JPH0568556A - ボルデテラ属細菌での遺伝子産物の発現のための自己プロモーターの使用 - Google Patents
ボルデテラ属細菌での遺伝子産物の発現のための自己プロモーターの使用Info
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- JPH0568556A JPH0568556A JP3228212A JP22821291A JPH0568556A JP H0568556 A JPH0568556 A JP H0568556A JP 3228212 A JP3228212 A JP 3228212A JP 22821291 A JP22821291 A JP 22821291A JP H0568556 A JPH0568556 A JP H0568556A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ボルデテラ属の細菌でのタンパク質の発現の
ための発現系を提供する。 【構成】 百日咳菌株での遺伝子産物の発現のために自
己プロモーターを用いる。ＡＴＧコドンで固有の自己プ
ロモーターに融合された百日咳構造遺伝子を有するハイ
ブリッド百日咳遺伝子を構築する。相同組換えを用いて
該ハイブリッド遺伝子を染色体の特定の遺伝子座に挿入
することにより形質転換したＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
は、該構造遺伝子にコードされた対応するタンパク質の
発現を、それと相同な遺伝子により達成されるのと異な
る生産速度で行う。特定の菌株およびプラスミドについ
て記載した。この技術は、広範囲の種々の遺伝子産物お
よび生体に対して適用可能である。
ための発現系を提供する。 【構成】 百日咳菌株での遺伝子産物の発現のために自
己プロモーターを用いる。ＡＴＧコドンで固有の自己プ
ロモーターに融合された百日咳構造遺伝子を有するハイ
ブリッド百日咳遺伝子を構築する。相同組換えを用いて
該ハイブリッド遺伝子を染色体の特定の遺伝子座に挿入
することにより形質転換したＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
は、該構造遺伝子にコードされた対応するタンパク質の
発現を、それと相同な遺伝子により達成されるのと異な
る生産速度で行う。特定の菌株およびプラスミドについ
て記載した。この技術は、広範囲の種々の遺伝子産物お
よび生体に対して適用可能である。
Description
【産業上の利用分野】本発明は、各種蛋白質をコードす
る遺伝子のプロモーターを交換し、それらの発現レベル
を変化させることにより、遺伝子産物（特に蛋白質抗
原）の、なかでもボルデテラ（Bordetella）属に属する
細菌株での生産を変化させるための新規な方法に関す
る。
る遺伝子のプロモーターを交換し、それらの発現レベル
を変化させることにより、遺伝子産物（特に蛋白質抗
原）の、なかでもボルデテラ（Bordetella）属に属する
細菌株での生産を変化させるための新規な方法に関す
る。
【従来の技術】ボルデテラ属の細菌には、百日咳菌（B.
pertussis）、パラ百日咳菌（B. parapertussis）、B.
bronchiseptica 及び B. avium の各種が属している。
最初の２種はヒトに対する病原性を有し、後の２種は一
般にヒト以外にその宿主が制限される。百日咳菌とパラ
百日咳菌は非常に激しい初期症状を伴う百日咳の原因と
なる。この病気への感染によって、あるいはこの病気に
対するワクチン、例えば不活性化全菌体ワクチン（inac
tivated whole cell vaccine）の使用によって、各種抗
原、典型的には、百日咳トキシン（pertussis toxin ；
ＰＴ）、繊維状赤血球凝集素（filamentous heamagglut
inin；ＦＨＡ）、凝集原（線毛；fimbriae）及び６９ｋ
Ｄａの外膜蛋白質［outer membrane protein；ペルタク
チン（pertactin ）］に対する抗体が誘導される。
pertussis）、パラ百日咳菌（B. parapertussis）、B.
bronchiseptica 及び B. avium の各種が属している。
最初の２種はヒトに対する病原性を有し、後の２種は一
般にヒト以外にその宿主が制限される。百日咳菌とパラ
百日咳菌は非常に激しい初期症状を伴う百日咳の原因と
なる。この病気への感染によって、あるいはこの病気に
対するワクチン、例えば不活性化全菌体ワクチン（inac
tivated whole cell vaccine）の使用によって、各種抗
原、典型的には、百日咳トキシン（pertussis toxin ；
ＰＴ）、繊維状赤血球凝集素（filamentous heamagglut
inin；ＦＨＡ）、凝集原（線毛；fimbriae）及び６９ｋ
Ｄａの外膜蛋白質［outer membrane protein；ペルタク
チン（pertactin ）］に対する抗体が誘導される。
【発明が解決しようとする課題】上述の各種蛋白質は、
ワクチンの形態が不活性化全菌体ワクチン（生菌体を滅
菌して不活性化してそのまま用いたもの）であるか、特
定の部分を用いるコンポーネントワクチン（component
vaccine ）であるかに拘らず、百日咳に対する防御のた
めのワクチンに、個々に、あるいは組み合わせて用いる
免疫原として代表的なものである。従って、ワクチン用
菌株におけるこれらの抗原の効率良い発現が重要とな
る。
ワクチンの形態が不活性化全菌体ワクチン（生菌体を滅
菌して不活性化してそのまま用いたもの）であるか、特
定の部分を用いるコンポーネントワクチン（component
vaccine ）であるかに拘らず、百日咳に対する防御のた
めのワクチンに、個々に、あるいは組み合わせて用いる
免疫原として代表的なものである。従って、ワクチン用
菌株におけるこれらの抗原の効率良い発現が重要とな
る。
【課題を解決するための手段】ワクチン用抗原の発酵生
産において、モル濃度レベルでペルタクチンに対して約
７倍の、ＰＴに対して約１０倍のＦＨＡの分泌がそれぞ
れ観察された。各抗原における蛋白質の複雑な全体的構
造、あるいは分泌効率が各抗原の収量に影響を及ぼす重
要な因子となっている一方で、各抗原遺伝子固有のプロ
モーターの相対的な強度や制御状態によっても百日咳菌
の各抗原遺伝子の発現レベルが影響を受ける。従って、
百日咳菌の有する自己のプロモーターの各遺伝子間での
相互置換によって特定の抗原の生産量を増加または減少
させることにより、各抗原の生産量の適正化が可能とな
る。このようにして得られた百日咳菌形質転換株は、全
菌体ワクチンに直接使用する免疫原として経済的で好ま
しいものである。更に、自己プロモーター同士の交換
は、特定の抗原の生産速度及び収率を変化させること
で、コンポーネントワクチンの生産のための発酵生産過
程及びそれに続く工程の効率を高める手段を提供するこ
ともできる。他の遺伝子とともに、百日咳トキシンオペ
ロン（ＴＯＸ）、ＦＨＡオペロン及びペルタクチンン遺
伝子（ＰＲＮ）に対しては、ボルデテラ属細菌の毒力制
御遺伝子（virulence regulating gene ；Ｂｖｇ、以前
はＶＩＲとして知られていたもの）によってポジティブ
な制御が行われる。後で示すように、ＴＯＸ、ＦＨＡ及
びＰＲＮの構造遺伝子およびこれらのプロモーターのヌ
クレオチド配列が確定し、対応する蛋白質のアミノ酸配
列が推定された。ＴＯＸオペロンについては、プロモー
ターにおける対Ｂｖｇ応答部分が転写開始位置を基準と
して−１７０ｂｐ位に位置付けされている。他の遺伝子
においては、対応する制御遺伝子領域は決定されていな
い。本発明により、ある構造遺伝子自身に固有のプロモ
ーターを、他の構造遺伝子に固有のプロモーターで置換
することで、ボルデテラ属の各種における蛋白質の発現
を変化させるための新規な方法が提供される。この方法
により、蛋白質の発現を増加または減少させること、及
び同時的生産（synchronicity of production ）または
非同時的生産（asynchronicity of production）が可能
となる。本発明において、百日咳遺伝子とは、百日咳菌
（B. pertussis）、パラ百日咳菌（B. parapertussi
s）、B. bronchiseptica 及び B. avium 等のボルデテ
ラ属細菌の各種抗原蛋白質の遺伝子をいい、百日咳構造
遺伝子とはこれら遺伝子の有する構造遺伝子をいう。本
発明の１つの態様として、ある百日咳遺伝子に固有の自
己プロモーターに、他の百日咳遺伝子に固有の構造遺伝
子をＡＴＧ開始コドンで融合したハイブリッド百日咳遺
伝子が提供される。好ましいプロモーターと構造遺伝子
の組合せとして、 ａ．ＴＯＸプロモーターと、ＦＨＡ構造遺伝子もしくは
ＰＲＮ構造遺伝子の組合せ、 ｂ．ＦＨＡプロモーターと、ＴＯＸ構造遺伝子もしくは
ＰＲＮ構造遺伝子の組合せ、及び ｃ．ＰＲＮプロモーターと、ＴＯＸ構造遺伝子もしくは
ＦＨＡ構造遺伝子の組合せが提供される。 本発明により、更に、ハイブリッド百日咳遺伝子の１以
上により形質転換され、百日咳構造遺伝子に対応する遺
伝子産物の生産能を有するボルデテラ属形質転換株、特
に百日咳菌形質転換株が提供される。この形質転換株
は、同じ宿主を同じ百日咳構造遺伝子をＡＴＧ開始コド
ンで該百日咳構造遺伝子に固有のプロモーターに融合し
た相同遺伝子で形質転換して得た形質転換体で達成され
るのと異なる量で該百日咳構造遺伝子に対応する遺伝子
産物を生産するものである。特定の百日咳菌株の形質転
換体が以下に示され、特に、百日咳菌１２９０−４株、
３９０−５９株、５９０−４株及び８９０−４９が特定
された。更に、本発明の他の態様として、百日咳菌の非
形質転換株であるＦＨＡオペロンが欠失した３９０−１
０１株及びＰＲＮ遺伝子が欠失した１０９０−１０８−
