨ波動の便利で質のよい
検知器は受精能力問題を抱えセして／また受精能力調整
における助勢を有する女性のために排卵時を正確に指摘
することができた。また、診療室における医師により使
用できる量的ｈＬＨ検定もｈＬＨ存在および／または濃
度変化を伴った種々の条件の医学的評価および観察に有
用である。

同様に女性の体液中のｈＧＣ，の有意な存在にマ妊娠を
確認する最も信頼できるテストの一つとして受容されて
いる。ＩＩＣＧ　　は発育する脱胚シストにより分泌さ
れ且つ受精後７〜９日の早期に妊婦を検知できる。さら
に、妊娠の最初の２週間以内に信頼できる結果を提供で
きる質的「家庭内」妊娠テストも極度に有用である。ま
た、業として〜・る医師が使用できる便利な分析操作は
例え＋−Ｘ子宮外妊娠および自然的な発育不全σ）診断
および栄養脱胚病および不妊問題を抱える患者のフォロ
ーアツプのようにｈＣＧ量により特徴づけられた種々の
異常な条件の診断および評価の利点を証明して〜・る。

本願の一つの観点は放射性物質を必要としな℃・ｈＬＨ
および／またはｈＧＣ，測定用の改善された固層分析シ
ステムおよび方法に関する。本発明の一態様において、
酵素性の標識か使用さ」する。もう一つの態様において
、直接染料標識が酵素と測定用の基質との反応工程を省
略するためにイ吏用される。本願のもう一つの観点は改
善された検定システムおよび方法において使用されるべ
き材料および試薬に関する。

パン　ライ−マン等［Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｕｓｉ
ｎｇＡｎｔｉｇｅｎ　−Ｅｎｇｙｍｅ　Ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅ、　ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、　１５　：　２３２
　（１９７１）　’：ｌ　　はグルタルアルデヒドゝに
よりｈＧＧ−を西洋わさびペルオキシダーゼに接合しそ
して次いでｈＣＧの酵素−免疫検定用にその接合体を使
用した。固相検定操作はパン　ライ−マン等により開示
されているが、それはｈＣＧ抗体をセルロース性支持体
（ＣｎＢｒにより賦活された再沈澱し且つジアゾ化した
ｍ−アミノベンジルオキシメチルセルロースまたは微結
晶性セルロース）に付着するものである。また、同様の
検定操作においてパン　ライ−マン接合体を使用する米
国特許３，６５４，０９０号を参照のこと。西洋わさび
にルオキシダーゼの代りに当業上使用されていたもう一
つの酵素はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）である。

例えばエングバル等の’Ｅｎｚｙｍｓ　−１ｉｎｋｅｄ
　Ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ（ＥＬ
ＩＳＡ）　、　　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ａｓ５ａ
ｙ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏ−ｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｃｒ”　
（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８　：　８７１（
１９７１））　　を参照のこと。カヮオイ等（ｗ　Ａｎ
Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｉｏｎ　ｏｆＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ’　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、ｍ旦　Ａｂｓｔ
ｒａｃｔ　８４０（１９７３））　　もまた酵素−ホル
モン複合体を形成するための方法を開示している。

サクセナ等はＣ’Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　
５ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏ
ｎ　−ｆｒｅｅ　ＥｎｚｙｍｅＡｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ｌ
Ｈｆｏｒ　０ｖｕｌａｔｉｏｎ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ’
。

Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　
ｉｎ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ。

ツィテエラ等、エディターズ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎ
ｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ　（１９７９）、　Ｐ、　２７
７〕は夫々抗体−結合ガラスビーズまたはレセプター−
結合ガラスヒ−ス（ｆ　／ｌ／タルアルデヒド賦活アミ
ノプロピルガラスピーズ）およびｈＬＨ−アルカリホス
ファターゼ接合体（ｈＬＨの４−アジド８ベンゾイル誘
導体）を使用するｈＬＨ用の酵素免疫検定法および酵素
レセプター検定法を記載している。サクセ収率で且つ安
定性に劣る不利があった。

カールソン等（”Ｐｒｏｔ、ｅｉｎ　−Ｔｈ１ｏｌａｔ
ｉｏｎ　ａｎｄＲｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ
　−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ’。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、１７３ニア２３（１９７８）］
はＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プ
ロピオネ−）　（ＳＰＤＰ）　　がジサルファイト９結
合によりプロティン−プロティン接合体を形成する場合
にヘテロ２官能性試薬として使用できろことを開示して
いる。−例として、カールソン等は百科わさびペルオキ
シダーゼ−兎抗−（ヒトトランスファリン）抗体接合体
を形成している。一般に、２−ピリジルジサルファイド
構造はペルオキシダーゼおよび抗体の両者に５ＰＤＰに
よるそれらの反応によって導入される。２−ピリジルジ
サルファイ）”　ｉｔｓ分のいずれもがｐＩ（４，５に
おいてジチオスレイトルによる特別の還元により相当す
るチオール豹導体中へ転換できるとはいえ、カールソン
等はチオール化した抗体を形成し且つチオールジサルフ
ァイド交換によりそれらを×ルオキシダーゼ２−ビリジ
ルジサルファイド誘導体と反応せしめてペルオキシダー
ゼ酵素−抗体接合体を生産した。

ｈＬＨおよびｈＣＧはαおよびβサブユニットとして分
類される２種の非共有結合ポリペプチド鎖からなること
もまた知られている。これらグリコプロティンホルモン
のαサブユニット並びにその他のグリコプロティンホル
モンのαサブユニットは殆ど同一のアミノ酸連鎖を有し
且つ実際上免疫化学的に識別不能である。対照的に、各
々のβサブユニットはそれら自体の明瞭なアミノ酸連鎖
を有しており、それらをその他のグリコプロティンのβ
サブユニットから区別している。ｈＣＧβ抗血清のよう
な抗体を精製するためにｈＣＧαサブユニットによりま
たは類似のｈＬＨサブユニットにより、交差−反応性を
減少させる方法が知られて〜・る。例えば、ジビキ等の
”　Ａ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔ
ｈｅ　５ｐｅｃｉｆｃｉｔｙ　ｏｆ　Ａｎｔｉ　−ｂｃ
Ｇ−β　Ｓｅｒ＆’［ＡＣＴＡ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
ｏｇｉｃａｓ　８７．８３８（１９７８）：）　　を参
照すれば、ｈｃＧ−β抗血清はｈＬＨおよびｈｃＧ−α
で免疫吸収により精製される。

サイト−等［’Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　　
ｉｎ　ｔｈｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＬＨ−Ｆ
ｒｅｅ　Ｓｅｒｕｍ’、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、４３　：１１８６
　（１９７６）］は精製ゴナドトロピ／レセプターを使
用して血清ｈＬＨをその他の血清プロティンの排除物に
結合させた。この一般的な技術はレセプターの特性に基
づく一層純粋な血清を提供する。

ガラスピーズはｈＬ）Ｉ　およびｂｃＧのようなホルモ
ンの放射免疫検定におけろ固相として使用されている。

ポスト等の’　Ａ　Ｒａｐｉｄ、　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇ
ａ−ｔｉｏｎ　−Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ　５ｐｅｓｉｆｉｃｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　Ｃｈ
ｏｒｉｏｎｉｃ　Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ　Ｕｓｉｎ
ｇＧｌａｓｓ　Ｂｅａｄｓ　ａｓ　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａ
ｓｅ”、　［Ｊ、　Ｇ１１ｎ。

Ｅｎｄｏｃｌｉｎｏｌ、　Ｍｅｓａｂ、、　５０：　１
６９（１９８０））を参照すれば、６ｍ１ｎ直径の固相
ガラスピーズは砂吹付けされ、次いでγ−アミノプロピ
ルトリエトキシシランの存在において加熱されてガラス
表面に反応性アルキルアミノ基を生じた。アミン基はグ
ルタルアルデヒド８で賦活されそして次にｂＣＧ−β抗
体がそこに共有結合される。

最後に、ｈＬＨまたはｈＣＧ　レセプター検定における
主要な試薬はレセプター自体である。これまで大量のコ
ルポラルテアの共通ｈＬＨおよびｈＣＧ　レセプターは
良好な信頼性および正確性の酵素レセプター検定に使用
するのに充分純粋な形態で得られていない。カーノ等の
”　Ｕｓｅ　ｏｆＰｕｒｉｆｉｅｄ　Ｇｏｎａｄｏｔｒ
ｏｐｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅＤｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒａｓｓａｙ（ＥＲＡ）　　ｆｏｒ　Ｌｕｔｅｉｎ
ｉｚｉｎｇ　Ｈｏｒｍｏｎｅ（ＬＨ）ａｎｄＨｕｍａｎ
　Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ　Ｇｏｎａｄｒｅｔｒｏｐｉｎ　
（ｈＣＧ）。

［Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓ
、ｓａｙ　ｏｆ　Ｈａｒｍ：＋ｎｅｓａｎｄ　Ｄｒｕｇ
ｓ　、　Ｓ、　Ｂ、　Ｐａｌ、エディター、ｄｅＧｒｕ
ｙｌｅｒ　＆　Ｇｏ、　　（１９７８）　］を参照のこ
と。

本発明のレセプター精製システムに使用された多くの工
程、より良好な安定性およびより高い純度を有するレセ
プターの良好な収率な与える本発明は本発明者によりシ
ンポジウム紙’Ｆ’ｕｎｃｔｉｏｎａｌＣｉｏｒｒｅｌ
ａｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ
　１ｎＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”、　　［Ｍａｈｅｓ
ｈ　ｅｔ　ａｌｐエディターズ、　　Ｐ、　３９７．　
Ｅ挑ｅｖｉｅｒ　Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ（１９８
０）、１９８０年１０月１５日提出〕に開示された。

両者ともサクセナによる米国特許第４，０１６，２５０
号およびその分割出願としての米国特許第４，０９４，
９６３号は体液中のｈＣＧ　および／またはｈＬＨ定量
のためのレセプター検定法を開示しており、そこではサ
ンプル中の前記ｈｃＧ　およびｈＬＨの結合はｈＣＧ　
およびｈＬＨ用の共通レセプターを所有する種のコルプ
スルテウムから抽出された細胞膜による。本明細書中に
開示する追加の精製工程はサクセナ特許と比較した場合
有意により高純度且つ結合能力を有するレセプター材料
の調製を与える。

本発明の目的はｈＬＨまたはｈＣＧを質的に検出するた
めの改善された同相レセプター−ベースおよび抗体−ベ
ース検定を提供することである。

本発明のもう一つの目的はｈＬＨまたはｈｃＧを量的に
決定するための改善された固相レセプター−ベースおよ
び抗体−ば−ス検定を提供することである。

本発明のもう一つの目的は信頼でき、便利な方法で受精
または妊娠を検出するための女性に有用な「家庭内」テ
ストを提供することである。

本発明のさらにもう一つの目的は診療室で業務を行なう
医師により定量的方法で使用することができるｈＬＨお
よびｈｃＧ　用の改善された同相分析を提供することで
ある。

本発明のもう一つの目的は改善された実質的に純粋なｈ
ＬＨおよびｈＣＧ　レセプターおよびそれを得るための
方法を提供することである。

本発明のさらに一層の目的は改善された酵素−ホルモン
接合体およびそれを得るための方法を提゛供することで
ある。

本発明によれば、実質的に純粋且つ安定なｈＬＨ−ｈＣ
Ｇレセプターが新規な連続的濃縮および精製方法の使用
により大きな収率でウシのコルポラルテアから得られる
。この新規な実質的に純粋なイナドトロピンレセプター
は本発明の酵素レセプター検定態様におけるレセプター
として使用されるのみならず、実質的に純粋なホルモン
が本発明の酵素レセプター検定（以下”　ＥＲＡ“と言
う）および酵素免疫検定（以下”ＥＩＡ”と言う）の両
者において標準試薬として使用された酵素−ホルモン複
合体の調製に使用されるようにｈＬＨおよびｈＣＧを精
製するために使用することもできる。

若干のｈＬＨが患者の体液中にも存在するのでｈＣＧ　
量に基づく妊娠テストにおいて酵素免疫検定アプローチ
（レセプターの代りの特別な抗体）を使用するのが好ま
しい。酵素レセプター検定はｈＣＧが健康な妊娠してい
ない女性に有意な量で存在すべきものでないので受精検
知テスト態様にとって特別である。勿論、ＥＩＡおよび
ＥＲＡの両者はｈＣＧ　またはｈＬＨ検知用に使用でき
る。

妊娠中のｈ　Ｌ　Ｈは非常に低い量である。

本発明の一つの態様において、公知の予定量のｈＬＨ−
酵素接合体が標準または未知の存在におけるガラスピー
ズのような固相に結合した反応量のレセプターにより培
養される。レセプター量は受精における期待された波動
量によって充分に反応的である。何らかの未反応性また
は置換性ホルモン−酵素接合体を含有する上澄み液から
の固相の分離および色彩−形成反応の接触作用による次
の酵素の測定において、固相に結合した均衡した景の接
合体がｈＬＨにより置換されるので色彩が受精を示す上
澄み液中に形成されるかまたは無色が固相中に形成され
る。

妊娠についての同様の「家庭内」テストはｂＣＧ検知に
基づくことができる。しかしながら、妊娠テストにおい
て、精製ｈＣＧβ抗体をレセプターの代りに使用するの
が、レセプターとも反応する体液中のあるｈＬＨの存在
故に好ましい。

本発明のその他の態様は以後に明らかにしてゆく。

添付図面は本発明のレセプター精製方法の特別な例のフ
ローダイアダラムである。

ｈＬＨおよびｈＣＧについてのレセプターは同じもので
あり、内分泌腺反応性生殖腺細胞の細胞膜に位置してい
る。

、前に参照した”Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｒｒｅｌ
ａｔｅｓ　ｏｆＨｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　
ｉｎ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ’はこの分野における
先行技術業績の若干を記載している。

本発明のレセプター精製方法は出発材料として牛のコル
ポラルテアの使用に関連して述べる。その他の公知のレ
セプター源の材料例えばラットレイディグ細胞、偽妊娠
ラット卵巣などが牛のコルポラルテアに代用できること
が期待されろ。牛のコルポラルテアはその他の源の材料
と比較して一層大きな蛍のレセプターを提供すべ（選択
された。

従来技術はレセプターが相対的に水性媒体中で不溶性で
あるが、しかし洗浄剤−可溶性であることを示した。こ
の技術において、牛のコルポラルテアホモゲネートから
の上澄み液が出発材料として使用された。コルポラルテ
アは組織中に１５％シュークローズを含有するトリス−
ＨＣｌ　　緩衝液中で１５〜２０秒間均質化されて−１
：１０（Ｗ：■）の緩衝液比にされ、細胞片を除くため
に１．００　Ｏｒｐｍ　にて３０分間遠心されるホモゲ
ネートを収量する。上澄み液は次いで７，０００Ｘ、９
にて遠心されて、両者ともにレセプターを含有する沈殿
および上澄み液を得る。実際において、沈殿は上澄み液
のそれの殆んど５倍の結合能力を持ちそしてワンポール
　ラボラトリーズ（プリンストン、Ｎ、　Ｊ、　）によ
るＢｉｏｃｅｐｔ−（ｒ■　放射レセプター検定妊娠テ
ストキットの調製に使用される。

さもな（ば廃棄される上澄み液がここでは出発材料とし
て使用される。当然に一層活性の沈殿は洗浄剤溶解され
そして／また上澄み液と結合されそして／また１、０．
０　Ｏｒｐｍ　遠心からの上澄み液はレセプター源の材
料として用いることができた。

後述の特別な例において、７．　ＯＯＯＸ　Ｐ上澄み液
が使用されるとはいえ、明らかにその他の溶解されたフ
ラクションを使用することができ且つ便利には放射免疫
検定または同様の技術によりレセプターの存在について
テストすることができた。

ホモゲネートから分離後、液状フラクションは、限外濾
過により濃縮される。Ｈ’ｌ−５０中空繊維カートリツ
ジ（５０，０００分子量のカットオフ量）がアミコンＤ
Ｃ−１０ユ＝ット（Ａｍ１ｃｏｎ　ｏｆＬｅｘｉｎｇｔ
ｏｎ、　Ｍａｓｓから入手可能）で使用されて、ホルモ
ン−レセプター結合の阻害剤および分子量５０．０００
以下の不活性プロティンを除いた。この工程は濃縮され
た上澄み液を得る。先行技術はレセプターの分子量を１
１０，０００から１１５．０００の範囲内に見積もって
いた。

次に、濃縮された上澄み液を先ず分別して、高濃度の不
活性プロティンと低濃度の脂質とを除去する。予備のシ
ュークローズ−次濃度成分限外遠心はレセプターから不
活性材料を分離するのに有用な技術であることが見出さ
れている。３５％から１０％までの一層シュークローズ
成分を使用しながら、フラクションが殆ど全ての活性レ
セプターｙ含有する１８〜２８％シュークローズ成分を
溶離することか見出された。

