JPH0568572A - サケ成長ホルモンを生産するラン藻シネココツカス - Google Patents
サケ成長ホルモンを生産するラン藻シネココツカスInfo
- Publication number
- JPH0568572A JPH0568572A JP3232069A JP23206991A JPH0568572A JP H0568572 A JPH0568572 A JP H0568572A JP 3232069 A JP3232069 A JP 3232069A JP 23206991 A JP23206991 A JP 23206991A JP H0568572 A JPH0568572 A JP H0568572A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- growth hormone
- synechococcus
- salmon growth
- fish
- transformed
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ラン藻シネココッカス由来のプラスミドにE.
coliのトリプトファンプロモーターとサケ成長ホルモン
遺伝子を導入した組み換えプラスミド、該組み換えプラ
スミドで形質転換されたラン藻シネココッカスの形質転
換体、該形質転換されたラン藻シネココッカスを用いて
サケ成長ホルモンを製造する方法及び得られたサケ成長
ホルモンを含むシネココッカスの菌体を魚類に投与する
サケ成長ホルモンの投与方法。 【効果】 本発明によりラン藻シネココッカス菌体中に
サケ成長ホルモンを効率的に製造することができた。そ
して、このサケ成長ホルモンを含むラン藻シネココッカ
ス菌体を魚類に投与することにより魚類の成育を顕著に
促進することができた。
coliのトリプトファンプロモーターとサケ成長ホルモン
遺伝子を導入した組み換えプラスミド、該組み換えプラ
スミドで形質転換されたラン藻シネココッカスの形質転
換体、該形質転換されたラン藻シネココッカスを用いて
サケ成長ホルモンを製造する方法及び得られたサケ成長
ホルモンを含むシネココッカスの菌体を魚類に投与する
サケ成長ホルモンの投与方法。 【効果】 本発明によりラン藻シネココッカス菌体中に
サケ成長ホルモンを効率的に製造することができた。そ
して、このサケ成長ホルモンを含むラン藻シネココッカ
ス菌体を魚類に投与することにより魚類の成育を顕著に
促進することができた。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子組換えによって
サケ成長ホルモン(以下、ｓＧＨと言う場合もある）を
ラン藻シネココッカス菌体中に生産させる方法及びそれ
を魚類に投与する方法に関する。
サケ成長ホルモン(以下、ｓＧＨと言う場合もある）を
ラン藻シネココッカス菌体中に生産させる方法及びそれ
を魚類に投与する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】成長ホルモンは遺伝子工学の進歩により
微生物内で大量に生産することが可能になり、ウシ、ブ
タ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなど多数の家畜動物におい
て実用化が進められている。養殖漁業は成長ホルモンの
もうひとつの大きな応用分野であるが、家畜動物に比べ
実用化が遅れている。しかし最近、シロサケに続き、ニ
ジマス、ウナギ、ブリ、マグロ、マダイ、ヒラメの成長
ホルモン遺伝子がクローニングされ、ｓＧＨではその粗
精製物が実際にニジマスに投与されて成長促進効果が確
かめられた。そこで実用上大きな問題になるのは成長ホ
ルモンの投与法である。従来のテストでは腹腔への注射
と成長ホルモン溶液への浸漬が試みられた。しかしこれ
らの方法は大量に養殖されている魚に対してはとても実
用的とは言えず、最も望ましい経口投与の方法が求めら
れていた。
微生物内で大量に生産することが可能になり、ウシ、ブ
タ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなど多数の家畜動物におい
て実用化が進められている。養殖漁業は成長ホルモンの
もうひとつの大きな応用分野であるが、家畜動物に比べ
実用化が遅れている。しかし最近、シロサケに続き、ニ
ジマス、ウナギ、ブリ、マグロ、マダイ、ヒラメの成長
ホルモン遺伝子がクローニングされ、ｓＧＨではその粗
精製物が実際にニジマスに投与されて成長促進効果が確
かめられた。そこで実用上大きな問題になるのは成長ホ
ルモンの投与法である。従来のテストでは腹腔への注射
と成長ホルモン溶液への浸漬が試みられた。しかしこれ
らの方法は大量に養殖されている魚に対してはとても実
用的とは言えず、最も望ましい経口投与の方法が求めら
れていた。
【０００３】しかし、成長ホルモンはタンパク質なので
容易に失活したり、微生物によって分解する。また摂食
後においても魚の消化器官で消化されてしまう。したが
