JPH0568569A - エンドチアペプシン前駆体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明はクリホネクトリア・パラシチカ中の
エンドチアペプシンの発現カセット、このカセットで形
質転換された株、この株を使用するエンドチアペプシン
の製造法および優性選択マーカーを欠く株の製法を提供
するものである。 【構成】 配列（Ｐ１）を有するエンドチアペプシンの
前駆体をコード化する配列の上流に機能的プロモーター
を含むことを特徴とする、クリホネクトリア・パラシチ
カ中エンドチアペプシン前駆体の発現のためのカセッ
ト。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はクリホネクトリア・パラ
シチカ(Ｃryphonectria parasitica)中のエンドチアペ
シン発現カセット、このカセットで形質転換された菌種
の株、この株を使用するエンドチアペプシンの製造法お
よび優性選択マーカー（dominant selection marker）
を持たないような株の製法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】線状
真菌クリホネクトリア・パラシチカはエンドチア・パラ
シチカ(Ｅndothiaparasitica)としても知られ、子のう
菌類群に属し、天然にアスパラギン酸プロテアーゼ、す
なわち、エンドチアペプシンを分泌し、これはカゼイン
のミセルを特異的に加水分解して牛乳を凝乳にし得るも
のであり、ある種のチーズ、特に、エメンタル型の調理
されたチーズの製造に有用である。この酵素はその配列
が３３０個のアミノ酸であると、バーコルト Ｖ．ら、
ユーロピアンジャーナル・オブ・バイオケミストリー
(Ｅur．Ｊ．Ｂiochem)１６７巻３２７−３２８頁に記載
されており、キモシンに代替する。

【０００３】この酵素は最近、エンドチアペプシンの高
濃度発現により選択されたクリホネクトリア・パラシチ
カ種の発酵法により工業規模で生産されている。これら
のプロセスは欠点があり、特に大容量反応器が必須であ
るという欠点を有し、従って、単位バイオマス当りのエ
ンドチアペプシン量およびバイオマスの所与量について
の単位反応容器当りのエンドチアペプシン量が低いとい
う欠点を有する。従来の突然変異体／選択技術では単位
バイオマス当り生産されるエンドチアペプシン量を約３
０％だけ増加させるにすぎない。

【０００４】従って、過産生ファクターによりエンドチ
アペプシンを過産生するクリホネクトリア・パラシチカ
株を得る遺伝子工学技術が必要である。過産生ファクタ
ーはここでは、バイオマス同量当りの、非形質転換対照
株により生産されたエンドチアペプシンの量に対する過
産生性形質転換株により生産されたエンドチアペプシン
の量に対する比をいう。クリホネクトリア・パラシチカ
は線状真菌であり、子のう菌類中の他の線状真菌類、例
えばアスペルギルス菌、ノイロスポラ菌またはトリコデ
ルマ菌などの遺伝子とは対照的に、その遺伝子はほとん
ど知られていない。ごく最近、クリホネクトリアの最初
の形質転換体がチャーチルら、カレント・ジェネチクス
（Curr.Gen.）、１７巻２５−３１頁(１９９０年)に記載
された。この著者らはヒグロマイシン、ベノミルまたは
Ｇ４１８に対し耐性マーカーを有するプラスミドを用い
てクリホネクトリアの実験室株を形質転換した。遺伝子
工学による組換クリホネクトリアを用いて商品化された
蛋白質はこれまでのところない。

【０００５】最近、学会:アメリカ植物病理学会および
カナダ植物病理学会年会、１９９０年８月８日におい
て、Ｇ．Ｈ．チョワーらは−明らかに(その論文の刊行
要旨によれば)−エンドチアペプシンのコード化配列で
あり、８８個のアミノ酸およびＴＡＴＡボックスを含む
が、機能に必要な活性領域を含まないエンドチアペプシ
ンプロモーター部を含む推定プレプロ配列を提示してい
る。この遺伝子のＤＮＡフラグメントは、但し８９個の
アミノ酸のプレプロ配列を含むものが１９８９年に出願
人により配列化され、これはエンドチアペプシンの発現
が不可能であることが観察されている(下記セクション
１および６参照)。

【０００６】

【発明の構成】本発明はクリホネクトリア・パラシチカ
中のエンドチアペプシン前駆体の発現のための新規なカ
セットであり、エンドチアペプシン前駆体のコード化配
列の上流に機能的プロモーターを含むことを特徴とする
ものであり、エンドチアペプシンは下記の配列(Ｐ１):

【化７】 を有する。

【０００７】エンドチアペプシン前駆体発現用のカセッ
トはここでは、転写および翻訳されるべきクリホネクト
リア中のコード化配列を特徴づける符号によってフラン
クされたこの前駆体をコードする配列を含む。エンドチ
アペプシン前駆体は１または２個の成熟工程を経て培養
地中にエンドチアペプシンを分泌し、産生し得る蛋白質
を意味する。

【０００８】エンドチアペプシンの天然前駆体はプレプ
ロエンドチアペプシンといい、下記の配列(Ｐ４)を有し
ているものを用いるのが好ましい。

【化８】

【０００９】子牛キモシン(ホルトマン、メソッド・イ
ン・エンチモロジー(Ｍethods inＥnzymol．)、１９巻
４２１−４２３頁(１９７０年)、ブタペプシノーゲン
(ジェームスおよびシーレキ、ネイチュア(Ｎaturer)、
３１９巻３３−３８頁(１９８６年)およびサッカロミセ
ス・セレビシアエ(Ｓ．cerevisiae)プロテアーゼＡ(ウ
ールホルドら、モルキュラー・アンド・セルラー・バイ
オロジイ(Ｍol．Ｃell．Ｂiol．)６巻２５００−２５１
０頁(１９８６年)などの他の公知のアスパラギン酸プロ
テアーゼから類推して、エンドチアペプシンの天然の前
駆体は不活性分泌型でプロエンドチアペプシンといい、
これは自己消化によりエンドチアペプシンに成熟する。

【００１０】遺伝子コードの縮重の結果、配列Ｐ４が上
記配列に対応している蛋白質をコードする多数のＤＮＡ
配列が存在する。これらのうち、適切な配列は下記の配
列(Ｎ４a)を含む。

【化９】

【００１１】エンドチアペプシン前駆体をコード化する
配列は少くとも１個のイントロンにより遮断されている
のが好ましい。事実、遺伝子のコード化部分中のイント
ロンの存在はある種の場合に、遺伝子の発現を増大させ
る(例えば、Ｊ．カリスらの研究、ジーンズ・アンド・
デベロップメント（Genes and Development）、１巻１
１８３−１２００頁参照)。

【００１２】従って、エンドチアペプシンをコード化す
る有利な配列は少くとも１個のイントロンによって遮断
された配列(Ｎ４a)を含む。この型の特に価値の高い配
列は下記の配列(Ｎ４b)を含むものである。

【化１０】

【００１３】機能的なプロモーターはここでは、エンド
チアペプシン前駆体をコードする配列の転写をクリホネ
クトリア・パラシチカ中に生じさせうる、構造性または
調節可能なプロモーターを意味する。このプロモーター
は、ＡＴに富む領域中に位置するＴＡＴＡ要素、この要
素の下流の転写開始領域、ＴＡ要素の上流に、上流活性
化配列 ＵＡＳ、または調整蛋白の作用によってプロモ
ーターの長さを調節する上流抑制配列ＵＲＳを含む。プ
ロモーターとしエンドチアペプシンのＤＮＡ配列の機能
性を測定するために、セクション１１に記載された方法
を便宜的に用いた。これは、この蛋白質の構造遺伝子の
突然変異によりエンドチアペプシンの産生を欠いている
クリホネクトリア・パラシチカを、試験配列および選択
マーカーで形質転換し、形質転換体の中からエンドチア
ペプシンの生産するものを、セクション７に記載のカゼ
イン含有寒天培地上選択試験を用いて識別することから
なる。

【００１４】価値あるプロモーターはエンドチアペプシ
ンをコードする遺伝子のプロモーターまたはこのプロモ
ーターの機能的部分である。当該部分は、例えば、下記
の配列(Ｎ５):

【化１１】 を含むＴＡＴＡボックスを有する部分であり、配列(Ｎ
５)の上流に、フラグメントＡの５'−末端およびフラグ
メントＣの５'−末端に接しているフラグメントＣのセ
グメントＸを含み、このセグメントＸは活性化領域を含
むように選択されている。フラグメントＣは１９９０年
８月３１日にＣＮＣＭに寄託番号Ｉ−９９８のもとで寄
託されたエシェリヒア・コリ(Ｅ．Ｃoli)株中に含まれ
るクリホネクトリア・パラシチカのゲノムＤＮＡの一部
である。その制限地図およびフラグメントＣ中に含まれ
るフラグメントＡの制限地図を第４図に示した。フラグ
メントＡのヌクレオチド配列はプレプロエンドチアペプ
シンをコードしたクリホネクトリア・パラシチカのゲノ
ムＤＮＡを含むものであり、第２図に示した。この活性
化領域のより詳細な位置は、一連のフラグメントＣのセ
グメントを得る(例えば、エンドヌクレアーゼまたはエ
クソヌクレアーゼを用いて消化して調製される)ことに
行われ、フラグメントＣは、フラグメントＡの５'−末
端およびフラグメントＣの５'−末端に接しているフラ
グメントＣの種々の大きさの部分のセグメントによっ
て、５'−側でフランクされたフラグメントを含むもの
であり、上記の方法を用いて得られたプロモーターの機
能性を測定する。

【００１５】活性化領域を含むフラグメントＣのセグメ
ントＸの例は下記の配列のフラグメントである。

【化１２】

【００１６】プレプロエンドチアペプシンをコードする
遺伝子のプロモーターの機能的部分の例はフラグメント
ＣのＢgl ＩＩ−ＳcaＩおよびＢamＨＩ−ＳcaＩセグメ
ントである(第４図参照)。クリホネクトリア・パラシチ
カまたは子のう菌類に属する他の線状真菌中に発現する
ことが知られている他の遺伝子に由来するプロモータ
ー、例えば、チュワら、ヌクレイック・アシッド・リサ
ーチ(Ｎucleic Ａcid Ｒesearch)、１８巻１８頁(１
９９０年)、オックスフォード大学発行記載のクリホネ
クトリア・パラシチカのグリセルアルデヒド−３−ホス
ファートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のプロモ
ーターまたはムラネーら、モルキュラー・アンド・ジェ
ネラル・ジェネティクス(Ｍol．Ｇen．Ｇenet．)、１９
９巻３７−４５頁(１９８５年)記載のアスペルギルス・
ニデュランス(Ａspergillus nidulans)のグリセルアル
デヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子のプロモーターも有利に用い得る。

【００１７】発現カセットは好ましくは選択遺伝子を有
するベクターとの同時形質転換によってクリホネクトリ
ア・パラシチカ中に導入される。発現カセットはそれ自
体、好ましくは線状フラグメントの形態でベクターを有
する。発現カセットは染色体中に結合状態で維持される
のが好ましい。選択遺伝子を有するベクターは染色体中
組込によるか、または末端小粒配列型の配列を用いて染
色体外直線形態でのいずれかで維持する。胞子形成後、
選択マーカーを喪失した形質転換体を選択する。

【００１８】従って、本発明はまた、エンドチアペプシ
ン産生性クリホネクトリア・パラシチカ株に関するもの
であり、これは上記に定義されたカセットで形質転換さ
れており、非形質転換株と比較してエンドチアペプシン
を過産生、すなわち、非形質転換株より多量にエンドチ
アペプシンを分泌することを特徴とする。農産食品産業
でのこの株の利用については、この株が、例えば抗生物
質耐性遺伝子などの主要選マーカーを持たないことが有
利である。好ましくは宿主株は、通常の突然変異／選択
法の結果得られ、１９９０年８月３１日にＣＮＣＭに寄
託番号Ｉ−９９７のもとに寄託された株ＳＥＢＲ１０３
である。ついで、この形質転換株はＳＥＢＲ１０３と比
較して、エンドチアペプシンを、少くとも２倍の過産生
率で過産生することを認識すべきである。

【００１９】本発明はまた、エンドチアペプシンの製造
方法に関するものであり、上記で定義した株の培養工
程、蛋白質の分離および精製を含むことを特徴とする。
この方法は現在のエンドチアペプシン製造方法を有利に
代替するものである。

【００２０】本発明はまた、上記で定義したカセットで
形質転換され、優性選択マーカー（dominant selection
marker）を欠く、エンドチアペプシン過産生性クリホ
ネクトリア・パラシチカ株を得る方法であり、これは少
くとも１個の、請求項１−１２のいずれか１項記載のカ
セットと優性選択マーカーでの同時形質転換の工程、つ
いで有力な選択マーカーの除去を可能にする胞子形成に
よる精製工程を伴うサイクルを含むことを特徴とする。
この方法は少くとも２個のサイクルを含むのが好まし
い。

【００２１】本発明より理解するために下記に、実験結
果および結果の考察をセクションに分けて記載する。こ
れらのうち数セクションは、本発明を実施するために行
れた実験に関し、他は、本発明の具体的実施例に関する
ものであり、本発明の理解は詳細な説明により、自ら、
正確になされるであろう。下記の集合的技術の大部分
は、当業者には周知であり、サムブルックおよびマニア
チス、モルキュラー・クローニング(Ｍolecular cloni
ng):実験操作、１９８９年コールドスプリングハーバー
プレス刊、ニューヨーク(第２版)による論文中に詳細に
記載されている。第１図から１２を参照すれば以下の記
載はより理解できる。第１図はエンドチアペプシンのア
ミノ酸配列を示す。第２図はフラグメントＡのヌクレオ
チド配列、縦の線で示したセクション１０で用いたＢat
ＥＩＩ部位および翻訳アミノ酸配列を示す。第３図はプ
レプロエンドチアペプシンのアミノ酸配列を示す。第４
図はＢ、Ｈ、Ｐ、Ｓp、Ｃ、ＧおよびＳの文字で記号化
したフラグメントＣ、ＢamＨＩ、ＨindＩＩＩ、Ｐet
Ｉ、ＳphＩ、ＳacＩ、ＢglＩＩおよびＳcaＩ部位および
フラグメントＣ中に含まれるフラグメントＡ、Ｄ、Ｅお
よびＦを示す。第５図は下線を引いた３個のイントロン
により遮断されたプレプロエンドチアペプシンをコード
したゲノムＤＮＡ配列を示す。

【表１】 第７図はプラスミドp１６０のＰvuＩ−ＸhoＩ−ＢamＨ
Ｉ(１)およびＰvuＩ−ＯＲＩ−ＢamＨＩ(２)フラグメン
トがそれぞれプラスミドp１６３．１およびpＢＲ３２７
から由来し、プラスミドp１６０の小ＢamＨＩ(２)−Ｂa
mＨＩ(１)フラグメントが下記のフラグメント３であ
る、プラスミドp１６０の制限地図を示す。

【表２】 第１１図はプレプロエンドチアペプシンをコードする相
補的ＤＮＡ配列を示す。第１２図はフラグメントＦのＳ
phＩ−ＨindＩＩＩの配列を示す。

【００２２】セクション１：エンドチアペプシン前駆体
の暗号配列を含有するゲノムＤＮＡの約２.１kbフラグ
メントであるフラグメントＡの単離 １）ゲノムＤＮＡの調製 ＳＥＢＲ１０３と呼ぶ菌株をセントラル・ビューロー・
ボーア・シュメルカルチュレス（Centraal Bureau Voor
Schimellcultures）により種クリホネクトリア・パラ
シチカ（Cryphonectria parasitica）に属するものと同
定し、コレクシオン・ナシオナル・ド・キュルチュル・
ド・ミクロルガニスム（Collection Nationale de Cult
ure de Microorganismes(National Collection of Micr
oorganism Cultures)C.N.C.M.にNo.I-997のもとで寄託
した。予めクリホネクトリア・パラシチカ（Cryphonect
ria parasitica）株の菌糸移植体または分生子柄の懸濁
液を接種し、次いで室温および明るい所で４週間インキ
ュベートしておいた、寒天培地(培地Ｇ：その組成は後
記の表３に明示する)を入れたペトリ皿の表面から集め
たクリホネクトリア・パラシチカ（Cryphonectria para
sitica）株ＳＥＢＲ１０３の分生子柄から、１滴の分生
子柄の懸濁液をプレーティングすることによって寒天培
地(培地Ａ：その組成は後記の表１に示す)(２５ml)を入
れたペトリ皿の接種を行う。３０℃で３日間インキュベ
ートした後、得られた菌糸を液体培地(培地Ｂ：その組
成は後記の表２に示す)(１００ml)を入れた１Ｌフラス
コに接種する。２２０rpmで撹拌しながら２８℃で２４
時間インキュベートした後、培養ブロス(２５ml)を１Ｌ
フラスコ中の新鮮な培地Ｂ(２５０ml)の接種に用いる。
先に示した条件のもとでインキュベートした翌日に、全
培養ブロス(２５０ml)を５,０００ｇで５分間遠心す
る。このペレットを、１mＭ ＥＤＴＡ含有の０.１５Ｍ
酢酸ナトリウム溶液に懸濁させる。ホワットマン 3MM紙
で濾過して菌糸を回収し、液体窒素中で凍結させ、乳鉢
と乳棒によって粉末にする。

【００２３】菌糸粉末(１０g)を、４％ラウロイルサル
コシン ナトリウム塩を含有する０.１５Ｍ酢酸ナトリウ
ム溶液(pＨ５)(４０ml)に取る。室温で３０分間穏やか
に撹拌した後、塩化ナトリウムを０.１Ｍの最終濃度に
なるまで加える。室温で３０分間穏やかに撹拌した後、
イソアミルアルコール(２％ v／v)およびクロロホルム
(４９％ v／v)を含むフェノール溶液(４９％ v／v)でタ
ンパク質を抽出する。この混合液で３回抽出した後、イ
ソアミルアルコールを含むクロロホルム溶液(９６％ク
ロロホルム／４％イソアミルアルコール)で抽出を行
う。この溶液で２回抽出を行った後、水相に２容量のエ
タノールを加える。この２つの溶液を穏やかに反転混合
すると、沈澱したＤＮＡの繊維が現れる。この繊維をパ
スツールピペットで取り、エッペンドルフ管に入れる。
この管を１００ｇで５分間遠心する。このペレットを７
０％エタノール溶液で洗浄し、次いで真空下で乾燥す
る。このペレットを、組成が[１０mＭトリス-ＨＣl(pＨ
８)；１mＭ ＥＤＴＡ]である緩衝液(ＴＥ緩衝液と呼ぶ)
(１ml)に取る。

【００２４】 第１表 培地Ａの組成 グルコース(無水) ５０ g／Ｌ 大豆粉(Societe Industrielle des OleagineuxのSoyoptim) ２０ g／Ｌ 硝酸カルシウム ９ g／Ｌ 寒天(Difco Bacto-寒天) １５ g／Ｌ 塩溶液１(組成は以下に示す) ０.５ g／Ｌ pＨを調べ、１Ｎ ＨＣlまたは１Ｎ ＮaＯＨを用いて６.
０に調節する。 塩溶液１の組成 Ｈ₃ＢＯ₃ ３０ml ＭnＣl₂・４Ｈ₂Ｏ ７９ml ＺnＣl₂ ２００ml Ｎa₂ＭoＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ２０ml ＦeＣl₃(無水) ５０ml ＣuＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ２００ml 蒸留水(qs) ５００ml (この懸濁液は、１ヶ月以内は４℃で保存する)