３株がそれぞれ提供された。遺伝子産物、すなわち形質
転換体により生産された抗原蛋白質は百日咳菌に対する
コンポーネントワクチンに有用である。本発明の一態様
によれば、培養において生産される蛋白質の後続する分
離工程を容易とすることで、コンポーネントワクンの生
産をより経済的なものとすることができる。更に、本発
明の他の態様によれば、各抗原蛋白質発現を改善するこ
とで、各抗原蛋白質の分布がより良好なものとなった対
百日咳全菌体ワクチンの調製が可能となる。百日咳菌形
質転換株からの百日咳抗原蛋白質の発現のためのここに
記載した本発明の技術は、ボルデテラ属の他の種、例え
ばパラ百日咳菌、B. bronchiseptica 及び B. avium 等
においても用いることができる。また、この技術は、所
望の遺伝子産物をコードする構造遺伝子と他の構造遺伝
子に固有のプロモーターとを組み合わせ、それによって
形質転換した生体による所望の遺伝子産物の発現を行う
ためのハイブリッド遺伝子の形成に広く適用できる。従
って、本発明の他の態様においては、生体における遺伝
子産物の発現方法であって、所望の遺伝子産物をコード
する構造遺伝子が同一菌株由来の他の構造遺伝子に固有
のプロモーターと融合しているハイブリッド遺伝子を形
成する過程と、該ハイブリッド遺伝子で生体を形質転換
する過程と、得られた形質転換体を前記遺伝子産物の発
現が行われるように培養する過程とを有する方法が提供
される。百日咳菌（B. pertussis）１０５３６株は、本
願出願人の有するワクチン生産菌であり、本願発明者に
より詳細に述べられた全ての操作の出発菌株として使用
された。ＰＴ、ＦＨＡ及びペルタクチンの遺伝子がそれ
ぞれクローニングされ、これらの配列が決定され（Nico
sia et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 83, 46
31 [1986]; Loosmore et al., Nucl. Acids Res., 17,
8365, [1989]; Relman et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i., U.S.A., 86, 2637, [1989]; Charles et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 3554, [1989] ）、
更にこれらの遺伝子のプロモーター領域及び構造遺伝子
の翻訳開始点が決定された。本発明者らは、ともに同一
菌株由来の所定の２つの遺伝子間において、一方の遺伝
子に固有のプロモーターを他方の遺伝子に固有のプロモ
ーターで置換することによってハイブリッド遺伝子を形
成した。これは、ＡＴＧ開始コドンで構造遺伝子を所定
のプロモーターと融合させることにより達成された。こ
の融合は、百日咳菌に固有でしかも自己由来のプロモー
ターと構造遺伝子を該構造遺伝子に固有のシグナル配列
とともに融合した構造を提供した。その結果得られるハ
イブリッド遺伝子は、百日咳菌の染色体の適当な遺伝子
座に相同組換えにより導入された。自己プロモーターの
使用の例として、以下の組合せでハイブリッド遺伝子を
形成した。 ａ．ＦＨＡプロモーターをＴＯＸオペロンに組み合わせ
たＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝子、 ｂ．ＦＨＡプロモーターをＰＲＮ遺伝子に組み合わせた
ＦＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子、及び ｃ．ＴＯＸプロモーターをＦＨＡ遺伝子に組み合わせた
ＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッド遺伝子。 この方法の効果を示すために種々の百日咳菌形質転換株
が形成された。すべての場合において、自己プロモータ
ーは新たに導入された染色体の本来の位置とは別の位置
において機能した。本発明において、ＦＨＡプロモータ
ー／ＴＯＸハイブリッド遺伝子をＴＯＸ遺伝子座に挿入
することで百日咳菌３９０−５９株が形成できたことに
よって、ある構造遺伝子に固有のプロモーターを、他の
構造遺伝子に固有のプロモーターで置換できることが示
された。この３９０−５９株は、野生型１０５３６株に
匹敵する速度及び収量でＰＴを分泌した（図３Ａに示す
菌株１０５３６における通常の速度と比較して図３Ｂを
参照）。ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝
子は次にその菌株固有のＦＨＡ遺伝子座に導入され、２
つのＴＯＸ遺伝子コピーを有する百日咳菌５９０−１１
株が形成された。この菌株のＰＴ生産の速度および収量
は、２つのＴＯＸ遺伝子からの発現と矛盾するものでは
なかった。すなわち、一方のＦＨＡ遺伝子座に導入され
たＴＯＸはハイブリッドオペロン中のＦＨＡプロモータ
ーの指令によって発現し、他方のＴＯＸは菌株固有のＴ
ＯＸオペロンから発現する（図３Ｃ参照）。これらの実
験は、ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝子
を染色体の２つの異なる遺伝子座に組み込ことが可能で
あることを示した。ＰＴホロトキシンは、それぞれ５種
の異なった遺伝子によってコードされた６種のサブユニ
ットからなる蛋白質複合体である。この蛋白質が構造的
に複雑でないと仮定して、ＦＨＡプロモーターによって
該蛋白質の発現量の増加を指令できるかどうかを決定す
るために、ＦＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺
伝子を有する株（百日咳菌１２９０−４株）が形成され
た。ペルタクチン蛋白質は大きな前駆体から誘導される
単一ポリぺプチドである。ペルタクチンの収量は、ＦＨ
Ａプロモーターの指令による場合に、ファメンター中で
は３倍に、更に振とう培養器内では１０倍になった（１
０リットルのファーメンターにおける通常のペルタクチ
ン生産速度を示す図７Ａとともに図７Ｂ参照）。ＦＨＡ
の過剰生産は精製プロセスにおいて問題を生じる場合が
ある。すなわち、ＦＨＡ以外の生産量の少ない抗原の精
製を容易に行いたい場合、過剰のＦＨＡの生産は好まし
くない。そのような場合のために、ＦＨＡの収量を減少
させる目的で、ＦＨＡ遺伝子に固有のプロモーターをＴ
ＯＸに固有のプロモーター（ＴＯＸプロモーター）で置
換した。得られたＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリ
ッド遺伝子はＦＨＡ遺伝子座に導入され、百日咳菌８９
０−４９株が形成された。この操作によって、ＦＨＡの
生産量は大幅に減少し、１／５０〜１／１００となった
（図５Ａに示した通常のＦＨＡ生産速度及び図５Ｂ参
照）。本発明者らは以下の実施例で詳述するように、本
発明によってボルデテラ属細菌の有する２種の遺伝子間
でのプロモーターの置換及び置換されたプロモーターに
よる抗原の生産が可能であることが示された。更に、プ
ロモーターの置換によって、百日咳菌における各種抗原
の収量を選択的に増加もしくは減少させることも可能で
あることが示された。ペルタクチンの生産量は増加し、
ＦＨＡの生産量は減少した。抗原の生産速度における有
意な変化は認められなかったが、このプロモーターの置
換法は抗原生産の時間経過に伴う推移形態や収量を変化
させることに利用しても良い。この方法により、所定の
菌株での複数種の蛋白質の生産の制御をおこなうこと
で、発酵過程やそれに続く処理操作に好ましい条件を提
供することが可能となる。本発明のプロモーター置換方
法はボルデテラ属の各種におけるいかなる遺伝子の組合
せにおいても使用可能であり、他の生物にも適用可能で
ある。
産において、モル濃度レベルでペルタクチンに対して約
７倍の、ＰＴに対して約１０倍のＦＨＡの分泌がそれぞ
れ観察された。各抗原における蛋白質の複雑な全体的構
造、あるいは分泌効率が各抗原の収量に影響を及ぼす重
要な因子となっている一方で、各抗原遺伝子固有のプロ
モーターの相対的な強度や制御状態によっても百日咳菌
の各抗原遺伝子の発現レベルが影響を受ける。従って、
百日咳菌の有する自己のプロモーターの各遺伝子間での
相互置換によって特定の抗原の生産量を増加または減少
させることにより、各抗原の生産量の適正化が可能とな
る。このようにして得られた百日咳菌形質転換株は、全
菌体ワクチンに直接使用する免疫原として経済的で好ま
しいものである。更に、自己プロモーター同士の交換
は、特定の抗原の生産速度及び収率を変化させること
で、コンポーネントワクチンの生産のための発酵生産過
程及びそれに続く工程の効率を高める手段を提供するこ
ともできる。他の遺伝子とともに、百日咳トキシンオペ
ロン（ＴＯＸ）、ＦＨＡオペロン及びペルタクチンン遺
伝子（ＰＲＮ）に対しては、ボルデテラ属細菌の毒力制
御遺伝子（virulence regulating gene ；Ｂｖｇ、以前
はＶＩＲとして知られていたもの）によってポジティブ
な制御が行われる。後で示すように、ＴＯＸ、ＦＨＡ及
びＰＲＮの構造遺伝子およびこれらのプロモーターのヌ
クレオチド配列が確定し、対応する蛋白質のアミノ酸配
列が推定された。ＴＯＸオペロンについては、プロモー
ターにおける対Ｂｖｇ応答部分が転写開始位置を基準と
して−１７０ｂｐ位に位置付けされている。他の遺伝子
においては、対応する制御遺伝子領域は決定されていな
い。本発明により、ある構造遺伝子自身に固有のプロモ
ーターを、他の構造遺伝子に固有のプロモーターで置換
することで、ボルデテラ属の各種における蛋白質の発現
を変化させるための新規な方法が提供される。この方法
により、蛋白質の発現を増加または減少させること、及
び同時的生産（synchronicity of production ）または
非同時的生産（asynchronicity of production）が可能