って魚にどのように摂食させてどのように血液循環系に
吸収させ、ホルモンの効果を奏せさるかが大きな問題と
なる。ところで、最近 Moriyama ら (J. Comp. Physio
l. B (1990) 160：251-257)によってｓＧＨがニジマス
において腸管の後部で吸収され、循環系に入ることが明
らかにされた。この事実からすれば、成長ホルモンを食
後胃における消化を避けて腸管後部にまで送れればよい
こととなる。そこでこの解決手段としては二つの方法が
考えられる。ひとつは成長ホルモンそのものを適当な材
質でマイクロカプセル化する方法、いまひとつは分解さ
れにくい宿主細胞で成長ホルモンを生産し、得られる菌
体をそのまま魚類に摂取させる方法である。そして、後
者は前者に比べ、分離やマイクロカプセル化の工程を含
まないので経済的に有利である。
容易に失活したり、微生物によって分解する。また摂食
後においても魚の消化器官で消化されてしまう。したが
って魚にどのように摂食させてどのように血液循環系に
吸収させ、ホルモンの効果を奏せさるかが大きな問題と
なる。ところで、最近 Moriyama ら (J. Comp. Physio
l. B (1990) 160：251-257)によってｓＧＨがニジマス
において腸管の後部で吸収され、循環系に入ることが明
らかにされた。この事実からすれば、成長ホルモンを食
後胃における消化を避けて腸管後部にまで送れればよい
こととなる。そこでこの解決手段としては二つの方法が
考えられる。ひとつは成長ホルモンそのものを適当な材
質でマイクロカプセル化する方法、いまひとつは分解さ
れにくい宿主細胞で成長ホルモンを生産し、得られる菌
体をそのまま魚類に摂取させる方法である。そして、後
者は前者に比べ、分離やマイクロカプセル化の工程を含
まないので経済的に有利である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで、我々はラン藻
のシネココッカスが、従来宿主として使われている大腸
菌や酵母などと比べて、キチン質に富んだ厚い細胞壁を
持ち、且つ植物プランクトンの一種なので養殖池に生存
することができることに着目し、ラン藻シネココッカス
菌体中で遺伝子組換え技術によりサケ成長ホルモンを生
産せしめ、これを菌体のまま魚類に投与することを目的
として研究開発を行った。そして、鋭意研究の結果シネ
ココッカスに内在するプラスミドのひとつに大腸菌のト
リプトファンプロモーター (Ptrp) をプロモーターとし
てｓＧＨ遺伝子を導入し、シネココッカスを形質転換す
ると細胞中にｓＧＨが生産される事を見出し、本発明を
完成するに至った。
のシネココッカスが、従来宿主として使われている大腸
菌や酵母などと比べて、キチン質に富んだ厚い細胞壁を
持ち、且つ植物プランクトンの一種なので養殖池に生存
することができることに着目し、ラン藻シネココッカス
菌体中で遺伝子組換え技術によりサケ成長ホルモンを生
産せしめ、これを菌体のまま魚類に投与することを目的
として研究開発を行った。そして、鋭意研究の結果シネ
ココッカスに内在するプラスミドのひとつに大腸菌のト
リプトファンプロモーター (Ptrp) をプロモーターとし
てｓＧＨ遺伝子を導入し、シネココッカスを形質転換す
ると細胞中にｓＧＨが生産される事を見出し、本発明を
完成するに至った。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、ラン藻シネコ
コッカス由来のプラスミドにE.coliのトリプトファンプ
ロモーターとサケ成長ホルモン遺伝子を導入した組み換
えプラスミドにある。さらに、本発明は、組み換えプラ
スミドで形質転換されたラン藻シネココッカスの形質転
換体にある。
コッカス由来のプラスミドにE.coliのトリプトファンプ
ロモーターとサケ成長ホルモン遺伝子を導入した組み換
えプラスミドにある。さらに、本発明は、組み換えプラ
スミドで形質転換されたラン藻シネココッカスの形質転
換体にある。
【０００６】さらに、本発明は、前記組み換えプラスミ
ドで形質転換されたラン藻シネココッカスを培地に生育
せしめて該シネココッカスの菌体中においてサケ成長ホ
ルモンを蓄積せしめることを特徴とするサケ成長ホルモ
ンの製造方法にある。さらに、本発明は前記方法で得ら
れたサケ成長ホルモンを含むラン藻シネココッカスの菌
体を魚類に投与することを特徴とするサケ成長ホルモン
の投与方法にある。
ドで形質転換されたラン藻シネココッカスを培地に生育
せしめて該シネココッカスの菌体中においてサケ成長ホ
ルモンを蓄積せしめることを特徴とするサケ成長ホルモ
ンの製造方法にある。さらに、本発明は前記方法で得ら
れたサケ成長ホルモンを含むラン藻シネココッカスの菌
体を魚類に投与することを特徴とするサケ成長ホルモン
の投与方法にある。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。先ず、遺
伝子工学的手法によりラン藻シネココッカスにサケ成長
