JPH0568570A

JPH0568570A - プロクターゼｂ遺伝子

Info

Publication number: JPH0568570A
Application number: JP26056991A
Authority: JP
Inventors: Kenji Takahashi; 健治高橋; Hidefumi Inoue; 英史井上; Takao Kimura; 貴夫木村; Osamu Makabe; 理真壁
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1991-09-12
Filing date: 1991-09-12
Publication date: 1993-03-23

Abstract

(57)【要約】（修正有）【構成】特定のアミノ酸配列（配列表略）をコードす
るプロクターゼＢ遺伝子、上記のアミノ酸配列をコード
する塩基配列（配列表略）を含むプロクターゼＢ遺伝
子、上記のプロクターゼＢをコードする塩基配列を組み
込んだ発現ベクター、該発現ベクターを導入した細胞並
びに該細胞を培養し、培養物からプロクターゼＢを採取
することを特徴とするプロクターゼＢの製造法。【効果】上記によりプロクターゼＢをコードする遺伝
子がクローニングされ、組換え体の宿主細胞中での発現
に成功し、該酵素の構造が明らかにされた。更に、組換
え体の宿主細胞を用いて産業上有用なプロクターゼＢを
効率よく量産することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、プロクターゼＢ遺伝
子、該遺伝子を含有するベクター、該ベクターにより形
質転換された宿主細胞並びに該細胞を用いるプロクター
ゼＢの製造法に関する。詳しくは、アスペルギルス・ニ
ガー由来の酸性プロテアーゼであるプロクターゼＢをコ
ードする遺伝子、該遺伝子を含有するベクター、該ベク
ターにより形質転換された宿主細胞並びに該細胞を用い
るプロククターゼＢの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】プロク
ターゼは蛋白を加水分解する酵素として、消炎酵素製
剤，消化酵素製剤等の成分に使用されているが、アスペ
ルギルス・ニガー株が生産するプロクターゼは主にプロ
クターゼＡ及びプロクターゼＢ成分より構成されてお
り、プロクターゼＡについては、既に本発明者らによ
り、その遺伝子がクローニングされており、組換え体の
宿主細胞中での発現に成功している。しかし、プロクタ
ーゼＢについては、これを単離・精製し、その構造を決
定したという報告は未だなされていない。

【０００３】また、近年組換えＤＮＡ技術の発達により
遺伝子が単離され、その遺伝子を宿主細胞に導入するこ
とにより、目的とする酵素を量産する技術も可能とな
り、商業上関心のある酵素の遺伝子組換えによる生産も
検討・実施されている。

【０００４】プロクターゼＢは、従来知られている通常
の酸性プロテアーゼ中の典型的なアスパラギン酸型プロ
テアーゼであり、プロクターゼＡとは性質を異にしてい
る（特公昭４３−４４３６公報）。アスペルギルス・ニ
ガー株の染色体中に存在するプロクタ−ゼＢの構造遺伝
子をクローニングし、プロクターゼＢをコードするＤＮ
Ａ塩基配列を決定し、かかるＤＮＡ配列を含む宿主細胞
を創製し、該細胞を用いて該プロテアーゼを生産させる
ことは工業上重要な課題である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アスペル
ギルス・ニガー株(Aspergillus niger var.macrosporu
s) が生産する酸性プロテアーゼに着目し、その中で、
先に本発明者らによってクローニングされたプロクター
ゼＡとは性質を異にするプロクターゼＢについて該プロ
テアーゼを容易に生産する方法を見出すべく鋭意研究を
進めた。その結果、該プロテアーゼをコードする遺伝子
をクローニングし、宿主中で発現させることに成功し、
本発明を完成するに至った。

【０００６】本発明は、配列表の配列番号１記載のアミ
ノ酸配列をコードするプロクターゼＢ遺伝子、配列表の
配列番号１記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を
含むプロクターゼＢ遺伝子、該遺伝子を含むベクター、
該ベクターにより形質転換された宿主細胞並びに該細胞
を培養し、培養物からプロクタ−ゼＢを採取することを
特徴とするプロクターゼＢの製造法を提供しようとする
ものである。