となる。本発明において、百日咳遺伝子とは、百日咳菌
（B. pertussis）、パラ百日咳菌（B. parapertussi
s）、B. bronchiseptica 及び B. avium 等のボルデテ
ラ属細菌の各種抗原蛋白質の遺伝子をいい、百日咳構造
遺伝子とはこれら遺伝子の有する構造遺伝子をいう。本
発明の１つの態様として、ある百日咳遺伝子に固有の自
己プロモーターに、他の百日咳遺伝子に固有の構造遺伝
子をＡＴＧ開始コドンで融合したハイブリッド百日咳遺
伝子が提供される。好ましいプロモーターと構造遺伝子
の組合せとして、 ａ．ＴＯＸプロモーターと、ＦＨＡ構造遺伝子もしくは
ＰＲＮ構造遺伝子の組合せ、 ｂ．ＦＨＡプロモーターと、ＴＯＸ構造遺伝子もしくは
ＰＲＮ構造遺伝子の組合せ、及び ｃ．ＰＲＮプロモーターと、ＴＯＸ構造遺伝子もしくは
ＦＨＡ構造遺伝子の組合せが提供される。 本発明により、更に、ハイブリッド百日咳遺伝子の１以
上により形質転換され、百日咳構造遺伝子に対応する遺
伝子産物の生産能を有するボルデテラ属形質転換株、特
に百日咳菌形質転換株が提供される。この形質転換株
は、同じ宿主を同じ百日咳構造遺伝子をＡＴＧ開始コド
ンで該百日咳構造遺伝子に固有のプロモーターに融合し
た相同遺伝子で形質転換して得た形質転換体で達成され
るのと異なる量で該百日咳構造遺伝子に対応する遺伝子
産物を生産するものである。特定の百日咳菌株の形質転
換体が以下に示され、特に、百日咳菌１２９０−４株、
３９０−５９株、５９０−４株及び８９０−４９が特定
された。更に、本発明の他の態様として、百日咳菌の非
形質転換株であるＦＨＡオペロンが欠失した３９０−１
０１株及びＰＲＮ遺伝子が欠失した１０９０−１０８−
３株がそれぞれ提供された。遺伝子産物、すなわち形質
転換体により生産された抗原蛋白質は百日咳菌に対する
コンポーネントワクチンに有用である。本発明の一態様
によれば、培養において生産される蛋白質の後続する分
離工程を容易とすることで、コンポーネントワクンの生
産をより経済的なものとすることができる。更に、本発
明の他の態様によれば、各抗原蛋白質発現を改善するこ
とで、各抗原蛋白質の分布がより良好なものとなった対
百日咳全菌体ワクチンの調製が可能となる。百日咳菌形
質転換株からの百日咳抗原蛋白質の発現のためのここに
記載した本発明の技術は、ボルデテラ属の他の種、例え
ばパラ百日咳菌、B. bronchiseptica 及び B. avium 等
においても用いることができる。また、この技術は、所
望の遺伝子産物をコードする構造遺伝子と他の構造遺伝
子に固有のプロモーターとを組み合わせ、それによって
形質転換した生体による所望の遺伝子産物の発現を行う
ためのハイブリッド遺伝子の形成に広く適用できる。従
って、本発明の他の態様においては、生体における遺伝
子産物の発現方法であって、所望の遺伝子産物をコード
する構造遺伝子が同一菌株由来の他の構造遺伝子に固有
のプロモーターと融合しているハイブリッド遺伝子を形
成する過程と、該ハイブリッド遺伝子で生体を形質転換
する過程と、得られた形質転換体を前記遺伝子産物の発
現が行われるように培養する過程とを有する方法が提供
される。百日咳菌（B. pertussis）１０５３６株は、本
願出願人の有するワクチン生産菌であり、本願発明者に
より詳細に述べられた全ての操作の出発菌株として使用
された。ＰＴ、ＦＨＡ及びペルタクチンの遺伝子がそれ
ぞれクローニングされ、これらの配列が決定され（Nico
sia et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 83, 46
31 [1986]; Loosmore et al., Nucl. Acids Res., 17,
8365, [1989]; Relman et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i., U.S.A., 86, 2637, [1989]; Charles et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 3554, [1989] ）、
更にこれらの遺伝子のプロモーター領域及び構造遺伝子
の翻訳開始点が決定された。本発明者らは、ともに同一
菌株由来の所定の２つの遺伝子間において、一方の遺伝
子に固有のプロモーターを他方の遺伝子に固有のプロモ
ーターで置換することによってハイブリッド遺伝子を形
成した。これは、ＡＴＧ開始コドンで構造遺伝子を所定
のプロモーターと融合させることにより達成された。こ
の融合は、百日咳菌に固有でしかも自己由来のプロモー
ターと構造遺伝子を該構造遺伝子に固有のシグナル配列
とともに融合した構造を提供した。その結果得られるハ
イブリッド遺伝子は、百日咳菌の染色体の適当な遺伝子
座に相同組換えにより導入された。自己プロモーターの
使用の例として、以下の組合せでハイブリッド遺伝子を
形成した。 ａ．ＦＨＡプロモーターをＴＯＸオペロンに組み合わせ
たＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝子、 ｂ．ＦＨＡプロモーターをＰＲＮ遺伝子に組み合わせた
ＦＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子、及び ｃ．ＴＯＸプロモーターをＦＨＡ遺伝子に組み合わせた
ＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッド遺伝子。 この方法の効果を示すために種々の百日咳菌形質転換株
が形成された。すべての場合において、自己プロモータ
ーは新たに導入された染色体の本来の位置とは別の位置
において機能した。本発明において、ＦＨＡプロモータ
ー／ＴＯＸハイブリッド遺伝子をＴＯＸ遺伝子座に挿入
することで百日咳菌３９０−５９株が形成できたことに
よって、ある構造遺伝子に固有のプロモーターを、他の
構造遺伝子に固有のプロモーターで置換できることが示
された。この３９０−５９株は、野生型１０５３６株に
匹敵する速度及び収量でＰＴを分泌した（図３Ａに示す
菌株１０５３６における通常の速度と比較して図３Ｂを
参照）。ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝
子は次にその菌株固有のＦＨＡ遺伝子座に導入され、２
つのＴＯＸ遺伝子コピーを有する百日咳菌５９０−１１
株が形成された。この菌株のＰＴ生産の速度および収量
は、２つのＴＯＸ遺伝子からの発現と矛盾するものでは
なかった。すなわち、一方のＦＨＡ遺伝子座に導入され
たＴＯＸはハイブリッドオペロン中のＦＨＡプロモータ
ーの指令によって発現し、他方のＴＯＸは菌株固有のＴ
ＯＸオペロンから発現する（図３Ｃ参照）。これらの実
験は、ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝子
を染色体の２つの異なる遺伝子座に組み込ことが可能で
あることを示した。ＰＴホロトキシンは、それぞれ５種
の異なった遺伝子によってコードされた６種のサブユニ
ットからなる蛋白質複合体である。この蛋白質が構造的
に複雑でないと仮定して、ＦＨＡプロモーターによって
該蛋白質の発現量の増加を指令できるかどうかを決定す
るために、ＦＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺
伝子を有する株（百日咳菌１２９０−４株）が形成され
た。ペルタクチン蛋白質は大きな前駆体から誘導される
単一ポリぺプチドである。ペルタクチンの収量は、ＦＨ
Ａプロモーターの指令による場合に、ファメンター中で
は３倍に、更に振とう培養器内では１０倍になった（１
０リットルのファーメンターにおける通常のペルタクチ
ン生産速度を示す図７Ａとともに図７Ｂ参照）。ＦＨＡ
の過剰生産は精製プロセスにおいて問題を生じる場合が
ある。すなわち、ＦＨＡ以外の生産量の少ない抗原の精
製を容易に行いたい場合、過剰のＦＨＡの生産は好まし
くない。そのような場合のために、ＦＨＡの収量を減少
させる目的で、ＦＨＡ遺伝子に固有のプロモーターをＴ
ＯＸに固有のプロモーター（ＴＯＸプロモーター）で置
換した。得られたＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリ
ッド遺伝子はＦＨＡ遺伝子座に導入され、百日咳菌８９
０−４９株が形成された。この操作によって、ＦＨＡの
生産量は大幅に減少し、１／５０〜１／１００となった
（図５Ａに示した通常のＦＨＡ生産速度及び図５Ｂ参
照）。本発明者らは以下の実施例で詳述するように、本
発明によってボルデテラ属細菌の有する２種の遺伝子間
でのプロモーターの置換及び置換されたプロモーターに
よる抗原の生産が可能であることが示された。更に、プ
ロモーターの置換によって、百日咳菌における各種抗原
の収量を選択的に増加もしくは減少させることも可能で
あることが示された。ペルタクチンの生産量は増加し、
ＦＨＡの生産量は減少した。抗原の生産速度における有
意な変化は認められなかったが、このプロモーターの置
換法は抗原生産の時間経過に伴う推移形態や収量を変化
させることに利用しても良い。この方法により、所定の
菌株での複数種の蛋白質の生産の制御をおこなうこと
で、発酵過程やそれに続く処理操作に好ましい条件を提
供することが可能となる。本発明のプロモーター置換方
法はボルデテラ属の各種におけるいかなる遺伝子の組合
せにおいても使用可能であり、他の生物にも適用可能で
ある。
【実施例】下記の各実施例における遺伝子操作、発酵生
産、蛋白質生化学的取り扱い及びハイブリドーマ形成技
術等に関する方法において、詳細に記述されていないも
のについては科学文献等に報告された公知の方法に従っ
て行うことができるものであり、下記の各実施例は当業
者にとって良く理解できるものである。百日咳菌におけ
る遺伝子操作法は、ヨーロッパ特許公開第0,322,115 号
