JPH0568567A - カンジダ・アルビカンス細胞膜（ｈ）ａｔｐアーゼについてコードする遺伝子 - Google Patents
カンジダ・アルビカンス細胞膜（ｈ）ａｔｐアーゼについてコードする遺伝子Info
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- JPH0568567A JPH0568567A JP17793391A JP17793391A JPH0568567A JP H0568567 A JPH0568567 A JP H0568567A JP 17793391 A JP17793391 A JP 17793391A JP 17793391 A JP17793391 A JP 17793391A JP H0568567 A JPH0568567 A JP H0568567A
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- candida albicans
- dna
- atpase
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明はカンジダ・アルビカンスの細胞膜Ｈ
+ ＡＴＰアーゼについてコードする独特な遺伝子の単
離、精製、クローン化、配列決定及び発現に関する。 【効果】 クローン化された遺伝子は他のカンジダ核酸
を含まず、カンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰア
ーゼを産生するために用いられる。独特なカンジダ・ア
ルビカンス細胞膜遺伝子はカンジダ・アルビカンス細胞
膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ活性を乱しうる薬剤について評価す
るために使用可能な非病原性酵母を形質転換する上で使
用することができる。
+ ＡＴＰアーゼについてコードする独特な遺伝子の単
離、精製、クローン化、配列決定及び発現に関する。 【効果】 クローン化された遺伝子は他のカンジダ核酸
を含まず、カンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰア
ーゼを産生するために用いられる。独特なカンジダ・ア
ルビカンス細胞膜遺伝子はカンジダ・アルビカンス細胞
膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ活性を乱しうる薬剤について評価す
るために使用可能な非病原性酵母を形質転換する上で使
用することができる。
Description
【０００１】真菌及び植物の細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼは
栄養素の能動輸送に必要な内部pH及び膜ポテンシャルを
維持することによりこれらの生物で本質的役割を果た
す。その酵素で形成されるタンパク質勾配はＨ+共輸送
により栄養素を能動輸送するが、細胞増殖を媒介するpH
バランスにも関与しているらしい〔セラノら、ネーチャ
ー、第３１９巻、第６８９−６９３頁、１９８６年（Se
rrano et al.,Nature,３１９：６８９−６９３、１９８
６）〕。真菌Ｈ+ ＡＴＰアーゼについてコードする遺伝
子（ＰＭＡ１及びＰＭＡ２）がサッカロミセス・セレビ
シアエ（Saccharomyces cerevisiae) 〔セラノら、ネー
チャー、第３１９巻、第６８９−６９３頁、１９８６
年；シュレッサーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、第２６３巻、第１９４８０−１９４
８７頁、１９８８年（Schlesser etal., J. Biol. Che
m., ２６３：１９４８０−１９４８７、１９８８) 〕、
ニューロスポラ−クラッサ（Neurospora crassa)〔ヘー
ガーら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８３巻、第７６９３
−７６９７頁、１９８６年（Hager et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, ８３：７６９３−７６９７、１９
８６) 〕及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosacc
haromyces pombe ) 〔ギスライム（Ghislaim) ら、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６
２巻、第１７５４９−１７５５５頁、１９８７年）〕か
ら単離、クローン化及び配列決定された。このクラスの
酵素は哺乳動物細胞において直接的対応物を有しない
〔セラノ、Ｒ.,植物及び真菌の細胞膜ＡＴＰアーゼ、Ｃ
ＲＣプレス、１９８５年（Serrano, R., Plasma Membra
ne ATPasa of Plants and Fungi,CRC Press, １９８５)
〕。本発明はこの酵素が真菌症の異なる薬物療法用に
可能な標的として機能しうることを示唆している。カン
ジダ・アルビカンス（Candida albicans) のＨ+ ＡＴＰ
アーゼについてコードする遺伝子が下記のようにクロー
ン化され、配列決定された。その結果病原性真菌を形成
する酵素は過剰に産生でき、遺伝子的に操作でき、抗真
菌標的として詳細に研究できる。
栄養素の能動輸送に必要な内部pH及び膜ポテンシャルを
維持することによりこれらの生物で本質的役割を果た
す。その酵素で形成されるタンパク質勾配はＨ+共輸送
により栄養素を能動輸送するが、細胞増殖を媒介するpH
バランスにも関与しているらしい〔セラノら、ネーチャ
ー、第３１９巻、第６８９−６９３頁、１９８６年（Se
rrano et al.,Nature,３１９：６８９−６９３、１９８
６）〕。真菌Ｈ+ ＡＴＰアーゼについてコードする遺伝
子（ＰＭＡ１及びＰＭＡ２）がサッカロミセス・セレビ
シアエ（Saccharomyces cerevisiae) 〔セラノら、ネー
チャー、第３１９巻、第６８９−６９３頁、１９８６
年；シュレッサーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、第２６３巻、第１９４８０−１９４
８７頁、１９８８年（Schlesser etal., J. Biol. Che
m., ２６３：１９４８０−１９４８７、１９８８) 〕、
ニューロスポラ−クラッサ（Neurospora crassa)〔ヘー
ガーら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８３巻、第７６９３
−７６９７頁、１９８６年（Hager et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, ８３：７６９３−７６９７、１９
８６) 〕及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosacc
haromyces pombe ) 〔ギスライム（Ghislaim) ら、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６
２巻、第１７５４９−１７５５５頁、１９８７年）〕か
ら単離、クローン化及び配列決定された。このクラスの
酵素は哺乳動物細胞において直接的対応物を有しない
〔セラノ、Ｒ.,植物及び真菌の細胞膜ＡＴＰアーゼ、Ｃ
ＲＣプレス、１９８５年（Serrano, R., Plasma Membra
ne ATPasa of Plants and Fungi,CRC Press, １９８５)
〕。本発明はこの酵素が真菌症の異なる薬物療法用に
可能な標的として機能しうることを示唆している。カン
ジダ・アルビカンス（Candida albicans) のＨ+ ＡＴＰ
アーゼについてコードする遺伝子が下記のようにクロー
ン化され、配列決定された。その結果病原性真菌を形成
する酵素は過剰に産生でき、遺伝子的に操作でき、抗真
菌標的として詳細に研究できる。
【０００２】したがって、カンジダ・アルビカンス細胞
膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼについてコードできる遺伝子を単離
かつ精製することが本発明の目的である。もう１つの目
的は細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ遺伝子の発現に関して準備
することである。他の目的はカンジダ・アルビカンス細
胞膜Ｈ+ＡＴＰアーゼ遺伝子で形質転換された生物を得
ることである。
膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼについてコードできる遺伝子を単離
かつ精製することが本発明の目的である。もう１つの目
的は細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ遺伝子の発現に関して準備
することである。他の目的はカンジダ・アルビカンス細
胞膜Ｈ+ＡＴＰアーゼ遺伝子で形質転換された生物を得
ることである。
【０００３】真菌カンジダ・アルビカンスの細胞膜Ｈ+
ＡＴＰアーゼについてコードする独特な遺伝子が単離、
クローン化及び配列決定された。クローン化された遺伝
子は他のカンジダ・アルビカンス核酸を含まず、カンジ
ダ・アルビカンスＨ+ ＡＴＰアーゼを産生するために用
いられる。独特なカンジダ・アルビカンス細胞膜遺伝子
はカンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ活性
を乱しうる薬剤について評価するために使用可能な非病
原性酵母を形質転換する上で用いることができる。
ＡＴＰアーゼについてコードする独特な遺伝子が単離、
クローン化及び配列決定された。クローン化された遺伝
子は他のカンジダ・アルビカンス核酸を含まず、カンジ
ダ・アルビカンスＨ+ ＡＴＰアーゼを産生するために用