【００２５】 第２表 培地Ｂの組成 グルコース １０ g／Ｌ チアミン ２ mg／Ｌ 塩溶液２(組成は以下に示す) ６２.５ml／Ｌ 酵母エキス(Difco) ２.５ g／Ｌ 麦芽エキス(Difco) ７.５ g／Ｌ pＨを調べ、１Ｎ ＨＣlまたは１Ｎ ＮaＯＨを用いて６.
０に調節する。１１０℃で３０分間滅菌する。 塩溶液２の組成 ＮＨ₄ＮＯ₃ ２４g／Ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄ １６g／Ｌ ＮaＨＳＯ₄ ４g／Ｌ ＫＣl ８g／Ｌ ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２g／Ｌ ＣaＣl₂ １g／Ｌ 塩溶液１(表１に示した組成) ８ml／Ｌ

【００２６】第３表 培地Ｇの組成 パートＡ 麦芽エキス ２０g 酵母エキス ２g 寒天 １６g 水 １Ｌ pＨ５.５に調節。 １２０℃で２０分間オートクレーブ処理。 パートＢ アスパラギン酸 １,０００mg ビオチン １０mg 水 １Ｌ パートＢを１／１０に希釈し、これを１mlの分画中に
０.２Ｍの濃度で濾過しながら分配し、−２０℃で保存
する。使用時には、４５℃に過冷したパートＡ(１Ｌ)に
希釈したパートＢ(１ml)を加え、次いでこの混合物をペ
トリ皿に分配する。

【００２７】２）プローブ１およびプローブ２の調製 これらプローブは合成オリゴヌクレオチドのプールであ
り、クリホネクトリア・パラシチカ（Ｃ.parasitica）
の培養培地中に放出される成熟エンドチアペプシンのア
ミノ酸配列内から選ばれた２つのペプチドの集合的な暗
号配列からなり、V.バクホルト[Eur.J.Biochem.,167,32
7-338 (1987)]が開示しており、第１図に示されてい
る。この配列内から選ばれたペプチド(ペプチド１およ
びペプチド２と呼び、それぞれがプローブ１およびプロ
ーブ２に対応する)は次の通りである： ペプチド１： Val-Asp-Gly-Gln-Thr ペプチド２： Gly-Phe-Trp-Glu-Trp-Thr 。 これらのペプチドにはこれらをコードするそれぞれ２５
６(４³×２²)および６４(４²×２²)のオリゴヌクレオチ
ドが対応しており、これを以下の式で示す：

【化１３】

【００２８】３）プローブ１およびプローブ２のラベル
化 ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラー
ゼ(ＴdＴ)(ストラタジーンから市販；照会：600 132)を
用いてプローブをラベルする。 「コバルト」反応緩衝液(IBI Inc.から１０倍濃度で供
給)：１.４Ｍカコジル酸カリウム(pＨ７.２)、３００m
Ｍジチオトレイトール、１μlのターミナル デオキシヌ
クレオチジルトランスフェラーゼ酵素(ストラタジー
ン)、および５０μＣiの³²Ｐラベルしたデオキシシチジ
ン三リン酸dＣＴＰに溶解したオリゴヌクレオチド混合
物(１００ng)を用いて反応を行う。反応は３７℃で１０
分間行い、次いで０.５Ｍ ＥＤＴＡ(１μl)の添加によ
って停止させる。生成物をフェノールで抽出し、混合物
をビオゲル P10ポリアクリルアミド カラム(Biorad：15
0-1050)で透析する。このようにして、放射ラベルした
プローブ１および放射ラベルしたプローブ２が得られ
る。

【００２９】４）クリホネクトリア・パラシチカ（Cryp
honectria parasitica）のゲノムＤＮＡの加水分解 上記(1)で得たゲノムＤＮＡを別々に次の制限酵素のそ
れぞれによる消化にかけた：EcoRI、HindIIIおよびBamH
I。それぞれの場合において、消化産物(１０μg)を０.
８％アガロースゲル上にスポットし、一連の放射ラベル
された大きさのマーカー(Amersham；照会：SJ5000)の存
在下で電気泳動にかけた。次いで、Maniatis(上記)に記
載されているサザーン・ブロッティングの名で当業者に
周知の方法に従って、ＤＮＡをニトロセルロースフィル
ター(Biorad；照会：162-0117)に移した。この操作を繰
返して２つのニトロセルロースフィルターを得、一方は
プローブ１との、他方はプローブ２とのハイブリダイゼ
ーション用とした。

【００３０】５）ハイブリダイゼーション 常法(マニアチスら；上記)に従って処理したそれぞれの
ニトロセルロースフィルターを初めに６Ｘ ＳＳＣ、１
０Ｘ デンハルトおよび１００μg／mlの超音波処理して
変性したサケ精子ＤＮＡ(SigmaD9156)を含むプレハイブ
リダイゼーション溶液において４２℃で数時間洗浄し、
次いでラベルしたプローブ１および２の一方の存在下、
上記と同じ溶液中および同じ条件下でインキュベートし
た。このハイブリダイゼーションを一晩進行させた。６
Ｘ ＳＳＣ溶液は２０Ｘ ＳＳＣ溶液の希釈によって得
た。２０Ｘ ＳＳＣ緩衝液の調製はマニアチス(上記)に
記載されている。簡単に説明すると、この緩衝液は１７
５.３g／ＬのＮaＣlと８８.２g／Ｌのクエン酸ナトリウ
ムを含み、数滴の１ＮＮaＯＨでpＨ７に調節されてい
る。１０Ｘ デンハルト溶液は、最終容量５００mlあた
りに１gのフィコール、１gのポリビニルピロリドンおよ
び１gのウシ血清アルブミンを含んでいる。ハイブリダ
イゼーションの後に、それぞれのフィルターを４２℃で
０.５ＳＳＣ含有の溶液中で個々に洗浄する。次いで、
このフィルターを写真フィルム(Kodak XAR5)に一晩暴露
する。現像したフィルムの分析により、酵素HindIIIを
用いて得た加水分解物の場合には、大きさが２.１kbよ
りもわずかに大きいフラグメントにほぼ対応する分子量
のバンドが放射ラベルプローブの両方とポジティブに反
応することがわかる。

【００３１】６）放射ラベルされたプローブ１および２
とハイブリダイズする約２.１kbのHindIII-HindIII Ｄ
ＮＡフラグメントのクローニング ａ）ゲノムＤＮＡライブラリーの調製 クリホネクトリア・パラシチカ（Cryphonectria parasi
tica） ＤＮＡ(１００μg)を酵素HindIIIで加水分解
し、そのフラグメントを０.８％アガロースゲルの電気
泳動で分離する。大きさが２.１kbよりもわずかに大き
いフラグメントに対応する領域を切り出し、シリカミル
ク(Geneclean Tm, Biorad P.O.Box 2284, LaJolla, Cal
ifornia 92038-2284)に吸着させることによってＤＮＡ
を精製する。これらのフラグメントを、HindIIIで加水
分解して脱ホスホリル化しておいたpＢＲ３２２(Biolab
s；照会：321)にファージＴ４ ＤＮＡリガーゼ(Gibco B
RL)を用いて連結する。コンピテントな細胞(即ち、形質
転換されうる細胞)(ＲＲＩ細胞；Gibco BRL；照会：520
-8261 SA)を、供給元の指示の通り連結溶液で形質転換
し、以下の第４表に明示した組成の寒天培地[ＬＢ寒天
培地と呼ぶ；マニアチス(上記)]にプレーティングす
る。得られたコロニーを集めたものがゲノムＤＮＡライ
ブラリーである。 第４表 ＬＢ寒天培地の組成 Bactoトリプトンカゼイン加水分解物(Difco) １０g／Ｌ Bacto酵母エキス(Difco) ５g／Ｌ ＮaＣl １０g／Ｌ ５Ｎ ＮaＯＨを用いてpＨ７.０に調節 Bacto寒天(Difco) １５g／Ｌ １２０℃で２０分間オートクレーブ処理。

【００３２】ｂ）放射ラベルされたプローブ１および２
とハイブリダイズするHindIII-HindIIIフラグメント(フ
ラグメントＡと呼ぶ)を担持するクローンの選択 形質転換の後に得られたコロニーをニトロセルロースフ
ィルター(Schleicherand Schull；照会：40117)上に吸
着させ、２つの他のニトロセルロースフィルター上に複
製する。第１系列のフィルターは放射ラベルしたプロー
ブ１とハイブリダイズさせ、第２系列のフィルターは放
射ラベルしたプローブ２とハイブリダイズさせる。プレ
ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよ
び洗浄の条件は、先に用いた条件と同じである(上記５
を参照)。両プローブとポジティブに反応したクローン
を精製する。これらクローンの１つのプラスミドＤＮＡ
を単離する。対応するプラスミドをｐ４７２と呼ぶ。こ
のプラスミドが２種類の放射ラベルしたプローブ１およ
び２のそれぞれとまさしくハイブリダイズすることをチ
ェックした後、このプラスミドに担持されている２.１k
bのHindIII-HindIIIフラグメントを単離し、Ｍ１３mp１
９(Pharmacia)にサブクローニングした。このフラグメ
ントをフラグメントＡと呼ぶ。このフラグメントをサイ
クロン法(IBI "Cyclone I Biosystem")で配列決定し
た。フラグメントＡのヌクレオチド配列を第２図に示す
が、この図には、Ｎo.１をフラグメントＡの５'末端の
ヌクレオチドに割り当てるために任意に選んだヌクレオ
チドの数、ならびに翻訳されるアミノ酸配列も示されて
いる。

【００３３】７）フラグメントＡの配列の説明(第２図
を参照) フラグメントＡは、Barkoltが開示しているように(第１
図参照)、培養培地に放出される成熟エンドチアペプシ
ンのペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列を
担持しており、これはヌクレオチド６９４で始まってヌ
クレオチド１８６１で終わり、ヌクレオチド８５０−９
３８および１２７９−１３６７に位置する２つのイント
ロンで遮断されている。ヌクレオチド６９４の上流には
オープン読み取り枠がヌクレオチド５６６まで続き、こ
こにイントロン末端に特徴的なシグナル：ＡＧが存在す
る。ヌクレオチド４６８−４６９には、イントロンの始
まりに特徴的なシグナル：ＧＴが存在する。イントロン
の始まりとエクソンの終わりにまたがる配列、即ちＡＡ
ＧＧＴＧＡＧＴが、Mount S.M.[Nucl.Ac.Res., 10,459-
472 (1982)]が開示しているスプライス部位の５'共通配
列と一致していることがわかるであろう。ヌクレオチド
４６８の上流には、少なくとも１個のＡＴＧを含む１個
のオープン読み取り枠(停止コドンによって遮断されて
いない)のみが存在する。この枠は３６５−３６７位に
ＡＴＧ[そのヌクレオチド環境は、M.Kozak(Nucl.Ac.Re
s., 12, p.2 (1984))と適合する]を、そして３２９−３
３１位にＡＴＧ(この読み取り枠は３０５−３０７位の
停止コドンＴＡＧで遮断されている)を含有している。
ウイスコンシン大学のソフトウエアＵ.Ｗ.Ｇ.Ｃ.Ｇ.：D
evereuxら[Nucl.Ac.Res., 12, 8711-8721-Option (198
4)]：G.vonHeijne[Nucl.Ac.Res., 14, 483-490 (1986)]
の方法によるシグナルペプチドの試験は、このオープン
読み取り枠において、プレヌクレオチド配列(ヌクレオ
チド３２９から始まる)と呼ぶ以下の配列を有する、シ
グナルペプチドをコードしている１個の配列を予想させ
た：

【化１４】 この配列は、プレペプチド配列と呼ぶ以下の配列の２０
アミノ酸シグナルペプチドをコードしている： Met Ser Ser Pro Leu Lys Asn Ala Leu Val Thr Ala Met Leu Ala Gly Gly Ala Leu Ser

【００３４】シグナルペプチドは当業者によって予想さ
れるものであるが、これは、エンドチアペプシンが分泌
型タンパク質であり、シグナルペプチドの存在を必要と
するためである。上記シグナルペプチドをコードしてい
る配列と成熟タンパク質をコードしている配列の間に
は、プロヌクレオチド配列(ヌクレオチド３８９から始
まる)と呼ぶ次のヌクレオチド配列が存在し：

【化１５】 この配列はプロペプチド配列と呼ぶ以下のペプチド配列
をコードしている：

【化１６】

【００３５】プロペプチド配列(３８９−６９３)も当業
者によって予想されるものであるが、これは、C.parasi
ticaに対して恐らくは毒性であるエンドチアペプシンを
それが外部培地に放出されるまで抑制する機能を有して
いるためである(放出の後にこの配列は切断される)。従
って、成熟エンドチアペプシンをコードしている配列の
上流には、以下のプレプロペプチド配列をコードしてい
る配列が存在する：

【化１７】

【００３６】３つのイントロンで遮断されたヌクレオチ
ド３２９(第２図)から始まってヌクレオチド１８６１
(第２図)で終わるヌクレオチド配列を第５図に示すが
(イントロンには下線を引いた)、上記のようにこれはプ
レプロエンドチアペプシンをコードしている(そのアミ
ノ酸配列は第３図に示す)。フラグメントＡは、さら
に、開始ＡＴＧコドン(３２９−３３１)の５'側に３２
８ヌクレオチドの配列およびＴＡＡ停止コドン(１８６
２−１８６４)の３'側に２７５ヌクレオチドの配列(こ
れはいくつかの可能性あるポリアデニル化部位を含む)
を含有する。フラグメントＡの開始ＡＴＧの５'側の部
分は、一方でメッセンジャーＲＮＡの非翻訳化５'末端
を、そして他方でこの末端の上流に真核生物のほとんど
のプロモーターに存在する共通配列である通常ＴＡＴＡ
ボックスと呼ばれるＴＡＴＡＡ配列(１８７−１９１)を
含有する[BallanceD.J.,Yeast,2,229-236 (1986)]。対
照的に、この部分は、例えばSaccharomyces[Guarente
L., all, 52, 303-305(1988)]およびNeurospora[Freder
ick G.D., Mol.Gen.Gent., 221, 148-154 (1990)]に存
在している通常は上流活性化配列(ＵＡＳ)または上流調
節配列(ＵＲＳ)と呼ばれる型の配列を含有していない。
従って、フラグメントＡのＴＡＴＡボックスの上流には
プロモーター活性化領域は存在していない。従って、こ
のプロモーターは、セクション６に示すように機能的で
はない。

【００３７】セクション２：エンドチアペプシン前駆体
の暗号配列を含むゲノムＤＮＡの約３２.６kbフラグメ
ントであるフラグメントＢの単離 １）クリホネクトリア・パラシチカＤＮＡの調製 クリホネクトリア・パラシチカＳＥＢＲ１０３のゲノム
ＤＮＡを、下記に要約したＢ．タルコ（大学論文：専門
分野生命科学、ボルドーＩＩ大学１６８９年１月６日口
頭試問）記載のプロトコルと同じプロトコルにより調製
した。 プロトプラストの調製 クリホネクトリア・パラシチカ株ＳＥＢＲ１０３培養ブ
ロス２５０ｍｌから生じた菌糸体をセクション１と同様
に調製し、ガーゼ上で濾過し、１ＭＭｇＳＯ₄５０ｍｌ
で濯いだ。３７℃にて３０分間インキュベートした後、
菌糸体を再びガーゼ上で濾過し、１ＭＭｇＳＯ₄２０ｍ
ｌに添加する。ついで、チチナーゼ（chitinases）およ
びβ−１，３−、β−１，６−、α−１，３−、および
α−１，４グルカナーゼ、およびその他のポリサッカリ
ダーゼからなるＣＡＹＬＡＳＥＣ３（ＣＡＹＬＡ社製）
からなる酵素混合物１０ｍｇ／ｌを含む１ＭＭｇＳＯ₄
２０ｍｌを添加し、得られた混合物を、緩やかに撹拌し
つつ３７℃にて１時間３０分インキュベートする。混合
物を濾過した後、濾液を３０００ｇにて１０分間遠心分
離し、得られたプロトプラストペレットを、０．８Ｍソ
ルビトール、１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
の組成のＳＴ緩衝液と称する緩衝液２０ｍｌ中に添加す
る。

【００３８】プロトプラストからゲノＤＮＡの抽出 さらに、３０００ｇにて１０分間遠心分離した後、プロ
トプラストペレットを融解緩衝液（１００ｍＭトリス−
ＨＣｌ ｐＨ９、３５ｍＭＥＤＴＡ ｐＨ８；４（重量
／容量）％ＳＤＳ；プロテイナーゼＫ（シグマ社製）６
００μｇ／ｍｌ）１４ｍｌに添加し、ついで、混合物を
５０℃にて１時間インキュベートする。１２０００ｇに
て１０分間遠心分離した後、上清容量を、１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌｐＨ８、１ｍＭＥＤＴＡおよび１９．５３ｇ
のＣｓＣｌの組成のＴＥ緩衝液で１５．５ｍｌに調製し
た。超遠心分離（縦型ローター中で５００００ｒｐｍに
て１６時間）後、勾配ごとに各フラクションに集め、こ
れらを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８、１ｍＭＥＤＴ
Ａの組成の緩衝液に対して透析し、０．８％アガロース
ゲル上で分析する。２６０ｎｍにおける吸収と２８０ｎ
ｍにおける吸収の分光比が１．８の範囲にあるものを維
持した。

【００３９】コスミッドライブラリーの構築 上記のフラクションのゲノムＤＮＡの約１０μｇを制限
酵素で部分消化を行い、Ｔ４リガーゼを用いて、コスミ
ッドｐＨＣ７９−ｕｒａ５、市販のコスミッドｐＨＣ７
９（ＢＲＬ社製、ホーン Ｂ．ら構築、ジーン（Gene）
１１巻２９１−２９８頁（１９８０年））のＥｃｏＲＩ
部位にｕｒａ５遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフ
ラグメント（ベケレットら、ジーン（Gene）３２巻４８
７−４９２頁（１９８０年））を挿入して構築したおよ
そ８−ｋｂのコスミッドベクター、このコスミッドｐＨ
Ｃ７９−ｕｒａ５はエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩであ
らかじめ直線化されており、アルカリホスファターゼで
脱燐酸されている（プロメガ参照ＣＩＰ−Ｍ２０４）、
に連結した。連結混合物はストラタジーン「ギガパック
プラス」キットを用いてファージ粒子中にパッケージン
グし、形質転換のためにエシェリキア・コリ（E.coli）
リセプター株ＬＥ３９２（ムレら、モルキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティクス（Mol.gen.Gene）１５
０巻５３頁（１９７７年））を用い、これは市場で入手
可能であり、ゲノフィトから販売されている。アンピシ
リン１００ｍｇ／ｌを補足したＬＢ寒天培地（第４表参
照）上にプレーティングした後、こうして得られた４５
００個のアンピシリン耐性クローンを、寒天を含まない
第４表記載の組成であるＬＢ液体培地を含むマイクロタ
イタープレート上で個々に継代培養し、−８０℃にて貯
蔵した。ライブラリー中の挿入物の大きさ平均は約３７
ｋｂであることを、任意に採取したおよそ１２個のクロ
ーンから抽出したコスミッドの消化によって示した。

