JPH0568237B2

JPH0568237B2 -

Info

Publication number: JPH0568237B2
Application number: JP60265261A
Authority: JP
Inventors: Masahiko Sawada; Kazuhiko Kurosawa; Hiroshi Sasaki; Shoichi Takao
Original assignee: Godo Shusei KK
Current assignee: Godo Shusei KK
Priority date: 1985-11-26
Filing date: 1985-11-26
Publication date: 1993-09-28
Also published as: US4727026A; JPS62126989A; CA1247032A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は澱粉質の糖化に関し、さらに詳しくは
コルテイシウム属担子菌の生産する酵素を用いて
澱粉質を無蒸煮で糖化し、グルコースを生成させ
る方法に関する。〔従来の技術〕澱粉質を原料としてグルコースを製造するには
従来より２種のアミラーゼによる２段階反応、す
なわち、まず、澱粉乳を高温で糊化させ、α−ア
ミラーゼを80〜120℃で作用させて液化した後、
さらにグルコアミラーゼを45〜60℃で作用させて
糖化する方法が用いられている。しかしこの方法は、前段の蒸煮工程に多量の熱
エネルギーを必要とし、またα−アミラーゼとグ
ルコアミラーゼの作用温度、作用PHが異なるため
煩雑な操作が必要であり、さらに実際に工業的に
使用されている30〜50％の高濃度の糊化澱粉は極
めて粘度が高いため反応が均一に進行せず、生産
管理上多くの困難を伴つていた。〔発明が解決しようとする問題点〕これらの欠点を克服する目的で澱粉を糊化させ
ることなく、すなわち無蒸煮で澱粉を直接糖化し
ようとする試みがアスペルギルス属
（Aspergillus）、リゾプス属（Rhizopus）に属す
る酵素を利用することを中心に数多く行なわれる
様になつた。これらの方法は、一段階の反応でグ
ルコースが得られ、また澱粉が30％以上の高濃度
においても反応液は低粘度を保ち、エネルギーコ
ストおよび操作上の有利性を狙つたものである。しかし、これらの報告で用いられる酵素の多く
は、澱粉が高濃度である条件下では作用し難いと
いう欠点を有する。例えば上田らの報告によれ
ば、黒麺菌（Aspergillus awamori）〔スターチ
（starch／sta¨rke）、33(9)、313（1981）〕やリゾプ
ス属（Rhizopus sp.）〔スターチ（starch／
sta¨rke）、27、123（1975）〕では２％濃度の澱粉を
糖化するのが限度と考えられる結果を示してい
る。さらに強い無蒸煮澱粉糖化力を持つとされて
いる貝沼らにより報告されたカララ・パラドキサ
（Chalara paradoxa）〔澱粉科学、32(3)、189
（1985）、特開昭59−140896号〕においても５％澱
粉が糖化限度であり、10％濃度以上の澱粉の糖化
は非常に困難であつた。また、澱粉を無蒸煮で糖化する際には反応中の
雑菌汚染に注意しなければならず、なるべく高
温、好ましくは45〜60℃で反応を行なう必要があ
るが、リゾプス属、カララ・パラドキサ等の酵素
は50℃以上では全く使用する事ができないという
欠点もあつた。更に最近、コルテイシウム・ロルフシイ
（Corticium rolfsii）IFO4878株の生産する酵素
が澱粉を無蒸煮で糖化する作用を有することが報
告された〔日本食品工業学会誌、25(1)、22
（1978）〕。しかしこの酵素は、10％トウモロコシ
澱粉を無蒸煮で90％までしか糖化せず、当該報告
者らも述べているように「高濃度澱粉に対して
（無蒸煮で）本酵素での高い分解率を目指すのは
限界」（前記報告第27頁）があるとされていた。以上の如く澱粉質を工業的に無蒸煮で糖化する
ための満足すべき方法はなかつた。〔問題点を解決するための手段〕そこで本発明者らは、澱粉質を無蒸煮で糖化す
るための有用な方法を見い出すべく種々検討した
ところ、コルテイシウム属に属する菌株の生産す
る酵素が公知のグルコアミラーゼに比して無蒸煮