（European PatentPublication No. 0,322,115 ）およ
び米国特許出願第275,376 号（U.S. PatentApplication
Serial No. 275,376、本願出願人に譲渡されている）
に記載されており、本願においても引用されている。各
オリゴヌクレオチドは、ＡＢＩモデル３８０Ａ ＤＮＡ
合成機により合成し、ポリアクリルアミドゲルを用いた
電気泳動法によって精製した。遺伝子操作は、Sambrook
ら（Sambrook et al., Molecular cloning: a laborato
rymanual, second edition, Cold Spr[1989]）の方法に
従って行った。制限酵素は、製造者の示す操作法に従っ
て使用した。ＴＯＸ遺伝子、ＦＨＡ遺伝子及びＦＲＮ遺
伝子は、百日咳菌１０５３６株のＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ
断片を含むラムダシャロン３５ライブラリー（lambda C
haron 35 library）からクローニングした。染色体ＤＮ
Ａの構造は制限酵素地図の作成および遺伝子の全体ある
いは部分的な配列分析によって確認した。所定の遺伝子
のプロモーターの他の遺伝子の翻訳領域（coding seque
nce 、構造遺伝子）への連結は、合成オリゴヌクレオチ
ド（リンカー）を介して行った。プロモーターと構造遺
伝子とが正しく融合（連結）されたかどうかは、ジデオ
キシ法（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,USA,
74, 5463,[1977] ）による配列分析によって確認し
た。百日咳菌における遺伝子の置換操作は、エレクトロ
ポレーション法（Zealey et al., Bio/Technology, 8,
1025, [1990]）を用いてプラスミドＤＮＡを菌体に導入
することによる相同組換えによって行った。ＴＯＸ欠損
２９−８株、ＦＨＡ欠損３９０−１０１株、及びＰＲＮ
欠損１０９０−１０８−３株は同様の方法によって形成
した。また、遺伝子は非複製型プラスミドに組み込まれ
て導入され、対立遺伝子の置換は、一次形質転換体のス
トレプトマイシンでの選択により行われた（Stibitz et
al., Gene, 50,133, [1986] ）。染色体ＤＮＡは、Yac
oob及びZealeyの方法（Nucl. Acids Res., 16, 1639,
[1988]）により調製され、GeneScreen Plus（デュポ
ン）を用いたSambrookらによるサザーンブロット分析法
にかけられた。 実施例１ 本実施例は、ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド
オペロンの形成及び百日咳菌１０５３６株への導入を示
す。百日咳菌に固有の百日咳トキシン遺伝子（ＴＯＸ遺
伝子）の非翻訳領域（flaking region）に挟まれた位置
に、ＴＯＸ構造遺伝子とその発現を指令するＦＨＡプロ
モーターとを有し、プラスミドｐＵＣをベースとしたプ
ラスミドＳ−３６８０−１０が構築された。ＦＨＡプロ
モーターは、対Ｂｖｇ応答部分を含む約２４０ｂｐのＥ
ｃｏＲＩ／ＨｉｎｆＩ断片中にある（ＴＯＸオペロンは
１７０ｂｐの対Ｂｖｇ応答領域を必要とする）。２つの
相補的オリゴヌクレオチドをアニールして、２つの遺伝
子領域を連結するための約４５ｂｐのＨｉｎｆＩ／Ａｖ
ａＩ単位が形成され、プラスミドに組み込まれた（図１
参照）。この単位は、ＰＴサブユニットＳ１のリーダー
配列をコードするＤＮＡ断片を含む。Ｓ１遺伝子のＡｖ
ａＩ部位から翻訳終止点に続くＥｃｏＲＩ部位までのＴ
ＯＸオペロンの残りの部分がハイブリッドオペロンを完
成するために用いられた。ＴＯＸ遺伝子座に固有の３ｋ
ｂｐのＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ ５’側非翻訳領域（図１
における５’ＴＯＸ）及び４ｋｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｓａ
ｌＩ ３’側非翻訳領域（図１における３’ＴＯＸ）
が、ハイブリッドオペロンのＴＯＸ遺伝子座への相同組
換えによる導入のために用いられた。ＦＨＡプロモータ
ー／ＴＯＸハイブリッド遺伝子を有するプラスミドＳ−
３６８０−１０はエレクトロポレーション法により、百
日咳菌１０５３６株から誘導されたＴＯＸ欠損２９−８
株に導入され、その結果ＰＴの発現がＦＨＡプロモータ
ーによって行われる３９０−５９株が形成された。この
３９０−５９株におけるＰＴの生産速度及び収量は親株
（１０５３６株）とほぼ同じものであった（図３Ａ及び
３Ｂ参照）。制限酵素地図の作成及びサザーンブロット
分析によって、ＴＯＸ遺伝子座の本来の場所に正しくＦ
ＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝子が導入さ
れたことを確認した（図８参照）。ＴＯＸ欠損２９−８
株は、寄託番号５３９７３でＡＴＣＣに寄託されてお
り、先に挙げた米国特許出願第275,376 号に記載されて
いる。 実施例２ 本実施例は、ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド
オペロンの構築及び百日咳菌ＦＨＡ欠損株への導入を示
す。ＦＨＡ遺伝子の非翻訳領域に挟まれた位置に、ＦＨ
Ａプロモーターと該プロモーターにＳ１サブユニットの
リーダー配列をコードするＤＮＡ断片の開始コドンで連
結したＴＯＸ構造遺伝子とを含み、プラスミドｐＢＲ３
２２をベースとしたプラスミドＳ−３７４９−１８を構
築した。この構築は実施例１に従って行った。ＦＨＡオ
ペロンの２．５ｋｂｐのＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ ５’
側非翻訳領域（図２の５’ＦＨＡ）及び１．７ｋｂｐの
ＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ ３’側非翻訳領域（図２の３’
ＦＨＡ）がハイブリッドオペロンのＦＨＡ遺伝子座への
導入に利用された。プラスミドＳ−３７４９−１８は百
日咳菌ＦＨＡ欠損３９０−１０１株に導入された。この
操作によって、２つのＴＯＸ遺伝子コピーを有する５９
０−１１株が形成された。この２つのＴＯＸ遺伝子の一
方はそれ自身に固有のプロモーター（ＴＯＸプロモータ
ー）により転写され、他方はＦＨＡプロモーターによっ
て転写される。５９０−１１株におけるＰＴの全収量
は、１０５３６株における場合の約２倍に達したが、そ
の生産速度には変化はなかった（図３Ａ及び３Ｂ参
照）。ＦＨＡ欠損３９０−１０１株は１９９１年３月６
日にＡＴＣＣに寄託されている（寄託番号５５１５
７）。 実施例３ 本実施例は、ＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッド
遺伝子の構築及び百日咳菌への導入を示す。約５００ｂ
ｐのＥｃｏＲＩ部位で始まるＴＯＸプロモーター領域を
有し、プラスミドｐＢＲ３２２をベースとしたプラスミ
ドＳ−３８３８−９が構築された。この配列（プロモー
ター領域）は−１７０ｂｐの位置に対Ｂｖｇ応答領域を
含む。ＴＯＸプロモーターを含む４６０ｂｐのＥｃｏＲ
Ｉ／ＮｃｏＩ断片は、−１００ｂｐの位置にあるＮｃｏ
Ｉ／ＳｐｈＩオリゴヌクレオチドを介してＦＨＡ構造遺
伝子と転結された（図４参照）。ＦＨＡ構造遺伝子の残
りの部分（ＳｐｈＩ部位からＥｃｏＲＩ部位まで）を組
み込むことによってＦＨＡ構造遺伝子を完全なものとし
た。ＦＨＡオペロンの２．５ｋｂｐのＢｇｌＩＩ／Ｅｃ
ｏＲＩ ５’側非翻訳領域（図４の５’ＦＨＡ）及び
１．７ｋｂｐのＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ ３’側非翻訳領
域（図４の３’ＦＨＡ）がハイブリッドオペロンのＦＨ
Ａ遺伝子座への導入に利用された。ＦＨＡ遺伝子座の正
しい位置にＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッドオ
ペロンが導入されたかどうかは、図９に示すように、制
限酵素地図の作成およびサザーンブロット分析によって
確認した。ＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッドオ
ペロンが染色体に導入された百日咳菌８９０−４９株
は、大幅に低減されたレベルでＦＨＡを生産した（図５
Ａ及び５Ｂ参照）。 実施例４ 本実施例は、ＦＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド
遺伝子の構築及び百日咳菌への導入を示す。ＰＲＮ遺伝
子の非翻訳領域に挟まれた位置に、ペルタクチン構造遺
伝子のシグナル配列の開始コドンが融合したＦＨＡプロ
モーターを含み、プラスミドｐＵＣをベースとするプラ
スミドＳ−３９８２−７を構築した。ＦＨＡプロモータ
ーは約２４０ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｆＩ断片に含ま
れている。この断片は、９３ｂｐのＨｉｎｆＩ／Ｎｃｏ
Ｉオリゴヌクレオチドを介してＰＲＮ構造遺伝子と融合
している（図６参照）。ＮｃｏＩ部位で始まるＰＲＮ構
造遺伝子の残りの部分が組み込まれることでハイブリッ
ド遺伝子が完成された。ＰＲＮ遺伝子の１．６ｋｂｐの
Ｓａｕ３ＡＩ／ＥｃｏＲＩ ５’側非翻訳領域（図６の
５’ＰＲＮ）及び８ｋｂｐのＡｐａＩ／Ｓａｕ３ＡＩ
３’側非翻訳領域（図６の３’ＰＲＮ）がハイブリッド
遺伝子のＰＲＮ遺伝子座への導入に利用された。ＦＨＡ
プロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子が百日咳菌Ｐ
ＲＮ欠損１０９０−１０８−３株のＰＲＮ遺伝子座に正
しく導入されたかどうかは、図１０に示すように、制限