シュークローズが除去されるので、限外濾過が限外遠心
分離により再度実施されてレセプター材料を含有する沈
殿を得る。

追加の異質の脂質材料を除くために、一層の分離精製が
、表面活性剤（洗浄剤）の助勢により水中で沈殿を再分
散し且つ石油エーテルのような有機溶媒で抽出すること
により実施される。続く抽出は中性脂質および低い親和
力−高い容量の結合位置を殆んど除去し、水性相が何ら
かの不溶性残留物から分離される。その他の有機溶媒を
石油エーテルの代りに試みることができ且つその内の若
干は石油エーテルと同様に作用したと信じられる。

しかしながら、本発明者等はエタノール、メタノール、
四塩化炭素およびブタノールは満足するようには働かな
いことを見出している。

本発明者等の初期の研究および報告はｈＬＨ−ｈＣＧ　
　レセプターがアデニルサイクラーゼの結合サブユニッ
トおよび合同サブユニットからｔｘることおよびこれら
のサブユニットが容易にシュークローズ濃縮成分遠心お
よび洗浄剤溶解されたレセプターのセファロース−６Ｂ
クロマトグラフイーにより分離できることの証明を含ん
でいる（Ｋｈａｎｅｔ　ａｌ、　５ｕｐｒａ）。レセプ
ターから界面活性剤な分離することおよびさらにレセプ
タ〜を精製することもまた必要なので、多段階ゲル濾過
／クロマトグラフィーを実施してアデニレートサイクラ
ーゼ活性フラクションから、５′−ヌクレオチダーゼ活
性からそして界面活性剤から結合フラクシフンを分離し
た。

次いで追加のプロティン分離が電気泳動、一層％　Ｋ　
ｋ’！、本明細書中の実施例におけるセルロースカラム
におけろ垂直ゾーン電気泳動を使用して実施された。セ
ルロースブロック上のゾーン電気泳動は幾分の成功乞も
って試みられたが大規模精製用には有用でない。活性フ
ラクションが結合されそして再びクロマトグラフィー処
理された。最後に、クロマトグラフィーマトリックスに
直接接合されたｈｃＧ　結合されたーｈＣＧ　抗体にお
ける免疫親和力カラムクロマトグラフィーが実施されて
レセプター材料の精製を終了した。実施中、免疫親和力
カラムクロマトグラフィーを開始するために活性のみを
僅かに増加させるので、ゾーン電気泳動生産、物は実際
的な純度の限度に達した。直接親和力クロマトグラフィ
ーおよび間接免疫親和力クロマトグラフィーを電気泳動
の代りに使用することができるが、しかしプロティン回
収を開始する事は実際的な立場からは遅すぎる。これら
の操作はゾーン電気泳動から得られたものと近似の精製
レセプタープロティンの調製をもたらすがアミノ酸分析
とは異なる。加うるに親和力クロマトグラフィー操作の
いずれかにより得られた生産物は電気泳動的に均質（“
電気泳動的に純粋′）であるとは信じ難い。

次の実施例は本発明の改善されたレセプターの調製を説
明している。この実施例において、洗浄剤（Ｔｒｉｔｏ
ｎ　Ｘ−１００）　　がレセプタープロティンを溶解す
るために使用された。実験を通じて、本発明者等は０．
３５％トリトンＸ−１’００の最小濃度が２４０ｍ９プ
ロテイン／ゴの濃度において溶解状態にレセプターを維
持する必要があることを見出した。

実施例１ 一６０℃に貯蔵された１２００個の牛の卵巣を解かした
。それからのコルポラルテアを０．１Ｍ）す、＜−ＨＧ
ｌ　緩衝液（ＣａＣｌ２、ＭｇＣ，１２およびジチオス
レイトルの各々な１ｍＭ、０．０１％アジ化ナトリウム
、１０−６Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリドおよ
び１：１０（Ｗ：Ｖ）の緩衝液比に対し組織中に１５％
シュークローズを含ＷｊるｌＯＯμｇ／ｒｒｔｌ　　大
豆トリプシン阻害剤を含有するｐＨ７，４緩衝液）中で
１５〜２０秒間均質化した。

ホモゲネー）ヲＬＯＯＯｒｐｍ　　ｌｃテ８個の１１容
量揺動パケツト（Ｓｏｒｖａｌｌ、　Ｎｅｗｔｏｎ、　
Ｃｏｎｎ）　　中で３０分間遠心した。上澄み液を４５
分間７，０００×Ｉにて再遠心した・。収量はプロティ
ン１００Ｆであった。７，００ＱｘＩＩ上澄み液はＨ−
５０中空繊維カートリツジ（Ａｍｉｃｏｎ＊　Ｌｅｘｉ
ｎｇｔｏｎ、　Ｍａｓｓ）を備えたアミコンＤＣ−１０
ユニツトニより８倍に濃縮され、等量のトリス−ＨＧＩ
Ｉ　　緩衝液に懸濁サレ、シュークロース濃度を減少す
るために元の量に再濃縮され且つ一６０’Ｃにおいて２
００ｍ７！アリコツト中に貯蔵された。（本明細書中全
ての温度は特に述べない限り摂氏温度である）。この段
階における収量はプロティン７７ｇであった。この濃縮
物は緩衝液で稀釈され且つ再濃縮された。

次に上記の得られた濃縮上澄み液を一層シュークローズ
濃縮成分遠心により分別した。これは１．６ノ容量のロ
ーター（Ｔｉ−５０）を使用するベックマンモデルＬ２
−６５Ｂ冷蔵限外遠心中の濃縮７．０００Ｘ、９上澄み
液の各２ｏｏｉ（２ｏ、９プロテイン）のアリコツトの
予備的分別により達成した。３５％から１０％までの一
層シュークローズ成分なベックマン成分ポンプ（モデル
Ａ　１４１　）の助勢により調製した。サンプルなシュ
ークローズ成分の頂部に重ねた。ローターを３０，００
　Ｏｒｐｍに加速しそして遠心を２時間続けた。次いで
ローターを３．５０　Ｏｒｐｍ維持に減速した。シュー
クローズ濃縮成分を４０％シュークローズ溶液で代える
ことにより溶離しそして２０−フラクションを０．５分
毎に集めた。フラクションを１２５１−ｈＣＧによる特
別の結合のために分析した。二種のフラクションが殆ど
全ての活性レセプターを含有した１８〜２８％シューク
ローズを溶離した。シュークローズ濃度は屈折率により
測定した。得られたフラクションは計６．２Ｉのプロテ
ィンであった。

その後、二種のフラクションをＨニー５Ｑカートリッジ
を備えたアミコンＤＣ−２ユニットにより別々に濃縮し
た。次いでサンプルをトリス−ＨＣｌ　緩衝液で稀釈し
そして同じ容器で再濃縮した。再後に、精製プロセスの
この相はレセプタープロティンを沈殿するために、５５
．００　Ｏｒｐｍにて４時間遠心することにより終了し
た。二種のフラクションの回収率は夫々６０％および９
２％であった。沈殿物をこの点にて結合した。０．５％
トリトンＸ−１００を含有する１０ｍＭ　トリス−ＨＣ
ｌ　緩衝液をレセプターフラクション（２５〜プロテイ
ン／　ｍｌ　）に添加した。１％トリトンＸ−１００は
一層のプロティンを溶解したが、多分トリトンＸ−１０
０ミセルの形成に基づきホルモン結合活性を有意に減少
させた。懸濁液を５０ワツトにて４°Ｃで５秒間隔で４
回超音波処理してレセプタープロティン溶解およびホル
モン−結合活性の回復を増大させた。中性脂質を等量の
冷却した石油エーテルを用い４℃で１時間振とうしそし
て最後に１０，０００　ｒｐｍにて１時間遠心すること
により抽出した。有機溶媒、水性相および不溶性残留物
を分離した。水性相は溶解したレセプターを含有した。