【００４０】２）フラグメントＡとのハイブリッド形成
によるライブラリーのスクリーニング エンドチアペプシン構造遺伝子を含むフラグメントＡは
ハイブリッド形成のためのプローブとして使用した。最
初に、マイクロタイタープレート中に含まれるクローン
を、アンピシリンを添加したＬＢ寒天培地（第４表参
照）を含むペトリ皿中で継代培養し、ついで、ナイロン
膜（ハイボンドＮ⁺、アメルシャム）上に移した。つい
で、細菌を１．５ＭＮａＣｌおよび０．５ＭＮａＯＨを
含む溶液を用いて溶菌した。プロテイナーゼＫ（シグ
マ）の溶液で、３７℃にて３０分間処理し、フィルター
を２×ＳＳＣ（１７．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、くえん酸ナ
トリウム８．８２ｇ／ｌ、ｐＨ７）で洗浄し、４２℃に
て２０分間プレハイブリッド形成させた。フィルター
を、実施例１で分離しフラグメントＡと１夜、４２℃に
てハイブリッド形成させ、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（アメルシャム）で標識し、「Gene detection system」
ECL chemiluminescent probe kit(ＲＰＮ２１０１、Ame
rsham）に暴露させる。得られたハイブリダイゼーショ
ンシグナルを適当なフィルム上で可視化する。ライブラ
リーの４５００個のクローンのうち、２個のシグナルは
陽性シグナルであった。これらの２個のクローンは、以
下８Ｈ１２および４１Ｈ７と定義し、それぞれ、ｐ８Ｈ
１２およびｐ４１Ｈ７と称されるコスミッドを含んでお
り、アンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＬＢ液体培地上
で継代培養した。１夜３７℃にて培養後、コスミッドを
アルカリ性培地中溶菌法により抽出し、マニアチス、上
掲に記載の技法により、塩化セシウムおよび臭化エチジ
ウムとともに超遠心分離して精製した。かくして精製し
たコスミッドをＨｉｎｄＩＩＩ酵素にて消化し、得られ
たフラグメントを０．８％アガロースゲル上で電気泳動
にかけた。ナイロン膜上でサザンブロッティングを行
い、フィルターを、上記の技法を用いて、フラグメント
Ａとハイブリッド形成させた。コスミッドｐ８Ｈ１２お
よびｐ４１Ｈ７の各々におけるこのフラグメントの存在
をこれによって確認した。

【００４１】３）陽性コスミッドｐ８Ｈ１２各々ｐ４１
Ｈ７の物理的分析 酵素、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＳｆｉＩ、ＸｂａＩ、Ｂａ
ｍＨＩおよびＰｖｕＩを用いて得られたコスミッドｐ８
Ｈ１２およびｐ４１Ｈ７の制限プロフィールは一致し、
それによってクリホネクトリア・パラシチカのエンドチ
アペプシンをコードした遺伝子を含むゲノムＤＮＡの領
域はこれらの二つのクローンについて配列換えなしにク
ローンされている。コスミッドｐ８Ｈ１２の制限プロフ
ィール（このコスミッドは次ぎの検討で取り上げられて
いる）を第５表に示す。 第５表 コスミッドｐ８Ｈ１２の制限プロフィール 制限酵素 開裂部位数 ｋｂの寸法 合計（ｋｂ） ＮｏｔＩ １ 測定せず − ＳｍａＩ ２ 測定せず − ＳｆｉＩ ３ ２０；１６；４.１ ４０.１ ＸｂａＩ ４ ２３；１４；２.９；１.２ ４１.１ ＢａｍＨＩ ５ １５；９；７；７；２.６ ４０.６ ＰｖｕＩ ５ ２３；７.４；６.４；２.１；１.５ ４０.４ 平均 ４０.６ この表はコスミッドｐ８Ｈ１２の平均寸法が約４０.６
ｋｂであり、従って、ゲノム挿入物の寸法は、４０.６
−８.０＝３２.６であると計算することを可能にするも
のである。このゲノム挿入物をフラグメントＢという。

【００４２】さらに、ナイロン膜上のサザンブロッティ
ングにより、約９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグ
メント（第５表参照、以下、フラグメントＣという）
は、プローブとして用いたフラグメントＡとハイブリッ
ド形成する唯一のＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメント
であることが示された。従って、このフラグメントＣは
フラグメントＡを含む。

【００４３】セクション３:エンドチアペプシン前駆体
のコード配列を含むゲノムＤＮＡの約９−kbのフラグメ
ントである、フラグメントＣのクローニング １０μgのコスミドp８Ｈ１２をエンドヌクレアーゼＢam
ＨＩで消化し、種々のフラグメントを０．８％アガロー
スゲル上で分離した。フラグメントＣを含む酵素ＢamＨ
Ｉ消化産物を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(ギブゴＢＲＬ)を用
いて、ＢamＨＩ部位で開き脱リン酸化したプラスミドp
ＢＲ３２２に連結した(バイオラブズより市販−参照番
号３２０)。連結産物はエシェリキア・コリ(Ｅ．coli)
Ｋ１２ＲＲ１株(ギブゴＢＲＬ、参照番号５２０−８２
６１Ａ)のコンピテント細胞に形質転換するのに用い
た。形質転換混合物を、アンピシリン(１００μg／ml)
添加ＬＢ寒天培地を含むペトリ皿に置いた後、その皿を
３７℃で２４時間インキュベートし、コロニーをナイロ
ン膜上に写す;細菌は溶菌し、膜はその後セクション
２．２)記載のとおりフラグメントＡでハイブリダイズ
する。フラグメントＡとハイブリダイズするＤＮＡを含
むコロニーが、それにより１８個検出された。これらの
ＤＮＡ含有プラスミドを抽出し、エンドヌクレアーゼＢ
amＨＩで消化した後０．８％アガロースゲルで分析し
た。従って、これらの全てのコロニーがpＢＲ３２２に
由来する、ＢamＨＩ部位に挿入された約９−kbのフラグ
メントを有するプラスミドを含有することが立証され
た。ＳＥＢＲ３１０４と称するクローンは、pＥp１と称
するプラスミドを含有し、次の研究のために選択され
た。クローンＳＥＢＲ３１０４は、Ｎo．Ｉ−９９８の
もとでＣＮＣＭに寄託した。

【００４４】プラスミドpＥp１は、酵素ＢamＨＩ、Ｈin
dＩＩＩ、ＰstＩ、ＳacＩ、ＳphＩ、ＢglＩＩおよびＳc
aＩを用いた単一および／または多重消化に供した。得
られた制限地図を第４図に示すが、記号Ｂ、Ｈ、Ｐ、Ｓ
p、Ｃ、ＧおよびＳは各々ＢamＨＩ、ＨindＩＩＩ、Ｐst
Ｉ、ＳphＩ、ＳacＩ、ＢglＩＩおよびＳcaＩを示し、
Ｃ．パラスチカ(Ｃ．parasitica)のエンドチアペプシン
遺伝子の開始コドンはiにより示し、矢印は、エンドチ
アペプシン遺伝子の転写の方向を指す。セクション２に
記載されたフラグメントＡ、並びにセクション４および
５に記載されたフラグメントＤ、ＥおよびＦもこの図に
示す。フラグメントＣの５'末端を形成するＢamＨＩ部
位(Ｂ)は、開始コドンから約４kbの所に位置し、５'側
のＢglＩＩ部位(Ｇ)は開始コドンから約３kbの所に位置
することは明白である。故に、フラグメントＤと称す
る、フラグメントＡ全部を含む約５．１−kbのＢglＩＩ
−ＢglＩＩフラグメントを単離し、クローニングするの
に優れているようである。これをフラグメントＤとい
い、おそらくエンドチアペプシン前駆体の発現に必要な
情報を含んでいる。

【００４５】セクション４:エンドチアペプシン前駆体
のコード配列を含有するゲノムＤＮＡの約５．２−kbの
フラグメントである、フラグメントＤのクローニング ２０μgのプラスミドpＥp１を酵素ＢglＩＩ(第４図参
照)で消化し、消化産物を０．８％低融点アガロース(シ
グマ−参照番号Ａ９４１４)ゲル上で分離した。臭化エ
チジウムでアガロースゲルを染色した後、約５．２−kb
のフラグメントＤを含有するアガロースバンドを、３１
０nmの紫外光の下で、外科用メスを用いて切除する。次
いでＤＮＡをＮＡＣＳ、５２ＰＲＥＰＡＣキットに指示
されるとおりに抽出する。およびその後１０mＭトリス
−塩酸pＨ８、１mＭ ＥＤＴＡから成るＴＥ緩衝液１０
μl中に希釈する;得られた懸濁液１μlは、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ(ギブゴＢＲＬ)を用いて、pＵＣ１２のポリリ
ンカーのＳmaＩ部位でＢglＩＩリンカーの挿入すること
により、プラスミドpＢＴ３から得られるプラスミドpＢ
Ｔ６に連結した。オルバッハＭ．Ｊ．ら、Ｍol．Ｃel
l．Ｂiol、６巻２４５２−２４６１頁(１９８６年)によ
り報告されているプラスミドpＢＴ３は、ベノミル抵抗
性(優性選択標識)を有するニューロスポロ・クラサ(Ｎe
urospora crassa)(線状子嚢菌類)のβ−チューブリン
の変異遺伝子を持っている。連結する前に、プラスミド
pＢＴ６をエンドヌクレアーゼＢglＩＩで直線状にし、
アルカリ性ホォスファターゼ(プロメガ、参照番号ＣＩ
Ｐ−Ｍ２０４)で脱リン酸化した。

【００４６】連結産物はエシェリキア・コリ(Ｅ．coli)
Ｋ１２ＲＲ１株(ギブゴＢＲＬ、参照番号５３０−８２
６１ＳＡ)のコンピテント細胞に形質転換するために用
いた。形質転換混合物を、アンピシリン(１００μg／m
l)添加ＬＢ寒天培地を含むペトリ皿に置いた後、その皿
を３７℃で２４時間インキュベートし、コロニーをナイ
ロン膜上に写した。細菌を溶菌し、その後膜をセクショ
ン２．２)記載のとおり、フラグメントＡでハイブリダ
イズする。それにより、フラグメントＡでハイブリダイ
ズするＤＮＡを含有するコロニーが２個検出された。そ
れらのプラスミドＤＮＡ内容物を抽出し、エンドヌクレ
アーゼＢglＩＩで消化した後、０．８％アガロースゲル
上で分析した。従って、これらの２個のコロニーが、Ｂ
glＩＩ部位で、両方に可能な方向性をもって挿入された
約５．２−kbのフラグメントＤを有するpＢＴ６に由来
するプラスミドを含有することが立証された。このプラ
スミドを含有するクローンは、プラスミドpＥp２と称
し、次の研究のために選択された。

【００４７】セクション５:エンドチアペプシン前駆体
のコード配列を含有するゲノムＤＮＡの約３．５−kbの
フラグメントである、フラグメントＦのクローニング クローニングは二段階で行った。最初に段階Ｆ全部を含
有する約３．７−kbのフラグメントＥを、ポリリンカー
のＳphＩ部位でプラスミドpＵＣ１８にクローン化し
た。それにより得られたプラスミドpＥp３はフラグメン
トＦを精製することができ、そのフラグメントは、今度
はポリリンカーのＢamＨＩＩ部位でプラスミドpＵＣ１
８にサブクローン化した。それによりプラスミドpＥp４
が得られた。

【００４８】１) プラスミドpＥp３の構築 １μgのプラスミドpＥp１を酵素ＳphＩ(第４図参照)で
消化し、次にＤＮＡを０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムお
よび２容のエタノールで精製した。それにより約３．７
−kbのＳphＩフラグメントが得られ、これをフラグメン
トＥと称した。次にＤＮＡを組成：１０mＭトリス塩酸p
Ｈ８、１mＭ ＥＤＴＡであるＴＥ緩衝液４０μlに溶解
し、その後Ｐ１０カラム(ファルマシア)で透析した。上
記で得られた混合物１μlは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(ギブ
ゴＢＲＬ)を用いて、前もってエンドヌクレアーゼＳph
Ｉで直線状にし、アルカリ性フォスファターゼ(プロメ
ガ、参照番号ＣＩＰ−Ｍ２０４)で脱リン酸化したプラ
スミドpＵＣ１８約２５ngと連結した。連結産物は、エ
シェリキア・コリ(Ｅ．coli)ＤＨ５α株(ギブゴＢＲ
Ｌ、参照番号５３０−８２６３ＳＡ)のコンピテント細
胞に形質転換するために用いた。形質転換混合物をアン
ピシリン(１００μg／ml)、Ｘ−ガル(４０μ／ml)およ
びＩＰＴＧ(２μg／ml)添加ＬＢ寒天培地を含むペトリ
皿に置いた後、その皿を３７℃で２４時間インキュベー
トし、３５０個の白色コロニーを同じ培地で：継代培養
した。次にコロニーをナイロン膜上に写し、その後細菌
を溶菌し、最終的に上述のセクション２．２)に記載し
たとおり膜をフラグメントＡでハイブリダイズした。そ
れによりフラグメントＡでハイブリダイズするＤＮＡを
含有するコロニーが３７個検出された。３０クローンの
プラスミドＤＮＡを抽出し、エンドヌクレアーゼＳphＩ
で消化した後０．８％アガロースゲルで分析した。Ｓph
Ｉ部位で(両方に可能な方向性をもって)挿入された３．
７−kbのフラグメントＥを有するpＵＣ１８に由来する
プラスミドを含有するコロニー２個が維持された。これ
らのプラスミドはpＥp３(a)およびpＥp３(b)と称した。
プラスミドpＥp３(b)では、フラグメントＥのＢglＩＩ
部位は、pＵＣ１８のポリリンカー上に位置するＢamＨ
Ｉ部位から約３．５−kb離れたところにある。

【００４９】２) プラスミドpＥp４の構築 １０μgのプラスミドpＥp３(b)を、エンドヌクレアーゼ
ＢglＩＩ、ＢamＨＩおよびＰvuＩによる３連続消化に供
し、消化産物を０．８％アガロースゲル上で分離した。
ゲルを臭化エチジウムで染色した後、pＵＣ１８のポリ
リンカーのＳphＩ−ＢamＨＩフラグメントを混入した、
フラグメントＥと称する約３．５−kbのＳphＩフラグメ
ントを含有するアガロースバンドを、３１０nmの紫外光
の下で外科用メスを用いて切除した。次にＤＮＡを抽出
し、その後組成：１０mＭトリス塩酸pＨ８、１mＭ Ｅ
ＤＴＡであるＴＥ緩衝液２０μlに溶解した。得られた
懸濁液５μlを、前もってエンドヌクレアーゼＢamＨＩ
で直線状にし、アルカリ性ホォスファターゼで脱リン酸
化したプラスミドpＵＣ１８約７５０ngに連結した。連
結産物は、上述の手順に従って、エシェリキア・コリ
(Ｅ．coli)ＤＨ５α株のコンピテント細胞に形質転換す
るのに用いた。３０個の白色コロニーのプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、エンドヌクレアーゼＢamＨＩ、ＢglＩＩま
たはＳmaＩで消化した後、０．８％アガロースゲルで分
析した。約３．５−kbのフラグメントＦを有するpＵＣ
１８に由来し、pＵＣ１８のポリリンカーのＳphＩ−Ｂa
mＨＩフラグメントを混入し、ＢamＨＩ部位で挿入され
たプラスミドを含有するコロニーを採用した。このプラ
スミドをpＥp４と称した。

【００５０】３) フラグメントＦのＳphＩ−ＨindＩＩ
Ｉセグメントの配列の決定 この配列は上述と同様に決定し(セクション１参照)第１
２図に示す。これにはプレプロエンドチアペプシンをコ
ード化する遺伝子のプロモーターを活性化する信号が含
まれ、セクション１０を示す。

【００５１】セクション６:Ｃ．パラスチカ(Ｃ．parasi
tica)の、フラグメントＡ、ＢおよびＣの１つを含有す
るベクターの各々による形質転換 プロトプラストの調製 セクション１記載のとおり調製したＣ．パラスチカ
(Ｃ．parasitica)ＳＥＢＲ１０３株の培養液２５０mlか
ら得られた菌糸体を、１Ｍ ＭgＳＯ₄５０mlですすぐ。
３７℃で３０分インキュベートした後、菌糸体をガーゼ
で濾過し１Ｍ ＭgＳＯ₄２０mlに採る。次に、シチナー
ゼおよびβ−１,３、β−１,６−、α−１,３−および
α−１,４−グルカナーゼ並びにその他のポリサッカリ
ダーゼから成る酵素混合物ケイラーゼＣ３(カンパニー
・ケイラ)１０mg／lを含有する１ＭＭgＳＯ₄２０mlを加
え、その結果得られた混合物を３７℃で１時間３０分お
だやかに攪拌しながらインキュベートする。混合物を濾
過した後、濾液を３０００gで１０分間遠心にかけ、得
られたプロトプラストのペレットを、ＳＴ緩衝液と称す
る０．８Ｍソルビトール、１００mＭトリス塩酸pＨ７．
５から成る緩衝液１５mlに採る。さらに３０００gで１
０分間遠心にかけた後、ペレットをＳＴＣ１０緩衝液と
称する０．８Ｍソルビトール、１００mＭトリス塩酸pＨ
７．５、１０mＭＣaＣl₂から成る緩衝液１０mlに採る。
３０００gで１０分間遠心にかけ、ペレットをＳＴＣ５
０緩衝液と称する０．８Ｍソルビトール、１００mＭト
リス塩酸pＨ７．５、５０mＭＣaＣl₂から成る緩衝液に
採った後、プロトプラストをマラセッツセルを用いて数
え、濃度が１０⁸／mlになるよう調整する。

【００５２】コスミドp８Ｈ１２およびプラスミドpＢＴ
３を用いたプロトプラストの同時形質転換 フラグメントＢ(セクション２参照)を含有するコスミド
p８Ｈ１２は、優性選択標識を持たない(直接選択に使用
可能)。プラスミドpＢＴ３は、オルバッハＭ．Ｊ．ら、
モル．セル．ビオール(Ｍol．Ｃell．Ｂiol)６巻２４５
２−２４６１頁に報告されているように、ベノミル抵抗
性(優性選択標識)を有するニューロスポラ・クラサ(線
状子嚢菌類)のβ−チューブリンの変異遺伝子を運び、
そのためコスミドp８Ｈ１２と組み合わせて使われた(同
時形質転換法:ウェルナーズＫ．ら、モレキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジェネティクス(Ｍolecular and
Ｇeneral Ｇenetics)２０９巻７１−７７頁(１９８７
年)のアルペルギルス・ニガー(Ａspergillus niger)の
同時形質転換に関する研究を参照)。

【００５３】上述のサンブロークに報告された技法に従
って、塩化カルシウムおよび臭化エチジウムを含有する
緩衝液中超遠心にかけて前もって精製したプラスミドp
ＢＴ３ １μg、並びに同じ方法で組成：１０mＭトリス
塩酸pＨ８、１mＭＥＤＴＡであるＴＥ緩衝液１０ml中で
精製したコスミドp８Ｈ１２ ４μgから成る混合物を、
上述のとおり調製されたプロトプラスト調製物１００ml
(１０⁷プロトプラストに相当)と一緒に０℃で２０分間
インキュベートする。６０％(重量／容量)ＰＥＧ４００
０(分子量４０００のポリエチレングリコール)および組
成が２０mＭトリス塩酸pＨ７．５、１００mＭＣaＣl₂で
ある緩衝液から成る溶液１mlを加えた後、混合物を室温
で１０分間インキュベートし、ＳＴＣ１０緩衝液(上記
で定義)１mlを混合物に混合する。このように処理した
プロトプラストは、培地Ｄと称し、その組成は以下の第
６表に明記するベンレート(デュポント・ネモアーズよ
り市販されている抗菌剤)１mg／l含有寒天培地６０mlに
加え、４５℃で過冷した混合物はベンレート(デュポン
ト・ネモアズにより市販される、５０％ベノミルを含有
する抗菌剤)１mg／lを添加した寒天培地を含むペトリ皿
に置く。その培地は培地Ｃと称し、その組成は以下の第
７表に明記する。ペトリ皿を２８℃でベノミル抵抗性を
生じたプロトプラストを発現するのに必要な時間インキ
ュベートする。それにより得られた再繁殖した形質転換
体は２９Ｐnと称し、nは検討中のクローンの番号を意味
する。クローンのベノミル抵抗性は、１mg／lベンレー
トを補足した寒天２０g／lを加えた寒天培地にした培地
Ｂ上の各クローンの菌糸状埋没物(mycelial implants)
を継代培養することにより確認される。