いられる。独特なカンジダ・アルビカンス細胞膜遺伝子
はカンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ活性
を乱しうる薬剤について評価するために使用可能な非病
原性酵母を形質転換する上で用いることができる。
【０００４】本発明はカンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ
+ ＡＴＰアーゼ遺伝子の単離、特徴、配列決定及び発現
に関する。これによってこの病原性真菌の酵素を過剰に
産生し、遺伝的に操作し、抗真菌標的として詳細に研究
することができる。細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ遺伝子はそ
の酵素を産生しうる二形性病原性真菌カンジダ・アルビ
カンスのＤＮＡから得られる。このような真菌の株又は
種としては格別限定されず、当業界で公知でかつアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（American T
ype Culture Collection) から容易に入手しうる株：カ
ンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２６１、ＡＴＣＣ４
４９９０及びＡＴＣＣ２２１１４がある。
+ ＡＴＰアーゼ遺伝子の単離、特徴、配列決定及び発現
に関する。これによってこの病原性真菌の酵素を過剰に
産生し、遺伝的に操作し、抗真菌標的として詳細に研究
することができる。細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ遺伝子はそ
の酵素を産生しうる二形性病原性真菌カンジダ・アルビ
カンスのＤＮＡから得られる。このような真菌の株又は
種としては格別限定されず、当業界で公知でかつアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（American T
ype Culture Collection) から容易に入手しうる株：カ
ンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２６１、ＡＴＣＣ４
４９９０及びＡＴＣＣ２２１１４がある。
【０００５】染色体ＤＮＡはシャーマン（Sherman)ら
〔１９８３年、酵母遺伝学における方法、コールド・ス
プリング・ハーバー、ラボラトリー・プレス、コールド
・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８３、Me
thods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, Cold SpringHarbor, N. Y.)〕で示される
ような当業界で公知の方法によりＡＴＰアーゼを産生す
ることが知られた微生物、好ましくはカンジダ・アルビ
カンスＡＴＣＣ１０２６１の純粋培養物から単離され
る。染色体ＤＮＡは例えばＢamＨＩ、ＣlaＩ、ＢclＩ、
ＢglII、ＫpnＩ、Ｓau３Ａ又はＸhoＩのような１種以上
の制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断で部分的又は
完全に断片化されるが、Ｓau３Ａが好ましい。切断され
たＤＮＡ断片はサイズにより分離され、鎖長約２〜約１
５kbのサイズ特定断片がクローニングベクターに挿入さ
れる。ここで用いられるクローニングベクターとは特定
の実験的外来ＤＮＡを組込めるＤＮＡ配列として定義さ
れるが、組合されたＤＮＡは安定的に存在して実験ＤＮ
Ａで指示されるタンパク質を発現しうる宿主細胞中に導
入される。ベクターＤＮＡと組合された外来ＤＮＡは組
換え技術から誘導される組換えＤＮＡ分子を構成する。
クローニングベクターとしてはプラスミド、バクテリオ
ファージ、ウイルス及びコスミドがある。いかなるクロ
ーニングベクターも新規Ｃ．アルビカンスＤＮＡ配列を
クローニングするために用いてよいと理解されるが、プ
ラスミドが好ましい。クローニングベクターはＢamＨＩ
のような制限エンドヌクレアーゼで切断され、ホスファ
ターゼで処理され、ＤＮＡ断片がＤＮＡリガーゼ、好ま
しくはＴ４ＤＮＡリガーゼで結合される。クローニング
ベクターはＤＮＡ取込み用に適格な宿主細胞を形質転換
するために用いられる。クローニング、ＤＮＡプロセッ
シング及び遺伝的発現に用いられるコンピテント宿主細
胞としては細菌、酵母、真菌、昆虫、植物又は哺乳動物
細胞があるが、好ましい宿主は細菌及び酵母である。最
も好ましい酵母はカンジダ及びサッカロミセス属のであ
り、最も好ましい細菌はエシェリヒア（Escherichia )
属のである。最も好ましいエシェリヒア宿主としては大
腸菌Ｋ−１２株ＲＲ１、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９又はＤ
Ｈ５９７αがある。約５×１０4 の独立したインサート
からなるライブラリーは全ゲノムの代表を含んでいるら
しいことがここで調べられた。このようなライブラリー
の例はクルツら、ジェネティック・オブ・カンジダ、Ｃ
ＲＣプレス、１９９０年〔Kurtz et al., Genetic of C
andida, CRC Press(１９９０) 〕；マギー、アナライテ
ィカル・バイオケミストリー、第１７５巻、第３６１−
３７２頁、１９８８年〔Magee, Anal. Biochem.,１７
５：３６１−３７２（１９８８）〕；ギラムら、モレキ
ュラー・アンド・ゼネラル・ジェネティクス、第１９８
巻、第１７９−１８２頁、１９８６年〔Gillum et al.,
Mol. Gen. Genet.,１９８：１７９−１８２（１９８
６)〕；ローゼンブルー（Rosenbluh)ら、モレキュラー
・アンド・ゼネラル・ジェネティクス、第２００巻、第
５００−５０２頁、１９８５年で記載されている。酵
母、真菌及び植物からのＨ+ ＡＴＰアーゼは高度に保存
されているため、Ｃ．アルビカンスライブラリーはこれ
ら生物のＨ+ ＡＴＰアーゼ遺伝子の保存配列と相同的な
クローンに関してスクリーニングされる。使用可能な生
物からの公表されたＤＮＡ配列としては格別限定され
ず、Ｓ．セレビシアエ（セラノら、ネーチャー、第３１
９巻、第６８９−６９３頁、１９８６年；シュレッサー
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第２６３巻、第１９４８０−８７頁、１９８８
年）、ニューロスポラ・クラッサ〔アジソン（Addiso
n)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第２６１巻、第１４８９６−９０１頁、１９８６
年；ヘーガーら、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８３巻、第
７６９３−７６９７頁、１９８６年〕、シゾサッカロミ
セス・ボンベ（ギスラインら、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、第２６２巻、第１７５４９
−５５頁、１９８７年）及びアラビドプシス−タリアナ
（Arabidopsis thaliana) 〔ハーパー（Harper) ら、プ
ロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンスＵＳＡ、第８６巻、第１２３４−３８頁、
１９８９年；パルド（Pardo)及びセラノ、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６４巻、第
８５５７−８５６２頁、１９８９年〕があるが、Ｓ．セ
レビシアエ配列が好ましい。ライブラリーは標準的操作
で製造された公表配列から形成されるクローン化遺伝子
又はオリゴヌクレチドの標識断片でスクリーニングされ
る。標識プローブは放射性同位元素、好ましくは32Ｐで
又はビオチニル化ような非同位元素法で製造できる。す
べてのプロセスは当業界で周知である。
〔１９８３年、酵母遺伝学における方法、コールド・ス
プリング・ハーバー、ラボラトリー・プレス、コールド
・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８３、Me
thods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, Cold SpringHarbor, N. Y.)〕で示される
ような当業界で公知の方法によりＡＴＰアーゼを産生す
ることが知られた微生物、好ましくはカンジダ・アルビ
カンスＡＴＣＣ１０２６１の純粋培養物から単離され
る。染色体ＤＮＡは例えばＢamＨＩ、ＣlaＩ、ＢclＩ、
ＢglII、ＫpnＩ、Ｓau３Ａ又はＸhoＩのような１種以上
の制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断で部分的又は
完全に断片化されるが、Ｓau３Ａが好ましい。切断され
たＤＮＡ断片はサイズにより分離され、鎖長約２〜約１
５kbのサイズ特定断片がクローニングベクターに挿入さ
れる。ここで用いられるクローニングベクターとは特定
の実験的外来ＤＮＡを組込めるＤＮＡ配列として定義さ
れるが、組合されたＤＮＡは安定的に存在して実験ＤＮ
Ａで指示されるタンパク質を発現しうる宿主細胞中に導
入される。ベクターＤＮＡと組合された外来ＤＮＡは組
換え技術から誘導される組換えＤＮＡ分子を構成する。
クローニングベクターとしてはプラスミド、バクテリオ
ファージ、ウイルス及びコスミドがある。いかなるクロ
ーニングベクターも新規Ｃ．アルビカンスＤＮＡ配列を
クローニングするために用いてよいと理解されるが、プ
ラスミドが好ましい。クローニングベクターはＢamＨＩ
のような制限エンドヌクレアーゼで切断され、ホスファ
ターゼで処理され、ＤＮＡ断片がＤＮＡリガーゼ、好ま
しくはＴ４ＤＮＡリガーゼで結合される。クローニング
ベクターはＤＮＡ取込み用に適格な宿主細胞を形質転換