水性相を５．００　Ｏｒｐｍ　　にて遠心しそして９４
３〜のプロティンを回収した。この生産物をセファロー
ス−６Ｂのカラムのゲル濾過により精製した。

このカラムを１３．５ａｌｌ！／時間のフロー速度にて
０．５％トＩＪ　）ｙ　　Ｘ−１００’ｉ有ノ）　ｌＪ
ス−ＨＣｌ緩衝液で溶離した。６ｍｌフジクションを集
めそして１２５１−ｈｃＧ　　を使用するレセプターの
ためにテストした。これらのフラクションは貯められて
いる有意なレセプター活性を有しておりそして次いでセ
ファロース−４Ｂの多層２．８Ｘ３５ｃＩｒＬカラムで
分別された。セファロース−６Ｂにおける上昇クロマト
ゲランイーはホルモン結合活性（遅れないプロティンフ
ラクション）からアデニレートサイクラーゼ活性（遅れ
たプロティンフラクション）を多量分離した。この点に
おいてサンプルはトリス−ＨＧＩＩ　　緩衝液１５ｍｊ
！当りプロティン２２Ｔｎ９を含有していた。カラム溶
離な８１ｎｌ／時間のフロー速度にて０．５％ト、４１
）ンＸ−１００を含有するトリス−ＨＧｌ　　緩衝液を
使用して実施した。４ｄフラクシヨンな集めた。本質に
おいて、セファロース−６Ｂカラムかう得たフラクショ
ンをセファロース−４Ｂカラムにより２種のフラクショ
ンに副分割した。一つのフラクションはホルモン結合活
性（遅れないプロティンフラクション）の殆どを含有し
ておりそしてその他のフラクションは５′−ヌクレオチ
ダーゼ活性（遅れたフラクション）の殆どを含有してい
る。再び、１２５１−　ｈ　ＣＧへの特別な結合による
テストを通じて活性フラクションを貯えた。４本のセフ
ァロース−４Ｂカラムからの活性フラクションをアミコ
ン限外フィルターおよびウルトロゲルーＡ　ＣＡ　−３
４（ＬＫＢ　　Ｉｎｓｔｒｕ−ｍｅｎｔｓ）の５×５０
ｃｒＩＬカラムによるゲルフィルターにより５倍濃縮し
た。

ウルトロゲルーＡＣ；Ａ−３４カラムを０．３Ｍホウ酸
リチウム緩衝液（１ｍＭ　ＭｇＣｌ１２．０．０１％Ｎ
ａＮ３および０．５％トリトｙ）１０ｍＡ／ｈｒ　のフ
ロー速度にてｐＨ７，２により溶離した。４ＴｒＬｌフ
ラクシヨンを集めた。ウルトロゲル−ＡＣＡ　Ｌ　３４
はトリトン−Ｘ−１００濃度を有意に、例えば約０．５
％から約０．２％まで減少した。

この点で、サンプルはホウ酸リチウム緩衝液中７３．５
１ｎ９のプロティンからなっていた。垂直ゾーン電気泳
動をセルロースの３Ｘ４２ｃｒｒＬカラムで実施した。

セルロース粉末をホウ酸リチウム緩衝液中で均衡させ、
傾斜しそして次いでカラム中に詰めた。カラムを電気泳
動に先立って同緩衝液で大規模ＩＣ洗浄した。レセプタ
ープロティンを同緩衝液で透析により均衡させた。電気
泳動の条件は６０６０−８Ｏ，３００−３１５ボルト、
７２時間であった。もう一つの操作において、３００ボ
ルトの一定の電圧および４℃にて５時間６０ｍＡが使用
された。カラムはホウ酸リチウム緩衝液で溶離された。

レセプター含有７ラクシヨンを限外１過により濃縮し、
ホウ酸リチウム緩衝液中のウルトロゲルＡＣＡ−３４カ
ラムでクロマトグラフィー処理して過剰のトリトンを除
去し且つより少量へ濃縮した。この段階において、精製
生産物は６．５２ｍｇの重量であった。元の７，０ＯＯ
Ｘ、！ｉ’上澄液の結合能力、第１のウルトロゲルフラ
クションおよびこの段階における生産物は夫々５．１５
゜３１０および２．６８１　ｐＭｈＣＧ／〜　プロディ
ン（０，７６Ｘ　１．　ｏ−１０１Ｍ−”の親和力定数
（Ｋｄ））であり、これらは７，０ＯＯＸＮ上澄み液中
プロティンの１１，８０５倍精製を大よそ表わしており
そして最終の５３６倍はレセプター結合能力を増大する
。

一層の精製工程を”ｈｃｃｒ結合抗−ｈｃＧセファロー
ス−４Ｂマトリツクスにおける免疫親和力カラムクロマ
トグラフィーにより実施した。ゾーン電気泳動生産物と
比較した場合、レセプターの特別な活性は１．０５倍ま
でしか増加しなかった。

電気泳動的に純粋なレセプターグリコプロティンは一層
充分に後述するようにゲル透過クロマトグラフィーを使
用する場合約５．９百万であることが見出された。精製
はディスク−ゲル電気泳動、引続いての後述する処理に
よるレセプター材料の分析が約２４０，０００分子量の
単一のグリコプロティン−バンドを与える程度に進んだ
。（本明細書中に開示されたレセプタープロティンおよ
びこれの成分の全分子量、アミノ酸分析および炭化水素
分析は開示された値の±ｌＯ％の通常受入れられる誤差
内にあることを理解すべきである。）種々のプロティン
標識が後で開示する集合体分子量並びに種々の集合体サ
ブ−ユニットの分子量を見積もるために使用された。そ
れ故、本発明の一つの態様はグリコプロティン集合体成
分がディスク−ゲル電気泳動により決定される単一グリ
コプロティンバンドとして表われるグリコプロティン集
合体を形成するために恐らくはジ−サルファイドにより
相互に結合した複数のグリコポリペプチド成分からなる
約５．９百万分子量の電気泳動的に均質なｆｉＬＨ−ｈ
ｃＧレセプターグリコプロティンの発見を含んでいる。

単離したレセプターがｈＬＨおよびｈＣＧ用の共通レセ
プターを有する種々の種の動物のコルプルルテウム並び
に本明細書中前述したもののようなその他のレセプター
源から得ることができること（そしてまたアミノ酸連鎖
のような続いての一層構造的な分解物を合成的に製造で
きること）が信じられるとはいえ、本発明渚等は牛のコ
ルポラルテアからそれを得るのである。かくして、本発
明のこの観点の一層特別な態様は前に明らかにしたよう
に洗浄剤可溶性の、電気泳動的に純粋な牛のコルポラル
テアのｈｃＧ　　−ｈＬＨレセプターグリコプロティン
を包含し且つ少なくとも２０００ｐＭ　ｈＧｃｒ／ｍｇ
プロティン、好ましくは少な（とも２５００　ｐＭ　ｈ
ｃＧ／ｍ９プロティンの特別な結合能力を有している。

結合能力は０．２５〜２０．０００ｎｇのラベルしない
ｈＣＧ　の増大する濃度の存在に：Ｍイ’Ｃ１１２５Ｉ
−ｈＣＧ　　）１．２５　ｎＪ　と同等の大よそ５０，
０００　ｃｐｍ　　を有するプロティンサンプルの均衡
化により達せられる。慣用の培養操作はリン酸緩衝液に
溶解した等量の２０％’（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコ
ール６，０００の添加によりホルモンーレセゾクー複合
体を沈殿させるために培養するのが常である。その後、
管を振と５し、遠心しそして上澄み液を吸引した。沈殿
物を緩衝液に再懸濁し、再びポリエチレングリコールと
混合し且つ再遠心する。１２５ニーｈＣＧ　レセプター
複合体を表わす啄レットの放射性を測定した。特別な結
合および親和力常数をスカツチャート”ＣＧ、Ｎ±。

Ｎ、Ｙ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　５１．６６０（１９
４１）］の方法に基いて算出した。

ディスク−ゲル電気泳動を硫酸ドデシルナトリウム（以
下’　ＳＤＳ　”と言う）−ポリアシル−アミドゝゲル
ディスク電気泳動を使用して次のように実施例 小さな修正を伴うキングおよびラエムリの方法（Ｊ、　
Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　６２．４６５（１９７１）：
）により精製ｈＬＨ−ｈｃ（、レセプターフラクション
を５ＤＳ−Ｊリアクリルアミドディスクゲル電気泳動に
より分析してプロティン成分の最適な分析を得た。ｈＬ
Ｈ−ｈＣＧレセプターの精製フラクション３０〜６０μ
ｓのアリコツトを水１００μ）に親液化し且つ溶解した
０、５％トリトンＸ−１００に溶解した。次いでサンプ
ルを１ｍＭＥＤＴＡＢ有ｐ）（ｓ、ｏの０．１２５Ｍ）
リス−ＨＣ７に対して４８時間透析した。サンプルを２
％ＳＤＳ単独または２％ＳＤＳおよび１％メルカプトエ
タノール（λ４．Ｅ、）の存在において沸騰水中でＩＶ
２分間加熱した。トリス−ＨＧＩＩ　緩衝液に溶解し且
つ２％ＳＤＳおよび１％Ｍ、Ｅ、で処理した公知分子量
のプロティン標識を積重ねたゲルに適用しそして同時に
電気泳動に付した。電気泳動は０．１％ＳＤＳ含有ｐ）
（３，３００，０２５Ｍ）リス−グリシン緩衝液中で行
なった。電気泳動の後、ゲルをガラスカラムから除去し
そしてプロティンバンド３Ｃｏｏｍａ−ｓｓｉｅブルー
で染色した。プロティン標識および精製レセプターフラ
クションの相対的流動性ＣＲｆ）を計算しそしてＲｆと
各標識プロティンの分子量のロガリズムとの関係を確立
し゛Ｃ精製レセプターサンプルの分子量を算出した。２
％ＳＤＳで処理゛した５、９百万集合体す／プルは大よ
そ２４０，０００分子量の単一グリコプロティンバンド
を与工た。