澱粉によく作用し、10％以上の高濃度無蒸煮澱粉
でもほぼ100％糖化することができる事、かつそ
の作用温度およびPHが公知の無蒸煮澱粉分解酵素
に比して高温・酸性側にあり、雑菌汚染防除の面
からも有利である事を見い出し、本発明を完成し
た。すなわち、本発明は無蒸煮の澱粉質に、コルテ
イシウム・ロルフシイ（Corticium ro−lfsii）
AHU−9627またはその変異株の生産する澱粉質
分解酵素を作用させることを特徴とする澱粉質の
無蒸煮糖化法を提供するものである。本発明において使用することができる無蒸煮澱
粉分解酵素を生産する菌株、AHU−9627株は次
のような菌学的性質を有する。 (1) 各種培地における生育状態麦芽エキス寒天培地、オートミール寒天培
地での生育は極めて良好で、30℃、７日間の
培養でコロニーの直径が10cm程度に達する。
培地表面には羽毛状の白色菌糸が放射状に生
育する。気菌糸の生成もさかんで、９cmシヤ
ーレ中に300〜500個程度の菌核（Sclerotia）
を形成する。培地表面に近接する主幹をなす
菌糸は、直径4.5〜9.0μｍと太く、所々にか
すがい連結（Clamp connection）を生ずる
が、これより分枝して生ずる菌糸は次第に細
くなりかすがい連結はみられない。菌核は最初茶褐色の色調を呈するが、次第
に黒褐色となる。表面は平滑で直径は１〜２
mmのほぼ球形を示している。ポテトデキストロース寒天培地での生育は
上記２種の培地に比してかなり劣り、菌糸が
放射状に生ずるが気菌糸および菌核の生成は
少ない。 (2) 生理的性質麦芽エキス寒天培地、オートミール寒天培地
または0.1％酵母エキス含有ポテトデキストロ
ース液体培地における性質を以下に示す。生育温度範囲５〜50℃ 生育至適温度 15〜30℃ 生育PH範囲 1.5〜8.5 生育至適PH 3.0〜6.0 以上の性質のうち、菌核の形成およびその形
状、麦芽寒天平板培養における生育状態、特にそ
の菌糸の性状、「かすがい連結」（Clamp
connection）を形成すること、並びに分離直後に
は、トマト茎葉のエキス50％を加えた寒天培地上
で担子胞子の形成が認められ、担子器は太い根棒
形ないし長卵形で、７〜９×４〜5μｍ、担子柄
は長さ2.5〜4.0μｍ、担子胞子は卵形ないし太い
棍棒形で先端部が細くなつていた（大きさ4.5〜
6.5×3.5〜4.5μｍ）等の観察結果に基づき、ケー．
エツチ．ドムシユ（K.H.Domsch）らの「コンペ
ンデイウムオブソイルフンギイ」、アカデ
ミツクプレス、ロンドン（Compendium of
Soil Fungi、Academic Press、London
（1980））、北島らの「原色作物病害図説」、第３
版、養賢堂、ジー．エル．バロン（G.L.Barron）
の「ザジエネラオブハイフオマイセテスフ
ロムソイル」、ウイリアムスアンドウイル
キンス、バルチモア（The Genera of
Hyphomycetes from Soil、Williams＆
Wilkins、baltimore（1968））、フイトパソロジー
（Phytopathology）、51、107〜128（1961）等によ
つて検索し、本菌株は、コルテイシウム・ロルフ
シイ（Corticium rolfsii）に属するものであると
同定した。なお、本菌株は、トマトの茎から分離されたも
のであるが、コルテイシウム・ロルフシイは、
「コツブコウヤクタケ」あるいは「白絹病菌」の
和名を有し、植物病原菌の１種で、担子菌類に属
する。異名同種として、ペリクラリア・ロルフシイ
（Pellicularia rolfsii）、ボトリオバシジウム・ロ
ルフシイ（Botryobasidium rolfsii）、コルテイ
シウム・セントリフガム（Corticium
centrifugum）、アテリア・ロルフシイ（Athelia
rolfsii）などがあり、また本菌株の不完全世代は
スクレロテイウム・ロルフシイ（Sclerotium
rolfsii）と呼ばれている。コルテイシウム・ロルフシイに属する本菌株に
類似の菌被としてコルテイシウム・ロルフシイ
IFO4878若しくはIFO6146が挙げられるが、これ
らのIFO株と本菌株を形態的に比較すると以下の
点で相違している。 (a) 本菌株の菌核は小粒であるが、均一な大きさ