するために用いられる。クローニング、ＤＮＡプロセッ
シング及び遺伝的発現に用いられるコンピテント宿主細
胞としては細菌、酵母、真菌、昆虫、植物又は哺乳動物
細胞があるが、好ましい宿主は細菌及び酵母である。最
も好ましい酵母はカンジダ及びサッカロミセス属のであ
り、最も好ましい細菌はエシェリヒア（Escherichia )
属のである。最も好ましいエシェリヒア宿主としては大
腸菌Ｋ−１２株ＲＲ１、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９又はＤ
Ｈ５９７αがある。約５×１０4 の独立したインサート
からなるライブラリーは全ゲノムの代表を含んでいるら
しいことがここで調べられた。このようなライブラリー
の例はクルツら、ジェネティック・オブ・カンジダ、Ｃ
ＲＣプレス、１９９０年〔Kurtz et al., Genetic of C
andida, CRC Press(１９９０) 〕；マギー、アナライテ
ィカル・バイオケミストリー、第１７５巻、第３６１−
３７２頁、１９８８年〔Magee, Anal. Biochem.,１７
５：３６１−３７２（１９８８）〕；ギラムら、モレキ
ュラー・アンド・ゼネラル・ジェネティクス、第１９８
巻、第１７９−１８２頁、１９８６年〔Gillum et al.,
Mol. Gen. Genet.,１９８：１７９−１８２（１９８
６)〕；ローゼンブルー（Rosenbluh)ら、モレキュラー
・アンド・ゼネラル・ジェネティクス、第２００巻、第
５００−５０２頁、１９８５年で記載されている。酵
母、真菌及び植物からのＨ+ ＡＴＰアーゼは高度に保存
されているため、Ｃ．アルビカンスライブラリーはこれ
ら生物のＨ+ ＡＴＰアーゼ遺伝子の保存配列と相同的な
クローンに関してスクリーニングされる。使用可能な生
物からの公表されたＤＮＡ配列としては格別限定され
ず、Ｓ．セレビシアエ（セラノら、ネーチャー、第３１
９巻、第６８９−６９３頁、１９８６年；シュレッサー
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第２６３巻、第１９４８０−８７頁、１９８８
年）、ニューロスポラ・クラッサ〔アジソン（Addiso
n)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第２６１巻、第１４８９６−９０１頁、１９８６
年；ヘーガーら、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８３巻、第
７６９３−７６９７頁、１９８６年〕、シゾサッカロミ
セス・ボンベ（ギスラインら、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、第２６２巻、第１７５４９
−５５頁、１９８７年）及びアラビドプシス−タリアナ
（Arabidopsis thaliana) 〔ハーパー（Harper) ら、プ
ロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンスＵＳＡ、第８６巻、第１２３４−３８頁、
１９８９年；パルド（Pardo)及びセラノ、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６４巻、第
８５５７−８５６２頁、１９８９年〕があるが、Ｓ．セ
レビシアエ配列が好ましい。ライブラリーは標準的操作
で製造された公表配列から形成されるクローン化遺伝子
又はオリゴヌクレチドの標識断片でスクリーニングされ
る。標識プローブは放射性同位元素、好ましくは32Ｐで
又はビオチニル化ような非同位元素法で製造できる。す
べてのプロセスは当業界で周知である。
【０００６】Ｓ．セレビシアエＰＭＡ１ ＤＮＡと相同
性を示すクローン化Ｃ．アルビカンスＤＮＡを含んだ宿
主細胞が増殖され、ＤＮＡが当業界で公知のルーチン方
法により抽出される。約１２キロ塩基（kb) インサート
で運搬されるＣ．アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ
（ＰＭＡ１）についてコードする遺伝子は、配列分析及
び制限地図作成に有用な二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の
産生用に考えられた１種以上のベクターに移される。こ
のようなベクターとしては格別限定されず、ｐＢＲ３２
２、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４（市販）、ｐＧＥＭ３zf
（＋）及びｐＧＥＭ５zf（＋）〔プロメガ（Promega)〕
がある。ｄｓＤＮＡの制限地図作成は当業者に公知の操
作により様々な市販制限酵素で行われ、結果はカンジダ
−アルビカンスＤＮＡのゲノム制限地図と比較される。
ゲノム地図は酵素を産生しうるカンジダ・アルビカンス
から染色体ＤＮＡを抽出することにより作成される。こ
のような真菌としては格別限定されず、当業界で公知で
かつ容易に入手しうる株：カンジダアルビカンスＡＴＣ
Ｃ１０２６１、ＡＴＣＣ２２１１４及びＡＴＣＣ４４９
９０がある。染色体ＤＮＡは当業界で周知の方法により
抽出される（シャーマン、Ｆ．ら、１９８３年、酵母遺
伝学における方法、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク）。一部の染色体ＤＮＡはＥcoＲＩ、
ＨindIII、ＥcoＲＶ、ＣlaＩ及びＸhoＩのようないくつ
かの制限酵素で完全に切断される。必要であれば、一部
のＤＮＡ断片は２種以上の酵素で切断される。切断され
たＤＮＡ断片はゲル電気泳動により分離される。次いで
断片はニトロセルロース又はナイロン膜のような固体膜
支持体に移されるが、ナイロン膜が好ましい支持体であ
る。次いでナイロンブロットは放射線標識プローブとハ
イブリッド形成される。選択される放射性同位元素は32
Ｐである。ＤＮＡ断片はニックトランスレーション操作
〔リグビー（Rigby)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー、第１１３巻、第２３７−２５１頁、
１９７７年〕又はランダム・プライミング操作〔ファイ
ンバーグ（Feinberg) 及びフォーゲルスタイン（Vogels
tein) 、アナライティカル・バイオケミストリー、第１
３２巻、第６−１３頁、１９８３年〕のいずれかで放射
線標識されるが、ランダムプライミング操作が選択技術
である。ハイブリッド形成ブロットは好ましいプローブ
としてＳ．セレビシアエＰＭＡ１遺伝子からの約２kbＫ
pnＩの相同放射線標識断片と一夜インキュベートされる
（セラノら、ネーチャー、第３１９巻、６８９−６９３
頁、１９８６年）、翌日ブロットが当業界で公知の方法
により洗浄される〔マニアティス（Maniatis）ら、１９
８２年、分子クローニング：実験マニュアル（Molecula
r Cloning : A Laboratory Manual)、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー〕。次いでブロットはＸＡＲ−５フ
ィルムに露出され、常法で現像される〔ラスキー及びミ
ルズ、ＦＥＢＳレターズ、第８２巻、第３１４−３１６
頁、１９７７年（Laskey and Mills, FEBS Letters, ８
２：３１４−３１６（１９７７）〕。プローブとハイブ
リッド形成する切断された断片のサイズ及びパターンに
よりゲノム地図を作成できる。ゲノム地図とクローン化
配列の制限地図との比較で、望ましいゲノム配列を有す
るクローン化遺伝子の同一性を確認する。
性を示すクローン化Ｃ．アルビカンスＤＮＡを含んだ宿
主細胞が増殖され、ＤＮＡが当業界で公知のルーチン方
法により抽出される。約１２キロ塩基（kb) インサート
で運搬されるＣ．アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ
（ＰＭＡ１）についてコードする遺伝子は、配列分析及
び制限地図作成に有用な二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の
産生用に考えられた１種以上のベクターに移される。こ
のようなベクターとしては格別限定されず、ｐＢＲ３２
２、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４（市販）、ｐＧＥＭ３zf
（＋）及びｐＧＥＭ５zf（＋）〔プロメガ（Promega)〕
がある。ｄｓＤＮＡの制限地図作成は当業者に公知の操
作により様々な市販制限酵素で行われ、結果はカンジダ
−アルビカンスＤＮＡのゲノム制限地図と比較される。
ゲノム地図は酵素を産生しうるカンジダ・アルビカンス
から染色体ＤＮＡを抽出することにより作成される。こ
のような真菌としては格別限定されず、当業界で公知で
かつ容易に入手しうる株：カンジダアルビカンスＡＴＣ
Ｃ１０２６１、ＡＴＣＣ２２１１４及びＡＴＣＣ４４９
９０がある。染色体ＤＮＡは当業界で周知の方法により
抽出される（シャーマン、Ｆ．ら、１９８３年、酵母遺
伝学における方法、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク）。一部の染色体ＤＮＡはＥcoＲＩ、
ＨindIII、ＥcoＲＶ、ＣlaＩ及びＸhoＩのようないくつ
かの制限酵素で完全に切断される。必要であれば、一部
のＤＮＡ断片は２種以上の酵素で切断される。切断され
たＤＮＡ断片はゲル電気泳動により分離される。次いで
断片はニトロセルロース又はナイロン膜のような固体膜
支持体に移されるが、ナイロン膜が好ましい支持体であ
る。次いでナイロンブロットは放射線標識プローブとハ
イブリッド形成される。選択される放射性同位元素は32
Ｐである。ＤＮＡ断片はニックトランスレーション操作
〔リグビー（Rigby)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー、第１１３巻、第２３７−２５１頁、