ＳＤＳプラスＭ、Ｅ、で処理したサンプルはオリゴマー
、恐らくジサルファイド結合した、の存在を示唆してい
る大よそ１６０，０００；５７，０００および４４，０
００分子量の３個のバンドを与えた。

ディスク−ゲル電気泳動に先立って、セルロースゾーン
電気泳動後に得られたレセプタープロティンをセファロ
ース−４Ｂのカラムにおけるゲル透過クロマトグラフィ
ーに付して分子量ケ決定した。ゲルｆ過の後、レセプタ
ープロティンの遅れないフラクションは前述の如＜５．
９百万分子集合体である。カラムは１　ｍＭ　　Ｍｆｉ
Ｇｌ１２　、０．０１７０ＮａＮ３および０．５％トリ
トンＸ−１００含有１０ｍＭ）’Ｊスス−Ｃｌ　緩衝液
で溶離した。

一層の実験を５．９百万集合体を形成する成分または単
位を決定するために実施した。各々の場合に、分子量見
積りは後述する如（ゲル透過クロマトグラフィーを使用
して決定した。

５．９百万分子量プロティンをその最大のポリペプチド
９単位に分解する試みを行なった。

し・セプターグリコプロテインのゲル透過クロマトグラ
フィーを下記の種々の処理の前後に実施した。（大よそ
１■／ｍＡ！のプロティン濃度が各処理に使用された。

）夫々の場合に、ゲルカラムを０．５％トリトンＸ−１
００含有の適当な溶媒で均衡させ且つ溶離した。公知分
子量（ＤＮＡ（スーパーコイルした）ブルーデキストラ
ン、ケログロプリン、フェリチン、アルドラーゼおよび
カタラーゼ）の標準をプロティン標識の分子径の大よそ
の範囲を決定するために選択されたカラムおよびゲルに
よりゲル沢過した。各標識および各レセプター成分用の
Ｋａｖ　（ゲルクロマトグラフィー中の溶質移転のイン
デックス）をその溶離量から算した。レセプクー成分の
分子量をＫａｖ対公知プロティン標識の分子量の標準曲
線から決定した。

ＬＭ　　Ｎａ（Ｊを用い４°にて一夜並びに２％ＳＤＳ
および１％メルカプトエタノールを用い４゜にての処理
はレセプタープロティン集合体の分子量を変えなかった
。しかしながら、２％ＳＤＳを用いる、１００℃にて１
１７４分間の処理は５．９百万分子量材量をホルモンな
しのｈＬＨ−ｈｃＧレセプターのセファロース−６Ｂカ
ラムで分離して複数の２８０．０００分子量種類に分解
した。セファロース−６Ｂカラムを１　ｍＭ　ＭｇＣ１
１２，０，０１％ＮａＮ３．０．１％’ＳＤＳおよび０
．５％トリトンＸ−１００を含有する０、１Ｍ酢酸で溶
離した。２８０，０００分子量種類を、１２５　■−ｈ
ＣＧ　　で培養しそしてセファロース−６Ｂカラムに適
用した時、１８５，０００の分子量を有する主要ホルモ
ン−結合成分が１ｍＭＭＩＣ，ｌ　２．０．０１％Ｎａ
Ｎ３　および０．５　％　）リドンＸ−１００含有のｌ
ＯｍＭ）リス−Ｈ（Ｊ　　緩衝液で溶離することにより
回収した。４０，０００の分子量が１８５，０００分子
量種類からｈＣＧ　を減じるならば、得られる１４５，
０００の分子量は大よそ２８０．０００分子量のレセプ
ターの二量体の存在を示唆している。それは２８０，０
００種類が各々大よそ１４５，０００分子量の二種のオ
リコマ−に分離することである。１２５ニーｈＣＧの結
合または１２５１−ｈＣＧ　単独の共有結合の両者は２
８０，０００分子量二量体の減少を引起しそしてホルモ
ン−結合１８５，０００分子量の出現がレセプターを形
成する。

もう−セットの実験において、ウルトロゲルＡＣＡ−３
４０カラムにおけるゲル濾過に従った２％ＳＤＳおよび
１．５ｍＭＤＴＴ（ジチオスレイトル）を用い、１００
℃にて１１／！分間処理による２８０．０００分子量成
分け１　ｍＭ　ＭｇＧ１１２．０．０１％ＮａＮ３．０
．０１％ＳＤＳ、２ｍＭＤＤＴおよび０．５％）　＋）
）ｙＸ−１００を含有する０、ｏＩＭ）リス−ＨＣ，ｌ
　　緩衝液で溶離することにより１２０．０００分子量
種類のＩＩＬ）Ｉ−ｂＣＧ　　レセプターを得た。

ｉｏｏ℃における１儀分間、５ＱｍＭＤＴＴによる１２
０，０００種類の一層の処理および前記０．０１Ｍ）リ
ス−ＭＣ，ｌ　　緩衝液中のウルトロゲルＡＣＡ−３４
でのゲル濾過は分子−ｚｓｓ、ｏｏｏおよび３８，００
０の二種のオリゴマーを与えた。これら成分の各々はと
くに１２５Ｉ−ｈＣＧ　Ｙ結合しそして夫々１２５，０
００および９２，０００の分子量ノ：ｔ、　ルモンー結
合複合体として１　ｍＭ　’　ＭＩ　Ｇ　１３２．０．
０１％ＮａＮ３オヨヒ０．５％トリ）ｙＸ−１００を含
有する１０ｍＭ）リス−ＨＧ１　　緩衝液によりウルト
ロゲルＡＣＡ−３４から溶離された。

もう−っの実験において、　　■−ｈｃＧ　　を５．９
百万分子量集合体に共有結合し、次いで２％ＳＤＳを用
い、１００°にて１棒分間処理によりホルモン−結合１
８５，０００分子量種類へと分離した。

これの３００ｏｒｐｍ　上澄み液をセファロース−６Ｂ
のカラムに適用しそしてさらに沈殿物を０．５％トリト
ンＸ−１００含有の１０ｍＭ）リス−ＨＣ１緩衝液に再
び溶解しそして次に同型カラムにおけるゲル濾過に従っ
て２％ＳＤＳを用い１ｏ。

℃にて１≠分間処理した。両者の例において、１ｍＭ　
ＭｇＣｌ２．０．０１％ＮａＮ、０．１％ＳＤＳおよび
０．５％トリトンＸ−１００含有の１０ｍＭ）リス−Ｈ
Ｃｄ　　緩衝液を用いる溶離により１８５，０００分子
量種類が得られた。５０ｍＭＤＴＴを用℃・、１００°
にてＩＡＡ分間１２５■−ｈＣＧ結合種の処理もまた１
１０，０００および７４，０００の分子量の１２５ニー
ｈＣＧ　結合オリゴマー（ｈＣＧ　　につき４０．００
０を減少した後の７０，０００および３４．０００分子
量単位に相当する）を得た。２％ＳＤＳの存在において
、１００°にてｌ”Ａ分間、１５０ｍＭＤＴＴまでによ
る８５，０００および３８．０００分子量の処理はこれ
らの単位をさらに一層少さた分子量成分に分離しなかっ
た。それ故、７０．０００〜８５，０００および３４，
０００〜３８．０００分子量種類は恐らく、１２０，０
００〜１４５．０００分子量成分力ジサルファイト９結
合したサブユニットでありそしてｈＣＧ　およびｈＬＨ
により特別な結合を実施する最小の先金なポリペプチド
単位であり得ることが期待される。

前記の実験および検討から、この時点において、自然に
一発生するレセプターが知られた二種の最小分子量単位
は、ホルモン単位からのそれらの解放に関して、夫々約
３４，０００〜３８，０００および約７０，０００〜８
５，０００のそれらの分子量範囲、それらのｈＣＧ　に
一ついての特別な結合能力および前述した種々の処理条
件下のそれらの安定性と定義することができる。順に、
これらの基本的単位は共有ジサルファイト９結合により
約１２０，０００〜１４５，０００分子量の縁返し単位
に連結１−るよ５である。現在、二種の基本単位の各々
が１２０，０００〜１４５，０００分子量単位を形成す
べく加入すると信じられる。分子量決定の変化は使用し
た多数の異なる標準プロティン標識を包含するディスク
ゲル電気泳動およσゲル、クロマトグラフィーシステム
の限度に基づくと信じられる。