【００５４】この培地で成長するクローンのみが、セク
ション１．１)に記載された方法に準じて胞子形成され
る。得られた分生子胞子(conidiospores)は、少なくと
も１５％のグリセロールを含有する緩衝液中に大量に採
取し、−８０℃で保存した。 第６表 培地Ｄの組成
ショ糖 ２５０ g／l グルコース ２０ g／l チアミン ２ g／l アスパラギン １００ mg／l 麦芽抽出物 ０．２ g／l 寒天 ２０ g／l 生理食塩水１(組成は第２表に明記) ６２．５ ml １ＮＨＣlまたはＮaＯＨを用いてpＨ調整１１０℃で３
０分間高圧滅菌次いで６０℃に冷却した培地に１mg／l
のベンレート添加 第７表 培地Ｃの組成 培地Ｄ ７５０ ml／l ＳＴＣ１０緩衝液 ２５０ ml／l (０．８Ｍソルビトール、１００mＭトリス塩酸pＨ７．５、１０mＭ ＣaＣl₂ から成る) pＨ６．０に調整 ６０℃で高圧滅菌した培地に１mg／lのベンレート添加

【００５５】一方でプラスミドp４７２およびプラスミ
ドpＢＴ３と、並びに他方でプラスミドpＥp１およびプ
ラスミドpＢＴ３を用いた、プロトプラストとの同時形
質転換 フラグメントＡ(セクション１参照)を含有するプラスミ
ドp４７２も、フラグメントＣ(セクション３参照)を含
有するプラスミドpＥp１も、優性選択標識は持たない。
Ｃ．パラシチカ(Ｃ．parasitica)ＳＥＢＲ１０３株は、
上述のサブセクションに記載されたのと同じ手順に従っ
て以下のプラスミド混合物と同時形質転換した。４μg
のpＥp１および１μgのpＢＴ３、４μgのp４７２および
１μgのpＢＴ３。それにより得られた形質転換体は、プ
ラスミドpＥp１およびpＢＴ３で同時形質転換したもの
は３０Ｐn、並びにプラスミドp４７２およびpＢＴ３で
同時形質転換したものは３１Ｐnと称し、nは検討中のク
ローンの番号を表示する。

【００５６】セクション７:エンドチアペプシンを過産
生する形質転換株の選択 １) 一般法 a) カゼイン含有寒天培地上の選択 約１００のベノミル抵抗性コロニーの菌糸状埋没物(myc
elial implants)は、カゼイン含有寒天培地上で継代培
養する。この培地は培地Ｅと称し、その組成は以下の第
８表に明示する。この培地では、プロテアーゼを産生す
るクリフォネクトリア・パラシチカ(Ｃryphonectria p
arasitica)コロニーは塩沈殿を増加させ、その面積はエ
ンドチアペプシン分泌量に比例する。過産生株は塩沈殿
の直径の、コロニーの直径に対する比率に基づいて選択
され、その比率は形質転換していない対照株の比率より
も有意に高い。これらの過産生株の分生子胞子(conidio
spores)の調製は、セクション１．１)で用いた方法に準
じて行う。さらに、アスパラギン酸プロテアーゼを特異
的な阻害する物質であるペプスタチン５μg／mlを培地
Ｅに添加することにより、過産生株で観察される塩の増
加が減少することが立証された。この結果は、観察され
た効果が全くアスパラギン酸プロテアーゼの過産生に寄
与するものであることを示している。

【００５７】b) 液体培地での選択 α) フラスコでの検討 この結果を確認するために、以下の方法:組成は以下に
明記する培地Ｆ４０mlを含む２５０mlフラスコに接種す
ることにより、フラスコ中の産生試験を実施した。フラ
スコは２２０ppm４８時間に調整した偏心回転攪拌器中
２８℃でインキュベートする。各々の株について、３個
の別個のフラスコで培養を行い、３個のフラスコの凝集
活性の検定結果の平均を算出した。形質転換していない
クリフォネクトリア・パラシチカ(Ｃryphonectria par
asitica)ＳＥＢＲ１０３株を対照とする。凝集活性の検
定は、ジャーナル・オフィシェル・デ・ラ・レパブリー
ク・フランセーズ(オフィシャル・ジャーナル・オブ・
ザ・フレンチ・リパブリック)Ｊournal Ｏfficial de
la Ｒepubliqne Ｆransaise(Ｏfficial Ｊournal
of the Ｆrench Ｒepublic)１９８１年３月２０日
(セクションＣ)で公けにされている凝固溶液の酵素含量
の公的な検定方法に準じて行い、それを以下に要約す
る: −凝固時間が５−１０分になるように水で希釈した培養
上清１mlに標準化ミルク(ＩＮＲＡより入手−エクスペ
リメンタル・デイリー・ステーション−３９８０ ０ポ
リグニー)１０mlを加え、適当なビンに入れる; −３０℃の水浴中で回転した時、ビンの壁にミルクの凝
固が認められることによって確認される凝固時間を測定
する; −凝固活性はＣＡと表示し、mg／lで表し、以下の式に
より得られる: ＣＡ＝（Ｋ／Ｔ−ａ）×α Ｋおよびa因子はミルクおよび検討中の酵素により変化
する(各々mgs／lおよびsで表す) Ｔ:凝固時間(秒で表す) α:希釈因子

【００５８】β) 発酵器条件下での検討 エンドチアペプシンの産生は、１２０℃で４５分間高圧
滅菌により無菌化した、培地Ｆを濃縮して得られる培養
培地１．２lを含有する２−１発酵器(ビオラファイト)
中で検定した。培養条件は以下のとおりである:８００r
pmで振とう;通気:２vvm(vvm:分あたりの培地容量あたり
の空気容量)。発酵器は５％(容量／容量)の比率で上述
(α)のフラスコ前培養で接種する。温度は２８℃を維持
する。凝固活性の測定は、上述の検定方法に従って約９
０時間発酵させた後に行う。

【００５９】培養物の乾燥重量を決定することにより、
形質転換体の過産生により産生する生物量は、対照株が
産生したものとは有意には異ならないことが立証され
る。 第８表 培地Ｅの組成 ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．３６ g／l Ｎa₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．７１ g／l ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．５０ g／l ＮaＣl ０．１０ g／l カゼイン加水分解物 ０．０５ g／l (ディフコ、カスアミノ酸) カゼイン(ハンマーステン) ６．０ g／l ＣaＣl₂ ０．０６ g／l 生理食塩水２ １０ ml／l (組成は実施例２の第２表に明記) 泡を形成しないように１５分間攪拌。寒天１５g(ディフ
コ、バクト寒天)を添加。１ＮＨＣlまたは１Ｎ ＮaＯ
Ｈを用いてpＨ６．１に調整。１２０℃で２０分間高圧
滅菌。

【００６０】 コットンシードミール １０ g／l グルコース ３５ g／l Ｃa(ＯＨ₃)₂ ３．５ g／l ＣaＣＯ₃ ０．７５ g／l リンシード油 ２．５ ml／l オレイン酸ナトリウム １．５ g／l １Ｎ ＨＣlまたは１Ｎ ＮaＯＨを用いてpＨ６．２０
に調整。１２０℃で４５分間高圧滅菌。

【００６１】形質転換体により分泌される酵素の分析 発酵は、（フラスコまたは発酵器中)培養した過産生形
質転換体および形質転換していないＣ．パラシチカ
(Ｃ．parasitica)の対照株ＳＥＢＲ１０３を遠心に供
し、菌糸体ペレットを除去した後に得られる。ＳＤＳの
存在下１００℃で５分間上清中のタンパクを変性した
後、ＳＤＳの存在下ポリアクリルアミドゲルで電気泳動
した。コマシー・ブルーで染色した後、３６kＤaの分子
質量の部分に主なバンドが観察され、これは、その配列
(第１図参照)から導き出される成熟エンドチアペプシン
の分子質量に相当し、過産生形質転換体の場合は、対照
株の場合よりも強く染色され、過産生形質転換体および
対照株で一致するバンドはあまり重要でない。さらに、
過産生形質転換体と形質転換していない対照株の培養上
清における抗原−抗体反応(レネテストキット、フラン
ス・バイオケム)により、ジャーナル・オフィシェル・
デ・ラ・レプリーク・フランセーズ(オフィシャル・ジ
ャーナル・オブ・ザ・フランス・リパブリック(Ｊourna
l Ｏfficial de la Ｒepubliqne Ｆransaise(Ｏff
icial Ｊournal of the Ｆrench Ｒepublic)１９
８１年３月２０日で報告された同定法に準じ、分泌酵素
はクリフォネクトリア・パラシチカ(Ｃryphonectria p
arasitica)の酵素と同一であることが立証された。

【００６２】さらに、分泌酵素のタンパク分解活性に対
する凝固活性の比率を検定した。凝固活性はg／lで表
し、上述のサブセクションb)α)に記載された方法に準
じて測定する;タンパク分解活性はリットルあたりのグ
リシンのミリ当量として表現し、Ｒ．フィールズ、ザ・
バイオケミカル・ジャーナル(the Ｂiochemical Ｊou
rnal)１２４巻５１８−５９０頁(１９７１年)で報告さ
れたＴＮＢＳ試薬を用い、ジメチルカゼインのタンパク
分解後に現れるアミノ基を検定することにより測定す
る。この比率は過産生形質転換体では０．０４５と０．
０５０の間であり、形質転換していない対照株の値と非
常に近接している。これらの３研究よりエンドチアペプ
シン産生は、過産生形質転換体で特異的に増加するとい
う特徴があると結論づけることができる。

【００６３】c) サザンブロッティングによる、フラグ
メントＡ、ＢまたはＣの組み込みの立証 選択された形質転換体のゲノムＤＮＡは、リーダーおよ
びブロダ、レターズ・イン・アプライド・ミクロバイオ
ロジー(Ｌetters in Ａpplied Ｍicrobiology)１巻
１７−２０頁(１９６５年)に報告されたのと同じ手順に
従って調製し、この手順は以下に要約する:セクション
１．１)に記載されたとおりに実施したフラスコ培養に
由来する菌糸体を凍結乾燥し、カーゼで濾過する。２０
mＭ ＥＤＴＡ溶液pＨ８ですすいだ後、菌糸体を再び濾
過し、−８０℃で凍結し凍結乾燥する。得られた凍結乾
燥物５０mgをすり砕き、その後以下の抽出緩衝液:２０
０mＭトリス塩酸pＨ８．５、２５０mＭ ＮaＣl、２５m
Ｍ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、２００μg／mlプロテ
ィナーゼＫ(シグマ)、５００μlに再懸濁する。混合物
は４５℃で４５分間インキュベートし、ＤＮＡをフェノ
ール／クロロホルムで抽出し、次いでイソプロパノール
で沈殿させる。ペレットをＴＥ(１０mＭ トリス塩酸p
Ｈ８、１mＭ ＥＤＴＡ)１００μlに採る。ＤＮＡを適
当なエンドヌクレアーゼで消化し、得られたフラグメン
トを０．８％アガロースゲル上で電気泳動して分離す
る。フラグメントは、製造業者により推挙される方法従
って、毛細管でナイロン膜(ハイボンＮ⁺−アメルシャ
ム)上に移す。濾過膜は、フラグメントＡおよびプラス
ミドpＢＴ３のニューロスポラ(Ｎeurospora)のβ−チュ
ーブリンの変異遺伝子を含むフラグメントＡおよびＨin
dＩＩＩ−ＨindＩＩＩフラグメントを用いて４２℃で一
晩連続的にバイブリダイズする。これらのフラグメント
は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(アメルシャム)で標識
し、“遺伝子検出システム“ＥＣＬ化学蛍光プローブキ
ット(ＲＰＮ２１０１、アメルシャム)で暴露される。得
られたハイブリダイズした信号は、適当なフィルム上で
可視化する。

【００６４】２) ２９Ｐn形質転換体(フラグメントＢ
を持つコスミドp８Ｈ１２を含む−セクション４参照)の
中からの過産生体の選択 コスミドp８Ｈ１２およびプラスミドpＢＴ３とで同時形
質転換している間に、ベノミル抵抗性クローン１６４個
得られた。その中から無作為に１２７個のクローンを選
び、カゼイン含有寒天培地で選択試験を行い、１４のク
ローンを採用することができた。その中から無作為に選
んだ７個を、液体培地中の選択試験に供した。それによ
り３個のクローンが採用された;これらのクローン２９
Ｐ１、２９Ｐ２および２９Ｐ３は、フラスコ培養後、各
々０．９、１．０７および０．９４g／lの凝固活性を有
し、一方、形質転換していない対照株は、０．６２g／l
の活性を有する(過産生ファクター、すなわち過産生株
の凝固活性の、対照株の凝固活性に対する比率は、従っ
て、各々１．４５、１．７３、および１．５４であ
る)。クローン２９Ｐ２および２９Ｐ３は、次に２−１
発酵器中で試験を行い、凝固活性は各々１．７６および
２．１９g／lであり、対照株では１．２０g／lであった
(過産生ファクターは従って＋１．４７および＋１．８
３である)。

【００６５】クローン２９Ｐ３およびＣ．パラシチカ
(Ｃ．parasitica)の対照株ＳＥＢＲ１０３を、実験条件
とりわけ振とう、通気およびバルク移動に関してをあま
り限定しないで、工業的な方法で用いられる条件に近づ
けて２０−１培養器中で培養した。この試験により、対
照株により産生される量の約２倍の量に等しいエンドチ
アペプシンを得ることができた。上記無作為に選ばれた
７個のクローンをサザンブロッティングにより分析し
た。これらのゲノムＤＮＡと、非形質転換Ｃ．パラシチ
カ(Ｃ．parasitica)の対照株ＳＥＢＲ１０３のゲノムＤ
ＮＡを酵素ＳmaＩで消化し、これによりコスミドp８Ｈ
１２中の２か所でのみ開裂し、フラグメントＡでは開裂
しない。フラグメントＡとハイブリダイズすると、クロ
ーン２９Ｐ１、２９Ｐ２および２９Ｐ３について、２本
のハイブリダイゼーションでできたバンドが観察され、
対照株および液体培地中での選択試験の後で採用されな
かったその他のクローンについて観察された１本のハイ
ブリダイズでできたバンドは、上述の２本のバンドの１
つに大きさが同じである。３個の過産生クローン２９Ｐ
１、２９Ｐ２および２９Ｐ３はコスミドp８Ｈ１２の複
製をそのゲノムと異なる遺伝子座で組み込み、それ故、
観察される余分なバンドは大きさが異なる。最終的に、
上記で得られたサザンブロットはベノミル抵抗性を有す
るプラスミドpＢＴ３のＨidnＩＩＩフラグメントでハイ
ブリダイズした。これにより以下のことを確立すること
ができた;７個のベノミル抵抗性クローンは全て、少な
くとも１個のプラスミドpＢＴ３の複製を受けとること
ができる。というのはこれらは対照株と比べてさらに数
本のハイブリダイズによるバンドを示し、対照株は内因
性β−チューブリン遺伝子(βチューブリンは線状菌、
とりわけニューロスポラ・クラサ(Ｎeurospora crass
a)およびＣ．パラシチカ(Ｃ．parasitica)に存在する構
造タンパクである)対応する１本のバンドしか示さな
い。

【００６６】これらの結果は、フラグメントＢがエンド
チアペプシンの発現(および分泌)に必要な信号を含んで
いることを示す。従ってこれがエンドチアペプシンの機
能的遺伝子、すなわちエンドチアペプシン前駆体をコー
ドし、機能的プロモーターおよび機能的ターミネーター
によってフランクされた配列を含む。この機能的プロモ
ーターは、フラグメントＡ(セクション１参照)に局在す
るＴＡＴＡボックスの上流に位置する活性化部位から成
る。このフラグメントをさらに複製したものをＣ．パラ
シチカ(Ｃ．parasitica)ＳＥＢＲ１０３株のゲノム、形
質転換により加えると、２の部分のファクターを持った
エンドチアペプシンを過産生する形質転換株を得ること
ができるようになる。

【００６７】３) ３０Ｐn形質転換体(フラグメントＣ
を運ぶプラスミドpＥp１を含有する:セクション６参照)
の中からの過産生体の選択 プラスミドpＥp１およびプラスミドpＢＴ３で同時形質
転換している間に、６６３個のベノミル抵抗性コロニー
が得られた。その中から、カゼイン含有寒天培地中で行
う選択試験のために１０８個のクローンが無作為に選ば
れ、３２個のクローンが採用された。この試験により、
２９Ｐn形質転換体から得られるよりも(１４／１２７)
３２Ｐn形質転換体からの方が著しく高値の過産生体(３
２／１０８)を採用することができることは注目される
であろう。このことは、約１３．４−kbのプラスミドp
Ｅp１で得られる同時形質転換の頻度が、約４０．６−k
bのコスミドp８Ｈ１２で得られるものよりも高いことを
示している。これらの３２個のクローンの中から、１２
個のクローンを無作為に選び、液体培地中での選択試験
に供した。それにより７個のクローンが採用された:ク
ローン３０Ｐ１、３０Ｐ２、３０Ｐ３、３０Ｐ４、３０
Ｐ５、３０Ｐ６および３０Ｐ７であり、これらはフラス
コ培養の後、凝固活性が各々１．１２、１．０６、０．
９６、１．１２、１．０５、０．８８および０．９０g
／lであり、一方、形質転換していない対照株では活性
は０．６２g／lであった(従って、過産生ファクターは
＋１．４２と＋１．８１の間である)。次にクローン３
０Ｐ１、３０Ｐ２および３０Ｐ５を２−１発酵器中で試
験し、各々３．０５、３．０および３．０４g／lの凝固
活性が得られ、対照株では１．２０g／lにしかならなか
った(従って過産生ファクターは各々＋２．５４、＋
２．５０および＋２．５３である)。恐らく(上記２参
照)２０−１発酵器の試験を実験条件を制限しないで行
うと、過産生ファクターを約３に達することができるで
あろう。

【００６８】上記で無作為に選択した７個のクローンを
サザンブロッティングで分析した。これらのゲノムＤＮ
Ａおよび形質転換していないＣ．パラシチカ(Ｃ．paras
itica)対照株ＳＥＢＲ１０３のゲノムＤＮＡを酵素Ｓac
Ｉで消化した。この酵素はプラスミドpＥp１で１か所で
しか開裂しないので選ばれた。この開裂部位はフラグメ
ントＡの外側でフラグメントＣ(第４図参照)に局在す
る。フラグメントＡで７個のクローンの各々をハイブリ
ダイズした後、少なくとも２本のハイブリダイズによる
バンド(クローンに依り２−４本)が観察されたが、対照
株にも存在する内因性エンドチアペプシンのバンドも含
み、プロフィールは各クローンにより異なっている。３
０Ｐ１、３０Ｐ２および３０Ｐ５のクローンでは直線状
プラスミドpＥp１のバンドと大きさが同じであるハイブ
リダイズによるバンドがバンド間に観察され、このこと
はプラスミドのさらに少なくとも２個の複製が直列に組
み込まれている可能性を示唆している。