【０００７】本発明の方法に係わる酸性プロテアーゼ活
性を有するプロクターゼＢは、アスペルギルス・ニガー
株、特にアスペルギルス・ニガー株(Aspergillus niger
var. macrosuporus) ＤＢＤ−０４０６により生産され
る。また、本発明のプロクターゼＢ遺伝子は、この菌株
から得ることができる。この菌株は、工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第２７３７号（ＡＴＣＣ
Ｎo.１６５１３）として寄託されている。

【０００８】アスペルギルス・ニガー株からクローン化
されたプロクターゼＢ酵素の遺伝子の塩基配列及びそれ
から推定されるプロクターゼＢのアミノ酸配列を配列表
の配列番号１に示す。表中、上列はクローン化された遺
伝子の全塩基配列であり、このうち６３位のヌクレオチ
ドから１２４４位のヌクレオチドにより３９４個のアミ
ノ酸（下列）から成るポリペプチドがコードされてい
る。

【０００９】このアミノ酸配列のＮ−末端には−６９位
のＭｅｔから−１位のＡｌａまでのシグナル配列及びプ
ロ配列を含み、活性酵素はアミノ酸番号１位から３２５
位までの３２５残基よりなるポリペプチドを有する。以
下に、本発明を段階を追って説明する。

【００１０】ａ．プロクターゼＢの特異的ＤＮＡプロー
ブの作製プロクターゼＢの遺伝子或いは cＤＮＡをＤＮＡプロー
ブを用いてクローニングするためには、アミノ酸配列の
情報が必要である。そこで、本発明者らのグループによ
り決定されたアミノ酸配列を基にしたが、その手順と結
果を以下に述べる。

【００１１】精製プロクターゼＢをトリプシンにより分
解し、精製ペプチドをゲルろ過及び液体クロマトグラフ
ィーにより分離し、その内３本のペプチドフラグメント
についてアミノ酸組成分析を行い、アミノ酸配列をＥｄ
ｍａｎ法を用いたアプライド・バイオシステム（ＡＢ
Ｉ）社のペプチド・シークエンサーにより決定した。ま
た、精製プロクターゼＢのＮ−末端のアミノ酸配列も同
様にして決定した（図１参照）。

【００１２】ＤＮＡプローブは、特異的な塩基配列が長
いほどスクリーニングの確実性が増すので、プロクター
ゼＢ産生菌の全ＤＮＡを鋳型にしたポリメラーゼ・チエ
イン・リアクション（ＰＣＲ）法により数百塩基対の特
異的配列を持ったＤＮＡを増幅して用いた。ＰＣＲ法は
両端の塩基配列がわかっていれば、その間の配列が未知
であっても、そのＤＮＡを得ることができるという利点
がある。

【００１３】本発明の場合、プロクターゼＢの全塩基配
列が未知であるが、本酵素の部分アミノ酸配列がペニシ
ロペプシンと高い相同性を有していることが判明した
（図２参照）ために、ＰＣＲ法によって得られる部分Ｄ
ＮＡの長さもある程度推定される。そこで、決定した部
分アミノ酸配列からペニシロペプシンのアミノ酸配列と
相同性のより高い領域を２個所選んで、可能な塩基配列
をすべて含むオリゴヌクレオチドの混合物を、塩基配列
の縮重を１６通り以下に抑えて数本合成し、ＰＣＲのプ
ライマーとして用いた（図３）。

【００１４】次に、プロクターゼＢ産生菌アスペルギル
ス・ニガー・ヴァール・マクロスポルス（Aspergillus
niger var.macrosporus) DBD-0406(ATCC No.16513)より
調製したｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ反応を行ったとこ
ろ、プライマーａ−１とプライマーｂ−１の組合せ
で約４８０塩基対のＤＮＡが増幅されることがアガロー
ス・ゲルを用いた電気泳動により確認された。ゲルから
ＤＮＡのバンドを切り出し、抽出後、³²Ｐ標識してプロ
ーブとして用いた。