酵素地図の作成およびサザーンブロット分析によって確
認した。この操作で得られたＦＨＡプロモーター／ＰＲ
Ｎハイブリッド遺伝子を有する１２９０−４株における
ペルタクチン外膜蛋白質の生産量は増加した（図７Ａ及
び７Ｂ参照）。１０９０−１０８−３株及び１２９０−
４株は１９９１年３月６日にＡＴＣＣに寄託された（前
者の寄託番号；５５１５６、後者の寄託番号５５１５
５）。 実施例５ 本実施例は、ハイブリッドオペロンを含む百日咳菌の調
製及びその構造の分析を示す。Zealey らの方法（Bio/
Technology, 8, 1025 [1990]）を用いて、コンノートワ
クチン用百日咳菌１０５３６株（Connaught vaccine st
rain 10536）とプラスミド中の所望の遺伝子の非翻訳領
域との間に起こる相同組換えを利用して、百日咳菌ＴＯ
Ｘ欠損２９−８株、ＦＨＡ欠損３９０−１０１株及びＰ
ＲＮ欠損１０９０−１０８−３株が形成された。遺伝子
の欠損あるいは置換に利用された非翻訳領域は実施例１
〜４に示されたとおりである。非翻訳領域に挟まれた領
域内に組込んだテトラサイクリン耐性遺伝子を含む単位
が遺伝子座の構造遺伝子が削除された位置に該構造遺伝
子の代りに挿入された。続いて行われる欠損株へのハイ
ブリッド遺伝子の導入の際の対立遺伝子の置換の過程に
おいて、この単位はハイブリッド遺伝子と置換された。
ハイブリッド遺伝子の所定の位置への導入が正しく行わ
れたかどうかは、組換え株（形質転換株）から精製した
染色体ＤＮＡを制限酵素で消化し、得られた消化物をサ
ザーンブロット分析法によって分析することで確認し
た。 実施例６ 本実施例は、百日咳菌３９０−５９株のサザーンブロッ
トの調製を示す（図８参照）。野生型（ＷＴ）百日咳菌
１０５３６株及び百日咳菌３９０−５９株から染色体Ｄ
ＮＡを単離し、それぞれについて、制限酵素ＫｐｎＩ及
びＳｍａＩで消化した消化物と、制限酵素ＢｇｌＩＩ単
独で消化した消化物とを調製し、これらを展開した。す
なわち、図８（Ｃ）に示すように、レーン１に１０５３
６株の染色体ＤＮＡのＫｐｎＩ／ＳｍａＩ消化物を、レ
ーン２に１０５３６株の染色体ＤＮＡのＢｇｌＩＩ消化
物を、レーン３に３９０−５９株の染色体ＤＮＡのＫｐ
ｎＩ／ＳｍａＩ消化物を、レーン４に３９０−５９株の
染色体ＤＮＡのＢｇｌＩＩ消化物をそれぞれ展開した。
展開されたサンプルをフィルターに転写し、４．７ｋｂ
ｐの全ＴＯＸをコードする配列を有するＥｃｏＲＩ断片
をプローブとして分析した。染色体におけるＴＯＸプロ
モーターのＦＨＡプロモーターでの置換は、図８（Ａ）
に矢印で示されているＫｐｎＩ部位の消失を起こす（図
８（Ｂ）参照）。なお、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩでの消化
によって、１０５３６株の染色体ＤＮＡからは３．０、
１．６及び１．５ｋｂｐの、また、３９０−５９株の染
色体ＤＮＡからは４．８及び５．１ｋｂｐのＴＯＸに特
異的なハイブリダイゼーションを起こす断片が生じた。 実施例７ 本実施例は、百日咳菌８９０−４９株のサザーンブロッ
トを示す（図９）。野生型（ＷＴ）百日咳菌１０５３６
株及び百日咳菌８９０−４９株から染色体ＤＮＡを単離
し、それぞれについて、制限酵素ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩ
Ｉで消化した消化物と、制限酵素ＢａｍＨＩ単独で消化
した消化物とを調製し、これらを展開した。すなわち、
図９（Ｃ）に示すように、レーン１に１０５３６株の染
色体ＤＮＡのＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩ消化物を、レーン２
に１０５３６株の染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物を、
レーン３に８９０−４９株の染色体ＤＮＡのＫｐｎＩ／
ＢｇｌＩＩ消化物を、レーン４に８９０−４９株の染色
体ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物をそれぞれ展開した。展開
されたサンプルをフィルターに転写し、ＦＨＡに特異的
なプローブを用いて分析を行った。染色体におけるＦＨ
ＡプロモーターのＴＯＸプロモーターでの置換は、図９
（Ａ）および（Ｂ）に示されているように、ＫｐｎＩ部
位の導入を起こす。なお、ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩでの
消化によって、１０５３６株の染色体ＤＮＡからは９ｋ
ｂｐの、また、８９０−４９株の染色体ＤＮＡからは６
ｋｂｐのＦＨＡに特異的なハイブリダイゼーションを起
こす断片が生じた。 実施例８ 本実施例は、百日咳菌１２９０−４株のサザーンブロッ
トの調製を示す（図１０参照）。野生型（ＷＴ）百日咳
菌１０５３６株及び百日咳菌１２９０−４株から染色体
ＤＮＡを単離し、それぞれについて、制限酵素ＡｐａＩ
で消化した消化物と、制限酵素ＳａｌＩで消化した消化
物とを調製し、これらを展開した。すなわち、図１０
（Ｃ）に示されるように、レーン１に１０５３６株の染
色体ＤＮＡのＡｐａＩ消化物を、レーン２に１０５３６
株の染色体ＤＮＡのＳａｌＩ消化物を、レーン３に１２
９０−４株の染色体ＤＮＡのＡｐａＩ消化物を、レーン
４に１２９０−４株の染色体ＤＮＡのＳａｌＩ消化物を
それぞれ展開した。展開されたサンプルをフィルターに
転写し、ＰＲＮに特異的なプローブを用いて分析を行っ
た。染色体におけるＰＲＮプロモーターのＦＨＡプロモ
ーターでの置換は、図１０Ａ）および（Ｂ）に示されて
いるように、ＡｐａＩ部位の導入を起こす。なお、Ａｐ
ａＩでの消化によって、１０５３６株の染色体ＤＮＡか
らは４．４ｋｂｐの、また、１２９０−４株の染色体Ｄ
ＮＡからは２．５ｋｂｐのＰＲＮに特異的なハイブリダ
イゼーションを起こす断片が生じた。 実施例９ 本実施例は、各種百日咳菌株の培養と、免疫学的測定法
（immunoassay ）による各種抗原の定量を示す。各種百
日咳菌株を、０．２％ヘプタキス（２，６−ｏ−ジメチ
ル）β−シクロデキストリン（Imaizumi et al., Infac
t. Immun., 41, 1138 [1983]）を含む変法スタイナー−
ショルテ培地（Stainerーscholte medium）を用い、１０
リットルのｐＨ及び溶存酸素の制御が行われるＣｈｅｍ
Ａｐファーメンターで、もしくは１０ｍｌの容量で培養
した。培養上清を抗原の特異性を利用するＥＬＩＳＡ法
で分析して、抗原生産性が試験された。ＰＴはLoosmore
らの記述（Infect. and Immun., 58, 3653 [1990] ）に
従ってフェツイン補足ＥＬＩＳＡ（fetuin-captureELIS
A ）によって測定された。ＦＨＡは、腹水から精製した
マウスモノクローナル抗ＦＨＡ抗体によって補足し、２
次標識抗体としてワサビペルオキシダーゼに結合させた
ポリクローナルウサギＩｇＧ抗ＦＨＡ抗体を用いるＥＬ
ＩＳＡによって分析した。ペルタクチンは、非特異性モ
ルモット過免疫血清から精製したポリクロナール抗体に
よって捕獲し、２次標識抗体としてワサビペルオキシダ
ーゼに結合させたモルモットＩｇＧ抗ペルタクチン（６
９ｋＤａ）抗体を用いるＥＬＩＳＡによって測定した。
野生型１０５３６株の培養における培養液から精製した
ＰＴ、ＦＨＡ及びペルタクチン（６９ｋＤａ）の各蛋白
質を標準として使用した。以上の開示内容を総括する
と、本発明は、特にボルデテラ属細菌に対し実用性のあ
る新規な遺伝子産物発現方法を提供するものである。本
発明の範囲において変更、修正は可能である。
産、蛋白質生化学的取り扱い及びハイブリドーマ形成技
術等に関する方法において、詳細に記述されていないも
のについては科学文献等に報告された公知の方法に従っ
て行うことができるものであり、下記の各実施例は当業
者にとって良く理解できるものである。百日咳菌におけ
る遺伝子操作法は、ヨーロッパ特許公開第0,322,115 号
（European PatentPublication No. 0,322,115 ）およ
び米国特許出願第275,376 号（U.S. PatentApplication
Serial No. 275,376、本願出願人に譲渡されている）
に記載されており、本願においても引用されている。各
オリゴヌクレオチドは、ＡＢＩモデル３８０Ａ ＤＮＡ
合成機により合成し、ポリアクリルアミドゲルを用いた
電気泳動法によって精製した。遺伝子操作は、Sambrook
ら（Sambrook et al., Molecular cloning: a laborato
rymanual, second edition, Cold Spr[1989]）の方法に
従って行った。制限酵素は、製造者の示す操作法に従っ
て使用した。ＴＯＸ遺伝子、ＦＨＡ遺伝子及びＦＲＮ遺
伝子は、百日咳菌１０５３６株のＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ
断片を含むラムダシャロン３５ライブラリー（lambda C
haron 35 library）からクローニングした。染色体ＤＮ
Ａの構造は制限酵素地図の作成および遺伝子の全体ある
いは部分的な配列分析によって確認した。所定の遺伝子
のプロモーターの他の遺伝子の翻訳領域（coding seque
nce 、構造遺伝子）への連結は、合成オリゴヌクレオチ
ド（リンカー）を介して行った。プロモーターと構造遺
伝子とが正しく融合（連結）されたかどうかは、ジデオ
キシ法（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,USA,
74, 5463,[1977] ）による配列分析によって確認し
た。百日咳菌における遺伝子の置換操作は、エレクトロ
ポレーション法（Zealey et al., Bio/Technology, 8,