しかしながら、重要な決定は各々が特別なｈＣＧ結合能
力を有する二種の異なる分子量サブユニットが、順にレ
セプターの基本的な繰返しビルディング群を形成するこ
とで存在することである。

１２０．０００〜１４５，０００分子量種類は、ある意
味で繰返し単量体単位であり、それの二つが２４０．０
００〜２８０，０００分子分子量ゴマーを形成すべく結
合する。複数のこれらオリゴマーは互いに合わさって５
．９百万集合体を形成する。

アミノ酸および炭化水素分解を電気泳動的に純粋なレセ
プター生産物および部分的に純粋な中間レセプター生産
物のいくつかにより実施した。アミノ酸分析を水に対し
て、−夜レセプターの１００μｇアリコツトを透析し、
真空乾燥し、そしてＪｌｏｏにて２４時間５．７　Ｎ　
ＨＣｌＪ、　ＯＯμｌで加水分解することにより実施し
た。加水分解物を真空中で再度乾燥して℃）＜らの残留
酸を除去した。

サンプルをクエン酸緩衝液に溶解しそして自動アミノ酸
分析機（Ｄｕｒｒｕｍ、　Ｍｏｄｅｌ　Ｄ　−５００）
　　でアミノ酸を分析した。

ｈＬＨ−ｈＣＧ　　レセプターの中性糖含量は糖の加メ
タノール分解、トリメチシリル化、およびガス液体クロ
マトグラフィーにより測定した。ヘキソースアミン含量
は、５．７　Ｎ　Ｈ（Ｊ　　によるサンプルの４時間加
水分解後、アミノ酸分析機で測定した。

精製レセプターのシアル酸含量は、チオバルビッール醒
法により測定した。

電気泳動的に純粋なレセプター中に見出された主要なア
ミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸であった。

百分率ベースで、ゾーン電気泳動につき代用の親和力ク
ロマトグラフィー以外は、実施例１の連続法により精製
されたサンプルと比較して各々若干少ない。電気泳動的
に純粋なレセプターの炭化水素含量は大よそ１０％であ
る。三種のレセプター材料のアミノ酸および炭化水素分
析を表１に示す。グリコプロティン集合体中の各種アミ
ノ酸残留物の数は表１から算出できる。

電気泳動的に純粋なグリコプロティンレセプター集合体
は抗血清の生産につき兎のようなテスト動物に投与した
場合、抗原として作用する。前述したように、集合体の
種々のグリコプロティンサブユニットもまたテスト動物
において抗原反応を誘い出すと信じられる。

表１ ｈＬＨ−ｈＣＣレセプターのアミノ酸および炭化ウルト
ロ親相カクロ　終免疫親和カクロマゲルＡＣマドグラフ
　　トダラフィ一工程なスレオニン　　　　　４．０　
　　　５．６　　　　　　　　５．３セリン　　　　　
　３．９　　　４．６　　　　　　５．８グルタミ２袋
　　　　１３，６　　　　１２，６　　　　　　　１２
．１プロリン　　　　　　　９．０　　　　　８．７　
　　　　　　　５．２グリシン　　　　　　　３．８　
　　　　４．７　　　　　　　４．５アラニン　　　　
　　　４．６　　　　　５．４　　　　　　　４．８バ
リン　　　　　　６．０　　　　５．１　　　　　８．
３システイン　　検出不能　　検出不能 システィン酸　　痕　跡　　　１．３　　　　　　２．
４＆メチオニン　　　　　　１．５　　　　　１．７　
　　　　　　２．３インロイシン　　　　　４．９　　
　　　５．５　　　　　　　４．４０イシン　　　　　
　１１．７　　　　　９．６　　　　　　　８．７チロ
シン　　　　　　　３．４　　　　４．３　　　　　　
　４．９フエニルアラニン　　　５．１　　　　　６．
０　　　　　　　５．Ｑリシン　　　　　　　　７．３
　　　　　６．９　　　　　　　７．０ヒスチジン　　
　　　　３．６　　　　　ｅ　　　　　　　　　２．８
アルギニン　　　　　　７．５　　　　　７．６　　　
　　　　７．４炭化水素 フコース　　　検出不能　　　　　　　　　検出不能マ
ンノース　　　　　　１．２　　　　　　　　　　　　
　　１．１ガラクトース　　　　　０．７　　　　　　
　　　　　　　　１．６Ｎ−アセチルグルコース°１，
１　　　　　　　　　　　　　　３．７アミン Ｎ−アセチル ガラクト−、アミ７０・３２°。

ａ　過ギ酸酸化後、別アリコツトで測定ｅ　洗浄剤で溶
離 ※　一層の精製に先立つ以外、ウルトロゲルＡＧＡ−３
４を使用するクロマトグラフィ一工程までおよびこれを
含む実施例１型順序の中間サンプル ※※　ウルトロゲルＡＣＡ−３４を使用するクロマトグ
ラフィ一工程まで実施し且つゾーン電気泳動の代りに親
和力クロマトグラフィーを行なった実施例１型順序 実施例２ この実施例は中間−サイクルｈＣＣＴ　　波動の検知を
包含する本発明の詳細な説明する。

Ａ、ホルモン−酵素複合体の調製 ０４Ｍ　　ＮａＧ７を含有するｐＨ７，５の０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液２００μｌに２ｍｙのｈＬＨを浴
解しそして振と５器中で、室温にて３０分間、エタノー
ル中２０　ｍＭ、Ｎ−スクシンイミジル３，２−ピリジ
ルジチオ−プロピオネート（ＳＰＤＰ）２００μｌと反
応させた。過剰の５ＰＤＰをｐＨ８，４のＯ，０１Ｍ重
炭酸アンモニウム緩衝液においてセファデックスＧ−２
５（精製）のｌＸ２０ｃｒＩＬカラム上ゲル沢過によ（
）除去した。このカラムをユビコービレコーダーを経て
冷蔵したフラクションコレクター中で８．４ｄ／時間の
速度で溶離した。

各フラクションを標準放射免疫検定で分析してｈＬＨ活
性を位置づけた。２−ピリジルージサルファイト”−ｈ
ＬＨを含有する親液化したフラクションの０．５■プロ
テインをチオール化アルカリホスファターゼの０．２５
１ｎ９プロティン等量（即ち５０μβ中２．５μＭ）を
有するガラスバイアル中で振とうしながら室温にて２４
時間反応させた。

培養物をｐＨ８，４の０．０１Ｍｍ炭酸アンモニウム緩
衝液で均衡させ且つ溶出したウルトロゲル−ＡＣＡ−３
４のＱ、５Ｘ２ＳｃｒＩＬカラムに適用した。

カラムから溶離したフラクションの好適なアリコツトを
ｈＬＨの放射免疫検定により分析しそしてベックマン分
光光度計における４　２０　ｎＭにて光学密度を試験し
てｈＬＨ−アルカリホスファターゼ接合、並びに未接合
アルカリホスファターゼおよびｈＬＨを位ｆｔづけた。

ｈＩＪ（−アルカリホスファターゼ接合体を含有するフ
ラクションを使用するまで一２０℃にて好適なアリコツ
トに貯蔵した。

Ｂ。抗−ＬＨ−γ−グロブリンまたは共有結合した精製
レセプターを有する不活性支持体の調製、６朋直径の固
形ガラスピーズを７５Ｉｂ／ｓｑインチの圧力で１０分
間６０グリツド粒子で砂吹付けした。抗−ｈＬＨ−γ−
グロブリンの０．００１％溶ｉ（１，４μ９／　ビーズ
）および実施例１の精製ｈＬＨ−レセゾクープロテイン
の０．００３５％水性溶液が反応に使用された。砂吹付
けたビーズ２００ｙのバッチ（大よそ７００ビーズ）を
トノぐノフ代謝振と５器中で７０°Ｃにて４時間、トル
エン中１０％γ−アミノプロピル−トリエトキシシラ７
２００ｍ１中で加熱してアルキルアミノ基を生じさせた
。試薬を傾斜しそしてビーズをトルエンのアリコツト２
００ｍ７！で３回洗浄し、風乾しそして室温で１時間ｐ
Ｈ７，０の０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の１．
２５％グルタルアルデヒド１００ｒｒＬｌで培養した。