【００１５】ｂ．プロクターゼＢ遺伝子のクローニング上記で得たｃＤＮＡ及びアマシャム社のλｇｔ１０クロ
ーニング・キットを用いて、常法によりｃＤＮＡライブ
ラリーを作製した。そのファージライブラリーを大腸菌
に感染させて生じたプラークをナイロンメンブランへ移
し、アルカリ変性，中和処理後、前記のプローブとハイ
ブリダイゼーションさせた。その結果、約１万４千個の
クローンから５個のハイブリダイゼーション陽性のプラ
ークが得られた。このプラークをとり、同様にして２次
スクリーニングを行い、クローン化した。

【００１６】ｃ．塩基配列の決定上記で得られたクローンのうちの１個について、ファー
ジのＤＮＡを調製し、制限酵素ＥｃｏＲ１で消化してＭ
１３ｍｐ１８ベクターのＥｃｏＲ１部位に挿入してサブ
クローニングを行った。大腸菌ＪＭ１０３により、２本
鎖プラスミッドＤＮＡを調製し、挿入したＤＮＡについ
てＥｘｏIII ヌクレアーゼを用いて種々の長さの欠失変
異体を作成し、ＡＢＩ社のＤＮＡシークエンサーを用い
て塩基配列を決定した。その結果、得られたクローンは
１４４６塩基対を含み、配列表の配列番号１に示す様
に、１１８４塩基のオープン・リーデイング・フレーム
（Open reading frame）を有していた。その結果、プロ
クターゼＢは３９４アミノ酸残基の前駆体として生合成
され、そのＮ端の−６９位から−１位にシグナル配列及
びプロ配列を有することが明かとなり、活性酵素は１位
から３２５位迄の３２５アミノ酸残基よりなることが判
明した。

【００１７】ｄ．大腸菌による発現上記のようにして得られたプロクターゼＢの遺伝子を大
腸菌中で発現できることを以下の様に確認した。すなわ
ち、アスペルギルス・ニガーのｃＤＮＡを鋳型にしてＰ
ＣＲ法によりプロクターゼＢ前駆体（配列表の配列番号
１の−４９番目から３２５番目のアミノ酸）をコードす
る塩基配列をそれぞれ増幅し、発現ベクターｐＫＫ２３
３−２（クローンテック社、Clontech）に挿入して組換
えプラスミッドとした。この様にして作製した発現プラ
スミッドを形質転換した大腸菌を培養後、溶菌してＳＤ
Ｓ電気泳動，ウエスタン・ブロッテイングを行った。そ
の結果、プロクターゼＢ前駆体タンパク質が大腸菌によ
り製造されることを、精製プロクターゼＢを抗原として
ウサギより調製した抗プロクターゼＢ抗血清を用いて確
認した。

【００１８】

【実施例】さらに、実施例により本発明の説明を詳細に
行うが、本発明はこれらによって制限を受けるものでは
ない。

【００１９】実施例１プロクターゼＢの部分アミノ酸
配列の決定精製したプロクターゼＢ（２．０ｍｇ），ＴＰＣＫ−ト
リプシン（４０μｇ），５０ｍＭＮ−エチルモルフォ
リン・酢酸バッファー（ｐＨ８．０）を含む２００μｌ
溶液を３７℃で６時間反応させた後、高速液体クロマト
グラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ１２０Ｔ，流
速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ，溶媒系：０．１％トリフルオ
ロ酢酸−０〜５０％アセトニトリル｛グラデイエント，
３０分｝）で分取し、３本のペプチド・フラグメントを
凍結乾燥し、アミノ酸組成分析（アプライドバイオシ
ステムズ：ＡＢＩ社，モデル４２０Ａ）をした後，Ｅｄ
ｍａｎ法を用いたＡＢＩ社のペプチド・シーケンサーに
よりアミノ酸配列を決定した。また、精製プロクターゼ
ＢのＮ末端のアミノ酸配列も同様に決定した。これらの
結果を図１に示す。これらの配列はいずれもPenicilliu
m janthinellum の酸性プロテアーゼであるペニシロペ
プシンの配列中に相同な配列が見出されたことから、そ
れぞれ図２に示すような配列位置関係にあると推定し
た。