１９７７年〕又はランダム・プライミング操作〔ファイ
ンバーグ（Feinberg) 及びフォーゲルスタイン（Vogels
tein) 、アナライティカル・バイオケミストリー、第１
３２巻、第６−１３頁、１９８３年〕のいずれかで放射
線標識されるが、ランダムプライミング操作が選択技術
である。ハイブリッド形成ブロットは好ましいプローブ
としてＳ．セレビシアエＰＭＡ１遺伝子からの約２kbＫ
pnＩの相同放射線標識断片と一夜インキュベートされる
（セラノら、ネーチャー、第３１９巻、６８９−６９３
頁、１９８６年）、翌日ブロットが当業界で公知の方法
により洗浄される〔マニアティス（Maniatis）ら、１９
８２年、分子クローニング：実験マニュアル（Molecula
r Cloning : A Laboratory Manual)、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー〕。次いでブロットはＸＡＲ−５フ
ィルムに露出され、常法で現像される〔ラスキー及びミ
ルズ、ＦＥＢＳレターズ、第８２巻、第３１４−３１６
頁、１９７７年（Laskey and Mills, FEBS Letters, ８
２：３１４−３１６（１９７７）〕。プローブとハイブ
リッド形成する切断された断片のサイズ及びパターンに
よりゲノム地図を作成できる。ゲノム地図とクローン化
配列の制限地図との比較で、望ましいゲノム配列を有す
るクローン化遺伝子の同一性を確認する。
【０００７】カンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰ
アーゼ遺伝子はサッカロミセス・セレビシアエＰＭＡ１
遺伝子のセクションと相同的にクローン化されるため、
それらのＤＮＡ配列が互いにある程度の相同性を有しか
つサッカロミセス配列がカンジダＤＮＡを配列決定する
ためのガイドとして機能するのは当然である。カンジダ
クローンにおける最大相同性領域は約２．０kbＥcoＲＶ
断片であり、それは最初の配列決定にとり好ましいセグ
メントである。この断片はプロメガから市販のプラミス
ドであるｐＧＥＭ５zf（＋）のようなインサートの塩基
配列を解明しうるベクターに組込まれてサブクローニン
グされる。二重鎖ＤＮＡはリム及びペニ、ジーン・アナ
ライティカル・テクノロジー、第５巻、第３２−３９
頁、１９８８年〔Lim and Pene, Gene Anal. Techn.,
５：３２−３９（１９８８）の方法により挿入プラスミ
ドの各々から製造される。当業界で公知の二重鎖配列決
定操作は配列データを調べるために用いられる〔リム及
びペニ、ジーン・アナライティカル・テクノロジー、第
５巻、第３２−３９頁、１９８８年；ＵＳバイオケミカ
ル社（US Biochemical Corp.) 製のシークエナーゼ（Se
quenase) キットプロトコール〕。様々なプライマーが
配列決定に使用能であるが、このベクターにおいて２．
０kb ＥcoＲＶカンジダ断片の上流及び下流に各々隣接
する市販Ｔ７及びＳＰ６プライマーが好ましい。そのプ
ライマーに近づけない領域と合成オリゴヌクレオチドプ
ライマーの使用により配列決定された。
アーゼ遺伝子はサッカロミセス・セレビシアエＰＭＡ１
遺伝子のセクションと相同的にクローン化されるため、
それらのＤＮＡ配列が互いにある程度の相同性を有しか
つサッカロミセス配列がカンジダＤＮＡを配列決定する
ためのガイドとして機能するのは当然である。カンジダ
クローンにおける最大相同性領域は約２．０kbＥcoＲＶ
断片であり、それは最初の配列決定にとり好ましいセグ
メントである。この断片はプロメガから市販のプラミス
ドであるｐＧＥＭ５zf（＋）のようなインサートの塩基
配列を解明しうるベクターに組込まれてサブクローニン
グされる。二重鎖ＤＮＡはリム及びペニ、ジーン・アナ
ライティカル・テクノロジー、第５巻、第３２−３９
頁、１９８８年〔Lim and Pene, Gene Anal. Techn.,
５：３２−３９（１９８８）の方法により挿入プラスミ
ドの各々から製造される。当業界で公知の二重鎖配列決
定操作は配列データを調べるために用いられる〔リム及
びペニ、ジーン・アナライティカル・テクノロジー、第
５巻、第３２−３９頁、１９８８年；ＵＳバイオケミカ
ル社（US Biochemical Corp.) 製のシークエナーゼ（Se
quenase) キットプロトコール〕。様々なプライマーが
配列決定に使用能であるが、このベクターにおいて２．
０kb ＥcoＲＶカンジダ断片の上流及び下流に各々隣接
する市販Ｔ７及びＳＰ６プライマーが好ましい。そのプ
ライマーに近づけない領域と合成オリゴヌクレオチドプ
ライマーの使用により配列決定された。
【０００８】クローン化カンジダ・アルビカンス細胞膜
Ｈ+ ＡＴＰアーゼのＤＮＡ配列は図２乃至図９で示され
ている。クローン化Ｃ．アルビカンスＤＮＡの全鎖長は
約２．７キロ塩基対であり、図２乃至図９で示されてい
る。選択された制限エンドヌクレアーゼの開裂部位はそ
の配列の上に記され、図１で示されている。Ｃ．アルビ
カンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ遺伝子に関して予想され
るアミノ酸配列は図２乃至図９においてＤＮＡ配列の下
に示されている。ＤＮＡ配列のＮ末端領域の分析によ
り、ヌクレオチド約１５１から始まるオープン読取り枠
を位置決定した。最初の約８９７アミノ酸の分析では、
このペプチドがサッカロミセス・セレビシアエＰＭＡ１
遺伝子と類似し、約７９４アミノ酸重複で約８４％の同
一率であることを示す。この分析では他の３種の真菌Ｐ
ＭＡ遺伝子とも高度の類似性を示し、即ち、Ｓ．セレビ
シアエＰＭＡ２と約８４７アミノ酸重複で約８４％の同
一率；Ｓ．ポンベＰＭＡ１と約７９４アミノ酸重複で約
７５％の同一率；及びＮ．クラッサＰＭＡ１遺伝子と約
８９０アミノ酸重複で約７６％の同一率を示す。Ｃ．ア
ルビカンスＨ+ ＡＴＰアーゼに関するヌクレオチド配列
には遺伝コードの縮重で示されるようにＨ+ＡＴＰアー
ゼに関する配列で適切なアミノ酸についてコードするす
べてのコドンを包含すると解釈されている。本発明では
生物学的に活性な酵素を生じるＨ+ ＡＴＰアーゼ塩基配
列のすべての正常な変異も含んでいる。更に、ＡＴＰア
ーゼのヌクレオチド配列にはＡＴＰアーゼの生物活性断
片についてコードする端部切欠遺伝子（truncated gene
s)を含む。相変形体とはカンジダ−アルビカンスＨ+ Ａ
ＴＰアーゼ遺伝子において変化したものに関する。ここ
で用いられる生物活性とは細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ活性
を示しうる組換え遺伝子産物の能力を含む。
Ｈ+ ＡＴＰアーゼのＤＮＡ配列は図２乃至図９で示され
ている。クローン化Ｃ．アルビカンスＤＮＡの全鎖長は
約２．７キロ塩基対であり、図２乃至図９で示されてい
る。選択された制限エンドヌクレアーゼの開裂部位はそ
の配列の上に記され、図１で示されている。Ｃ．アルビ
カンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ遺伝子に関して予想され
るアミノ酸配列は図２乃至図９においてＤＮＡ配列の下
に示されている。ＤＮＡ配列のＮ末端領域の分析によ
り、ヌクレオチド約１５１から始まるオープン読取り枠
を位置決定した。最初の約８９７アミノ酸の分析では、
このペプチドがサッカロミセス・セレビシアエＰＭＡ１
遺伝子と類似し、約７９４アミノ酸重複で約８４％の同
一率であることを示す。この分析では他の３種の真菌Ｐ
ＭＡ遺伝子とも高度の類似性を示し、即ち、Ｓ．セレビ
シアエＰＭＡ２と約８４７アミノ酸重複で約８４％の同
一率；Ｓ．ポンベＰＭＡ１と約７９４アミノ酸重複で約
７５％の同一率；及びＮ．クラッサＰＭＡ１遺伝子と約
８９０アミノ酸重複で約７６％の同一率を示す。Ｃ．ア
ルビカンスＨ+ ＡＴＰアーゼに関するヌクレオチド配列
には遺伝コードの縮重で示されるようにＨ+ＡＴＰアー
ゼに関する配列で適切なアミノ酸についてコードするす
べてのコドンを包含すると解釈されている。本発明では
生物学的に活性な酵素を生じるＨ+ ＡＴＰアーゼ塩基配
列のすべての正常な変異も含んでいる。更に、ＡＴＰア
ーゼのヌクレオチド配列にはＡＴＰアーゼの生物活性断
片についてコードする端部切欠遺伝子（truncated gene
s)を含む。相変形体とはカンジダ−アルビカンスＨ+ Ａ
ＴＰアーゼ遺伝子において変化したものに関する。ここ
で用いられる生物活性とは細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ活性
を示しうる組換え遺伝子産物の能力を含む。
【０００９】精製された遺伝子は適切なベクターに組込
まれ、遺伝子産物を発現しうる宿主細胞を形質転換する
ために用いられる。宿主細胞としては格別限定されず、
細菌、真菌、藍藻類、植物細胞及び動物細胞がある。宿
主細胞としては細菌及び真菌があり、好ましい宿主細胞
は真菌である。最も好ましい真菌細胞としては格別限定
されず、サッカロミセス及びカンジダ属のものがある。
サッカロミセス・セレビシアエ及びカンジダ・アルビカ
ンスにカンジダ・アルビカンス遺伝子を組込むクローニ
ングは、カンジダ遺伝子をそれ自体のプロモーターから
又はクローニングベクター上のプロモーターから発現さ
せる適切なベクター中に特定のカンジダＤＮＡ断片を組
込んでサブクローニングすることにより最も容易に行わ
れる。プロモーターとは、実験遺伝子Ｃ．アルビカンス
Ｈ+ ＡＴＰアーゼの上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼ
をＤＮＡに結合させてＲＮＡ合成を開始し、実験遺伝子
からｍＲＮＡを産生させるＤＮＡ配列として定義され
る。強プロモーターとはｍＲＮＡ産生を高頻度で開始さ
せるものである。全コード領域を含んだ約１２kb Ｃla
Ｉカンジダ・アルビカンス細胞膜ＡＴＰアーゼ断片又は
より小さな断片は、ＬＥＵ２遺伝子のようなサッカロミ