【００６９】線状菌では形質転換の後、プラスミドのい
くつかの複製が直列に組み込まれることが通常的におこ
り(フィンチャムＪ．Ｒ．Ｓ．、マイクロバイオロジカ
ル・レビューズ(Ｍicrobiological Ｒeviews)１４８−
１７０頁(１９８９年３月))、プラスミドがそれより組
み込まれるゲノムＤＮＡを、このプラスミドを１箇所で
しか開裂しないエンドヌクレアーゼで消化すると、この
プラスミドを遊離することが、実際には当業者間では周
知である。これらの結果により、フラグメントＣがエン
ドチアペプシンの発現(および分泌)に必要な全ての信号
を含むことが示唆される。従ってこれはエンドチアペプ
シンの機能的遺伝子および完全な機能的プロモーターを
含む。プロモーター活性化部位は、故にフラグメントＣ
に位置する。このフラグメントの複製を少なくともさら
に２個、Ｃ．ポアラシチカ(Ｃ．poarasitica)ＳＥＢＲ
１０３株のゲノムに加えると、３の領域中にファクター
を有するエンドチアペプシンを過産生する形質転換株を
得ることができる。

【００７０】４) ３１Ｐn形質転換体(フラグメントＡ
を持つプラスミドp４７２を含む:セクション６参照)の
中からの過産生体の選択 プラスミドp４７２およびプラスミドpＢＴ３で同時形質
転換している間に、ベノミル抵抗性コロニーが８４０個
得られた。カゼイン含有寒天培地での選択試験のため
に、１０８のクローンを無作為に選んだ。上述の２９Ｐ
nおよび３０Ｐnの同時形質転換で得られた結果と対照的
に、過産生体は検出されなかった。それにもかかわら
ず、形質転換していない対照株よりも有意ではないが多
い加水分解塩ができるものの中から選んだ５個のクロー
ン３０Ｐ１、３０Ｐ２、３０Ｐ３、３０Ｐ４および３０
Ｐ５を液体培地中で選択試験に供した。上述のクローン
はフラスコ培養後、凝固活性が各々０．３８、０．６
６、０．６６、０．５６および０．６５g／lであり、一
方対照株の活性は０．６２g／lである(従ってディフェ
レンス・ファウンド(difference found)は−３８、＋
６、＋６、−２２および＋４％である)。液体培地中で
のこの試験では、有意な過産生は検出されず、カゼイン
寒天培地中の選択試験で陰性の結果が確認された。

【００７１】サザンブロッティングにより分析すると、
５個のクローンはプラスミドpＢＴ３の複製を少なくと
も１個組み入れたことが示されたが、５個のうち３個の
クローンはプラスミドpＢＴ３およびプラスミドp４７２
により真正に同時形質転換される。プラスミドp４７２
に含まれるフラグメントＡをさらに複製したものを加え
ても、エンドチアペプシンの過産生は引きおこさない。
このことは、エンドチアペプシンの発現に不可欠なＤＮ
Ａ配列がこのフラグメントでは欠如していることを示唆
している。従ってフラグメントＡはエンドチアペプシン
の機能的遺伝子を含まず、フラグメントＡでは、それを
機能的にするのに必要なプロモーターの上流にある活性
化部位が欠如していることが確認されるセクション１−
７参照)。プロモーターの上流にある活性化部位は、フ
ラグメントＣの、５'末端(ＢamＨＩ部位)およびフラグ
メントＣに含まれるフラグメントＡの５'末端(ＨindＩ
ＩＩ部位)の間に位置する。

【００７２】この活性化部位の厳密な位置は、フラグメ
ントＡの５'末端並びにフラグメントＡの５'末端および
フラグメントＣの５'末端の間に位置するヌクレオチド
に接しているフラグメントＣの一部分の大きさの異なる
セグメントを、５'末端でフランクしたフラグメントＡ
から成るフラグメントＣの一連のセグメントを得(たと
えばエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼを用
いて消化して調製する)、これらの切片でクリフォネク
トリア・パラシチカ(Ｃryphonectria parasitica)ＳＥ
ＢＲ１０３を形質転換し、組み換えプロテアーゼを発現
する形質転換体を選択することにより、さらに正確に決
定することができる。このようなフラグメントＣの切片
の例は、フラグメントＤおよびＦであり、これの調製に
ついてはセクション４および５に記載する。

【００７３】セクション８:エンドチアペプシンを過産
生する形質転換体の精製方法(選択標識の除去)および連
続形質転換によるエンドチアペプシンの遺伝子コードの
増幅方法 １) 背景 菌細胞は、一般的に同じ遺伝物質を含有するいくつかの
核を包含することが知られている(とりわけ、フィンシ
ャムＪ．Ｒ．Ｓ．、マイクロバイオロジカル・レビュー
ズ(Ｍicrobiological Ｒeviews１４８−１７０頁(１９
８９年３月)参照)。細胞壁を酵素で消化した後得られる
プロトプラストは無核(再生不可)、単核または多核にな
る。後者を形質転換すると、形質転換された核を含むヘ
テロカオリン型の形質転換細胞を得ることができ、その
細胞では異なる種類の核(組み込み方法および組み込む
物質に依存し、変化し得る)および形質転換していない
核が充当される。Ｃ．パラシチカ(Ｃ．parasitica)の場
合、分生子胞子(cinidiospores)は単核である(プハラ
Ｊ．Ｅ．ら、フィトパソロジー(Ｐhytopathology)６１
巻１６９−１７３頁(１９７１年))。以下に記載された
研究は、興味のある組み換えＤＮＡのみを含有し、選択
標識は含有しない鎖を構築するために、菌類細胞のこれ
らの特徴を用いたものである。

【００７４】２) ベノミル感受性過産生体を試験する
目的のための形質転換体２９Ｐ３の精製(選択標識の除
去); 最初のエンドチアペプシン２９Ｐ３の過産生転換体の分
生子胞子の調製物[セクション１．１)およびセクション
７．２)参照]は、単離コロニーを得るために十分希釈
し、寒天培地に寒天２０g／lを加えて作られる培地Ｂ
(上記の第２表参照)を含有するペトリ皿に接種するため
に用いた。３０℃で５日間インキュベートした後、５０
コロニーの菌糸埋没物を同じ寒天培地Ｂおよびそれにベ
ンレート(５０％ベノミル含有)１μg／mlを添加した培
地とで平行して前培養した。３０℃で５日間インキュベ
ートした後、寒天培地Ｂでは６個のクローンが正常な成
長を示し、ベンレートを添加した寒天培地では全く成長
が認められない。これらの６個のベノミル感受性クロー
ンは、各々１個の胞子の発芽に由来するものであり、ホ
モカオリン型であるので純粋である。６個のクローンお
よび最初の形質転換体２９Ｐ３は、カゼイン含有寒天培
地でエンドチアペプシンの過産生の選択試験に供した
[セクション７．１)a)参照]．これにより、２９Ｐ３ben
^Sと称するベノミル感受性クローンが選択でき、そのク
ローンが過産生を示すが、最初の形質転換体と有意差は
ない。クローン２９Ｐ３ben^S、クローン２９Ｐ３および
Ｃ．パラシチカ(Ｃ．parasitica)対象株ＳＥＢＲ１０３
を胞子形成後、液体培地での選択試験に供した。クロー
ン２９Ｐ３および２９Ｐ３ben^Sは同等の凝固活性を有す
る(実験誤差の範囲を考慮に入れる)が、対照株の活性よ
りは著しく大きい。さらに、これらの２個のクローンお
よび対照株でサザンブロッティング行なったが、これら
のゲノムＤＮＡをエンドヌクレアーゼＳmaＩで消化した
後、２個のクローンの各々はプローブとしてのフラグメ
ントＡとのハイブリダイゼーションプロフィールを有
し、このプロフィールは対照と比較すると余分なバンド
を有する(セクション７．２)参照)。これは、両者のク
ローンで、エンドチアペプシンの機能的遺伝子の組み込
みが同じであり、ベノミル抵抗性を有するプラスミドp
ＢＴ３のＨindＩＩＩ−ＨindＩＩＩフラグメントによる
ハイブリダイズのプロフィールは異なり(セクション６
参照)、最初の形質転換体２９Ｐ３をこのフラグメント
でハイブリダイズすると数本のバンドが示され、クロー
ン２９Ｐ３ben^Sおよび対照株もハイブリダイズすると同
じ大きさのバンドが認められる(β−チューブリンの内
因性遺伝子に相当)。これらの結果は、精製方法により
(遺伝子型に関して)純粋で、選択標識(ベノミル抵抗性
を有する遺伝子)を欠いた形質転換体を得ることがで
き、エンドチアペプシン過産生という特徴は、クローン
２９Ｐ３ben^Sに安定して組み込まれており、それは単核
分生子胞子(conidiospore)の発芽に由来し全ての菌糸細
胞はＤＮＡにコスミドp８Ｈ１２を組み込んだ核を保有
するためである。

【００７５】３) 増幅: クローン２９Ｐ３ben^Sより調製したプロトプラストは、
セクション６に記載された手順に従ってプラスミドpＢ
Ｔ３で形質転換した。４００のベノミル−抵抗性クロー
ンが、プラスミドＤＮＡ１μgにつき得られた。従っ
て、エンドチアペプシンの機能的遺伝子を含有するコス
ミドおよび選択標識を含むプラスミドで同時形質転換す
ると、エンドチアペプシンを過産生し、選択標識を欠
き、再び形質転換する能力のある形質転換体を得ること
が可能である。故に、上記の２個のベクターを用いた同
時形質転換の段階、次に選択標識を除去できる精製段階
から成るいくつかの連続したサイクルを行うことによ
り、Ｃ．パラシチカ(Ｃ．parasitica)のエンドチアペプ
シン前駆体をコードする遺伝子を選択的に増幅すること
が可能である。

【００７６】セクション９:Ｃ．パラシチカ(Ｃ．parasi
tica)ＳＥＢＲ１０３形質転換後のエンドチアペプシン
産生欠失株の試験 Ｃ．パラシチカ(Ｃ．parasitica)ＳＥＢＲ１０３株をコ
スミドp８Ｈ１２およびプラスミドpＢＴ３で同時形質転
換(セクション６参照)した後に得られたベノミル抵抗性
クローンを完全分析すると、カゼイン含有寒天倍地Ｅ上
で加水分解の塩を産生しないクローンを得ることができ
た。このクローンはセクション８記載の方法により精製
し、加水分解の塩を産生しないベノミル感受性クローン
を多く得た。２９Ｐ(end−)と称する１個のクローン
を、これらのベノミル感受性クローンの中から無作為に
選んだ。フラスコ培養の後、クローン２９Ｐ(end−)の
凝固活性は０．０１g／l以下であり、一方形質転換して
いないクリホォネクトリア・パラシチカ(Ｃryphonectri
a parasitica)対照株ＳＥＢＲ１０３の凝固活性は０．
６２g／l(産生において観察される差は従って９８％以
上である)であった。さらに、このクローンの形態学的
および生理学的特徴は、Ｃ．パラシチカ(Ｃ．parasitic
a)ＳＥＢＲ１０３株の特徴に相応して変えられる。

【００７７】クローン２９Ｐ(end−)のゲノムＤＮＡお
よび対照株ＳＥＢＲ１０３のサザンブロット分析を、一
方ではフラグメントＡと、もう一方ではプラスミドpＢ
Ｔ３のベノミル抵抗性遺伝子を含有するフラグメントで
ハイブリダイズした後に行ったが、差異は認められなか
った。これらの結果は、Ｃ．パラシチカ(Ｃ．parasitic
a)株をコスミドp８Ｈ１２およびプラスミドpＢＴ３で同
時形質転換すると、選択され精製されたクローン２９Ｐ
(end−)はエンドチアペプシン産生を欠失することを示
唆する。当業者では、エンドチアペプシン産生を欠失す
る形質転換体は、Ｃ．パラシチカ(Ｃ．parasitica)ＳＥ
ＢＲ１０３を、選択標識たとえばプラスミドpＢＴ３、
およびたとえばコード配列の一部を欠失することにより
非機能的にしたプレプロエンドチアペプシン遺伝子を含
有するＤＮＡで同時形質転換し、次いでカゼインの加水
分解塩を産生しないベノミル抵抗性形質転換体を選択し
て得られるということは明白であると解されている。こ
のような非機能的遺伝子を運ぶＤＮＡは、pＥp１プラス
ミドのＤＮＡを直線状にし、たとえばＳcaＩおよびＳfi
Ｉで二重消化し、次いで大きなフラグメントを０．８％
アガロースゲルで電気泳動して精製し、最後にこのフラ
グメントの末端を４つのデオキシリボヌクレオチドトリ
フォスファターゼdＮＴＰの存在下クレノウポリメラー
ゼで処理してベクターを再連結させ、それによりエンド
チアペプシンの非機能的遺伝子を運ぶプラスミドを得る
ようにして容易に得ることができる。

【００７８】セクション１０:エンドチアペプシンの生
産せず、優性選択マーカーを欠く、ＳＥＢＲ３７００株
の構築。 １)エンドチアペプシンをコードする配列が２個の翻訳
停止コドンにより中断されているフラグメント(フラグ
メントＥＭと称す)の構築。 エンドチアペプシン前駆体をコードする配列の始めに、
翻訳の停止を引き起こす突然変異を導入した。その結
果、エンドチアペプシンはこれらの突然変異が加えられ
たメッセンジャーＲＮＡからはもはや生産されなくな
る。エンドチアペプシンのフラグメントＡは約３６０bp
(塩基対)ＨindIII−ＢstＥIIフラグメント(第２図参照)
を含み、ＢstＥII部位は暗号化配列の始まりから２５bp
下流に位置している。問題の天然配列は次の通りであ
る。

【化１８】 下線部のＡＴＧトリプレットは、暗号化フレームを開く
コドンを表す。ＢstＥII部位は垂線により示されてい
る。

【００７９】所望の突然変異配列は次の通りである。

【化１９】 この配列は、一方は第５および第６コドン間、他方は第
６コドン内(第２および第３塩基間)である、２Ｔの導入
の点で天然配列とは相異する。これらの導入の結果、エ
ンドチアペプシン遺伝子の解読枠を停める２つの停止コ
ドンが作成される。これら２つの修飾のみが野生型配列
とは異なるＨindIII−ＢstＥIIフラグメントは、プライ
マーの一方について所望の突然変異を有するオリゴヌク
レオチドを用いて、セクション１５記載のＰＣＲ増幅技
術により得られた。オリゴヌクレオチド１は下記配列を
有する。

【化２０】 この配列は、ＨindIII−ＢstＥIIフラグメントのＨindI
II末端に見出される。ＨindIII部位は垂線により示され
ている。オリゴヌクレオチド２は下記配列を有する。

【化２１】 このオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異配列に相補
的である。天然ＢstＥII部位に近接するＢamＨＩ部位は
それに結合されている。下線部のヌクレオチドは、相補
鎖上に停止コドンを作成する付加配列に対応する。

【００８０】鋳型として使用されるＤＮＡは、セクショ
ン１記載のプラスミドp４７２のＤＮＡである。増幅混
合物は、３００ng(３μlに等しい)のp４７２ ＤＮＡ、
１００ng(１μlに等しい)の各オリゴヌクレオチド、５
μlの１０倍濃縮緩衝液bipv２、４０μlの水、２単位
(０.５μlに等しい)の酵素Ｔaqポリメラーゼを含む。１
０倍濃縮緩衝液bipv２は次の組成を有する:６７０ミリ
モルのトリス−ＨＣl(pＨ８.８)、１６５ミリモルの硫
酸アンモニウム、１０ミリモルの２−メルカプトエタノ
ール、ゼラチン２mg／ml、トリトンＸ−１００(１.５
％)、６７マイクロモルのＥＤＴＡ、２０ミリモルのＭg
Ｃl₂、２ミリモルのdＡＴＰ、２ミリモルのdＣＴＰ、２
ミリモルのdＧＴＰ、２ミリモルのdＴＴＰ。

【００８１】３つの増幅試験は平行して行なわれる。１
５の増幅サイクルが遂行され、各サイクルは９２℃で１
分の変性、５５℃で１分のハイブリダイゼーションおよ
び７２℃で１分の伸長に分けられる。ＰＣＲ増幅後、２
本の管を１本のエッペンドルフ管で合わせ、０.３モル
酢酸アンモニウムを含む２倍容量の無水エタノールによ
り沈澱させ(０℃で２０分間)、次いで、１００００gで
遠心分離(２０分間)する。沈澱物を７０％エタノールで
洗浄し、次いで１０分間真空乾燥する。ＤＮＡを６０μ
lのＴＥ溶液(１０ミリモルのトリス−ＨＣl、pＨ７.
５、１ミリモルのＥＤＴＡ)に吸収させ、アガロース・
ゲルで分析する。３６０bpフラグメントに対応する帯を
ゲルから溶離し、精製し、これらの酵素の作用後、Ｈin
dIIIおよびＢamＨＩ部位間におけるファージＭ１３の複
製形態(Ｍ１３mp１９)へクローン化する。

【００８２】こうしてクローン化されたフラグメントを
１本鎖フラグメントから配列決定し、この配列が、予想
された点に突然変異が存在するフラグメントには事実上
対応しないことが証明された。セクション１記載の約
２.１kbフラグメントＡは２つのＨindIII部位により結
合され、一端から３６０塩基対の場所に位置する単一Ｂ
stＥII部位を有する。この故、単一ＢstＥII部位はフラ
グメントＡの２つのセグメントを結合する。短い方は、
ＰＣＲ増幅に付された配列に対応する。フラグメントＡ
の大きなＢstＥII−ＨindIIIセグメントおよび小さい突
然変異ＨindIII−ＢstＥIIセグメントを製造し、ＨindI
IIによるpＢＲ３２２切断で全体をライゲーションする
ことにより、２つの突然変異を有するフラグメントＡ
(フラグメントＡ−Ｍと称す)が再形成される。フラグメ
ントＡ−Ｍは、このフラグメントに特有なＰstＩ部位を
有する。この故、このＰstＩ部位は、二重突然変異を有
する約１.６７kbのＨindIII−ＰstＩセグメントを含
む、フラグメントＡ−Ｍの２つのセグメントを結合す
る。

【００８３】セクション５記載のプラスミドpＥp３は、
約３.７kbのＳphＩフラグメント(フラグメントＥと称
す)がクローン化されたpＵＣプラスミドから誘導され
る。この３.７kbフラグメントは、サブフラグメントと
してフラグメントＡを含む。このフラグメントＡは、次
の方法でフラグメントＡ−Ｍと置き換えられた。プラス
ミドpＥp３bを、一方は酵素ＳcaＩおよびＰstＩおよび
他方は酵素ＳcaＩおよびＨindIIIにより両方とも消化し
た。第１消化により、約２.２５０kbのＳcaＩ−ＰstＩ
フラグメントが単離された。第２消化により、約２.４
２kbのＳcaＩ−ＨindIIIフラグメントが単離された。二
重突然変異をもつ１.６７kbのＨindIII−ＰstＩセグメ
ントによりこれら２つのフラグメントをライゲーション
すると、二重突然変異のみがpＥＰ３bとは異なるpＥpＭ
３bと称する新しいプラスミドが得られる。二重突然変
異を有するＳphＩフラグメント(フラグメントＥ−Ｍと
称す)は、pＥpＭ３bのＳphＩ消化、次いで０.８％アガ
ロース・ゲルでの２つのＤＮＡフラグメントの分離およ
び２０μlのＴＥ溶液中における突然変異３.７kbフラグ
メントの抽出により製造された。