【００２０】実施例２ｃＤＮＡ及びｃＤＮＡライブラ
リーの作製プロクターゼＢ生産菌アスペルギルス・ニガー（Asperg
illusniger）をＣＥＳ−Ｍｕ３培地中で２８℃，２２０
ｒｐｍで培養した。ＣＥＳ−Ｍｕ３の組成はグルコース
（２．０％），グリセリン（１．０％），ポリペプトン
（１．０％），イースト・エクストラクト（０．３
％），リン酸一カリウム（０．０５％），ｐＨ６．０で
ある。３２時間培養した後、コラーゲンを０．５％にな
るように添加し、さらに１２時間培養した。次いで、菌
糸を集め、２ｇの菌糸を液体窒素中で粉砕し、常法に従
いＲＮＡを精製した。得られたＲＮＡ１．９ｍｇからオ
リゴｄＴカラム処理により６４μｇのメッセンジャーＲ
ＮＡを得た。アマシャム社のｃＤＮＡ合成システム及び
λｇｔ１０クローニング・キットを用いてｃＤＮＡを合
成し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００２１】実施例３ＤＮＡプライマーの合成前述したように、本酵素とペニシロペプシンとのアミノ
酸配列の相同性が高いことから、図２の下線ａ及びｂを
プライマーに用いてアスペルギルス・ニガーの全ｃＤＮ
Ａを鋳型にしてポリメラーゼ・チエイン・リアクション
（ＰＣＲ）を行えば、約４８０塩基のＤＮＡが増幅され
ることが予想される。そこで、下線ａ，ｂのアミノ酸配
列から予想される可能な塩基配列をすべて含むオリゴヌ
クレオチドの混合物を合成し、ＰＣＲのプライマーとし
て用いた。ただし，ａはセンス・ストランドの配列を１
６通りの混合物２プール、ｂはアンチセンス・ストラン
ドの配列を１６通りの混合物４プールに分けて合成した
（図３）。なお、オリゴヌクレオチドの合成はＡＢＩ社
製のシンセサイザー（Synthesizer ）モデル３８１Ａを
用いて行った。

【００２２】実施例４ＰＣＲ法による特異的ＤＮＡプ
ローブの増幅合成オリゴヌクレオチド混合物をプライマーに用い、ア
スペルギルス・ニガーより得た全ｃＤＮＡを鋳型として
ＰＣＲを行った。ＰＣＲは宝酒造のGene Amp（登録商
標）DNA Amplification Reagent Kitを用いた。鋳型
ＤＮＡは１００ｎｇ／ｍｌ，プライマー混合物は各１０
μＭ，９４℃（１分），５５℃（２分），７２℃（３
分）を３５サイクルの条件で行った。その結果、プライ
マーａ２種類，ｂ４種類の組合せ８通りのいずれにおい
ても約４８０塩基対のＤＮＡが特異的に増幅されること
がアガロース・ゲルを用いた電気泳動により確認され
た。そのうち、最も生成量の多いａ−１とｂ−１の組合
せについて、アガロース・ゲルからＤＮＡバンドを切り
出し、抽出後³²Ｐ標識してプローブとして用いた。標識
にはアマシャム（Amersham）のMultiprime（登録商標）
DNA labelling system及び｛α−³²Ｐ｝ｄＣＴＰを用い
た。