セス用の選択マーカー及びサッカロミセス・セレビシア
エで低コピープラスミドとして複製しうるＣＥＮ１ＡＲ
Ｓを含んだｐＵＮ１００〔エレッジ及びデービス、ジー
ン、第７０巻、第３０３−３１２頁、１９８８年（Elle
dge and Davis, Gene,７０：３０３−３１２、１９８
８) 〕のようなプラスミドに組込んでサブクローニング
される。約１２kb ＣlaＩ断片は標準的技術を用いた制
限酵素ＣlaＩによる酵素切断で前記のようにそれを含ん
だプラスミドから得られる。カンジダ遺伝子は標準ゲル
電気泳動技術でベクター成分から分離され、マニアティ
スら、分子クローニング：実験マニュアル、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレー、コール
ド・スプリング・ハーバー、１９８２年で記載された方
法により精製される。ＣlaＩ断片は平滑末端化するため
Ｔ４ＤＮＡで処理される。受容体プラスミドｐＵＮ１０
０はＨindIIIで切断され、平滑末端化するためＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで処理される。ＣlaＩ／平滑断片はＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いてｐＵＮ１００に結合される。同
様の挿入はＬＥＵ２遺伝子のようなサッカロミセス用の
選択マーカー及びサッカロミセスで高コピー数を達成し
うる２μ配列を含んだプラスミドであるＹＥｐ１３又は
類似ベクターで行われる。平滑ＣlaＩ断片はＹＥｐ１３
上のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理ＨindIII部位に挿入さ
れる。得られたプラスミドはＲＳ−７２〔セラノら、カ
レント・ジェネティクス（Current Genetics) 、第１２
巻、第１０５−１１０頁、１９８７年〕のようなサッカ
ロミセス・セレビシアエ株又は他の適切なマーカー化酵
母株に組込んで形質転換させる。形質転換はシャーマン
ら、酵母遺伝学における方法、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリン
グ・ハーバー、ニューヨーク、１９８３年で記載された
スフェロプラスティング（spheroplasting) 法のような
標準的方法で行われる。
まれ、遺伝子産物を発現しうる宿主細胞を形質転換する
ために用いられる。宿主細胞としては格別限定されず、
細菌、真菌、藍藻類、植物細胞及び動物細胞がある。宿
主細胞としては細菌及び真菌があり、好ましい宿主細胞
は真菌である。最も好ましい真菌細胞としては格別限定
されず、サッカロミセス及びカンジダ属のものがある。
サッカロミセス・セレビシアエ及びカンジダ・アルビカ
ンスにカンジダ・アルビカンス遺伝子を組込むクローニ
ングは、カンジダ遺伝子をそれ自体のプロモーターから
又はクローニングベクター上のプロモーターから発現さ
せる適切なベクター中に特定のカンジダＤＮＡ断片を組
込んでサブクローニングすることにより最も容易に行わ
れる。プロモーターとは、実験遺伝子Ｃ．アルビカンス
Ｈ+ ＡＴＰアーゼの上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼ
をＤＮＡに結合させてＲＮＡ合成を開始し、実験遺伝子
からｍＲＮＡを産生させるＤＮＡ配列として定義され
る。強プロモーターとはｍＲＮＡ産生を高頻度で開始さ
せるものである。全コード領域を含んだ約１２kb Ｃla
Ｉカンジダ・アルビカンス細胞膜ＡＴＰアーゼ断片又は
より小さな断片は、ＬＥＵ２遺伝子のようなサッカロミ
セス用の選択マーカー及びサッカロミセス・セレビシア
エで低コピープラスミドとして複製しうるＣＥＮ１ＡＲ
Ｓを含んだｐＵＮ１００〔エレッジ及びデービス、ジー
ン、第７０巻、第３０３−３１２頁、１９８８年（Elle
dge and Davis, Gene,７０：３０３−３１２、１９８
８) 〕のようなプラスミドに組込んでサブクローニング
される。約１２kb ＣlaＩ断片は標準的技術を用いた制
限酵素ＣlaＩによる酵素切断で前記のようにそれを含ん
だプラスミドから得られる。カンジダ遺伝子は標準ゲル
電気泳動技術でベクター成分から分離され、マニアティ
スら、分子クローニング：実験マニュアル、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレー、コール
ド・スプリング・ハーバー、１９８２年で記載された方
法により精製される。ＣlaＩ断片は平滑末端化するため
Ｔ４ＤＮＡで処理される。受容体プラスミドｐＵＮ１０
０はＨindIIIで切断され、平滑末端化するためＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで処理される。ＣlaＩ／平滑断片はＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いてｐＵＮ１００に結合される。同
様の挿入はＬＥＵ２遺伝子のようなサッカロミセス用の
選択マーカー及びサッカロミセスで高コピー数を達成し
うる２μ配列を含んだプラスミドであるＹＥｐ１３又は
類似ベクターで行われる。平滑ＣlaＩ断片はＹＥｐ１３
上のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理ＨindIII部位に挿入さ
れる。得られたプラスミドはＲＳ−７２〔セラノら、カ
レント・ジェネティクス（Current Genetics) 、第１２
巻、第１０５−１１０頁、１９８７年〕のようなサッカ
ロミセス・セレビシアエ株又は他の適切なマーカー化酵
母株に組込んで形質転換させる。形質転換はシャーマン
ら、酵母遺伝学における方法、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリン
グ・ハーバー、ニューヨーク、１９８３年で記載された
スフェロプラスティング（spheroplasting) 法のような
標準的方法で行われる。
【００１０】カンジダ細胞膜ＡＴＰアーゼ遺伝子の配列
分析及び制限地図作成では、その遺伝子が６kb ＳnaＢ
１断片に完全に含まれていることを示す。ｐＲＣ２３１
２はセラノら、モレキュラー・アンド・ゼネラル・ジェ
ネティクス、第２２１巻、第２１０−２１８頁、１９９
０年で記載されたプラスミドから誘導されるプラスミド
である。それはカンジダ選択マーカーＵＲＡ３を有しか
つゲノム当たり２〜３のコピーを産生するカンジダＡＲ
Ｓを有する。カンジダにおいて高コピー数を産生しうる
他のＡＲＳベクターは当業界で公知である。６kb Ｓna
Ｂ１断片は標準的技術を用いた制限酵素ＳnaＢ１による
酵素切断でそれを含むプラスミドから得られる。ベクタ
ーから離した断片は標準ゲル電気泳動技術で得られ、前
記及び実施例中の方法で精製される。断片はＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いｐＲＣ２３１２のＳmaＩ部位に組込んで
サブクローニングされる。制限酵素ＳnaＢ１及びＳmaＩ
の双方が平滑末端化するため、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
処理は不要である。得られたｐＪＡＭ３０と命名される
プラスミドはカンジダ・アルビカンス株１００６〔ゴシ
ャーン（Goshorn)ら、ジェネティクス、第１２３巻、第
６６７−６７３頁、１９８９年〕のような適切にマーカ
ー化された株を形質転換するために用いられる。形質転
換はクルツ、カンジダの遺伝学、ＣＲＣプレス、第２１
−７３頁、１９９０年の酢酸リチウム法で行われる。
分析及び制限地図作成では、その遺伝子が６kb ＳnaＢ
１断片に完全に含まれていることを示す。ｐＲＣ２３１
２はセラノら、モレキュラー・アンド・ゼネラル・ジェ
ネティクス、第２２１巻、第２１０−２１８頁、１９９
０年で記載されたプラスミドから誘導されるプラスミド
である。それはカンジダ選択マーカーＵＲＡ３を有しか
つゲノム当たり２〜３のコピーを産生するカンジダＡＲ
Ｓを有する。カンジダにおいて高コピー数を産生しうる
他のＡＲＳベクターは当業界で公知である。６kb Ｓna
Ｂ１断片は標準的技術を用いた制限酵素ＳnaＢ１による
酵素切断でそれを含むプラスミドから得られる。ベクタ
ーから離した断片は標準ゲル電気泳動技術で得られ、前
記及び実施例中の方法で精製される。断片はＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いｐＲＣ２３１２のＳmaＩ部位に組込んで
サブクローニングされる。制限酵素ＳnaＢ１及びＳmaＩ
の双方が平滑末端化するため、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
処理は不要である。得られたｐＪＡＭ３０と命名される
プラスミドはカンジダ・アルビカンス株１００６〔ゴシ
ャーン（Goshorn)ら、ジェネティクス、第１２３巻、第
６６７−６７３頁、１９８９年〕のような適切にマーカ
ー化された株を形質転換するために用いられる。形質転
換はクルツ、カンジダの遺伝学、ＣＲＣプレス、第２１
−７３頁、１９９０年の酢酸リチウム法で行われる。
【００１１】下記実施例は本発明を説明するが、但し、
それを制限するものではなく、本発明の修正は当業者に
とって明らかであろう。
それを制限するものではなく、本発明の修正は当業者に
とって明らかであろう。
【００１２】実施例１カンジダ・アルビカンス細胞膜ＡＴＰアーゼ遺伝子のク
ローニング 単一大コロニーのカンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０
２６１を寒天（１．５％）で固化されたＹＥＰＤ（１％
酵母エキス、１％ペプトン及び２％グルコース）含有培
養プレートから単離し、ＹＥＰＤブロス１００mlに接種
するために用いた。３０℃で１６時間インキュベート
後、細胞を集め、染色体ＤＮＡをシャーマン、Ｆら、酵