のほぼ球形を占しているのに対し株はその大き
さに拡がり（0.8〜3.5mm）IFOがあり、変形し
た球状を示す。 (b) 本菌株の菌核は９cmシヤーレ中に300〜500個
（平均５〜８個／cm²）程度生成するのに対し、
IFO株は10〜100個（平均0.2〜２個／cm²））と
少ない。以上の特性より、本菌株な新規な菌株と判断さ
れる。従つて、本発明者は、本菌株を公知菌株と
区別するために、コルテイシウム・ロルフシイ
AHU−9627（Corticium rolfsii AHU−9627）と
命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に受託
番号微工研条寄第1033号（FERMBP−1033）と
して寄託した。本発明に使用可能な無蒸煮澱粉分解酵素（以下
本酵素と称す）を得るには、前記菌株を栄養源含
有培地に接種し、常法に従つて培養し、該培養物
から採取することにより行われる。本酵素生産株としては、上記AHU−9627株は
もとより、その人工変異株あるいは自然変異株で
あつても本酵素を生産する能力を有するものであ
ればすべて本発明に使用することができる。上記AHU−9627株の人工変異株は、例えば紫
外線照射、コバルト60照射、化学変異誘起剤処理
等により容易に得ることができる。これらの菌株の培養法としては、通常の担子菌
の培養法、例えば液体培養、固体培養等が用いら
れる。炭素源としては、バレイシヨ、キヤツサ
バ、米その他の無蒸煮澱粉や液化澱粉；白糖；
皺；大豆粉；コーンミール等；マルトース、ラク
トース、シユクロース等の二糖類；グルコース、
フラクトース、マンノース等の単糖類；デキスト
リン等が使用可能である。就中、還元糖が培地中
に20mg／ml以上となると、酵素生産が抑制される
ので、高濃度での還元糖の蓄積の少ない無蒸煮の
バレイシヨン澱粉が好適である。窒素源としては、コーンステイープリカー
（CSL）、麦芽エキス、カゼイン、肉エキス、ペプ
トン、無機アンモニウム塩等が使用可能である
が、粘質物を生成しないポリペプトンが特に有効
である。また、KH₂PO₄、MgSO₄、FeSO₄、MnSO₄、
CaCl₂、CoCl₂、KCl、NaCl、などの無機塩類や
有機微量要素、さらにツイーン40、ツイーン80、
スパン80等の界面活性剤を必要に応じて適宜量を
加える事ができる。培養は、上記栄養源等を添加した培地にて、15
〜30℃、好ましくは27℃付近で行なわれ、５〜10
日間の培養で充分な酵素の産性が行なわれる。培養液または抽出液を直接酵素液として用いる
事も可能であるが、培養液、菌体、培養液濃
縮物またはこれより硫安、食塩等による塩析；イ
オン交換クロマトグラフイー；等電点沈澱；溶媒
分画；吸着クロマトグラフイーなどの精製法の単
独又は組合せにより得られた部分精製、精製標品
も用いる事ができる。得られた本酵素は以下のような酵素学的諸性質
を有する。作用PH 2.0〜7.0、好適範囲は4.0〜4.5である。生澱
粉では4.0、糊化澱粉では4.5が好適である。安定PHは3.0〜7.5、好ましくは4.0〜5.0であ
る。作用温度 0.05Mの酢酸緩衝液（PH4.5）中での作用温
度は50〜70℃、好ましくは60〜65℃であるが、
安定性面を考慮すると20〜60℃、好ましくは40
〜50℃である。各種無蒸煮澱粉に対する作用本酵素を米、小麦、サツマイモ、バレイシ
ヨ、ワキシーコーン、タピオカ、サゴの各澱粉
（５％濃度）にPH4.0、45℃で作用させたとこ
ろ、澱粉の種類によらず糖化されているのがみ
られ、高速液クロによる分析から澱粉のほとん
どがグルコースに転換されている事が確認でき
た。また糊化澱粉糖化活性に対する生澱粉糖化
活性の比は、PH、反応温度で若干異なるが40℃
で1.5〜2.5である。更に、本酵素と前記のコルテイシウム・ロル
フシイIFO4878株の産生する酵素（以下
IFO4878株酵素と称す）の酵素学的差異を以下
に示す。すなわち、両酵素の酵素学的差異を明
らかにするために、高濃度無蒸煮澱粉糖化試験
を行なつた。両株の培溶液を60％硫安塩析によ
り部分精製したものを酵素液とし、30％トウモ
ロコシ澱粉をPH3.0又は4.5；温度35、45、55℃
の各条件で糖化を行なつた。その結果を表１に
示す。表中の値は糖化率（％）を表わす。