【００２３】実施例５プロクターゼＢの遺伝子クロー
ニング実施例２で得られたファージ・ライブラリーを大腸菌に
感染させてＬ−寒天培地にまき、３７℃で培養後、生じ
たプラークをアマシャム（Amersham）ナイロンメンブラ
ンへ移し、０．５ＭＮａＯＨ，１．５ＭＮａＣｌで
ＤＮＡを変性させ、０．５Ｍトリス塩酸バッファー
（ｐＨ７），１．５ＭＮａＣｌで中和処理を行った。
しかる後、実施例４のＰＣＲプローブとハイブリダイゼ
ーションさせた。なお、ハイブリダイゼーションは、６
倍濃度のＳＳＣ（０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０），アマシャム（Am
ersham）ハイブリダイゼーション・バッファー及び，Ｄ
ＮＡプローブ約５ｘ１０5 ｃｐｍ／ｍｌを用いて６５
℃，２時間行った。この後、６倍のＳＳＣ（０．１％Ｓ
ＤＳを含む）を用いて６５℃で３０分、続いて２倍濃度
のＳＳＣで２回、１倍のＳＳＣで１回洗浄した。更に、
ＳＤＳを含まない２倍のＳＳＣで軽く洗浄した後、風乾
してオートラディオグラフィー（−８０℃，一夜）に供
した。その結果、約１万４千個のクローンから５個のハ
イブリダイゼーション陽性のプラークが得られた。この
プラ−クをとり、同様にして２次スクリーニングを行
い、クローン化した。

【００２４】実施例６塩基配列の決定実施例５で得られたクローンを大腸菌に感染させてＬＢ
培地で培養、溶菌後、遠心分離して上清のファージ溶菌
液を得た。この溶菌液に各５μｇのＲＮａｓｅＡ及びＤ
ＮａｓｅＩを加え、３７℃で３０分間インキュベートし
た後、等量の２０％ポリエチレングリコール，２Ｍ塩化
ナトリウム溶液を加え、氷上１時間インキュベ−トし
た。次いで、遠心して上清を取り除き、沈澱に０．５ｍ
ｌのＳＭバッファーを加えて懸濁し、遠心して上清を取
った。上清にＥＤＴＡ，ＳＤＳをそれぞれ１０ｍＭ，
０．１％になるように加え、６０〜６５℃で１５分間保
温した。フェノール抽出，フェノール−クロロホルム抽
出の後、水層をイソプロパノール沈澱してファージのＤ
ＮＡを得た。このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ１で消化し
てアガロース・ゲル電気泳動を行い、最もインサートＤ
ＮＡの長かったクローン（１．４ｋｂ）について塩基配
列の決定を行った。インサートＤＮＡを切り出してＭ１
３ｍｐ１８ベクターのＥｃｏＲ１部位に挿入し、大腸菌
ＪＭ１０３に導入し、２本鎖プラスミッドＤＮＡを常法
に従って調製した。挿入したＤＮＡについてＥｘｏIII
ヌクレアーゼを用いて種々の欠失変異体を作製し、次い
でＪＭ１０３を用いてＭ１３の１本鎖ＤＮＡを調製し、
ＡＢＩ社のＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列を決
定した。ＥｘｏIII による欠失には宝酒造のキロシーク
エンス・キットを用いた。

【００２５】その結果、得られたクローンは１４４６塩
基対を含み、配列表の配列番号１に示すように、１１８
４塩基のオープン・リーデイング・フレーム（Open rea
dingframe）を有していた。プロクターゼＢのＮ末端及
びトリプシン消化断片のアミノ酸配列はすべて一残基の
相違もなく、このｃＤＮＡにコードされていた。また、
Ｎ末端には６９残基のシグナルペプチド及びプロ配列が
存在する。