母遺伝学における方法、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー・プレスコールド・スプリング・ハー
バー、ニューヨーク、１９８３年の方法で抽出した。一
部の染色体ＤＮＡ（３μｇ）は製造業者により勧められ
る条件を用いてＥcoＲＩ、ＨindIII、ＥcoＲＶ、ＣlaＩ
及びＸhoＩのようないくつかの制限酵素で完全に切断し
た。切断されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に
より分離して別々のバンドを得たが、そのサイズは市販
分子サイズ標準との比較により評価できる。次いで断片
をサザン・ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー、第９８巻、第５０３−５１７頁、１９７５年〔So
uthern, J. Mol. Biol.,９８：５０３−５１７（１９７
５) 〕のプロセスでジーン・スクリーン（Gene Screen)
ナイロン膜〔ニュー・イングランド・ヌクレア（New En
gland Nuclear)〕に移した。次いでナイロンブロット上
のＤＮＡ断片をファインバーグ及びフォーゲルスタイ
ン、アナライティカル・バイオケミストリー、第１３２
巻、第６−１３頁、１９８３年のランダムプライミング
操作により製造された32Ｐ放射性標識プローブとハイブ
リッド形成させた。
ローニング 単一大コロニーのカンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０
２６１を寒天（１．５％）で固化されたＹＥＰＤ（１％
酵母エキス、１％ペプトン及び２％グルコース）含有培
養プレートから単離し、ＹＥＰＤブロス１００mlに接種
するために用いた。３０℃で１６時間インキュベート
後、細胞を集め、染色体ＤＮＡをシャーマン、Ｆら、酵
母遺伝学における方法、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー・プレスコールド・スプリング・ハー
バー、ニューヨーク、１９８３年の方法で抽出した。一
部の染色体ＤＮＡ（３μｇ）は製造業者により勧められ
る条件を用いてＥcoＲＩ、ＨindIII、ＥcoＲＶ、ＣlaＩ
及びＸhoＩのようないくつかの制限酵素で完全に切断し
た。切断されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に
より分離して別々のバンドを得たが、そのサイズは市販
分子サイズ標準との比較により評価できる。次いで断片
をサザン・ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー、第９８巻、第５０３−５１７頁、１９７５年〔So
uthern, J. Mol. Biol.,９８：５０３−５１７（１９７
５) 〕のプロセスでジーン・スクリーン（Gene Screen)
ナイロン膜〔ニュー・イングランド・ヌクレア（New En
gland Nuclear)〕に移した。次いでナイロンブロット上
のＤＮＡ断片をファインバーグ及びフォーゲルスタイ
ン、アナライティカル・バイオケミストリー、第１３２
巻、第６−１３頁、１９８３年のランダムプライミング
操作により製造された32Ｐ放射性標識プローブとハイブ
リッド形成させた。
【００１３】カンジダブロットをハイブリッド形成する
ために用いられたＤＮＡ断片は、ｐＵＣ１８ベクター中
にサッカロミセス・セレビシアエ細胞膜ＡＴＰアーゼ
（ＰＭＡ１）遺伝子（セラノら、ネーチャー、第３１９
巻、第６８９−６９３頁、１９８６年）を含んだプラス
ミドＢ１１３８から単離された２kb ＫpnＩ断片であっ
た。２０μｇのＢ１１３８を製造業者により勧められる
ようにＫpnＩで切断した。切断されたプラスミドを低ゲ
ル化温度アガロース上の電気泳動で分離した。２kbバン
ドをゲルから切出し、ＤＮＡをマニアティスら、前掲で
記載された操作により抽出した。ブロットを２kb Ｋpn
Ｉ放射線標識断片と一夜かけてハイブリッド形成させ
た。翌日ブロットをマニアティスら、分子クローニン
グ：実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハー
バー、１９８２年により記載された方法で洗浄した。次
いでブロットをＸＡＲ−５フィルムに露出させ、常法に
より現像した（ラスキー及びミルズ、ＦＥＢＳレター
ズ、第８２巻、第３１４−３１６頁、１９７７年）。プ
ローブはサッカロミセスＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ
の選択断片とハイブリッド形成した。カンジダＤＮＡが
ＥcoＲＩで切断された場合には、９．４kb及び３．４kb
バンドが生じた。ＨindIIIが用いられた場合には、７．
１kb及び３．６kbバンドが観察された。ＥcoＲＶの場合
には、５．０及び１．９kbバンドが生じた。ＣlaＩによ
る開裂で単一の１３kbバンドを得た。ＸhoＩはカンジダ
ＤＮＡを切断しない。染色体ＤＮＡをＨindIII及びＥｃ
ｏＲＩの双方で切断した場合には、３．６及び３．４kb
断片がプローブとハイブリッド形成する。ＨindIII／Ｅ
coＲＶの場合には、３．３及び１．１kbバンドが生じ
た。ＥcoＲＩ／ＥcoＲＶを用いた場合には、３．０５、
１．０及び０．７kbバンドが観察された。これらの観察
から、Ｓ．セレビシアエと相同的な染色体ＤＮＡの制限
地図を作成した。そのブロットは、カンジダ・アルビカ
ンスＤＮＡがＰＭＡ１遺伝子からのサッカロミセス・セ
レビシアエ２kb ＫpnＩ断片と相同的であることを示
す。
ために用いられたＤＮＡ断片は、ｐＵＣ１８ベクター中
にサッカロミセス・セレビシアエ細胞膜ＡＴＰアーゼ
（ＰＭＡ１）遺伝子（セラノら、ネーチャー、第３１９
巻、第６８９−６９３頁、１９８６年）を含んだプラス
ミドＢ１１３８から単離された２kb ＫpnＩ断片であっ
た。２０μｇのＢ１１３８を製造業者により勧められる
ようにＫpnＩで切断した。切断されたプラスミドを低ゲ
ル化温度アガロース上の電気泳動で分離した。２kbバン
ドをゲルから切出し、ＤＮＡをマニアティスら、前掲で
記載された操作により抽出した。ブロットを２kb Ｋpn
Ｉ放射線標識断片と一夜かけてハイブリッド形成させ
た。翌日ブロットをマニアティスら、分子クローニン
グ：実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハー
バー、１９８２年により記載された方法で洗浄した。次
いでブロットをＸＡＲ−５フィルムに露出させ、常法に
より現像した（ラスキー及びミルズ、ＦＥＢＳレター
ズ、第８２巻、第３１４−３１６頁、１９７７年）。プ
ローブはサッカロミセスＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ
の選択断片とハイブリッド形成した。カンジダＤＮＡが
ＥcoＲＩで切断された場合には、９．４kb及び３．４kb
バンドが生じた。ＨindIIIが用いられた場合には、７．
１kb及び３．６kbバンドが観察された。ＥcoＲＶの場合
には、５．０及び１．９kbバンドが生じた。ＣlaＩによ
る開裂で単一の１３kbバンドを得た。ＸhoＩはカンジダ
ＤＮＡを切断しない。染色体ＤＮＡをＨindIII及びＥｃ
ｏＲＩの双方で切断した場合には、３．６及び３．４kb
断片がプローブとハイブリッド形成する。ＨindIII／Ｅ
coＲＶの場合には、３．３及び１．１kbバンドが生じ
た。ＥcoＲＩ／ＥcoＲＶを用いた場合には、３．０５、
１．０及び０．７kbバンドが観察された。これらの観察
から、Ｓ．セレビシアエと相同的な染色体ＤＮＡの制限
地図を作成した。そのブロットは、カンジダ・アルビカ
ンスＤＮＡがＰＭＡ１遺伝子からのサッカロミセス・セ
レビシアエ２kb ＫpnＩ断片と相同的であることを示
す。
【００１４】カンジダ・アルビカンスゲノムＤＮＡのラ
イブラリーをＣ．アルビカンスＷＯ−１株から単離され
たＢamＨＩ−ＨindIII切断ＤＮＡから作成し、マギー
ら、アナライティカル・バイオケミストリー、第１７５
巻、第３６１−３７２頁、１９８８年で記載されるよう
にｐＥＭＢＬＹ−２３のＢamＨＩ−ＨindII 切断ＤＮＡ
に挿入した。ｐＥＭＢＬＹ−２３ベクターはバルダリ及
びセサレニ、ジーン、第３５巻、第２７−３２頁、１９
８５年〔Baldari and Cesareni, Gene, ３５：２７−３
２（１９８５）〕で記載されていた。形質転換された細
胞のライブラリーをアンピシリン５０μｇ／mlで補充さ
れたＬＢプレート上で増殖させた。２０個のプレートを
プレート当り全部でコロニー２３０以下又はコロニー４
７００以下の密度で調製した。コロニーをＮＥＮコロニ
ー／プラーク・スクリーン（ＮＥＮColony/Plaque Scre
en)（ニュー・イングランド・ヌクレア）に移した。移
転されたコロニーのＤＮＡを０．５Ｎ ＮａＯＨで変性
し、pH７．５の１．０ＭトリスＨＣｌで中和した〔グラ
ンスタイン（Grunstein)及びホグネス（Hogness)、１９
７５年、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス、第７２巻、第３９６１−３９
６５頁〕。二重フィルターを作製し、 ２kbＫpnＩサッ
カロミセス・セレビシアエＰＭＡ１断片と一夜かけてハ
イブリッド形成させた。翌朝フィルターを標準的方法で
洗浄し、ＸＡＲ−５フィルムに露出させた。二重フィル
ター上で２kb ＫpnＩプローブとハイブリッド形成した
ＤＮＡを含有していたコロニーは５つであった。これら
５つのコロニーの精製後、１−１０と記された１つのみ
のコロニーがサッカロミセス２kbＫpnＩ断片とハイブリ
ッドさせた場合に再現的に陽性であった。１−１０のＤ
ＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＶ、ＥcoＲＩ及び
ＨindIIIで切断し、染色体ＤＮＡから得られる断片と比