【００８４】２)フラグメントＥＭおよびテロマー配列
によりフランクされたベノミル耐性遺伝子をもつＳfiＩ
フラグメントによるクリホネクトリア・パラシティカ
(Ｃryphonectria parasitica)の同時形質転換。 精製フラグメントＥＭは、ＳfiＩにより消化されたプラ
スミドp５７８.１２のＤＮＡによる同時形質転換で使用
された。プラスミドp５７８.１２は、既に記載したプラ
スミドpＢＴ３の誘導体である。pＢＴ３のＤＮＡをエン
ドヌクレアーゼＸhaＩにより線形化し、両端をクレノウ
ＤＮＡポリメラーゼによりブラント化した。それに、ポ
リメラーゼにより修復し、ＢamＨＩ部位をＳfiＩと置き
換えるべく修飾された、ペロ、バリューおよびベゲレ、
Ｍol．Ｃel．Ｂiol.、１９８７（７）、１７２５−１７
３０頁に記載されたプラスミドpＰＡＴuraに由来するテ
トラヒメナ(Ｔetrahymena)のテロマー配列を含むＸhaＩ
フラグメントを組み込んだ。ＳfiＩによるp５７８.１２
の消化により、ベノミル耐性遺伝子をもち、その両端の
各々でテロマー配列により終結する線形フラグメントが
解離される。ペロ等(上記参考文献)は、かかるフラグメ
ントが、糸状菌ポドスポラ・アンセリナ(Ｐodospora an
serina)において線形プラスミドの状態(染色体に組み込
まれていない)で維持され得ることを示した。さらに、
ポーウェルおよびキツラー(「ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー」(Ｊ．Ｂacteriology)、１９９０、１７２
巻、３１６３−３１７１頁)は、テロマー型の反復配列
が、クリホネクトリア・パラシティカ(Ｃ．parasitica)
において線形プラスミドの自律複製を可能にすることを
示した。この特性を利用して、線形フラグメントとの同
時形質転換により適当な株を構築した。染色体にベノミ
ル耐性マーカーが組み込まれていない場合、ベノミル感
受性株は、形質転換体の胞子形成後に得られた分生子か
ら非常に高い頻度で回収され得るべきである。

【００８５】クリホネクトリア・パラシティカ(Ｃrypho
nectria parasitica)株ＳＥＢＲ１０３において、各々
プラスミドp５７８.１２のフラグメントＥ−Ｍ約０.５
μg(３μl)およびＳfiＩフラグメント０.５μg(４μl)
により２つの同時形質転換実験を行った。３９７のベノ
ミル耐性コロニーが得られた。これらのコロニーのうち
３９５を、培地Ｅ(セクション７参照)で継代培養するこ
とにより、セクション７記載のハローの存在について試
験した。カゼイン凝結のハローをもはや形成しない一コ
ロニーが見出された。コロニーＡＪ７.７２と称するこ
のコロニーを、１セクション記載の方法に従い胞子形成
（分生子形成）培地へ移した。分生子を塊で採取し、発
芽培地で希釈した。分生子形成から誘導された１５２の
コロニーをカゼイン培地で試験した。それらのうち、凝
結のハローを示したものは無かった。これらのコロニー
のベノミル耐性についても試験した。１５２のうち５８
は、この形質転換特性を喪失していた。５８のうちの５
つを取り出した。それらをコロニーＡＪ７２７２／Ａ、
コロニーＡＪ７２７２／Ｂ、コロニーＡＪ７２７２／
Ｊ、コロニーＡＪ７２７２／ＬおよびコロニーＡＪ７２
７２／Ｍと称した。ゲノムＤＮＡを各コロニーから抽出
し、ハイブリダイゼーション・プロフィールおよびＳＥ
ＢＲ１０３株の場合を、様々な制限酵素を用いたサザー
ン・ブロッティング技術により比較した。フラグメント
Ａ(エンドチアペプシン遺伝子)、pＵＣ１８(細菌性配
列)またはネウロスポラ(Ｎeurospora)のベータ-ツブリ
ンにおける遺伝子によりプローブした、ＳＥＢＲ１０３
株および５つの突然変異体間に差異は見出されなかっ
た。フラグメントＡの場合、エンドチアペプシン遺伝子
の配列が現れた。ハイブリダイゼーション・プロフィー
ルは全株とも同じであるため、突然変異体に突然変異フ
ラグメントの「変位的」組換え(すなわち、非相同的組換
え)は存在しないという結論に達し得る。pＵＣ１８の場
合、株とは関係無くハイブリダイゼーションは達成され
ず、細菌由来の配列が突然変異体に一切組み込まれてい
ないことを示している。β−ツブリン遺伝子の場合、配
列は全ての株に現れる。これは、非常に高い確率でクリ
ホネクトリア・パラシティカ(Ｃ．parasitica)のβ−ツ
ブリンにおける「内在性」遺伝子に対応する。

【００８６】コロニーＡＪ７２７２から誘導された株が
実際にエンドチアペプシン構造遺伝子で突然変異してい
ることをチェックするため、それらの欠如が形質転換に
より補われ得ることを証明した。上記コロニーの各々
を、プラスミドpＢＴ３およびプラスミドpＥＰ２のＤＮ
Ａを伴う同時形質転換用のレセプターとして使用した。
下表は、この方法で得られたベノミル耐性形質転換体の
大多数もまたエンドチアペプシンを生産することを示
す。 株 ベノミル耐性コロニー プロテアーゼ生産性コロニー (カゼインに関する試験) ＡＪ７２７２／Ａ ２ ２ ＡＪ７２７２／Ｂ ８ ７ ＡＪ７２７２／Ｊ １３ １１ ＡＪ７２７２／Ｌ １７ １６ ＡＪ７２７２／Ｍ １０ １０ 対照: プラスミドpＢＴ３単独による分離体の形質転換
によって、プロテアーゼを生じる形質転換体は得られな
い。アクリルアミド・ゲル電気泳動による培養上清の分
析の結果、突然変異株は、形質転換前には検出可能量の
エンドチアペプシンを生産しないことが確認された。こ
うして、胞子形成後、エンドチアペプシン構造遺伝子に
作用する１つまたはそれ以上の突然変異のみがＳＥＢＲ
１０３株とは異なる５つのコロニーを生じるＡＪ７２７
２／株を構築した。これらのコロニーの一つを採用し
た。それをＳＥＢＲ３７００と称す。それは、エンドチ
アペプシンの生産に不完全であり、優性選択マーカーを
欠く。

【００８７】セクション１１:エンドチアペプシンの生
産に不完全なＳＥＢＲ３７００株の補足によるフラグメ
ントＤおよびＦの機能性の証明。 プラスミドpＥp１に含まれるフラグメントＣは、エンド
チアペプシンの発現に必要なシグナルを全てもつこと
が、セクション７のサブセクション３において立証され
た。セクション１０で得られた、エンドチアペプシンの
生産に不完全なＳＥＢＲ３７００株を用いて、プラスミ
ドpＥp２およびpＥp４に含まれるフラグメントＤおよび
Ｆの機能性が証明された。 １)プラスミドpＥp２およびpＢＴ３によるＳＥＢＲ３７
００株のプロトプラストの形質転換。 プラスミドpＥp２は、ベノミル耐性遺伝子およびフラグ
メントＤの両方をもつため、形質転換に直接使用され得
る。エンドチアペプシンをコードする遺伝子をもたない
プラスミドpＢＴ３を陰性対照として使用する。約１μg
のプラスミドpＥp２および１μgのプラスミドpＢＴ３に
よるＳＥＢＲ１０３株(セクション６参照)に関する記載
と同一のプロトコールに従い、ＳＥＢＲ３７００株を形
質転換した。

【００８８】２)プラスミドpＥp１およびpＢＴ３および
プラスミドpＥp４およびpＢＴ３によるＳＥＢＲ３７０
０株のプロトプラストの同時形質転換。 プラスミドpＥp１およびpＥp４は、優性選択マーカーを
もたない。プラスミドpＥp１を、ＳＥＢＲ３７００株の
補足の陽性対照として使用する。ＳＥＢＲ３７００株
を、プラスミド混合物:４μgのpＥp１および１μgのpＢ
Ｔ３、４μgのpＥp４および１μgのpＢＴ３により同時
形質転換した。

【００８９】３)エンドチアペプシンを生産する形質転
換体の検出。 上記形質転換および同時形質転換の各々について選択さ
れた幾つかの形質転換体の菌糸体移植物を、培地Ｅ、す
なわちカゼインを含む寒天培地において継代培養した。
インキュベーション後、エンドチアペプシンの分泌の沈
澱特性であるハローを示すコロニーが同定された。得ら
れた結果は次の通りである。 −プラスミドpＢＴ３により得られた形質転換体: 沈澱
のハローを与えるクローンは無かった。 −プラスミドpＥp１およびpＢＴ３またはプラスミドpＥ
p４およびpＢＴ３により得られた形質転換体: 約３０％
の比率のクローンは沈澱のハローを与えた。 −プラスミドpＥp２により得られた形質転換体: 試験さ
れたクローンの９２％は沈澱のハローを与えた。 これらの結果は、プラスミドpＥp１、pＥp２およびpＥp
４がエンドチアペプシンの生産に不完全なＳＥＢＲ３７
００株を補足すること、このため、これらのプラスミド
に含まれるフラグメントＣ、ＤおよびＦは全てエンドチ
アペプシンの機能的プロモーターをもつことを示す。し
かしながら、フラグメントの各々に存在するプロモータ
ーの相対強度は、この定性試験からは誘導され得ない。
これらの結果から、配列がセクション５で決定されたフ
ラグメントＦのＳphＩ−ＨindIIIセグメントは、プレプ
ロエンドチアペプシンをコードする遺伝子のプロモータ
ーの活性化に関与するシグナルを有することが誘導され
得る。

【００９０】セクション１２:エンドチアペプシンを過
産生し、優性選択マーカーを欠く形質転換体の選択。 １)選択プロトコール プロトコールの相異なる段階を下表に示す。その原理は
次の通りである。セクション６記載のプロトコールと同
一のプロトコールに従って、プラスミドpＥp１またはp
Ｅp２の消化後アガロース・ゲルで予め精製し、バイオ
ラド・ジーン-クリーン・キットの使用説明書に従い抽
出した０.５〜２μgのフラグメントＣ、ＤまたはＦ、お
よび環状または線状形態の選択プラスミドpＢＴ３また
はpＢＴ６、０.５μgから成る混合物を用いて、クリホ
ネクトリア・パラシティカ(Ｃ．parasitica)ＳＥＢＲ１
０３プロトプラストを同時形質転換する。

【００９１】培地Ｃにおいてプロトプラストの再生後、
得られた形質転換体(「初代形質転換体」と命名する)を、
２０g／lの寒天(非選択的培地)を加えることにより寒天
培地に調製された培地Ｂおよびカゼイン含有寒天培地で
ある培地Ｅにおいて、適当ならば５μg／mlのペプスタ
チンを補充し、同時に継代培養する。沈澱のハローの直
径対コロニー直径が非形質転換対照株の場合よりも顕著
に高いクローンを、「過産生性初代形質転換体」と命名
し、胞子形成用に調整する。これらの株の分生子標本を
セクション１.１で使用した方法に従い製造し、各分生
子懸濁液の希釈液を培地Ｇで培養することにより、分離
コロニーが得られる。約５０コロニーから生じる菌糸体
移植物を、２０g／lの寒天を加えることにより寒天培地
に調製された培地Ｂ(適当な場合０.５mg／lのベンレー
トを補充する(ベノミル感受性試験))および培地Ｅ(カゼ
イン培地に関する試験)において同時に、各過産生性初
代形質転換体に関して継代培養する。この段階で、ベノ
ミル感受性であり、エンドチアペプシン過産生性である
クローンを、過産生性ベノミル(複数もあり得る)分離体
と命名し、胞子形成用に調整する。次いで、分生子標本
を作成することにより、フラスコ培養後のエンドチアペ
プシンの過産生を証明し、フラグメントＡから成るプロ
ーブによるゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションによ
るフラグメントＣ、ＤまたはＦの１つまたはそれ以上の
コピーの組み込みを証明し、選択プラスミドの全部また
は一部から成るプローブを用いて異種ＤＮＡが存在しな
いことをチェックする。これら３つの基準を積極的に満
たす株を過産生性適性株と命名する。次いで、同時形質
転換／選択のさらに別のサイクルをこの過産生性適性株
から遂行することにより、フラグメントＣ、ＤまたはＦ
を再増幅することができる。

【００９２】この方法の利点は、興味の対象であるフラ
グメントの増幅により得られるものに加えて、法定規則
の見地からさらに許容性の高い、選択マーカーを欠く形
質転換体を構築することである。

【表３】

【００９３】２) フラグメントＣ、ＤまたはＦおよび
プラスミドpＢＴ３でＳＥＢＲ１０３の同時形質転換後
主要選択マーカーを欠く過産生性形質転換体の選択。 下記の表は得られた結果を要約したものである。 同時形質転換 フラグメントＦ フラグメントＣ フラグメントＤ 量 ０.５μg ２μg ０.５μg 選択プラスミド 環状 環状 直線状 初代形質転換体 ４ １３７ １０６ 過産生性初代 １ ２６ ３３ 形質転換体 ベノミル分離体 １ ４＊ ８＊＊ 過産生性ベノミル ０ ２ ７ 被分離体 過産生性適性株 ０ １ ４ フラグメントＣでは過産生性該当株は得られなかった。
このことは初代被形質転換体数が低いことを考慮すると
驚くべきことではない。 ＊１２個の過産生性初代被形質転換体の子孫に対して行
った選択 ＊＊２１個の過産生性初代被形質転換体の子孫に対して
行った選択

【００９４】フラグメントＤにより得られた過産生性適
性株を２リットル発酵槽中で試験すると、１.９g／lの
凝結活性を生じたが、対照株は１.２g／lの凝結活性し
か生じなかった(この故、過産生性係数は＋１.５８であ
る)。ＳＥＢＲ３５７４株のサザーン・ブロッティング
によるゲノムＤＮＡの分析は、それが直列での２コピー
を含め、フラグメントＤの少なくとも３つの追加コピー
を組み入れていることを示した。フラグメントＦにより
得られた４つの過産生性適性株の中で、ＳＥＢＲ３９１
２株を２リットル発酵槽中で試験すると、２.４g／lの
凝結活性が生じた(この故、対照株に対する過産生性係
数は＋２である)。サザーン・ブロッティングによるゲ
ノムＤＮＡの分析は、それが頭−尾配向に従い直列でフ
ラグメントＦの少なくとも５つの追加コピーを組み入れ
ていることを示した。

【００９５】得られた過産生性株からは、選択プラスミ
ドの組み込みは全く検出されなかった。従って、これら
の株は、同時形質転換／選択のさらに別のサイクルに付
され得る。さらに、これらの株について観察された過産
生性係数を組み込まれたコピーの推定数と比較すると、
得られた割合は０.２の範囲であり、フラグメントＣを
含むプラスミドpＥp１の２つの追加コピーが組み込まれ
た３０Ｐn形質転換体の場合約１であることが見出され
た。従って、これは、フラグメントＤの５'末端に位置
するＢglII部位の上流からＢamＨＩ部位までに、エンド
チアペプシン遺伝子の強力な発現に重要な調節配列が存
在することを示唆している。

【００９６】セクション１３:プラスミドpＥＭＲ７１
３、すなわち、アスペルギルス・ニデュランス(Ａsperg
illus nidulans)のグリセルアルデヒド−３−燐酸デヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子のプロモーター領域を
含むクリホネクトリア・パラシティカ(Ｃ．parasitica)
におけるプレプロエンドチアペプシン発現用ベクターの
構築。 プラスミドpＡＮ５２(プント等、１９８７、「ジーン」
(Ｇene)、５６、１１７−１２４)は、アンピシリン耐性
をコードする遺伝子およびpＵＣ１８の複製開始点に加
えて、アスペルギルス・ニデュランス(Ａspergillus ni
dulans)のグリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナ
ーゼ(gpd)をコードする遺伝子のプロモーター領域[プン
ト等、「ジーン」(Ｇene)、９３、(１９９０)１０１−１
０９]およびtrpＣ遺伝子のターミネーター領域[ムラニ
ー等、「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネテ
ィクス」(Ｍol．Ｇen．Ｇenet.)(１９８５)１８９、３７
−４５]を有する。プロモーター領域およびターミネー
ター領域は、制限酵素ＮcoＩおよびＭluＩにより認識さ
れるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列により分離され
る。これらの配列はプラスミドpＡＮ５２に特有のもの
である。ＮcoＩ部位の配列、すなわちＣＣＡＴＧＧは、
それが大多数の蛋白質における開始コドンであるメチオ
ニンをコードするＡＴＧコドンを含むため、特に有用で
ある。この実験の目的は、上記発現シグナルを用いてエ
ンドチアペプシンをコードする遺伝子を発現させること
である。エンドチアペプシンをコードする遺伝子の組み
込みは、下記セクション１５で詳述されている、ＰＣＲ
(ポリメラーゼ連鎖反応)技術により行なわれる。

【００９７】１−ＰＣＲに使用されるプライマーの記
載。 ＰＣＲによる遺伝子増幅により、増幅される配列に修飾
が加えられる。この特性を用いることにより、エンドチ
アペプシンをコードする遺伝子のプレプロ配列の５'末
端にＮcoＩ部位が導入され、エンドチアペプシンをコー
ドする遺伝子の非暗号化３'末端にＭluＩ部位が導入さ
れる。従って、２種のプライマーの配列は次の通りであ
る: −ＮcoＩ部位をもつ５'プライマー

【化２２】 このプライマーは、主として a)制限酵素ＮcoＩにより認識される配列:ＣＣＡＴＧＧ b)エンドチアペプシンのシグナルペプチドの５'末端の
修飾配列 により構成される。

【００９８】この修飾は、メチオニンの後の第１コドン
の変更により構成される。事実、セリンをコードするＴ
ＣＴコドンは、アラニンをコードするＧＣＴコドンと置
き換えられている。この修飾は、シグナルペプチドの効
力に影響を及ぼさない。−ＭluＩ部位をもつ３'プライ
マー

【化２３】 このプライマーは、主として a)制限酵素ＭluＩにより認識される配列:ＡＣＧＣＧＴ b)第２図のヌクレオチド１９２１および１９４０間に位
置する配列に相補的な配列である、エンドチアペプシン
の非暗号化３'末端の配列 により構成される。

【００９９】２−修飾エンドチアペプシンをコードする
遺伝子を含む増幅フラグメントの製造。 セクション１に記載されている生成物のプラスミドp４
７２を鋳型として用いる。 a)ＰＣＲ反応 予めＰ１０カラムで精製しておいた１００ngのプラスミ
ドp４７２を、１００ngの５'プライマー、１００ngの
３'プライマー、２ミリモルのＭgＣl₂、０.２ミリモル
のdＮＴＰおよび５μlの１０倍濃縮した反応混合物(最
終量:６７ミリモルのトリス−ＨＣl(pＨ８.８)、１６.
６ミリモルの(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、１ミリモルのβ−メルカ
プトエタノール、６.７ミリモルのＥＤＴＡ、０.１５％
のトリトンＸ−１００、２００g／mlのゼラチン)と混合
する。次いで、水を加えることにより混合物の容量を５
０μlにする。こうして得られた反応混合物を９４℃で
４分間インキュベーションし、次いで５０℃の温度に
し、４分間維持する。次いで、２.５単位に等しい０.５
μlのＴaqポリメラーゼ(ベーリンガー・マンハイム参照
番号１１４６−１６５)を加える。次に、反応混合物を
パラフィンで覆うことにより、水溶液の蒸発を防ぐ。増
幅は１８反応サイクル間で行なわれ、その段階は次の通
りである。 ９２℃で２分間 → 変性 ５０℃で２分間 → ハイブリダイゼーション ７２℃で２分間 → ポリマー化。 １８サイクル後、２０ミリモルのＥＤＴＡ溶液を加える
ことにより酵素反応を止める。次いで、約１６２０bpの
予測されたサイズを有する、こうして増幅されたＤＮＡ
フラグメントを単離し、１％アガロース・ゲルで精製
し、Ｐ１０カラム(ファルマシア)において透析し、次い
で、酵素ＮcoＩおよびＭluＩにより同時に加水分解す
る。加水分解後、フラグメントをＰ１０カラムで精製す
る。