クルタルアルデヒド賦活化ビーズをｐＨ７，０の０．０
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液のアリコツ）　１００ＴＬ
ｌで５〜６回洗浄した。抗−ＬＥ（−γグロブリンをポ
スト等（ｓｕｐｒａ）により記載された如く、共有的に
ガラスピーズに結合した。同様に、０，５％トリトンＸ
−１００を含有するｐＨ７，２の０．ＯＩＭ）リス−Ｈ
Ｇ１　　緩衝液中のｈＬＨレセプターをガラスピーズに
結合した。結合反応の後、ビーズな冷却した０、０１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液で洗浄して未反応抗体またはレ
セプターを除去した。次いでビーズをｐＨ００，０１Ｍ
リン酸ナトリウム中ＩＭグリシンｉｇｔｏｏ−で緩（振
と５しながら４℃にて２時間培養して遊離アルキルアミ
ノ基をブロックした。抗−ｈＬＨ−γ−グロブリンまた
はｈＬＨ−レセプター結合したビーズを、使用ｆるまで
一２０°Ｃにて気密容器に貯蔵した。

Ｃ６実際の検定操作ケ慣用の方法、例えばｈＬＨを定量
するために次の操作を使用して実施した。

二セットの７５Ｘ１００ｍｍポリスチレン検定管、即ち
一個の抗体結合したガラスピーズな含有する一セットの
６管および一個のレセプター−結合したガラスピーズを
含有する他のセットの６管に、１）コントロールまたは
未知物としての未知の尿サンプル（１：１０稀釈）とし
て（ルテア相中で集めそしてリン酸緩衝液０．０１　Ｍ
、　ｐＨ７，０で１：１０稀釈した）尿を含有する低い
１１ＬＨ１００μｌ、２）コントロール管へのｈＬＨ標
準液または未知の管にリン酸す）　ＩＪウム緩衝液１０
０μｌおよび３）全ての管の１５０　ｎ、ｌ！プロティ
ン／管と同時のＬＨ−アルカリホスファターゼ接合体１
００μｌを添加した。８００から６．２５　ｍＩＵ／―
へのｈＬＨの２倍稀釈物を尿のｈＬＩ（標準液が含んで
いた。管の内容物を混合しそしてトゝバッフ振と５器で
室温にて２時間培養した。培養後、試薬を傾斜しそして
ビーズを０．９％Ｎａｃ６１ｍｌで２度洗浄した。基質
溶’ｔ’ｆＥＩ　ＴＬｌ　（６，３ｍＭ　ｐ　−ニトロ
フェニルホスフェート−Ｎａ２．０．０５Ｍクリシンお
よび０．ＩＮ　　ＮａＯＨ，ｐＨ１０，５中０，５Ｍｋ
ＡｊｊＣ，ｌ　２）を６管に添加した。反応を３７℃に
て３０分間実施し、次いでＩ　Ｎ　　ＮａＯＨＱ、５Ｔ
Ｌｌを６管に添加しそして吸収をベックマン２４００分
光光度計で４２０　ｎＭにて記録した。標準曲線をコン
トロールから進展させそして得られた標準曲線を未知物
中のｈＬＨの濃度を測定するために使用した。

前記はｈＬ）（Ｏ酵素免疫検定（ＥＩＡ）および酵素レ
セプター検定（ＥＲＡ）の両者を説明している。

ｈｃＧ　の検定および分析を同様の試薬を使用する同様
の方法で実施する。

テストの感度、１１．０〜１２．５　ｍＩＵ／ｍＪは正
常な月経サイクルの小胞およびルテア相の間、ｈＬＨ量
からの尿の中間サイクルｈＬＨ波動（７５〜１００ｍＩ
Ｕ　ｈＬＨ／ｍｌ）を区別す７）［充分である。

２つの追加的利点が試薬およびとの実施例のテスト操作
により生じる。第１に、ＥＲＡにおいて、精製レセプタ
ーの安定性が不活性支持体に結合した後に増加する。第
２にＥＩＡおよびＥＲＡ方法が放射免疫検定方法よりも
ｈＬＨに関して一層高い値を与える。この１増幅１特性
はｈＬＨ増加の量として増加し且つこの方法において、
ＥＩＡおよびＩＩＡ方法はｈＬ（、波動の検知における
助勢のため１増幅器１として働く。

本発明の好ましい態様において、検定に使用したホルモ
ン（ｈＬＨまたは（ｈｃＧ））　をすなわち、ホルモン
−酵素複合体を形成することが、精製レセプターの使用
により精製して密接に関連したホルモンおよびサブユニ
ットを除去する。本明細書中参照して入れたサイト−等
（ｓｕｐｒａ）　　の操作のような操作をホルモン精製
を達成するために使用することができる。例えば、ホル
モンを以前に同相に結合したレセプターにより培養する
ことができ、次いで固相および上澄み液を互いに分離し
そしてホルモンを適当なｐＨおよび温度における緩衝液
、例えば４０°Ｃにて１分間、ｐＨｌ０の０．１Ｍトリ
ス−ＨＧＩ　　緩衝液による処理でレセプターから分離
して精製ホルモンを得る。

前記実施例２において、ｈＬＨ−ホスファターゼ接合体
はＮ−スクシンイミドゝエステル基により最初にｈＬＨ
ホルモンを５ＰＤＰと反応する反応連鎖によりｈＬＨ−
８ＰＤＰ　　複合体を形成することにより調製された。

その後、プロティン結合した２−ピリジルジサルファイ
ド構造がチオール化アルカリホスファターゼにより還元
された。化学的に、得られた分子はジチオプロピオンア
ミド９に゛より結合したプロティン−プロティン複合体
である。

カールソン等（ｓｕｐｒａ）　　はこれらのタイプの化
学反応連鎖を詳細に記載している。

ホルモン−酵素複合体を調製する一層好ましい方法は、
第１に別々にホルモン（この場合にはｈＬＨまたはｂＣ
Ｇ）および（非チオール性）酵素を５ＰＤＰと反応させ
てホルモン−８ＰＤＰｉ合体および酵素−３ＰＤＰ複合
体を形成することである。その後、ホルモン−３ＰＤＰ
複合体または酵素−５ＰＤＰ複合体のいずれもが、例え
ば０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中でジチオスレイトル
と反応することによりチオール化される。

最後に、チオール性試薬は非チオール性と反応する。す
なわち、ｈＬＨ−Ｓ　Ｐ　Ｄ　Ｐ複合体はチオ−ル性酵
素−８Ｐ、Ｄ　Ｐ複合体と反応する。中間チオール化工
程を除いて、反応条件は実施例２のそれらであり得ろ。

前記実施例において、本発明の固相分析に使用された不
活性支持体はガラスピーズにより例示される。画業上知
られたその他の不活性支持体は、例えば合成および天然
Ｊリマーのようなその他の無機１性を基礎にした粒子な
ど、一方、ビーズの形態またはその他の形においては、
例えばロッド、細い片、試験管、水、その他を使用ｊる
ことかできろ。同様に、ホルモン−酵素複合体はアルカ
リホスファターゼで例示できるが、しかし色彩−形成す
るＥＩＡまたはＥＲＡ反応に使用されるその他の酵素、
例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、グルクロニダーゼ
、その他がここでは好適である。

本発明の洗練性および単純性、とくに家庭内受精または
妊娠テストにおける質的な適合性は染料をホルモンに直
接結合することである。か（して、ホルモン−染料複合
体カー、ホルモノー酵素複合体を形成するために前述し
た操作を使用して、ホルモン−酵素複合体の代りに形成
される。ホルモン−染料複合体の特別な例は、螢光塗料
ＡＮＳに結合したｈＬＨである。これは色彩−形成基質
の必要性を除く。本発明のこの態様において、ホルモン
−染料接合体が着色されろ。もし接合体が、未知のサン
プル中のｈＬＨにより固相から置代えられるならば、上
澄み液は着色するであろう。

本発明の変形として、次のものが挙げられる。

例えば、医師の診療所または家庭において、テスト操作
を実施ｊるために使用されろ態様において、抗体または
レセプターはプラスチック試験管、例　′えば画業上知
られた操作に使用されるポリスチレン管に直接結合する
ことができる。抗体およびレセプターは試験管内部表面
部分の被覆物として存在し得ろ。ホルモン−酵素接合体
力添加後、培養および傾斜を実施する。酵素の存在下、
色彩を形成するための基質を次いで元の管または上澄み
液に添加して受精および／または妊娠の有無を決定する
ことができる。本発明のもう一つの変形は、抗体または
レセプターを結合するためにプラスチックまたはガラス
の細片またはロッドの使用を包含している。この固相を
、ホルモン−酵素またはホルモン−染抜合体プラス未知
のものが加えられる試験管に入れる。標準色彩形成反応
が使用されろ。尿以外の生物学的液体を試験操作に使用
することができる。例えば、ｈＬｆ（および／またはｈ
ＣＧ　を含有することか知られた種々の血液フラクショ
ンを使用することができる。「家庭内」テスト態様にお
いて、使用に便利な液体は唾液または尿である。