【００２６】実施例７発現プラスミッドの構築クローン化したプロクターゼＢのｃＤＮＡを鋳型に、セ
ンス・プライマーA-G-A-G-A-C-C-A-T-G-G-C-G-C-C-G-G-
C-T-C-C-T-A-C-T-C-G-C-A-A-G 、アンチセンス・プライ
マ− A-G-A-G-A-A-A-G-C-T-T-A-C-T-A-A-G-C-C-T-G-A-
G-C-G-G-C-G-A-A-T-C-Cを用いて実施例４と同様にして
ＰＣＲを行った。増幅後、ベクターのＮｃｏＩ／Ｈｉｎ
ｄIII 部位に挿入するために、センス・プライマーには
ＮｃｏＩ部位，アンチセンス・プライマ−にはＨｉｎｄ
III 部位が組み込んである。増幅した反応溶液をクロロ
ホルム抽出してアガロース・ゲル電気泳動後、約１．１
ｋｂのＤＮＡを単離した。ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIII 消
化後、ｐＫＫ２３３−２ベクター（クローンテック社，
Clontech）のＮｃｏＩ，ＨｉｎｄIII 部位に挿入し、プ
ロクターゼＢ前駆体（配列表の配列番号１のアミノ酸番
号２１〜３９４）の発現プラスミッドを構築した（図
４）。

【００２７】実施例８大腸菌によるプロクターゼＢ前
駆体の発現実施例７で構築したプラスミッドにより形質転換した大
腸菌ＨＢ１０１を５０μｇアンピシリンを含むＭ９ＣＡ
培地で３７℃で１．５時間培養し、ＩＰＴＧ（Isopropy
l β-D-Thiogalactopyranoside，終濃度０．１ｍＭ）を
加え、更に７時間培養した。集菌後、２％ＳＤＳ／０．
１２５Ｍトリス・塩酸（ｐＨ６．８）／０．２％ブロム
フェノールブルー溶液に懸濁して５分間煮沸して溶菌
し、ＳＤＳ−電気泳動後、ウエスタンブロッテイングを
行い、ウサギより調製した抗プロクターゼＢ抗血清と特
異的に反応するプロクターゼＢ前駆体の生成を確認し
た。

【００２８】

【発明の効果】本発明によりプロクターゼＢをコードす
る遺伝子がクローニングされ、組換え体の宿主細胞中で
の発現に成功し、該酵素の構造が明らかにされた。更
に、本発明によれば、組換え体の宿主細胞を用いて産業
上有用なプロクターゼＢを効率よく量産することが可能
である。