較した場合に、相同性領域の一部が失われていることが
注目された。これはライブラリーがＨindIII−ＢamＨＩ
切断ＤＮＡから製造されたためであろうと考えられる。
７．０kb ＨindIII断片、１．９kb ＥcoＲＶ断片及び
３．４kbＥcoＲＩ断片はクローン１−１０に存在しな
い。染色体カンジダＤＮＡで観察された０．７kb Ｅco
ＲＶ／ＥcoＲＩ断片はカンジダクローン１−１０でみら
れた。
イブラリーをＣ．アルビカンスＷＯ−１株から単離され
たＢamＨＩ−ＨindIII切断ＤＮＡから作成し、マギー
ら、アナライティカル・バイオケミストリー、第１７５
巻、第３６１−３７２頁、１９８８年で記載されるよう
にｐＥＭＢＬＹ−２３のＢamＨＩ−ＨindII 切断ＤＮＡ
に挿入した。ｐＥＭＢＬＹ−２３ベクターはバルダリ及
びセサレニ、ジーン、第３５巻、第２７−３２頁、１９
８５年〔Baldari and Cesareni, Gene, ３５：２７−３
２（１９８５）〕で記載されていた。形質転換された細
胞のライブラリーをアンピシリン５０μｇ／mlで補充さ
れたＬＢプレート上で増殖させた。２０個のプレートを
プレート当り全部でコロニー２３０以下又はコロニー４
７００以下の密度で調製した。コロニーをＮＥＮコロニ
ー／プラーク・スクリーン（ＮＥＮColony/Plaque Scre
en)（ニュー・イングランド・ヌクレア）に移した。移
転されたコロニーのＤＮＡを０．５Ｎ ＮａＯＨで変性
し、pH７．５の１．０ＭトリスＨＣｌで中和した〔グラ
ンスタイン（Grunstein)及びホグネス（Hogness)、１９
７５年、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス、第７２巻、第３９６１−３９
６５頁〕。二重フィルターを作製し、 ２kbＫpnＩサッ
カロミセス・セレビシアエＰＭＡ１断片と一夜かけてハ
イブリッド形成させた。翌朝フィルターを標準的方法で
洗浄し、ＸＡＲ−５フィルムに露出させた。二重フィル
ター上で２kb ＫpnＩプローブとハイブリッド形成した
ＤＮＡを含有していたコロニーは５つであった。これら
５つのコロニーの精製後、１−１０と記された１つのみ
のコロニーがサッカロミセス２kbＫpnＩ断片とハイブリ
ッドさせた場合に再現的に陽性であった。１−１０のＤ
ＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＶ、ＥcoＲＩ及び
ＨindIIIで切断し、染色体ＤＮＡから得られる断片と比
較した場合に、相同性領域の一部が失われていることが
注目された。これはライブラリーがＨindIII−ＢamＨＩ
切断ＤＮＡから製造されたためであろうと考えられる。
７．０kb ＨindIII断片、１．９kb ＥcoＲＶ断片及び
３．４kbＥcoＲＩ断片はクローン１−１０に存在しな
い。染色体カンジダＤＮＡで観察された０．７kb Ｅco
ＲＶ／ＥcoＲＩ断片はカンジダクローン１−１０でみら
れた。
【００１５】次いでカンジダ細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ遺
伝子に富むライブラリーをカンジダ及びサッカロミセス
プローブが約１２kbの単一ＣlaＩ断片とハイブリッド形
成するという観察に基づき作製した。Ｃ．アルビカンス
ＡＴＣＣ１０２６１染色体ＤＮＡの一部をＣlaＩで完全
に切断した。切断されたＤＮＡ断片をゲル電気泳動で分
離した。１０〜１５kb断片に富むＤＮＡフラクションを
電気泳動分離された切断ＤＮＡの適切なセグメントの電
気溶離により得た。集めた断片をＹＥｐ２４ベクターＤ
ＮＡに結合させた。ＹＥｐ２４ＤＮＡはニュー・イング
ランド・バイオラブス（New England Biolabs)から市販
され、ボトスタイン（Botstein) ら、ジーン、第８巻、
第１７−２４頁、１９７９年で記載されていた。結合前
にＹＥｐ２４ＤＮＡをＣlaＩによる完全切断で直鎖化
し、牛腸アルカリホスファターゼで処理した。結合産物
を大腸菌Ｋ−１２株ＤＨ５αに組込んで形質転換させ
た。ライブラリー有効ＤＨ５α細胞はベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ（BethesdaResearch Laboratories)
から得た。形質転換株をアンピシリン５０μｇ／ml含有
ＬＢプレート上で増殖しうるコロニーとして回収した。
形質転換株を集め、コロニー数／mlを調べるためアンピ
シリンプレート上に移した。ＣlaＩ−ＹＥｐ２４ライブ
ラリーの細胞力価を調べた後、アンピシリンで補充され
た２０個のＬＢプレートをプレート当たり全部でライブ
ラリー形質転換コロニー１５００〜２０００又はコロニ
ー３５，０００以下のコロニー密度にした。コロニーを
シュレイヒャー＆シュエル（Schleicher & Schuell) ニ
トロセルロースフィルターに移した。移転されたコロニ
ーを０．５Ｎ ＮａＯＨで処理してそれらのＤＮＡを変
性させ、pH７．５の１．０ＭトリスＨＣｌで中和した
（グランスタイン及びホグネス、プロシーディング・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、第７
２巻、第３９６１−３９６５頁、１９７５年）。二重フ
ィルターを作製し、カンジダクローン１−１０の０．７
kb ＥcoＲＶ／ＥcoＲＩ断片と一夜かけてハイブリッド
形成させた。翌朝フィルターを標準的方法で洗浄し、Ｘ
ＡＲ−５フィルムに露出させた。カンジダ０．７kb Ｅ
coＲＶ／ＥcoＲＩ断片とハイブリッド形成したＤＮＡを
含む１３のコロニーを回収したが、６つは精製した場合
に０．７kb ＥcoＲＶ／ＥcoＲＩ断片となおもハイブリ
ッド形成した。６つすべての推定コロニーは同様の制限
酵素パターンを有し、カンジダ染色体データから予想さ
れるすべてのバンドを有していた。図１は地図作成デー
タから予想される制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。
伝子に富むライブラリーをカンジダ及びサッカロミセス
プローブが約１２kbの単一ＣlaＩ断片とハイブリッド形
成するという観察に基づき作製した。Ｃ．アルビカンス
ＡＴＣＣ１０２６１染色体ＤＮＡの一部をＣlaＩで完全
に切断した。切断されたＤＮＡ断片をゲル電気泳動で分
離した。１０〜１５kb断片に富むＤＮＡフラクションを
電気泳動分離された切断ＤＮＡの適切なセグメントの電
気溶離により得た。集めた断片をＹＥｐ２４ベクターＤ
ＮＡに結合させた。ＹＥｐ２４ＤＮＡはニュー・イング
ランド・バイオラブス（New England Biolabs)から市販
され、ボトスタイン（Botstein) ら、ジーン、第８巻、
第１７−２４頁、１９７９年で記載されていた。結合前
にＹＥｐ２４ＤＮＡをＣlaＩによる完全切断で直鎖化
し、牛腸アルカリホスファターゼで処理した。結合産物
を大腸菌Ｋ−１２株ＤＨ５αに組込んで形質転換させ
た。ライブラリー有効ＤＨ５α細胞はベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ（BethesdaResearch Laboratories)
から得た。形質転換株をアンピシリン５０μｇ／ml含有
ＬＢプレート上で増殖しうるコロニーとして回収した。
形質転換株を集め、コロニー数／mlを調べるためアンピ
シリンプレート上に移した。ＣlaＩ−ＹＥｐ２４ライブ
ラリーの細胞力価を調べた後、アンピシリンで補充され
た２０個のＬＢプレートをプレート当たり全部でライブ
ラリー形質転換コロニー１５００〜２０００又はコロニ
ー３５，０００以下のコロニー密度にした。コロニーを
シュレイヒャー＆シュエル（Schleicher & Schuell) ニ
トロセルロースフィルターに移した。移転されたコロニ
ーを０．５Ｎ ＮａＯＨで処理してそれらのＤＮＡを変
性させ、pH７．５の１．０ＭトリスＨＣｌで中和した
（グランスタイン及びホグネス、プロシーディング・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、第７
２巻、第３９６１−３９６５頁、１９７５年）。二重フ
ィルターを作製し、カンジダクローン１−１０の０．７
kb ＥcoＲＶ／ＥcoＲＩ断片と一夜かけてハイブリッド
形成させた。翌朝フィルターを標準的方法で洗浄し、Ｘ
ＡＲ−５フィルムに露出させた。カンジダ０．７kb Ｅ
coＲＶ／ＥcoＲＩ断片とハイブリッド形成したＤＮＡを
含む１３のコロニーを回収したが、６つは精製した場合
に０．７kb ＥcoＲＶ／ＥcoＲＩ断片となおもハイブリ
ッド形成した。６つすべての推定コロニーは同様の制限
酵素パターンを有し、カンジダ染色体データから予想さ
れるすべてのバンドを有していた。図１は地図作成デー
タから予想される制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。
【００１６】実施例２カンジダ・アルビカンス細胞膜ＡＴＰアーゼＤＮＡの配
列決定 カンジダ・アルビカンス細胞膜ＡＴＰアーゼ（ＰＭＡ
１）遺伝子はサッカロミセス−セレビシアエＰＭＡ１遺
伝子と相同的にクローン化したため、それらのＤＮＡ配
列が互いに高度の相同性を有しかつサッカロミセス配列
がカンジダＤＮＡを配列決定するためのガイドとして機
能するのは当然である。カンジダクローンにおける最大
相同性領域は２．０kb ＥcoＲＶ断片であるため、それ
を最初に配列決定した。その断片をプロメガ市販のプラ
スミドであるｐＧＥＭ５zf（＋）のＥcoＲＶ部位に組込
んでサブクローニングした。二重鎖配列決定操作を行っ
た（リム及びペニ、１９８８年、ジーン・アナライティ
カル・テクノロジー、第５巻、第３２−３９頁；ＵＳバ
イオケミカル社製のシークエンナーゼキットプロトコー
ル）。Ｔ７及びＳＰ６プライマーは２．０kb ＥcoＲＶ
カンジダ断片の上流及び下流に各々隣接している。ＳＰ
６及びＴ７は市販のプライマー（プロメガ）であり、約
２５０塩基の配列を２．０kb断片中で形成させるために