〔作用及び発明の効果〕

本発明方法は、10％以上の高濃度澱粉質を無蒸
煮で直接糖化でき、反応条件も高温かつ酸性側で
可能であることから雑菌汚染防除の面からも極め
て有用な澱粉質糖化法である。更に、アルコール
又は有機酸発酵性微生物との併用によりアルコー
ル又は有機酸製造においても有用な手段となる。〔実施例〕次に実施例を挙げて本発明を説明する。実施例１コルテイシウム・ロルフシイ（Corticium
rolfsii）AHU−9627（微工研条寄第1033号）の菌
核を0.1％酵母エキス含有ポテトデキストロース
寒天培地平板に３個接種する。27℃、５日間培養
後本プレート２枚を50mlの滅菌水とともにホモジ
ナイズする。生産培地（エチレンオキシド別殺菌
済バレイシヨ無蒸煮澱粉％、ポリペプトン３％、
硝酸アンモニウム0.3％、硫酸マグネシウム0.18
％、ツイーン80 0.1％、PH6.0）を100ml含む500
ml坂口フラスコに上記ホモジナイズ菌体を３〜５
％接種し、27℃、７日間培養する。培養液を過
して得られた培養液を限外濃縮、透析した標品
を酵素液（44U／ml）とする。米、小麦、ワキシーコーン、タピオカ、甘藷、
サゴ、バレイシヨ澱粉を１ｇずつ100ml容三角フ
ラスコに秤量し、0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）10
ml、上記酵素液10mlを加え45℃で反応させDNS
法により反応液の糖化率を測定したところ、図１
に示す如く米、小麦、ワキシーコーン、タピオ
カ、甘藷、サゴ澱粉は12時間で100％の糖化がみ
られた。またバレイシヨ澱粉では12時間で50％、
24時間で80％の糖化がみられた。実施例２トウモロコシ澱粉を乾物として40ｇ秤量し、
100mlに定容する。この澱粉液15ml、実施例１に
より調製した酵素液（240GU／ml）２ml、1M酢
酸緩衝液（PH4.5）２mlを加え全容を20mlとし、
45℃で反応させた。糖化率をNDS法で定量した
ところ図２に示す如く、24時間で73％、48時間で
98％の糖化がみられた。市販のグルコアミラーゼ
製剤について同様に検討したころ、リゾプス起源
のものは48時間で72％、アスペルギルス起源のも
のは58％の糖化率であつた。実施例３生カンシヨを直径１cm、厚さ0.5cmの円筒状に
切断したもの40ｇを500ml容フラスコに取り、実
施例１により調製した酵素液（22U／ml）を100
ml加え、PH4.0、40℃で反応させたところ、48時
間でイモの組織はスポンジ状を呈し、澱粉質がほ
とんど糖化されているのが観察され、さらに反応
液中に約9.6ｇ／100mlのグルコースの生成が確認
された。実施例４バレイシヨ澱粉（局方）を乾物40ｇ測り、耐熱
性α−アミラーゼを澱粉に対し、0.2重量％、
NaCl0.1ｇ、Ca（OH）₂0.2ｇ、0.1M酢酸緩衝液
（PH6.0）10mlを加えて100mlに定容し、95〜100℃
の沸とう水中で10分間加熱した後オートクレーブ
して40％澱粉液化液を調整する（DE13.5％）こ
の液化澱粉液15ml、実施例１と同様に調製した酵
素液8GU／ｇ澱粉1M酢酸緩衝液（PH4.5）２mlを
加え全容を20mlとして45℃で反応を行なつた。そ
の結果48時間でほぼ100％の糖化がみられた。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明方法（実施例１）によつて各種
無蒸煮澱粉を糖化した場合の糖化率と反応時間と
の関係を示す図面である。図２は、実施例２にお
いて無蒸煮トウモロコシ澱粉を各種酵素を用いて
糖化した場合の糖化率と反応時間との関係を示す
図面である。

Claims

【特許請求の範囲】１無蒸煮の澱粉質に、コルテイシウム・ロルフ
シイAHU−9627（Corticium rolfsii AHU−
9627）〔微工研条寄第1033号〕またはその変異株
の生産する澱粉質分解酵素を作用させることを特
徴とする澱粉質の無蒸煮糖化法。２澱粉質分解酵素として、該酵素を含有する培
養液画分を使用する特許請求の範囲第１項記載
の澱粉質の無蒸煮糖化法。