【００２９】配列番号：１配列の長さ：1447 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：Aspergillus niger var. macrosporus 株名：DBD-0406 配列 GGCTTCTTTG TCTGGTTCTA TCTCTTCTCC GAACTCTCTT GCTTGACATT CTCGTGGTCAA 61 AATG GTC GTC TTC AGC AAA ACC GCT GCC CTC GTT CTG GGT CTG TCC TCC 110 Met Val Val Phe Ser Lys Thr Ala Ala Leu Val Leu Gly Leu Ser Ser -65 -60 -55 GCC GTC TCT GCG GCG CCG GCT CCT ACT CGC AAG GGC TTC ACC ATC AAC 158 Ala Val Ser Ala Ala Pro Ala Pro Thr Arg Lys Gly Phe Thr Ile Asn -50 -45 -40 CAG ATT GCC CGG CCT GCC AAC AAG ACC CGC ACC ATC AAC CTG CCA GGC 206 Gln Ile Ala Arg Pro Ala Asn Lys Thr Arg Thr Ile Asn Leu Pro Gly -35 -30 -25 ATG TAC GCC CGT TCC CTG GCC AAG TTT GGC GGT ACG GTG CCC CAG AGC 254 Met Tyr Ala Arg Ser Leu Ala Lys Phe Gly Gly Thr Val Pro Gln Ser -20 -15 -10 GTG AAG GAG GCT GCC AGC AAG GGT AGT GCC GTG ACC ACG CCC CAG AAC 302 Val Lys Glu Ala Ala Ser Lys Gly Ser Ala Val Thr Thr Pro Gln Asn -5 -1 1 5 10 AAT GAC GAG GAG TAC CTG ACT CCC GTC ACT GTC GGA AAG TCC ACC CTC 350 Asn Asp Glu Glu Tyr Leu Thr Pro Val Thr Val Gly Lys Ser Thr Leu 15 20 25 CAT CTG GAC TTT GAC ACC GGA TCT GCA GAT CTC TGG GTC TTC TCG GAC 398 His Leu Asp Phe Asp Thr Gly Ser Ala Asp Leu Trp Val Phe Ser Asp 30 35 40 GAG CTC CCT TCC TCA GAG CAG ACC GGT CAC GAT CTG TAC ACG CCT AGC 446 Glu Leu Pro Ser Ser Glu Gln Thr Gly His Asp Leu Tyr Thr Pro Ser 45 50 55 TCC AGC GCG ACC AAG CTG AGC GGC TAC ACT TGG GAC ATC TCC TAC GGT 494 Ser Ser Ala Thr Lys Leu Ser Gly Tyr Thr Trp Asp Ile Ser Tyr Gly 60 65 70 75 GAC GGC AGC TCA GCC AGC GGA GAC GTG TAC CGG GAT ACT GTC ACT GTC 542 Asp Gly Ser Ser Ala Ser Gly Asp Val Tyr Arg Asp Thr Val Thr Val 80 85 90 GGC GGT GTC ACC ACC AAC AAG CAG GCT GTT GAA GCA GCC AGC AAG ATC 590 Gly Gly Val Thr Thr Asn Lys Gln Ala Val Glu Ala Ala Ser Lys Ile 95 100 105 AGC TCC GAG TTC GTT CAG GAC ACG GCC AAT GAC GGC CTT TTG GGA CTG 638 Ser Ser Glu Phe Val Gln Asp Thr Ala Asn Asp Gly Leu Leu Gly Leu 110 115 120 GCC TTT AGC TCC ATT AAC ACT GTC CAG CCC AAG GCG CAG ACC ACC TTC 686 Ala Phe Ser Ser Ile Asn Thr Val Gln Pro Lys Ala Gln Thr Thr Phe 125 130 135 TTC GAC ACC GTC AAG TCC CAG CTG GAC TCT CCC CTT TTC GCC GTG CAG 734 Phe Asp Thr Val Lys Ser Gln Leu Asp Ser Pro Leu Phe Ala Val Gln 140 145 150 155 CTG AAG CAC GAC GCC CCC GGT GTT TAC GAC TTT GGC TAC ATC GAT GAC 782 Leu Lys His Asp Ala Pro Gly Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Ile Asp Asp 160 165 170 TCC AAG TAC ACC GGT TCT ATC ACC TAC ACG GAT GCC GAT AGC TCC CAG 830 Ser Lys Tyr Thr Gly Ser Ile Thr Tyr Thr Asp Ala Asp Ser Ser Gln 175 180 185 GGC TAC TGG GGC TTC AGC ACC GAC GGC TAC AGT ATC GGT GAC GGC AGC 878 Gly Tyr Trp Gly Phe Ser Thr Asp Gly Tyr Ser Ile Gly Asp Gly Ser 190 195 220 TCC AGC TCC AGC GGC TTC AGC GCC ATT GCT GAC ACC GGT ACC ACC CTC 926 Ser Ser Ser Ser Gly Phe Ser Ala Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu 205 210 215 ATC CTC CTC GAT GAC GAA ATC GTC TCC GCC TAC TAC GAG CAG GTT TCT 974 Ile Leu Leu Asp Asp Glu Ile Val Ser Ala Tyr Tyr Glu Gln Val Ser 220 225 230 235 GGC GCT CAG GAG AGC GAG GAA GCC GGT GGC TAC GTT TTC TCT TGC TCG 1022 Gly Ala Gln Glu Ser Glu Glu Ala Gly Gly Tyr Val Phe Ser Cys Ser 240 245 250 ACC AAC CCC CCT GAC TTC ACT GTC GTG ATT GGC GAC TAC AAG GCC GTT 1070 Thr Asn Pro Pro Asp Phe Thr Val Val Ile Gly Asp Tyr Lys Ala Val 255 260 265 GTT CCG GGC AGG TAC ATC AAC TAC GCT CCC ATC TCG ACT GGC AGC TCC 1118 Val Pro Gly Arg Tyr Ile Asn Tyr Ala Pro Ile Ser Thr Gly Ser Ser 270 275 280 ACC TGC TTT GGC GGT ATC CAG AGC AAC AGC GGT CTG GGA CTG TCC ATC 1166 Thr Cys Phe Gly Gly Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Gly Leu Ser Ile 285 290 295 CTG GGC GAT GTG TTC TTG AAG AGC CAG TAC GTG GTC TTC AAC TCT GAG 1214 Leu Gly Asp Val Phe Leu Lys Ser Gln Tyr Val Val Phe Asn Ser Glu 300 305 310 315 GGC CCT AAG CTG GGA TTC GCC GCT CAG GCT TAG ATCAACCACT GAAGTGGAGT 1267 Gly Pro Lys Leu Gly Phe Ala Ala Gln Ala *** 320 325 CTATAATCTG CTGATTGATC CCTCGACGAT GAACTACATG TGGAAATGTA TAGCAGACGA 1327 GGGTGATGGT GATGATGTTG ATTTGATGAT GACCCGTACA TACTTGATGA AGCTCGGTAC 1387 ATATGCAAAT GTGACTGTAT CTATGTGAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1447