画業上理解されているように、標準液および／または陽
性および／または陰性コントロールは比較目的のために
未知のものと並べて進める。

本発明の変形は当業者には明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のレセプター精製方法の特別な手続補正
書（方却 昭和５８年１２月２０日 特許庁長官殿 （特許庁審査官　　　　　　　　　　　殿）■、事件の
表示 昭和５８年特許願第２０９２７４　　号３、補正をする
者 事件との関係　特許出願人 名　称　　コーネル・リサーチ・ファウンデーション・
インコーホレイテッド霞が関ヒル内郵便局　私書箱第４
９月 昭和　　年　　月　　日（発送日　昭和　　年　　月　
　日）上記（１１、ｆ２１及び（３）共に別紙の通り。 但し、上記（２）は明細書の浄−一（同各に変史なし）
。 手続補正書（方却 昭和５９年　１月１′７日 特許庁長官殿 （特許庁審査官　　　　　　　　　　　　殿）１、事件
の表示 昭和５８年特許願第２０９２７４　　列事件との関係゛
特許出願人 名　称　コーオ・ル・リサーチ・ファウンデーション・
インコーホレイし昭和　　年　　月　　　日（発送日、
昭和　　年　　月　　日）６　補正により増加する発明
の数：０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）次の特性、すなわち 仏）電気泳動的に均質であり （ｂ）約５．９百方±１０％の分子量および（ｃ）　　
   ｈＬＨおよびｈＣＧ　　用の特別の結合能力を有してお
   り且つｈＬＨおよびｂＣＧ　用の共通レセプターの自然
   発生源から得られた実質的に純粋なグリコプロティン。 （２）少なくとも２０００ｐＭｂＣＧ／■　プロティン
   の特別な結合能力を有する特許請求の範囲第１項記載の
   グリコプロティン。 （３）少なくとも２５００　ｐＭ　ｈｃＧ／１ｎ９　　
   プロティンの特別な結合能力を有する特許請求の範囲第
   １項記載のグリコプロティン。 （４）次の追加的特性、すなわち 次のようなアミノ酸分析（重量％±１０％）アスパラギ
   ン酸　　　　　　９．１ スレオニン　　　　　　　　５．３ セリン　　　　　　　　　５．８ グルタミン酸　　　　　　　１２．１ プロリン　　　　　　　　　　５．２ グリシン　　　　　　　　　４．５ アラニン　　　　　　　　　４．８ バリン　　　　　　　　８．３ システィン　　　　　　　　Ｏ システィン酸　　　　　　　　２．４別のアリコツトに
   おける過ギ酸酸化 により決定された場 合。 メチオニン　　　　　　　　２．′３ インロイシン　　　　　　　４．４ ０イＳ／ン　　　　　　　　　　８．７チロシン　　　
   　　　　　　４．９ フエニルアラニン　　　　　５．０ リジン　　　　　　　　　　７．０ ヒスチジン　　　　　　　　２，８ アルギニン　　　　　　　　７．４ １００．０ （ｅ）　　マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグ
   ルコサニン・Ｎ−アセチルガラクトースアミド５および
   シアル酸か、らなる炭化水素組成物を有する特許請求の
   範囲第１〜３項のいずれかに記載のグリコプロティン。 （５）　　次の特性、すなわち （ａ）　　電気泳動的に均質であり、 （ｂ）　　約２４０．０００〜２８０．０００ｊｌ　０
   ％の分子量および （ｃ）　　ｈＬＨおよびｈｃＧ　用の特別な結合能カケ
   有するｈＬＨおよびｈｃＧ　用の共通レセプターの自然
   発生源から得られた実質的に純粋なグリコプロティン。 （６）次の特性、すなわち （ａ）　　電気泳動的に均質であり （ｂ）　　約１２０，０００〜１’４５，０００＋１０
   ％の分子量および （ｃ）ｈＬＨおよびｈＣＣ用の特別な結合能力を有する
   ｈＬＨおよびｈＣＧ　用の共通レセプターの自然発生源
   から得られた実質的に純粋なグリコプロティン。 （力　次の特性、すなわち （ａｌ　　電気泳動的に均質であり （ｂ）　　約３４，０００〜３８，０００＋１０％の分
   子量（ｃ）ｈＬＨおよびｈＣＧ　用の特別な結合能力を
   有するｈＬＨおよびｈｃＧ　用の共通レセプターの自然
   発生源から得られた実質的に純粋なグリコプロティン。 （８）次の特性、すなわち （ａ）　　電気泳動的に均質であり （ｂ）　　約７０，０００〜８５，０００＋１０％の分
   子量および （ｃ）　　ｈＬＨおよびｈＣＣ，用の特別な結合能力を
   有するｈＬＨおよびｂＣＧ用の共通レセプターの自然発
   生源から得られた実質的に純粋なグリコブロチ９ン。 （９１ｈＬＨまたはｂＣＣ，ホルモンをレセプターと複
   合せしめる条件下、特許請求の範囲第１〜８項のいずれ
   かに記載のレセプターと不純なｈＬＨまたはｂＣＧ　ホ
   ルモンとを接触させ、残留物からレセプター相を分離し
   そして次にレセプターからｈＬＨまたはｈＣＧを放出す
   ることからなるｈＬＨまたはｈｃＧ　ホルモンを精製す
   る方法。 ００）特許請求の範囲第９項の方法により生産された生
   産物。 Ｉ　特許請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のレセ
   プターを運ぶ固形支持体からなるｈＬＨまたはｈｃＧ　
   　レセプター検定用′の固形相。 （１２１Ａ、ホルモンがｈＬ’ＨまたはｈＣＧ　である
   ホルモン−酵素複合体またはホルモン−染料複合体− Ｂ、有許請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のレセ
   プターを運ぶ固形、不活性支持体からなる固形相、およ
   び Ｃ，ホルモン−酵素複合体が使用される場合に、Ａの酵
   素−複合体の酵素と反応した時色彩を形成する材料から
   なる試薬キット。 Ｑ３１Ａ、ホルモンがｈＬＨまたはｈｃＧ　であ゛るホ
   ルモン−酵素複合体またはホルモン−染料複合体、 Ｂ、ｈＬＨまたはｈＣＧ抗体を運ぶ固形、不活性支持体
   からなる固形相、 Ｃ，ホヘルモンー酵素複合体が使用される場合に、Ａの
   酵素−複合体の酵素と反応した時色彩を形成する材料お
   よびホルモンが特許請求の範囲第１０項に記載の生産物
   であることからなる試薬キット。 Ｃ４）Ａ。未知のサンプルおよびｈＬＨまたはｈｃＧ　
   　−酵素複合体またはｈＬＨまたはｈＣＧ　−染料複合
   体と共に自然に発生する精製ｈＬＨまたはｈＧＧ　　レ
   セプターを運ぶ不活性、固形支持体を混和すること、 Ｂ、ｈＬＨまたはｈＣＧをレセプターと反応せしめる条
   件下、混和物を培養すること、Ｃ９液相から固相を分離
   すること、 Ｄ。酵素複合体が使用される場合圧、酵素の存在におい
   て着色された化合物を形成する材料な液相または固相い
   ずれかに添加すること Ｅ。生産された着色された材料の量を質的または量的に
   測定することおよび量の測定を行なう場合に、生産され
   た着色された材料の量を標準曲線と比較して量的結果を
   決定すること、レセプターが特許請求の範囲第１〜８項
   のいずれかに記載の生産物である改善からなる未知のサ
   ンプル中ｈＬＨまたはｈＣＧ量を質的または量的に決定
   するための方法。 （１９Ａ、未知のサンプルおよびｈＬＨまたはＩＩＧＧ
   　　−酵素複合体またはｈＬ）（またはｈＣＣＴ−染料
   複合体と共にｈＬＨまたはｂＣＧ抗体を運ぶ不活性、固
   形支持体を混和すること、 Ｂ、ｈＬＨまたはｈＣＧを抗体と反応せしめる条件下、
   混和物を培養すること、 Ｃ０液相から固相を分離すること、 Ｄ、酵素複合体が使用される場合、酵素の存在において
   着色された化合物を形成する材料を液相または固相のい
   ずれかに添加すること、Ｅ、生産された着色された材料
   の量を質的または量的に測定することおよび量の測定を
   行なう場合に、生産された着色された材料の量を標準曲
   線と比較して量的結果を測定すること、その点でホルモ
   ン−酵素複合体またはホルモン−染料複合体を調製する
   ために使用されたｈＬＨまたはｈＣＧホルモンが特許請
   求の範囲第１０項に記載の生産物であることから未知の
   サイプル中のｈＬＨまたはｈＣＧ量を質的または量的に
   決定するための方法。