【０１００】b)プラスミドpＥＭＲ７１３の製造。 プラスミドpＡＮ５２のＤＮＡを、制限酵素ＮcoＩおよ
びＭluＩにより加水分解する。gpd遺伝子のプロモータ
ー領域、エシェリヒア・コリの複製開始点、アンピシリ
ン耐性をコードする遺伝子およびtrpＣターミネーター
をもつフラグメントを精製する。このフラグメント１０
０ngを、ＤＮＡリガーゼの存在下、エンドチアペプシン
遺伝子をもつ増幅フラグメント１００ngへライゲーショ
ンする(上記サブセクション２参照)。次いで、ライゲー
ション混合物を用いて、ＲＲＩ株を形質転換する。生成
したプラスミドは、修飾エンドチアペプシンをコードす
る遺伝子がgpdのプロモーター領域およびtrpＣのターミ
ネーター領域の制御下に置かれているpＥＭＲ７１３で
ある。

【０１０１】プロトプラストの製造。 セクション６参照。 プラスミドpＥＭＲ７１３およびプラスミドpＢＴ３によ
るＳＥＢＲ３７００株のプロトプラストの同時形質転
換。 セクション６参照。 得られた約２０００の形質転換体は、０.５mg／lのベン
レートを含む寒天培地Ｂにおいて生育し得る。これは、
これらのコロニーが全て少なくとも１つのプラスミドp
ＢＴ３をもつことを示している。

【０１０２】エンドチアペプシン生産性形質転換株の選
択。 Ａ)一般的方法 a)カゼイン含有寒天培地における選択。 ２０００ベノミル耐性コロニーの菌糸体移植物を、カゼ
イン含有寒天培地(培地Ｅと称す)において継代培養す
る。前記培地の組成は、上記表８に詳記されている。こ
の培地において、プロテアーゼを生産するクリホネクト
リア・パラシティカ(Ｃryphonectria parasitica)コロ
ニーは、面積が分泌されたエンドチアペプシンの量に比
例する沈澱のハロー（halo）を生じる。生産性株は、沈
澱のハローの存在に基づいて採用される。これらの生産
性株の分生子の標本を、セクション１.１)で使用された
方法に従い作成する。さらに、５μg／mlのペプスタス
チンという、アスパラギン酸プロテアーゼを特異的に阻
害する物質を培地Ｅへ加えることにより、過産生性株で
観察されたハローの増大は縮小されることが証明され
た。この結果は、観察された作用が事実上アスパラギン
酸プロテアーゼの過産生によるものであることを示す。
凝結のハローを生成し得る３つの形質転換体を単離し
た。対照実験は、プラスミドpＢＴ３およびpＥＭＲ７１
３により形質転換された組換えクローン(クローン１、
クローン２およびクローン３と称す)のハローのサイズ
が、ＳＥＢＲ１０３株の場合に得られるものと同等であ
ることを示す。

【０１０３】b)フラスコでの試験による液体培地におけ
る選択。 この結果を確認するため、フラスコでの生産性試験を、
４０mlの培地Ｆ(７セクション参照)を含む２５０mlフラ
スコの接種により行った。次いで、フラスコを、４８時
間２２０rpmに調節した偏心回転振動器上２８℃でイン
キュベーションする。各株について、３つの異なるフラ
スコで培養を行い、３フラスコに関する凝結活性の検定
結果の平均を計算した。対照は、非形質転換クリホネク
トリア・パラシティカ(Ｃryphonectriaparasitica)株Ｓ
ＥＢＲ１０３により構成される。凝結活性の検定は、１
９８１年３月２０日のジュルナル・オフィシエル・ド・
ラ・レプブリク・フランセーズ(Ｊournal Officiel de
la Republique Francaise)(フランス共和国の公式刊行
物)(セクションＣ)で発表された、凝固溶液の酵素含有
量の公式測定方法(セクション７で要約している)に従い
行なわれる。

【０１０４】c)クローン１、２および３により分泌され
る酵素の分析。 発酵物は生産性形質転換体の培養後に得られなければな
らず、非形質転換クリホネクトリア・パラシティカ(Ｃr
yphonectria parasitica)対照株ＳＥＢＲ３７００の発
酵物を遠心分離に付すことにより、菌糸体の塊を除去し
た。１００℃で５分間ＳＤＳの存在下での上清における
蛋白質の変性後、ＳＤＳの存在下ポリアクリルアミド・
ゲル電気泳動を行った。クーマシー・ブルーで染色後、
配列から誘導された(第１図参照)、成熟エンドチアペプ
シンの分子質量に対応し、生産性形質転換体の場合にも
対照株の場合と同じ強度を有する、３６kＤa領域におけ
る分子質量の優勢な帯、および過産生性形質転換体およ
び対照株において同一である重要性の劣る帯が観察され
る。

【０１０５】さらに、過産生性形質転換体および非形質
転換対照株の培養上清における抗原−抗体反応(レンネ
ッテスト・キット、フランス・バイオケム)によって、
分泌された酵素は、１９８１年３月２０日のジュルナル
・オフィシエル・ド・ラ・レプブリク・フランセーズ
(Ｊournal Officiel de la Republique Francaise)(フ
ランス共和国の公式刊行物)で報告された同定方法に従
い、クリホネクトリア・パラシティカ(Ｃryphonectria
parasitica)の場合と同一であることが証明された。さ
らに、分泌された酵素の凝結活性対蛋白質分解活性の割
合を評価した。g／lで表される凝結活性は、フィールズ
による「バイオケミカル・ジャーナル」(Ｂiochem．Ｊ.)
(１９７１)１２４:５８１−５９０に記載されたＴＮＢ
Ｓ試薬を用いて、ジメチルカゼインの蛋白質分解後に現
れたアミノ基を検定することにより測定される。この割
合は、過産生性形質転換体の場合０.０４０ないし０.０
４５であり、非形質転換対照株により得られた値に非常
に近い。これら３つの試験から、エンドチアペプシンは
事実上クローン１、２および３により特異的に生産され
たという結論に達し得る。この実験は、プロモーター領
域および異種ターミネーター領域(クリホネクトリア・
パラシティカに属していない)を用いると、クリホネク
トリア・パラシティカ(Ｃ．parasitica)におけるエンド
チアペプシンをコードする遺伝子の発現が可能であるこ
とを示す。

【０１０６】セクション１５.エンドチアペプシン前駆
体をコード化している相補的ＤＮＡのＰＣＲ法による増
幅 １)クリホネクトリア・パラシティカのメッセンジャー
ＲＮＡ類の分離 クリホネクトリア・パラシティカＳＥＢＲ１０３株をエ
ンドチアペプシン産生条件下に培養した。ガーゼ濾過に
より菌糸体を採取し、水洗し、液体窒素中で凍結した。
凍結菌糸体１５ｇ(湿潤重量)を溶解緩衝液４５mlにけん
だくし、同容のビーズ(直径０.４５μｍ)中にとる。溶
解緩衝液は４Ｍグアニジン・チオシアン酸塩、１０mＭ
トリスＨＣl(pＨ７.６)、１０mＭＥＤＴＡおよび５０mg
/lβ−メルカプトエタノールからなるものである。菌糸
体けんだく液を５分間磨砕する。磨砕物を回収しビーズ
を沈澱後除去する。約４５mlの上清をとり、塩化リチウ
ムを最終濃度３Ｍになるように加え、０℃で保存する。
２日後、上記溶液を10000rpmで６０分間遠心する。上清
を除き、ペレットを３ＭＬiＣl４０mlに入れる。得られ
たけんだく液を10000rpmで１時間３０分遠心する。プロ
ティナーゼＫ(シグマ社)４０μg/ml、ＳＤＳ(０.１％w/
v)および２０mＭＥＤＴＡを加える。混合物を３７℃で
３時間インキュベートする。エタノール２容で沈澱を生
起させ、沈澱物を７０％エタノールで洗浄する。ついで
ペレットをＴＥ緩衝液(１０mＭトリスＨＣl、１mＭＥＤ
ＴＡ、pＨ７.５)に入れ、混合物をクロロホルムで２回
抽出し、生成物をエタノールで沈澱させる。ＲＮＡをエ
タノール中−８０℃で保存する。

【０１０７】２)ＲＮＡポリ(Ａ)+フラクションの精製 ＲＮＡ約１mgを４℃(１５０００rpm)で２０分間沈澱さ
せ、７０％エタノールで洗い、乾燥する。ペレットをＴ
Ｅ緩衝液１mlに入れ、旋回させてけんだくする。タイプ
３オリゴ(dＴ)セルロース(コラボラティブ・リサーチ・
インコーポレイテッド、バイオメディカル製品部)を業
者の指示書に従って製造する。ＲＮＡをオリゴ(dＴ)に
加え、ゆるやかに撹拌してビーズを再けんだくし、６５
℃で１時間加温する。けんだく液を０.５ＭＮaＣlに調
整し、１０分間ゆるく撹拌する。ついで、けんだく液を
１０００rpmで１分間遠心し、上清を除き、ペレットを
０.５ＭＮaＣl含有ＴＥ緩衝液で２回洗浄する。上清を
除く。ビーズをＴＥ緩衝液１mlにけんだくし、このけん
だく液を６０℃で１分間加温し、ついでロックステージ
ミキサーで１０分間撹拌して、ポリアデニル化ＲＮＡフ
ラクション(メッセンジャーＲＮＡ)の溶離を行なう。混
合物を１０００rpmで１分間遠心し、溶液中遊離mＲＮＡ
を含む上清と、セルロースビーズのペレットを得る。上
記全操作(溶離から)を反復する。得られた上清を合わ
せ、過剰のビーズを遠心で除き、上清を常法(マニアテ
ィス、前掲)にしたがってＮaＣl含有エタノールで沈澱
させる。

【０１０８】３)ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法の記
載 ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法は、あらかじめ変性し
たＤＮＡの両鎖をプライマーとして２種のオリゴヌクレ
オチドを用い同時にコピーし得る、当業者に周知の技術
である[特に、エールリッヒ等、「ＰＣＲテクノロジー：
プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ・フォー
・ＤＮＡアンプリフィケーション(ＰＣＲ Ｔechnolog
y：Ｐrinciples and Ａpplications for ＤＮＡ ampli
fication)」マクミラン・パブリッシャーズ・リミテッド
(英国)１９８９年刊、および、イニス等、「ＰＣＲプロ
トコールズは(ＰＣＲ Ｐrotocols)」アカデミック・プ
レス・インコーポレイテッド(米国カルフォルニア州サ
ンジエゴ)１９９０年刊の研究参照］。この方法の原理
を以下に要約して示す。それぞれが３段階からなる多数
のサイクルが関心のあるＤＮＡ鎖の増幅をもたらす。そ
の３段階とは、次の通りである。 a)鋳型の変性 b)鋳型に対するプライマーのハイブリダイゼーション c)プライマーの延長 数時間のサイクル後、一般にＴaqポリメラーゼと称され
るテルムス・アクアティクス(Ｔhermus aquaticus)の熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、原鋳型の数百・数
千のコピーが生ずる。

【０１０９】このＰＣＲ法は下記３段階を反復すること
に基づく。 a)鋳型の変性 ２本鎖ＤＮＡを高温(９２℃−９６℃)で約２分間インキ
ュベートすることにより１本鎖ＤＮＡに変性する。 b)プライマーのハイブリダイゼーション プライマーは増幅すべき領域の端にハイブリダイズする
一対の合成オリゴヌクレオチドである。２種のプライマ
ーは反対側の鎖にハイブリダイズする。プライマーは、
プライマー鋳型複合体の生成に好都合なように、過剰に
加える。 c)プライマーの延長 ５’から３’へのプライマー鋳型複合体の延長をＴaqポ
リメラーゼが行なう段階は７２℃で実施する。ＰＣＲ法
では、関心がある生成物は第３サイクルで出現し、その
後著しく増幅する。サイクルが進むにつれて、増幅生成
物は急速に主要鋳型となり、そこにプライマーがハイブ
リダイズする。

【０１１０】４)使用するプライマーの記載 ２種の合成オリゴヌクレオチドはフラグメントＡの配列
から製造した(第２図)。第１のオリゴヌクレオチド(プ
ライマー１と称する)は下記配列

【化２４】 をもち、２つの異なる領域を有する。エンドヌクレアー
ゼＨindIIIの認識部位に対応するクローニング部位ＡＡ
ＧＣＴＴを有する領域１と、フラグメントＡのコード鎖
の非コード化領域にハイブリダイズさせる配列でプレプ
ロエンドチアペプシンをコード化する配列の３’側に位
置する領域２である(第２図、１８７０−１８８１位)。

【０１１１】第２のオリゴヌクレオチド(プライマー２
と称する)は下記配列

【化２５】 をもち、同様に２つの異なる領域を有する。エンドヌク
レアーゼＮdeＩの認識部位に対応するクローニング部位
ＣＡＴＡＴＧを有し開始コドンＡＴＧの配列を含む領域
１と、最初のメチオニンに続くプレプロエンドチアペプ
シンの最初の５個のアミノ酸をコード化するものに等し
いヌクレオチド配列を有する領域２である。この領域は
フラグメントＡの非コード化鎖とハイブリダイズするも
のである。

【０１１２】５)エンドチアペプシンの相補的ＤＮＡを
示す増幅フラグメントの産生 エンドチアペプシンをコード化するメッセンジャーＲＮ
Ａを含むことが知られるメッセンジャーＲＮＡプールを
鋳型として用いる。逆転写酵素を用いる酵素反応を増幅
前にメッセンジャーＲＮＡについて実施する。 a)総ＲＮＡ製品中におけるエンドチアペプシンコード化
メッセンジャーＲＮＡの存在の実証 イ)ノーザンブロッティング ノーザン法を用いる(マニアティス)。この方法は、基本
的に、変性条件(２０mＭ ＭＯＰＳ、pＨ７、５mＭ酢酸
ナトリウム、１mＭＥＤＴＡ、６.６％ホルムアルデヒ
ド)下１.０％アガロースゲル上で電気泳動することによ
り約１０μg総ＲＮＡを分離することからなる。分離し
たＲＮＡはニトロセルロースシートに移す(マニアティ
ス、前掲)。これにより２種の異なるニトロセルロース
シートを製造し、その一方を放射能標識プローブ１とハ
イブリダイズし、他方を放射能標識２とハイブリダイズ
させる(プローブの製造に関するセクション１(２)、１
(３)および³²Ｐ標識参照)。

【０１１３】ロ)放射能標識プローブ１および放射能標
識プローブ２とのハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション条件はセクション１(５)に記載
したのと同一である。ハイブリダイゼーション後、各フ
イルターを個々に０.５ＸＳＳＣ含有溶液中４２℃で洗
う。ついでフイルターを写真フイルム(コダックＸＡＲ
５)に一夜露出する。フイルムを分析すると、ＲＮＡ集
団が特異的に両プローブに対応し、エンドチアペプシン
をコード化するメッセンジャーＲＮＡが製品中に存在す
ることを示す。

【０１１４】ｂ)逆転写酵素を用いる反応 逆転写酵素とメッセンジャーＲＮＡ１μgの反応は、１
０mＭジチオスレイソールＤＴＴ、ＲＮasin(ＲＮエース
インヒビター、ゼノフィット)０.００４０Ｕ/μl、１０
mＭ濃度の４種のデオキシリボヌクレオチドトリホスフ
ェートdＮＴＰの混合物、組成：５０mＭトリスＨＣl(p
Ｈ８.３)、２０mＭＫＣlおよび１０mＭＭgＣl₂の緩衝
液、逆転写酵素(ストラタジーン)０.７単位および０.１
ngのプライマー１と０.１mgのプライマー２(最終容量１
０μl)の存在下に行なう。４６℃で２分の１時間インキ
ュベーション後、２０mＭＥＤＴＡを加えて反応を停止
させ、ついで６５℃で５分間混合物をインキュベートす
る。

【０１１５】ｃ)ＰＣＲ反応 上記混合物を、小分子(ヌクレオチド、ＥＤＴＡ等)を除
くためＰ１０ポリアクリルアミドゲルカラムでクロマト
グラフィーにかける。得られた溶液を９２℃で２分間イ
ンキュベートして相補的ＤＮＡ鎖とメッセンジャーＲＮ
Ａ鎖からなる鋳型を変性する。１００ngのプライマー
１、１００ngのプライマー２、２mＭ ＭgＣl₂、０.２m
ＭdＮＴＰおよび１０倍濃縮反応混合物５μl(最終量、
６７mＭトリスＨＣl(pＨ８.８)、１６.６mＭ(ＮＨ₄)₂Ｓ
Ｏ₄、１mＭβ−メルカプトエタノール、６.７mＭＥＤＴ
Ａ、０.１５％トリトンＸ−１００、２００g/mlゼラチ
ン)を試験管に入れる。混合物の容量を水で５０μlにす
る。得られた反応混合物を９４℃で４分間インキュベー
トし、４１℃にし、４分間維持する。４１℃の温度は、
当業者に周知の実験式で計算したオリゴヌクレオチドの
半変性温度より５度低い。２.５単位に対応する０.５μ
lのＴaqポリメラーゼ(ベーリンガーマンハイム、Ｎo.１
１４６−１６５)を加える。ついで、反応混合物をパラ
フィンで覆って水の蒸発を防ぐ。

【０１１６】増幅は３０反応サイクルで行ったが、１サ
イクルが含む段階は次の通りである。 ９２℃２分→変性 ４１℃２分→ハイブリダイゼーション ７２℃２分→ポリメリゼーション ３０サイクル後、２０mＭＥＤＴＡを加えて酵素反応を
停止させる。増幅したＤＮＡフラクションは、約１３０
０bpの寸法をもつと予測されるものであるが、これを分
離し、１％アガロースゲル上で精製し、Ｐ１０カラムで
透析し、当業者に周知の方法により酵素ＮdeＩおよびＨ
indIIIで同時加水分解(マニアティス、前掲)して、Ｎde
ＩおよびＨindIII付着末端を形成する。加水分解後、フ
ラグメントをＰ１０カラムで精製する。

【０１１７】セクション１６.エンドチアペプシン前駆
体をコード化するエシエリヒア・コリ(Ｅ.Ｃoli)相補的
ＤＮＡのクローニング・発現用ベクターであるプラスミ
ドp５７２の構築。この相補的ＤＮＡの配列決定と後者
の発現。 １)プラスミドp５７２の構築 プラスミドp５７２は、特許出願ＰＣＴ／ＦＲ９０／０
０５３２号に記載されたエシエリヒア・コリ(Ｅ.coli)
中でアスペルギルス・フラブス(Ａspergillus flavus)
ウレートオキシダーゼの相補的ＤＮＡをクローン化、発
現するベクターであるp４６６から構築されたが、上記
ベクターは複製開始点とアンピリシン耐性遺伝子を含む
プラスミドpＢＲ３２７のフラグメント、エシエリヒア
・コリ(Ｅ.coli)の合成プロモーター(ロドリゲおよびシ
ャンブルラン、「プロモータース−ストラクチュア・ア
ンド・ファンクション(Ｐromoters−Ｓtructure and fu
nction)」１９８２年、プリーガー社)、シャイン−ダル
ガルノ配列を有し、その後に単一ＮdeＩおよびＨindIII
部位を有するポリリンカー、転写ターミネーター(ファ
ージfd由来)およびlacで遺伝子をもつ。