1025, [1990]）を用いてプラスミドＤＮＡを菌体に導入
することによる相同組換えによって行った。ＴＯＸ欠損
２９−８株、ＦＨＡ欠損３９０−１０１株、及びＰＲＮ
欠損１０９０−１０８−３株は同様の方法によって形成
した。また、遺伝子は非複製型プラスミドに組み込まれ
て導入され、対立遺伝子の置換は、一次形質転換体のス
トレプトマイシンでの選択により行われた（Stibitz et
al., Gene, 50,133, [1986] ）。染色体ＤＮＡは、Yac
oob及びZealeyの方法（Nucl. Acids Res., 16, 1639,
[1988]）により調製され、GeneScreen Plus（デュポ
ン）を用いたSambrookらによるサザーンブロット分析法
にかけられた。 実施例１ 本実施例は、ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド
オペロンの形成及び百日咳菌１０５３６株への導入を示
す。百日咳菌に固有の百日咳トキシン遺伝子（ＴＯＸ遺
伝子）の非翻訳領域（flaking region）に挟まれた位置
に、ＴＯＸ構造遺伝子とその発現を指令するＦＨＡプロ
モーターとを有し、プラスミドｐＵＣをベースとしたプ
ラスミドＳ−３６８０−１０が構築された。ＦＨＡプロ
モーターは、対Ｂｖｇ応答部分を含む約２４０ｂｐのＥ
ｃｏＲＩ／ＨｉｎｆＩ断片中にある（ＴＯＸオペロンは
１７０ｂｐの対Ｂｖｇ応答領域を必要とする）。２つの
相補的オリゴヌクレオチドをアニールして、２つの遺伝
子領域を連結するための約４５ｂｐのＨｉｎｆＩ／Ａｖ
ａＩ単位が形成され、プラスミドに組み込まれた（図１
参照）。この単位は、ＰＴサブユニットＳ１のリーダー
配列をコードするＤＮＡ断片を含む。Ｓ１遺伝子のＡｖ
ａＩ部位から翻訳終止点に続くＥｃｏＲＩ部位までのＴ
ＯＸオペロンの残りの部分がハイブリッドオペロンを完
成するために用いられた。ＴＯＸ遺伝子座に固有の３ｋ
ｂｐのＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ ５’側非翻訳領域（図１
における５’ＴＯＸ）及び４ｋｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｓａ
ｌＩ ３’側非翻訳領域（図１における３’ＴＯＸ）
が、ハイブリッドオペロンのＴＯＸ遺伝子座への相同組
換えによる導入のために用いられた。ＦＨＡプロモータ
ー／ＴＯＸハイブリッド遺伝子を有するプラスミドＳ−
３６８０−１０はエレクトロポレーション法により、百
日咳菌１０５３６株から誘導されたＴＯＸ欠損２９−８
株に導入され、その結果ＰＴの発現がＦＨＡプロモータ
ーによって行われる３９０−５９株が形成された。この
３９０−５９株におけるＰＴの生産速度及び収量は親株
（１０５３６株）とほぼ同じものであった（図３Ａ及び
３Ｂ参照）。制限酵素地図の作成及びサザーンブロット
分析によって、ＴＯＸ遺伝子座の本来の場所に正しくＦ
ＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝子が導入さ
れたことを確認した（図８参照）。ＴＯＸ欠損２９−８
株は、寄託番号５３９７３でＡＴＣＣに寄託されてお
り、先に挙げた米国特許出願第275,376 号に記載されて
いる。 実施例２ 本実施例は、ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド
オペロンの構築及び百日咳菌ＦＨＡ欠損株への導入を示
す。ＦＨＡ遺伝子の非翻訳領域に挟まれた位置に、ＦＨ
Ａプロモーターと該プロモーターにＳ１サブユニットの
リーダー配列をコードするＤＮＡ断片の開始コドンで連
結したＴＯＸ構造遺伝子とを含み、プラスミドｐＢＲ３
２２をベースとしたプラスミドＳ−３７４９−１８を構
築した。この構築は実施例１に従って行った。ＦＨＡオ
ペロンの２．５ｋｂｐのＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ ５’
側非翻訳領域（図２の５’ＦＨＡ）及び１．７ｋｂｐの
ＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ ３’側非翻訳領域（図２の３’
ＦＨＡ）がハイブリッドオペロンのＦＨＡ遺伝子座への
導入に利用された。プラスミドＳ−３７４９−１８は百
日咳菌ＦＨＡ欠損３９０−１０１株に導入された。この
操作によって、２つのＴＯＸ遺伝子コピーを有する５９
０−１１株が形成された。この２つのＴＯＸ遺伝子の一
方はそれ自身に固有のプロモーター（ＴＯＸプロモータ
ー）により転写され、他方はＦＨＡプロモーターによっ
て転写される。５９０−１１株におけるＰＴの全収量
は、１０５３６株における場合の約２倍に達したが、そ
の生産速度には変化はなかった（図３Ａ及び３Ｂ参
照）。ＦＨＡ欠損３９０−１０１株は１９９１年３月６
日にＡＴＣＣに寄託されている（寄託番号５５１５
７）。 実施例３ 本実施例は、ＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッド
遺伝子の構築及び百日咳菌への導入を示す。約５００ｂ
ｐのＥｃｏＲＩ部位で始まるＴＯＸプロモーター領域を
有し、プラスミドｐＢＲ３２２をベースとしたプラスミ
ドＳ−３８３８−９が構築された。この配列（プロモー
ター領域）は−１７０ｂｐの位置に対Ｂｖｇ応答領域を
含む。ＴＯＸプロモーターを含む４６０ｂｐのＥｃｏＲ
Ｉ／ＮｃｏＩ断片は、−１００ｂｐの位置にあるＮｃｏ
Ｉ／ＳｐｈＩオリゴヌクレオチドを介してＦＨＡ構造遺
伝子と転結された（図４参照）。ＦＨＡ構造遺伝子の残
りの部分（ＳｐｈＩ部位からＥｃｏＲＩ部位まで）を組
み込むことによってＦＨＡ構造遺伝子を完全なものとし
た。ＦＨＡオペロンの２．５ｋｂｐのＢｇｌＩＩ／Ｅｃ
ｏＲＩ ５’側非翻訳領域（図４の５’ＦＨＡ）及び
１．７ｋｂｐのＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ ３’側非翻訳領
域（図４の３’ＦＨＡ）がハイブリッドオペロンのＦＨ
Ａ遺伝子座への導入に利用された。ＦＨＡ遺伝子座の正
しい位置にＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッドオ
ペロンが導入されたかどうかは、図９に示すように、制
限酵素地図の作成およびサザーンブロット分析によって
確認した。ＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッドオ
ペロンが染色体に導入された百日咳菌８９０−４９株
は、大幅に低減されたレベルでＦＨＡを生産した（図５
Ａ及び５Ｂ参照）。 実施例４ 本実施例は、ＦＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド
遺伝子の構築及び百日咳菌への導入を示す。ＰＲＮ遺伝
子の非翻訳領域に挟まれた位置に、ペルタクチン構造遺
伝子のシグナル配列の開始コドンが融合したＦＨＡプロ
モーターを含み、プラスミドｐＵＣをベースとするプラ
スミドＳ−３９８２−７を構築した。ＦＨＡプロモータ
ーは約２４０ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｆＩ断片に含ま
れている。この断片は、９３ｂｐのＨｉｎｆＩ／Ｎｃｏ
Ｉオリゴヌクレオチドを介してＰＲＮ構造遺伝子と融合
している（図６参照）。ＮｃｏＩ部位で始まるＰＲＮ構
造遺伝子の残りの部分が組み込まれることでハイブリッ
ド遺伝子が完成された。ＰＲＮ遺伝子の１．６ｋｂｐの
Ｓａｕ３ＡＩ／ＥｃｏＲＩ ５’側非翻訳領域（図６の
５’ＰＲＮ）及び８ｋｂｐのＡｐａＩ／Ｓａｕ３ＡＩ
３’側非翻訳領域（図６の３’ＰＲＮ）がハイブリッド
遺伝子のＰＲＮ遺伝子座への導入に利用された。ＦＨＡ
プロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子が百日咳菌Ｐ
ＲＮ欠損１０９０−１０８−３株のＰＲＮ遺伝子座に正
しく導入されたかどうかは、図１０に示すように、制限
酵素地図の作成およびサザーンブロット分析によって確
認した。この操作で得られたＦＨＡプロモーター／ＰＲ
Ｎハイブリッド遺伝子を有する１２９０−４株における
ペルタクチン外膜蛋白質の生産量は増加した（図７Ａ及
び７Ｂ参照）。１０９０−１０８−３株及び１２９０−
４株は１９９１年３月６日にＡＴＣＣに寄託された（前
者の寄託番号；５５１５６、後者の寄託番号５５１５
５）。 実施例５ 本実施例は、ハイブリッドオペロンを含む百日咳菌の調
製及びその構造の分析を示す。Zealey らの方法（Bio/
Technology, 8, 1025 [1990]）を用いて、コンノートワ
クチン用百日咳菌１０５３６株（Connaught vaccine st
rain 10536）とプラスミド中の所望の遺伝子の非翻訳領
域との間に起こる相同組換えを利用して、百日咳菌ＴＯ
Ｘ欠損２９−８株、ＦＨＡ欠損３９０−１０１株及びＰ
ＲＮ欠損１０９０−１０８−３株が形成された。遺伝子
の欠損あるいは置換に利用された非翻訳領域は実施例１
〜４に示されたとおりである。非翻訳領域に挟まれた領
域内に組込んだテトラサイクリン耐性遺伝子を含む単位
が遺伝子座の構造遺伝子が削除された位置に該構造遺伝
子の代りに挿入された。続いて行われる欠損株へのハイ
ブリッド遺伝子の導入の際の対立遺伝子の置換の過程に
おいて、この単位はハイブリッド遺伝子と置換された。
ハイブリッド遺伝子の所定の位置への導入が正しく行わ
れたかどうかは、組換え株（形質転換株）から精製した
染色体ＤＮＡを制限酵素で消化し、得られた消化物をサ
ザーンブロット分析法によって分析することで確認し
た。 実施例６ 本実施例は、百日咳菌３９０−５９株のサザーンブロッ
トの調製を示す（図８参照）。野生型（ＷＴ）百日咳菌
１０５３６株及び百日咳菌３９０−５９株から染色体Ｄ
ＮＡを単離し、それぞれについて、制限酵素ＫｐｎＩ及