【００３０】配列番号：２配列の長さ：１７配列の型：アミノ酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：タンパク質フラグメント型：Ｎ末端フラグメント起源生物名：Aspergillus niger var. macrosporus 株名：DBD-0406 配列 Ser Ile/Lys Ser Ala Val Thr Thr Pro Gln Asn Asn Asp Glu Glu Tyr Leu Thr 1 5 10 15

【００３１】配列番号：３配列の長さ：２４配列の型：アミノ酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：Aspergillus niger var. macrosporus 株名：DBD-0406 配列 Ser Thr Leu His Leu Asp Phe Asp Thr Gly Ser Ala Asp Leu Trp Val 1 5 10 15 Phe Ser Asp Glu Leu Pro Ser Ser 20

【００３２】配列番号：４配列の長さ：１６配列の型：アミノ酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：Aspergillus niger var. macrosporus 株名：DBD-0406 配列 His Asp Ala Pro Gly Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Ile Asp Asp Ser Lys 1 5 10 15

【００３３】配列番号：５配列の長さ：５配列の型：アミノ酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：Aspergillus niger var. macrosporus 株名：DBD-0406

【００３４】配列番号：６配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ

【００３５】配列番号：７配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ

【００３６】配列番号：８配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡアンチセンス：Yes

【００３７】配列番号：９配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡアンチセンス：Yes

【００３８】配列番号：１０配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡアンチセンス：Yes

【００３９】配列番号：１１配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡアンチセンス：Yes

【００４０】

【図面の簡単な説明】

図１：プロクターゼＢの部分アミノ酸配列を示す。図２：ペニシロペプシン（上段）とプロクターゼＢ（下
段）のアミノ酸配列の比較を示す。図３：ＰＣＲプライマーの配列を示す。図４：本発明のプラスミッドｐＭＰ−１０の構築方法を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/57 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/62 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列
をコードするプロクターゼＢ遺伝子。
【請求項２】配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列
をコードする塩基配列を含むプロクターゼＢ遺伝子。
【請求項３】配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列
のアミノ酸番号−６９から３２５までの３９４アミノ酸
残基を含むプロクターゼＢ前駆体酵素。
【請求項４】配列表の配列番号１記載の塩基配列の塩
基番号６３から１２４４までの１１８２塩基対を含む請
求項１記載の遺伝子。
【請求項５】配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列
のアミノ酸番号１から３２５までの３２５アミノ酸残基
を含む請求項１記載の遺伝子。
【請求項６】配列表の配列番号１記載の塩基配列の塩
基番号２７０から１２４４までの９７５塩基対を含む請
求項１記載の遺伝子。
【請求項７】請求項２記載のプロクターゼＢをコード
する塩基配列を組み込んだ発現ベクター。
【請求項８】請求項７記載の発現ベクターを導入した
細胞。
【請求項９】請求項８記載の細胞を培養し、培養物か
らプロクターゼＢを採取することを特徴とするプロクタ
ーゼＢの製造法。