【０１１８】a)プラスミドp４６６の構築 エシエリヒア・コリ(Ｅ.coli)中での発現用ベクターで
あるプラスミドp４６６を製造した。これは、複製開始
点とアンピシリン耐性遺伝子を含めたpＢＲ３２７フラ
グメントを有する。また、エシエリヒア・コリ(Ｅ.col
i)の合成プロモーター(ロドリゲおよびシャンブルラ
ン、「プロモータース−ストラクチュア・アンド・ファ
ンクション(Ｐromoters−Ｓtructure and function)」１
９８２年、プリーガー社)、シャイン−ダルガルノ配列
と、続く単一ＮdeＩおよびＫpnＩ部位含有ポリリンカ
ー、転写ターミネーター(ファージfd由来)およびlacで
遺伝子を有する。このプラスミドは、hＧＨ遺伝子を有
するフラグメントをウレートオキシダーゼcＤＮＡで置
換することによりエシエリヒア・コリ(Ｅ.coli)中でhＧ
Ｈを発現するためのプラスミドから構築した。プラスミ
ドp４６６の構築を第６図、第７図、第８図、第９図お
よび第１０図を参照しつつ以下に詳述する。

【０１１９】１)プラスミドp３７３.２の構築 使用したストラテジーンによると、公衆が入手可能な既
存プラスミドから得られるフラグメントと、現在一般に
用いられる技術による合成フラグメントを使用する。用
いたクローニング技術は、マニアティス、フリッツおよ
びザンブルツク、コールド・スプリンクグ・ハーバー・
ラボラトリー(１９８２年)の記載したものである。オラ
ゴヌクレオチド合成は、バイオサーチ４６００ＤＮＡ合
成機を用いて行なう。特許出願ＥＰ−Ａ−０２４５１３
８に記載されＣＮＣＭに１９８６年２月１７日付Ｉ−５
３０として寄託されたプラスミドp１６３.１(第６図)
を、酵素ＰvnＩおよびＢamhＩ消化に付した。このプラ
スミドはhＧＨコード化遺伝子を含む。ＰvuＩ−ＢamhＩ
フラグメント(以下、フラグメント１と称する)は第６図
に示すように制限酵素ＸhoＩの作用部位を含むが、これ
を精製した。同様に、当業者に周知(ソベロン等、ジー
ン(Ｇene)９巻(１９８０年)２８７−３０５頁)のプラス
ミドpＢＲ３２７を、酵素ＰvuＩおよびＢamＨＩ消化に
付した。ＰvuＩ−ＢamＨＩフラグメント(以下、フラグ
メント２と称する)は複製開始点を含むが、これを精製
した。

【０１２０】ついで、laci遺伝子およびそのプロモータ
ーを含み、第７および８図に示すプラスミド中のフラグ
メントの配向を明示するため鎖の両端に数字１と２を付
した配列をもつ合成ＢamＨＩ(１)−ＢamＨＩ(２)フラグ
メントであるフラグメント３を製造した。その配列を下
記に示す。

【化２６】 ついで、フラグメント１、２及び３を次いで第７図に示
すようにプラスミドp１６０を得るように連結した。

【０１２１】このプラスミドは制限酵素ＨincII及びＰs
tＩにより部分分解に付した。複製起源を含み第７図に
示される大きなＨincII−ＰstＩフラグメントは、次い
で以下に示す、hＧＨの天然前駆体の最初の４４アミノ
酸をコード化する配列及びこの配列の上流調節シグナル
を持つ合成ＤＮＡフラグメントであるフラグメント４に
連結した。 フラグメント４

【化２７】

【０１２２】このフラグメントにおいて、アミノ酸は以
下のコード化に従った文字により示す。 Ａ＝アラニン Ｍ＝メチオニン Ｃ＝システィン Ｎ＝アスパラギン Ｄ＝アスパラギン酸 Ｐ＝プロリン Ｅ＝グルタミン酸 Ｑ＝グルタミン Ｆ＝フェニルアラニン Ｒ＝アルギニン Ｇ＝グリシン Ｓ＝セリン Ｈ＝ヒスチジン Ｔ＝スレオニン Ｉ＝イソロイシン Ｖ＝バリン Ｋ＝リジン Ｗ＝トリプトファン Ｌ＝ロイシン Ｙ＝チロジン このフラグメントにおいて、プロモーター配列及びこの
分野の当業者によく知られたシャイン−ダルガルニ配列
の配列−３５(ＴＴＧＣＴＴ)及び−１０(ＴＡＴＡＡＴ)
は連続してアンダーラインをする。これによりプラスミ
ドp３８０.１を得た。

【０１２３】次いでプラスミドp３８０.１は、上記フラ
グメント４の小さいＣlaＩ−ＮdeＩフラグメントが除去
し、それに代って下のＣlaＩ−ＮdeＩフラグメントが置
き換るよう制限酵素ＣlaＩ及びＮdeＩによる消化に付し
た。

【化２８】 得られるプラスミドはプラスミドp３７３.２(第８図)で
ある。

【０１２４】２)プラスミドp４６６の構築 プラスミドp３７３.２を酵素ＢglII及びＨindIIIによる
二重消化に付した。この消化から導かれた大きなフラグ
メントを精製し、その配列が下に示され、hＧＨ遺伝子
末端および、その後３’末端でのＫpnＩ及びＳnaＢＩク
ローニング部位の再形成を意図するＤＮＡフラグメント
と結合した。

【化２９】 このフラグメントはＢglII及びＨindIII付着末端を含
む。形成される新しいプラスミドp４６２(第９図参照)
は即ち、発現ベクター中に尿酸オキシダーゼのｃＤＮＡ
をを有するフラグメントをクローニングするためにＫpn
Ｉ部位及びＮdeＩ部位を含む。

【０１２５】尿酸オキシダーゼのほぼ１.２−ＫbcＤＮ
ＡＣ(クローン９Ｃ)を持つpＴＺ１９Ｒから誘導される
ハイブリッドプラスミドは単一ＫpnＩ部位を含む。この
部位は、cＤＮＡのクローニング部位の少しの塩基対下
流に局在する。さらに、尿酸オキシダーゼのＤＮＡは、
５’末端に近接して位置するＡccＩ部位を含む。つい
で、このcＤＮＡの大きな部分を含むＡccＩ−ＫpnＩフ
ラグメントを分離し精製した。さらにその配列が下に与
えられ、

【化３０】 cＤＮＡの５’末端を再形成するよう意図される２つの
相補オリゴヌクレオチドを合成した。得られたこの合成
フラグメントは、ＮdeＩ末端及びＡccII末端を有する。
フラグメント及び合成配列は、ＫpnＩで及びＮdeＩでカ
ットした発現ベクターと連結した。この３フラグメント
連結反応は、p４６６と名づける、得られるべきエセリ
シア・コリ(Ｅ.coli)に対する尿酸オキシダーゼの発現
用ベクターを得ることを可能にする(第１０図参照)。こ
のプラスミドは、制限酵素によって一連の加水分解に付
し、このことは予想される制限部位、特に尿酸オキシダ
ーゼをコード化する遺伝子により運ばれる制限部位の存
在の照明を可能にした。

【０１２６】従って、プラスミドp４６６は、構築によ
って、下記配列の尿酸オキシダーゼをコード化する遺伝
子を含む。

【化３１】 (エイ.フラブス(Ａ.flavus)から分離したcＤＮＡのヌク
レオチドと異なるヌクレオチドは、上記配列においてア
ンダーラインを引いている。これらの差は、ＡＴＧの下
流に、ヌクレオチド配列が原核遺伝子に通常出存在する
ものにより密接に順応するヌクレオチド配列を持つよう
に、合成ＡccＩＩ−ＫpnＩフラグメントに導入され
た。)

【０１２７】プラスミドp４６６を酵素ＮdeＩ及びＨind
IIIで加水分解し、laci遺伝子を運ぶフラグメント、複
製の起源及びアンピシリン耐性をコード化する遺伝子を
この分野の当業者に知られた技術に従って精製した(マ
ニアティス、前掲)。このフラグメントはエンドヌクレ
アーゼＮdeＩ及びＨindIIIで予め加水分解した増幅相補
ＤＮＡフラグメントに連結した。この連結の生成物はエ
シエリシア・コリ(Ｅ.coli)株Ｋ１２ＲＲＩ(ジブコＢＲ
Ｌ−ref.：５２０−８２６１ＳＡ)に形質転換に用い
た。クローン５１２と名づけられ、p５７２として引用
されるプラスミドを含む形質転換体を採用した。

【０１２８】２)相補ＤＮＡの配列の測定 プラスミドp５７２を１方でエンドヌクレアーゼＣlaＩ
及びＫpnＩで、他方で酵素ＫpnＩ及びＨindIIIで加水分
解した。(エンドヌクレアーゼＫpnＩはフラグメントＡ
のコード配列をカットする)。蛋白をコード化するＤＮ
Ａの５末端を運ぶＣlaＩ−ＫpnＩフラグメント及び蛋白
をコード化するＤＮＡの３’末端を運ぶＫpnＩ−ＨindI
IIフラグメントを、ファージＭ１３mp１９(ファルマシ
ア)にコード化し、サイクロン技術(ＩＢＩの「ラククロ
ンＩバイオシステム」)により配列した。得られた相補Ｄ
ＮＡのヌクレオチド配列を第１１図に示す。相補ＤＮＡ
のコード配列がゲノムＤＮＡのそれと正に同一であり、
わずかの差は、後者が正しく局在する３つのイントロン
により中断されていることが観られる(セクション１、
７参照)。

【０１２９】３)プレプロエンドチアペプシン(preproen
dothiapepsin)の相補ＤＮＡの発現 エセリシア・コリ(Ｅ.coli)株Ｋ１２ＲＲＩ(ジブコＢＲ
ＬＲef：５２０−８２６１Ａ)を、その配列を２)で決定
したプレプロエンエンドチアペプチンの相補ＤＮＡを運
ぶプラスミド５７２と共に、及び陰性対照プラスミドp
ＢＲ３２２と共にアンピシリン耐性に形質転換した。ア
ンピシリン耐性コロニーを再場合において得た。各タイ
プの１コロニーを１００μg/mlのアンピシリンを補充し
た(表４に特定したが寒天のない組成の)ＬＢ液体培地に
培養した。一夜３７℃で撹拌後、両培養物を１００μg/
mlのアンピシリンを補充した液体ＬＢ培地に１００倍に
希釈した。１時間の培養後、ＩＰＴＧ(イソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド)を３時間で１mＭの濃度まで
加えた。

【０１３０】ウエスタンブロッティングによるプレプロ
エンドチアペプシンの免疫測定 ａ)方法 ＯＤ＝１を有する０.２mlに対応するアリコットフラク
ションを、ＩＰＴＧによる誘発の３時間後得た培養培地
から取る。アリコットを遠心し上清を除く。次いでペレ
ットを、以下の段階を含むこの分野の当業者によく知ら
れた技術のウエスタンブロッティングに付す。 −０.１２５Ｍトリス−ＨＣlpＨ６.８、４％ＳＤＳ、
０.００２％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロ
ール及びβ−メルカプトエタノールから成る充填緩衝液
(loading buffer)と呼ばれる緩衝液中１０分間煮沸する
ことによるペレットの可溶化(コー.ケイ.ラームリ.ネイ
チャー(Ｎature)、２２７(１９７０)、６８０−６８
５))。 −ラームリ(ユー.ケイ.ラームリ.ネイチャー(Ｎatur
e)、２２７、(１９７０)、６８０−６８５)により記載
されたプロトコールによる溶解物中に含まれる異なる蛋
白の電気泳動分離。 −ニトロセルロースフイルター上のゲルに含まれる該蛋
白の継代(エイチ.トウビン等、プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス・ユー
エスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)７６、(１９
７９)４３５０−４３５４)の技術による)。 −免疫検出、バーネッテ(ダブリュ・ダブリュ・バーネ
ッテ、アナリティカル・バイオケミストリィ(Ａna.Ｂio
chem.)１１２(１９８１)１９５−２０３)により実施、
これは次を含む。組成、１０mＭトリスーＨＣl、１７０
mＭＮaＣl、１mＭＫＣlの緩衝液により１０分間ニトロ
セルロースフイルターをすすぐこと。 ・１００ml当り３gの割合でウシ血清アルブミンを補足
した緩衝液Ａで３０分間３７℃でニトロセルロースフイ
ルターを接触させること。 ・１９８１年３月２０日のジャーナル・オフィシャル・
ド・ラ・レパブリーク・フランセーズ(オフィシャル・
ジャーナル・オブ・ザ・フレンチ・リパブリック)に記
載されたエンドチアペプシンの同空方法に従ってレネテ
スト・バイオケム・キットのポリクローナル抗体で１時
間３７℃でニトロセルロースフイルターを接触させるこ
と。 ・３g／１００mlのウシ血清アルブミンを補足した緩衝
液Ａでニトロセルロースフイルターをすすぐこと。 ・０.１ミクロキューリー／mlの活性を有するヨード−
１２５−標識化蛋白Ｇの溶液で１時間３７℃でニトロセ
ルロースを接触させること。 ・フイルターを緩衝液Ａですすぐこと。 ・フイルターを２枚の吸収性シートの間で乾燥するこ
と。 ・フイルターを放射線写真フイルムと接触させること。 ・フイルムを現像すること。

【０１３１】b)結果 プラスミドp５７２で形質転換した株は、プレプロエン
ドチアベプシンの予想される分子の大きさに相応する明
らかな分子量約４３ＫＤaの蛋白を生成し、これはエン
ドチアペプシンに直接対する抗体により認識され又、対
照株には存在しないことが見られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 エンドチアペプシンのアミノ酸配列を示す第
１図である。

【図２】 フラグメントＡのヌクレオチド配列、縦の線
で示したセクション１０で用いたＢatＥＩＩ部位および
翻訳アミノ酸配列を示す第２図の前半部である。

【図３】 第２図の後半部である。

【図４】 プレプロエンドチアペプシンのアミノ酸配列
を示す第３図である。

【図５】 Ｂ、Ｈ、Ｐ、Ｓp、Ｃ、ＧおよびＳの文字で
記号化したフラグメントＣ、ＢamＨＩ、ＨindＩＩＩ、
ＰetＩ、ＳphＩ、ＳacＩ、ＢglＩＩおよびＳcaＩ部位お
よびフラグメントＣ中に含まれるフラグメントＡ、Ｄ、
ＥおよびＦを示す第４図である。

【図６】 下線を引いた３個のイントロンにより遮断さ
れたプレプロエンドチアペプシンをコードしたゲノムＤ
ＮＡ配列を示す第５図である。

【図７】 プラスミドｐ１６３．１の制限地図を示す第
６図である。

【図８】 プラスミドp１６０の制限地図を示す第７図
である。

【図９】 プラスミドｐ９７３.２の制限地図を示す第
８図である。

【図１０】 プラスミドｐ４６２の制限地図を示す第９
図である。

【図１１】 プラスミドｐ４６６の制限地図を示す第１
０図である。

【図１２】 プレプロエンドチアペプシンをコードする
粗補正ＤＮＡ配列を示す第１１図である。

【図１３】 フラグメントＦのＳphＩ−ＨindＩＩＩの
配列を示す第１２図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/57 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (71)出願人 591067727 ソシエテ・ナシヨナル・エルフ・アキテー ヌ ＳＯＣＩＥＴＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ Ｅ ＬＦＡＱＵＩＴＡＩＮＥ フランス92400−６クールブヴオワ、ラ・ デフアンス、プラース・ド・ラ・クポル２ 番 トウール・エルフ (72)発明者 パトリツク・ジヤラ フランス31320カスタネ−トローザン、リ ユ・デ・イリス・ジヨーン27番 (72)発明者 リシヤール・ルグー フランス31460カラマン、アン・マナール −ル・フアジエ（番地の表示なし） (72)発明者 ジエラール・ロワソン フランス31300トウールーズ、リユ・エ フ・リカルデイ15番 (72)発明者 ヴオアアンジ・ラザナンパラニ フランス31400トウールーズ、リユ・バン ジヤマン・コンスタン51番

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の配列（Ｐ１）を有するエンドチア
   ペプシン： 【化１】 の前駆体をコードする配列の上流に機能的プロモーター
   を含むことを特徴とする、クリホネクトリア・パラシチ
   カ中エンドチアペプシン前駆体の発現のためのカセッ
   ト。
2. 【請求項２】 エンドチアペプシン前駆体が下記の配列
   （Ｐ４）： 【化２】 を有するプレプロエンドチアペプシンである、請求項１
   記載の発現カセット。
3. 【請求項３】 プレプロエンドチアペプシンをコードす
   る配列が下記の配列（Ｎ４ａ）： 【化３】 を含むものである、請求項２記載のカセット。
4. 【請求項４】 プレプロエンドチアペプシンをコードす
   る配列が少なくとも１個のイントロンによって遮断され
   た配列（Ｎ４ａ）を含むものである、請求項２記載のカ
   セット。
5. 【請求項５】 プレプロエンドチアペプシンをコードす
   る配列が下記の配列（Ｎ４ｂ）： 【化４】 である、請求項４記載のカセット。
6. 【請求項６】 プロモーターが、プレプロエンドチアペ
   プシンをコードする遺伝子のプロモーターまたはこのプ
   ロモーターの機能的部分である、請求項１−５のいずれ
   か１項記載のカセット。
7. 【請求項７】 プレプロエンドチアペプシンをコードす
   る遺伝子のプロモーターの機能的部分が、フラグメント
   ＣのＢglＩＩ−ＳｃａＩセグメントである、請求項６記
   載のカセット。
8. 【請求項８】 プレプロエンドチアペプシンをコードす
   る遺伝子のプロモーターの機能的部分が、フラグメント
   ＣのＢａｍＨＩ−ＳｃａＩセグメントである、請求項６
   記載のカセット。
9. 【請求項９】 プロモーターが下記の配列（Ｎ５）： 【化５】 を有するＴＡＴＡボックスを担持している部分を含み、
   配列(Ｎ５)の上流に、フラグメントＡの５'−末端およ
   びフラグメントＣの５'−末端と接しているフラグメン
   トＣのセグメントＸを含み、このセグメントＸは活性化
   領域を含むように選択されているものである、請求項６
   記載のカセット。
10. 【請求項１０】 フラグメントＣのセグメントＸが、下
    記の配列： 【化６】 を有するフラグメントである、請求項９記載のカセッ
    ト。
11. 【請求項１１】 プロモーターが、クリホネクトリア・
    パラシチカ中または他の子のう菌類の線状真菌中に発現
    する遺伝子に由来するものである、請求項１−５のいず
    れか１項記載のカセット。
12. 【請求項１２】 プロモーターが、アスペルギルス・ニ
    ドランスのグリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒ
    ドロゲナーゼをコードする遺伝子に由来するものであ
    る、請求項１１記載のカセット。
13. 【請求項１３】 請求項１−１２のいずれか１項記載の
    カセットにより形質転換され、非形質転換株と比較して
    エンドチアペプシンを過産生することを特徴とする、エ
    ンドチアペプシン産生クリホネクトリア・パラシチカ
    株。
14. 【請求項１４】 優性選択マーカーを欠くものである、
    請求項１３記載の株。
15. 【請求項１５】 宿主株がＣＮＣＭに１９９０年８月３
    １日付番号Ｉ−９９７で寄託されたＳＥＢＲ１０３株で
    ある、請求項１３または１４記載の株。
16. 【請求項１６】 ＳＥＢＲ１０３株と比較して、エンド
    チアペプシンを少なくとも２に等しい過産生ファクター
    を有するものである、請求項１５記載の株。
17. 【請求項１７】 請求項１３−１６のいずれか１項記載
    の株の培養段階、その後の分離および精製段階を含むこ
    とを特徴とする、エンドチアペプシンの製造法。
18. 【請求項１８】 請求項１−１１のいずれか１項記載の
    カセット、および優性選択マーカーによる形質転換段
    階、優性選択マーカーの除去を可能にする胞子形成によ
    る精製段階を伴う、少なくとも１個のサイクルを含むも
    のである、請求項１４記載の株の採取法。