びＳｍａＩで消化した消化物と、制限酵素ＢｇｌＩＩ単
独で消化した消化物とを調製し、これらを展開した。す
なわち、図８（Ｃ）に示すように、レーン１に１０５３
６株の染色体ＤＮＡのＫｐｎＩ／ＳｍａＩ消化物を、レ
ーン２に１０５３６株の染色体ＤＮＡのＢｇｌＩＩ消化
物を、レーン３に３９０−５９株の染色体ＤＮＡのＫｐ
ｎＩ／ＳｍａＩ消化物を、レーン４に３９０−５９株の
染色体ＤＮＡのＢｇｌＩＩ消化物をそれぞれ展開した。
展開されたサンプルをフィルターに転写し、４．７ｋｂ
ｐの全ＴＯＸをコードする配列を有するＥｃｏＲＩ断片
をプローブとして分析した。染色体におけるＴＯＸプロ
モーターのＦＨＡプロモーターでの置換は、図８（Ａ）
に矢印で示されているＫｐｎＩ部位の消失を起こす（図
８（Ｂ）参照）。なお、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩでの消化
によって、１０５３６株の染色体ＤＮＡからは３．０、
１．６及び１．５ｋｂｐの、また、３９０−５９株の染
色体ＤＮＡからは４．８及び５．１ｋｂｐのＴＯＸに特
異的なハイブリダイゼーションを起こす断片が生じた。 実施例７ 本実施例は、百日咳菌８９０−４９株のサザーンブロッ
トを示す（図９）。野生型（ＷＴ）百日咳菌１０５３６
株及び百日咳菌８９０−４９株から染色体ＤＮＡを単離
し、それぞれについて、制限酵素ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩ
Ｉで消化した消化物と、制限酵素ＢａｍＨＩ単独で消化
した消化物とを調製し、これらを展開した。すなわち、
図９（Ｃ）に示すように、レーン１に１０５３６株の染
色体ＤＮＡのＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩ消化物を、レーン２
に１０５３６株の染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物を、
レーン３に８９０−４９株の染色体ＤＮＡのＫｐｎＩ／
ＢｇｌＩＩ消化物を、レーン４に８９０−４９株の染色
体ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物をそれぞれ展開した。展開
されたサンプルをフィルターに転写し、ＦＨＡに特異的
なプローブを用いて分析を行った。染色体におけるＦＨ
ＡプロモーターのＴＯＸプロモーターでの置換は、図９
（Ａ）および（Ｂ）に示されているように、ＫｐｎＩ部
位の導入を起こす。なお、ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩでの
消化によって、１０５３６株の染色体ＤＮＡからは９ｋ
ｂｐの、また、８９０−４９株の染色体ＤＮＡからは６
ｋｂｐのＦＨＡに特異的なハイブリダイゼーションを起
こす断片が生じた。 実施例８ 本実施例は、百日咳菌１２９０−４株のサザーンブロッ
トの調製を示す（図１０参照）。野生型（ＷＴ）百日咳
菌１０５３６株及び百日咳菌１２９０−４株から染色体
ＤＮＡを単離し、それぞれについて、制限酵素ＡｐａＩ
で消化した消化物と、制限酵素ＳａｌＩで消化した消化
物とを調製し、これらを展開した。すなわち、図１０
（Ｃ）に示されるように、レーン１に１０５３６株の染
色体ＤＮＡのＡｐａＩ消化物を、レーン２に１０５３６
株の染色体ＤＮＡのＳａｌＩ消化物を、レーン３に１２
９０−４株の染色体ＤＮＡのＡｐａＩ消化物を、レーン
４に１２９０−４株の染色体ＤＮＡのＳａｌＩ消化物を
それぞれ展開した。展開されたサンプルをフィルターに
転写し、ＰＲＮに特異的なプローブを用いて分析を行っ
た。染色体におけるＰＲＮプロモーターのＦＨＡプロモ
ーターでの置換は、図１０Ａ）および（Ｂ）に示されて
いるように、ＡｐａＩ部位の導入を起こす。なお、Ａｐ
ａＩでの消化によって、１０５３６株の染色体ＤＮＡか
らは４．４ｋｂｐの、また、１２９０−４株の染色体Ｄ
ＮＡからは２．５ｋｂｐのＰＲＮに特異的なハイブリダ
イゼーションを起こす断片が生じた。 実施例９ 本実施例は、各種百日咳菌株の培養と、免疫学的測定法
（immunoassay ）による各種抗原の定量を示す。各種百
日咳菌株を、０．２％ヘプタキス（２，６−ｏ−ジメチ
ル）β−シクロデキストリン（Imaizumi et al., Infac
t. Immun., 41, 1138 [1983]）を含む変法スタイナー−
ショルテ培地（Stainerーscholte medium）を用い、１０
リットルのｐＨ及び溶存酸素の制御が行われるＣｈｅｍ
Ａｐファーメンターで、もしくは１０ｍｌの容量で培養
した。培養上清を抗原の特異性を利用するＥＬＩＳＡ法
で分析して、抗原生産性が試験された。ＰＴはLoosmore
らの記述（Infect. and Immun., 58, 3653 [1990] ）に
従ってフェツイン補足ＥＬＩＳＡ（fetuin-captureELIS
A ）によって測定された。ＦＨＡは、腹水から精製した
マウスモノクローナル抗ＦＨＡ抗体によって補足し、２
次標識抗体としてワサビペルオキシダーゼに結合させた
ポリクローナルウサギＩｇＧ抗ＦＨＡ抗体を用いるＥＬ
ＩＳＡによって分析した。ペルタクチンは、非特異性モ
ルモット過免疫血清から精製したポリクロナール抗体に
よって捕獲し、２次標識抗体としてワサビペルオキシダ
ーゼに結合させたモルモットＩｇＧ抗ペルタクチン（６
９ｋＤａ）抗体を用いるＥＬＩＳＡによって測定した。
野生型１０５３６株の培養における培養液から精製した
ＰＴ、ＦＨＡ及びペルタクチン（６９ｋＤａ）の各蛋白
質を標準として使用した。以上の開示内容を総括する
と、本発明は、特にボルデテラ属細菌に対し実用性のあ
る新規な遺伝子産物発現方法を提供するものである。本
発明の範囲において変更、修正は可能である。
【図１】（Ａ）はＦＨＡプロモーターとＴＯＸ構造遺伝
子の連結に用いたＤＮＡ単位の配列を示し、矢印はＳ１
遺伝子のＡＴＧ開始コドンを示す。（Ｂ）は百日咳菌Ｔ
ＯＸ欠損株への導入に利用されたＴＯＸ遺伝子の非翻訳
領域に挟まれたハイブリッドオペロンを有するプラスミ
ドＳ−３６８０−１０の構造を示す図である。
子の連結に用いたＤＮＡ単位の配列を示し、矢印はＳ１
遺伝子のＡＴＧ開始コドンを示す。（Ｂ）は百日咳菌Ｔ
ＯＸ欠損株への導入に利用されたＴＯＸ遺伝子の非翻訳
領域に挟まれたハイブリッドオペロンを有するプラスミ
ドＳ−３６８０−１０の構造を示す図である。
【図２】百日咳菌ＦＨＡ欠損株への導入に利用されたＦ
ＨＡ遺伝子の非翻訳領域に挟まれたＦＨＡプロモーター
／ＴＯＸハイブリッドオペロンを有するプラスミドＳ−
３７４９−１８の構造を示す図である。
ＨＡ遺伝子の非翻訳領域に挟まれたＦＨＡプロモーター
／ＴＯＸハイブリッドオペロンを有するプラスミドＳ−
３７４９−１８の構造を示す図である。
【図３】（Ａ）は百日咳菌１０５３６株におけるＰＴの
生産速度及び発現レベルを示すグラフである。（Ｂ）は
ＴＯＸ遺伝子座にＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリ
ッドオペロンを有する百日咳菌３９０−５９株における
ＰＴの生産速度及び発現レベルを示すグラフである。
（Ｃ）はＦＨＡ遺伝子座にＦＨＡプロモーター／ＴＯＸ
ハイブリッドオペロンを、更にＴＯＸ遺伝子座に固有の
ＴＯＸオペロンを有する百日咳菌５９０−１１株におけ
るＰＴの生産速度及び発現レベルを示すグラフである。
生産速度及び発現レベルを示すグラフである。（Ｂ）は
ＴＯＸ遺伝子座にＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリ
ッドオペロンを有する百日咳菌３９０−５９株における
ＰＴの生産速度及び発現レベルを示すグラフである。
（Ｃ）はＦＨＡ遺伝子座にＦＨＡプロモーター／ＴＯＸ
ハイブリッドオペロンを、更にＴＯＸ遺伝子座に固有の
ＴＯＸオペロンを有する百日咳菌５９０−１１株におけ
るＰＴの生産速度及び発現レベルを示すグラフである。
【図４】（Ａ）はＴＯＸプロモーターとＦＨＡ構造遺伝
子の連結に用いたＤＮＡ単位の配列を示し、矢印はＦＨ
Ａ構造遺伝子のＡＴＧコドンを示す。（Ｂ）は百日咳菌
ＦＨＡ欠損株のＦＨＡ遺伝子座への導入に利用されたＦ
ＨＡ遺伝子の非翻訳領域に挟まれたハイブリッドオペロ
ンを有するプラスミドＳ−３８３８−９の構造を示す図
である。
子の連結に用いたＤＮＡ単位の配列を示し、矢印はＦＨ
Ａ構造遺伝子のＡＴＧコドンを示す。（Ｂ）は百日咳菌
ＦＨＡ欠損株のＦＨＡ遺伝子座への導入に利用されたＦ
ＨＡ遺伝子の非翻訳領域に挟まれたハイブリッドオペロ
ンを有するプラスミドＳ−３８３８−９の構造を示す図
である。
【図５】（Ａ）は百日咳菌１０５３６株におけるＦＨＡ
の生産速度及び発現レベルを示すグラフである。（Ｂ）
はＦＨＡ遺伝子座にＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブ
リッド遺伝子を有する百日咳菌８９０−４９株における
ＦＨＡの生産速度及び発現レベルを示すグラフである。
の生産速度及び発現レベルを示すグラフである。（Ｂ）
はＦＨＡ遺伝子座にＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブ
リッド遺伝子を有する百日咳菌８９０−４９株における
ＦＨＡの生産速度及び発現レベルを示すグラフである。
【図６】（Ａ）はＦＨＡプロモーターとペルタクチン構
造遺伝子の連結に用いたＤＮＡ単位の配列を示し、矢印
はペルタクチン構造遺伝子のＡＴＧコドンを示す。
（Ｂ）は百日咳菌ＰＲＮ欠損株のペルタクチン遺伝子座
への導入に利用されたペルタクチン遺伝子の非翻訳領域
に挟まれたハイブリッド遺伝子を有するプラスミドＳ−
３９８２−７の構造を示す図である。
造遺伝子の連結に用いたＤＮＡ単位の配列を示し、矢印
はペルタクチン構造遺伝子のＡＴＧコドンを示す。
（Ｂ）は百日咳菌ＰＲＮ欠損株のペルタクチン遺伝子座