用いた。プライマーに近づけない領域は合成オリゴヌク
レオチドプライマーの使用により配列決定した。クロー
ン化カンジダ・アルビカンス細胞膜ＡＴＰアーゼのＤＮ
Ａ配列は図２乃至図９で示されている。クローン化され
たＣ．アルビカンスＤＮＡの全鎖長は２６９１塩基対で
あると決定された。選択された制限エンドヌクレアーゼ
の開裂部位は配列上に示されている。細胞膜遺伝子に関
して予想される８９６アミノ酸は図２乃至図９において
ＤＮＡ配列の下に示されている。
列決定 カンジダ・アルビカンス細胞膜ＡＴＰアーゼ（ＰＭＡ
１）遺伝子はサッカロミセス−セレビシアエＰＭＡ１遺
伝子と相同的にクローン化したため、それらのＤＮＡ配
列が互いに高度の相同性を有しかつサッカロミセス配列
がカンジダＤＮＡを配列決定するためのガイドとして機
能するのは当然である。カンジダクローンにおける最大
相同性領域は２．０kb ＥcoＲＶ断片であるため、それ
を最初に配列決定した。その断片をプロメガ市販のプラ
スミドであるｐＧＥＭ５zf（＋）のＥcoＲＶ部位に組込
んでサブクローニングした。二重鎖配列決定操作を行っ
た（リム及びペニ、１９８８年、ジーン・アナライティ
カル・テクノロジー、第５巻、第３２−３９頁；ＵＳバ
イオケミカル社製のシークエンナーゼキットプロトコー
ル）。Ｔ７及びＳＰ６プライマーは２．０kb ＥcoＲＶ
カンジダ断片の上流及び下流に各々隣接している。ＳＰ
６及びＴ７は市販のプライマー（プロメガ）であり、約
２５０塩基の配列を２．０kb断片中で形成させるために
用いた。プライマーに近づけない領域は合成オリゴヌク
レオチドプライマーの使用により配列決定した。クロー
ン化カンジダ・アルビカンス細胞膜ＡＴＰアーゼのＤＮ
Ａ配列は図２乃至図９で示されている。クローン化され
たＣ．アルビカンスＤＮＡの全鎖長は２６９１塩基対で
あると決定された。選択された制限エンドヌクレアーゼ
の開裂部位は配列上に示されている。細胞膜遺伝子に関
して予想される８９６アミノ酸は図２乃至図９において
ＤＮＡ配列の下に示されている。
【００１７】
配列番号：１ 配列の長さ：２９３３ 配列の型：核酸 配列
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【００１８】配列番号：２ 配列の長さ：８９６ 配列の型：アミノ酸 配列
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【００１９】配列番号：３ 配列の長さ：２９３３ 配列の型：核酸 配列
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
図１はカンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼ
についてコードするＤＮＡを開裂しうる制限酵素で認識
される配列の位置を示した制限地図である。 図２乃至図９はエンドヌクレアーゼ制限部位の位置を含
めたカンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼに
関するヌクレオチド及びアミノ酸配列について示す。
についてコードするＤＮＡを開裂しうる制限酵素で認識
される配列の位置を示した制限地図である。 図２乃至図９はエンドヌクレアーゼ制限部位の位置を含
めたカンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼに
関するヌクレオチド及びアミノ酸配列について示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/56 Ｃ１２Ｒ 1:725） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジーン エー．マリナン アメリカ合衆国，08873 ニユージヤーシ イ，ソマーセツト，アヴエバリー プレイ ス 74
Claims (10)
- 【請求項１】 カンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴ
ＰアーゼについてコードするＤＮＡ配列から本質的にな
り、他のカンジダ・アルビカンスＤＮＡを含まない、精
製かつ単離されたＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 カンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴ
Ｐアーゼについてコードする下記ヌクレオチド配列： 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 及び生物学的に活性なカンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ
+ ＡＴＰアーゼを発現するいずれかの変形体からなる、
精製かつ単離されたＤＮＡ配列。 - 【請求項３】 請求項１記載のＤＮＡ配列を含むベクタ
ー。 - 【請求項４】 請求項２記載のＤＮＡ配列を含むベクタ
ー。 - 【請求項５】 カンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴ
ＰアーゼについてコードするＤＮＡ配列を含んだ請求項
３記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 - 【請求項６】 カンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴ
ＰアーゼについてコードするＤＮＡ配列を含んだ請求項
４記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 - 【請求項７】 請求項５記載の形質転換微生物宿主をカ
ンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼの発現に
適した条件下で培養し、カンジダ・アルビカンス細胞膜
Ｈ+ ＡＴＰアーゼを回収することからなる、カンジダ・
アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼの産生方法。 - 【請求項８】 請求項６記載の形質転換微生物宿主をカ
ンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼの発現に
適した条件下で培養し、カンジダ・アルビカンス細胞膜
Ｈ+ ＡＴＰアーゼを回収することからなる、カンジダ・
アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアーゼの産生方法。 - 【請求項９】 カンジダ・アルビカンスの全部又は生物
活性部分のアミノ酸配列に実質上相当するアミノ酸配列
からなる生物学的に活性で均一な純粋タンパク質。 - 【請求項１０】 少なくとも下記アミノ酸配列からなる
組換えカンジダ・アルビカンス細胞膜Ｈ+ ＡＴＰアー
ゼ： 【化６】 【化７】 【化８】 【化９】 及びその生物活性形。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55512390A | 1990-07-18 | 1990-07-18 | |
| US555123 | 1990-07-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0568567A true JPH0568567A (ja) | 1993-03-23 |
Family
ID=24216060
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17793391A Pending JPH0568567A (ja) | 1990-07-18 | 1991-07-18 | カンジダ・アルビカンス細胞膜（ｈ）ａｔｐアーゼについてコードする遺伝子 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0472286A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0568567A (ja) |
| CA (1) | CA2047028A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK0939830T3 (da) | 1996-09-06 | 2009-04-06 | Peter Ruhdal Jensen | Fremgangsmåde til forbedring af produktionen af et önsket produkt fra en celle |
| AU4858597A (en) * | 1996-10-30 | 1998-05-22 | National Research Council Of Canada | (candida albicans) proteins associated with virulence and hyphal formation and uses thereof |
-
1991
- 1991-07-15 CA CA 2047028 patent/CA2047028A1/en not_active Abandoned
- 1991-07-18 JP JP17793391A patent/JPH0568567A/ja active Pending
- 1991-07-18 EP EP91306542A patent/EP0472286A1/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J BIOL CHEM=1988 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0472286A1 (en) | 1992-02-26 |
| CA2047028A1 (en) | 1992-01-19 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 19941208 |