への導入に利用されたペルタクチン遺伝子の非翻訳領域
に挟まれたハイブリッド遺伝子を有するプラスミドＳ−
３９８２−７の構造を示す図である。
【図７】（Ａ）は百日咳菌１０５３６株におけるペルタ
クチン（６９ｋＤａ）の生産速度及び発現レベルを示す
グラフである。（Ｂ）はＰＲＮ遺伝子座にＦＨＡプロモ
ーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子を有する百日咳菌１
２９０−４株におけるペルタクチンの生産速度及び発現
レベルを示すグラフである。
クチン（６９ｋＤａ）の生産速度及び発現レベルを示す
グラフである。（Ｂ）はＰＲＮ遺伝子座にＦＨＡプロモ
ーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子を有する百日咳菌１
２９０−４株におけるペルタクチンの生産速度及び発現
レベルを示すグラフである。
【図８】（Ａ）は百日咳菌１０５３６株の有する野生型
ＴＯＸオペロン（ＷＴ ＴＯＸ）の制限酵素地図であ
る。（Ｂ）は百日咳菌３９０−５９株のＴＯＸ遺伝子座
に導入されたＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド
オペロンの制限酵素地図である。（Ｃ）は１０５３６株
及び３９０−５９株の染色体ＤＮＡの消化物のサザーン
ブロットの結果を示す図であり、ハイブリッドオペロン
が所定の位置に導入されていることを示す。
ＴＯＸオペロン（ＷＴ ＴＯＸ）の制限酵素地図であ
る。（Ｂ）は百日咳菌３９０−５９株のＴＯＸ遺伝子座
に導入されたＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド
オペロンの制限酵素地図である。（Ｃ）は１０５３６株
及び３９０−５９株の染色体ＤＮＡの消化物のサザーン
ブロットの結果を示す図であり、ハイブリッドオペロン
が所定の位置に導入されていることを示す。
【図９】（Ａ）は百日咳菌１０５３６株の有する野生型
ＦＨＡオペロン（ＷＴ ＦＨＡ）の制限酵素地図であ
る。（Ｂ）は百日咳菌８９０−４９株のＦＨＡ遺伝子座
に導入されたＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッド
オペロンの制限酵素地図である。（Ｃ）は１０５３６株
及び８９０−４９株の染色体ＤＮＡの消化物のサザーン
ブロットの結果を示す図であり、ハイブリッドオペロン
が所定の位置に導入されていることを示す。
ＦＨＡオペロン（ＷＴ ＦＨＡ）の制限酵素地図であ
る。（Ｂ）は百日咳菌８９０−４９株のＦＨＡ遺伝子座
に導入されたＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッド
オペロンの制限酵素地図である。（Ｃ）は１０５３６株
及び８９０−４９株の染色体ＤＮＡの消化物のサザーン
ブロットの結果を示す図であり、ハイブリッドオペロン
が所定の位置に導入されていることを示す。
【図１０】（Ａ）は百日咳菌１０５３６株の有するＰＲ
Ｎ遺伝子（ＰＲＮ）の制限酵素地図である。（Ｂ）は百
日咳菌１２９０−４株のＰＲＮ遺伝子座に導入されたＦ
ＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子の制限酵
素地図である。（Ｃ）は１０５３６株及び１２９０−４
株の染色体ＤＮＡの消化物のサザーンブロットの結果を
示す図であり、ハイブリッドオペロンが所定の位置に導
入されていることを示す。
Ｎ遺伝子（ＰＲＮ）の制限酵素地図である。（Ｂ）は百
日咳菌１２９０−４株のＰＲＮ遺伝子座に導入されたＦ
ＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子の制限酵
素地図である。（Ｃ）は１０５３６株及び１２９０−４
株の染色体ＤＮＡの消化物のサザーンブロットの結果を
示す図であり、ハイブリッドオペロンが所定の位置に導
入されていることを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年２月５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/74 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/31 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 15/11 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ゲヴイン ズイーレイ カナダ国 エル４ケイ １ジー８ オンタ リオ州 コンコード ベイ ヒル ドライ ヴ 49 (72)発明者 レザ カイヤーム ヤコブ カナダ国 エル５エイ ２エス１ オンタ リオ州 ミスイサウガ オールド フイー ザント ロード 2354 (72)発明者 マイケル クライン カナダ国 エム５エイ ３エム２ オンタ リオ州 ウイロウダール マンロー ブー ルヴアード 16
Claims (17)
- 【請求項１】 百日咳構造遺伝子と、該百日咳構造遺伝
子がＡＴＧ開始コドンで融合した百日咳菌に固有の自己
プロモーターとを有することを特徴とするハイブリッド
百日咳遺伝子。 - 【請求項２】 プロモーターがＴＯＸプロモーターであ
り、百日咳構造遺伝子がＦＨＡ構造遺伝子もしくはＰＲ
Ｎ構造遺伝子であるか；プロモーターがＦＨＡプロモー
ターであり、百日咳構造遺伝子がＴＯＸ構造遺伝子もし
くはＰＲＮ構造遺伝子であるか；またはプロモーターが
ＰＲＮプロモーターであり、百日咳構造遺伝子がＴＯＸ
構造遺伝子もしくはＦＨＡ構造遺伝子である請求項１に
記載のハイブリッド百日咳遺伝子。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載のハイブリッド
百日咳遺伝子、あるいはこれらハイブリッド百日咳遺伝
子の複数によって形質転換されたものであることを特徴
とするボルデテラ属形質転換株。 - 【請求項４】 百日咳菌をハイブリッド百日咳遺伝子に
より形質転換して得たものである請求項３に記載のボル
デテラ属形質転換株。 - 【請求項５】 その培養において、ＡＴＧ開始コドンで
それ自身に固有のプロモーターに融合した百日咳構造遺
伝子を有する相同遺伝子で形質転換された同種のボルデ
テラ属細菌株により達成されるのと異なる生産量で遺伝
子産物を生産する請求項４に記載のボルデテラ属形質転
換株。 - 【請求項６】 ＰＲＮ - 株をＦＨＡプロモーター／ＰＲ
Ｎハイブリッド遺伝子で形質転換したＡＴＣＣに寄託番
号５５１５５で寄託されている百日咳菌１２９０−４
株；ＴＯＸ - 株をＦＨＡプロモーター／ＴＯＸ（ＴＯ
Ｘ）ハイブリッド遺伝子で形質転換した百日咳菌３９０
−５９株；ＦＨＡ - 株をＦＨＡプロモーター／ＴＯＸ
（ＦＨＡ）ハイブリッド遺伝子で形質転換した百日咳菌
５９０−１１株；またはＦＨＡ - 株をＴＯＸプロモータ
ー／ＦＨＡ（ＦＨＡ）ハイブリッド遺伝子で形質転換し
た百日咳菌８９０−４９株。 - 【請求項７】 百日咳菌（ＦＨＡ - ）３９０−１０１株
（ＡＴＣＣ ５５１５７）；または百日咳菌（ＰＲＮ
- ）１０９０−１０８−３株（ＡＴＣＣ ５５１５
６）。 - 【請求項８】 ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッ
ド遺伝子及びＴＯＸ非翻訳領域が図１に示す制限酵素地
図をそれぞれ有するプラスミドＳ−３６８０−１０；Ｆ
ＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝子及びＦＨ
Ａ非翻訳領域が図２に示す制限酵素地図をそれぞれ有す
るプラスミドＳ−３７４９−１８；ＴＯＸプロモーター
／ＦＨＡハイブリッド遺伝子及びＦＨＡ非翻訳領域が図
４に示す制限酵素地図をそれぞれ有するプラスミドＳ−
３８３８−９；またはＦＨＡプロモーター／ＰＲＮハイ
ブリッド遺伝子及びＰＲＮ非翻訳領域が図６に示す制限
酵素地図をそれぞれ有するプラスミドＳ−３９８２−
７。 - 【請求項９】 請求項３のボルデテラ属形質転換株によ
って生産された抗原性蛋白質。 - 【請求項１０】 百日咳トキシン、繊維状赤血球凝集素
またはペルタクチン（６９ｋＤａ）である請求項９に記
載の抗原性蛋白質。 - 【請求項１１】 少なくとも、請求項９の抗原性蛋白質
の有効量と生理学的に許容される担体とを含む対百日咳
用コンポーネントワクチン。 - 【請求項１２】 請求項４の百日咳菌の形質転換株の滅
菌菌体および生理学的に許容される担体とを含む対百日
咳用全菌体ワクチン。 - 【請求項１３】 （ａ）生体を所望の遺伝子産物をコー
ドする遺伝子で形質転換する過程と、（ｂ）該形質転換
体を該遺伝子産物が発現するように培養する過程とを有
し、前記過程（ａ）における形質転換が、所望の遺伝子
産物をコードする構造遺伝子を他の構造遺伝子に固有の
プロモーターと融合したハイブリッド遺伝子により行わ
れることを特徴とする生体での遺伝子発現方法。 - 【請求項１４】 遺伝子産物の生産が、生体を構造遺伝
子と該構造遺伝子自身に固有のプロモーターとを有する
相同遺伝子で形質転換した場合と異なる量で行われる請
求項１３に記載の遺伝子発現方法。 - 【請求項１５】 遺伝子産物の生産が同時的または非同
時的である請求項１３または１４に記載の遺伝子発現方
法。 - 【請求項１６】 生体の形質転換がハイブリッド遺伝子
を適当な染色体の遺伝子座に相同組換えによって導入す
ることで行われる請求項１４、１５または１６に記載の
遺伝子発現方法。 - 【請求項１７】 生体が百日咳菌である請求項１４〜１
６のいずれか１項に記載の遺伝子発現方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9008746.1 | 1990-04-18 | ||
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