ホルモンを産生せしめる方法について説明する。 １) ラン藻シネココッカスを培地中で培養し、内在する
プラスミドのうちの最小サイズのプラスミドを分離精製
する。このプラスミドと大腸菌プラスミドとを連結して
シネココッカス、大腸菌双方で増殖するシャトルベクタ
ーをつくる。このベクターにはマーカーとなる抗生物質
耐性遺伝子（アンピシリン遺伝子）も導入しておく。 ２) このシャトルベクターの、上記の増殖機能が損なわ
れないようなサイトに大腸菌、Ptrpそしてその転写開始
コドンの下流にｓＧＨの構造遺伝子、更にその下流に転
写のターミネーターを導入して組み換えプラスミドを得
る。 ３) この組み換えプラスミドの数μg を先のラン藻シネ
ココッカスの対数増殖期の培養液に加え、１％CO2 含有
空気の雰囲気と照光の条件下で培養する。その結果、組
え換えプラスミドがラン藻シネココッカスの細胞内に取
込まれた形質転換株が得られる。この形質転換株は抗生
物質含有の寒天プレートに培養液を塗布して選抜する。
伝子工学的手法によりラン藻シネココッカスにサケ成長
ホルモンを産生せしめる方法について説明する。 １) ラン藻シネココッカスを培地中で培養し、内在する
プラスミドのうちの最小サイズのプラスミドを分離精製
する。このプラスミドと大腸菌プラスミドとを連結して
シネココッカス、大腸菌双方で増殖するシャトルベクタ
ーをつくる。このベクターにはマーカーとなる抗生物質
耐性遺伝子（アンピシリン遺伝子）も導入しておく。 ２) このシャトルベクターの、上記の増殖機能が損なわ
れないようなサイトに大腸菌、Ptrpそしてその転写開始
コドンの下流にｓＧＨの構造遺伝子、更にその下流に転
写のターミネーターを導入して組み換えプラスミドを得
る。 ３) この組み換えプラスミドの数μg を先のラン藻シネ
ココッカスの対数増殖期の培養液に加え、１％CO2 含有
空気の雰囲気と照光の条件下で培養する。その結果、組
え換えプラスミドがラン藻シネココッカスの細胞内に取
込まれた形質転換株が得られる。この形質転換株は抗生
物質含有の寒天プレートに培養液を塗布して選抜する。
【０００８】上記ラン藻シネココッカスは多くの株が内
外のカルチャーコレクションに登録されており利用可能
である。海洋性、淡水性、好熱性など、数多くの種があ
り、多くは数種類のプラスミドを保持している。組換え
るプラスミドはそのどれを用いて行ってもよいが、サイ
ズの小さい方が便利である。遺伝子工学の多くの操作は
E.coli系に準拠して行うことが出来る。
外のカルチャーコレクションに登録されており利用可能
である。海洋性、淡水性、好熱性など、数多くの種があ
り、多くは数種類のプラスミドを保持している。組換え
るプラスミドはそのどれを用いて行ってもよいが、サイ
ズの小さい方が便利である。遺伝子工学の多くの操作は
E.coli系に準拠して行うことが出来る。
【０００９】上記Ptrp, ｓＧＨ遺伝子、ターミネーター
の位置関係や配列は、E.coli系の発現と同じように考え
て工夫できる。しかしそれで高発現が保証されるわけで
はなく、最終的には試行錯誤に依るしかない。例えば、
Ptrpはタンデムにしたり、lacプロモーターと並べると
発現レベルが高まる。組え換えプラスミドによるラン藻
シネココッカスの形質転換は通常上記のような自然取込
み法で行うことができる。しかし効率が良くない種では
他の方法、例えば電気パルス法を使ってもよい。その場
合E.coli系に比べてやや高いパルス電場 (〜７KV/cm)を
必要とする。
の位置関係や配列は、E.coli系の発現と同じように考え
て工夫できる。しかしそれで高発現が保証されるわけで
はなく、最終的には試行錯誤に依るしかない。例えば、
Ptrpはタンデムにしたり、lacプロモーターと並べると
発現レベルが高まる。組え換えプラスミドによるラン藻
シネココッカスの形質転換は通常上記のような自然取込
み法で行うことができる。しかし効率が良くない種では
他の方法、例えば電気パルス法を使ってもよい。その場
合E.coli系に比べてやや高いパルス電場 (〜７KV/cm)を
必要とする。
【００１０】本発明は大腸菌のトリプトファンプロモー
ターがラン藻シネココッカス中でも機能するという我々
の新しい知見に基づくものであるが、本来シネココッカ
ス遺伝子が持っているプロモーターを使ってｓＧＨ遺伝
子を発現してもよい。シネココッカスはラン藻の中で最
も原始的な単細胞生物のひとつであり、生活環境に対し
て非常に優れた耐久能力を持っている。細胞壁はキチン
質に富み、非常に厚い。また、一様に小孔 (〜70nm) が
分布している。細胞壁を構成するペプチドグリカン層
(１-10nm)は１00℃の４％ＳＤＳでも溶解しない。した
がって、細胞壁はｓＧＨにとってマイクロカプセルのよ
うなもので、これによって保護されると同時に、外にし
み出ることも可能になる。ここではサケ成長ホルモンに
注目して、経口から腸への運搬体としたが、腸管で吸収
するのは魚だけでなく、哺乳動物においても同じである
ので、本発明は成長ホルモンの経口投与法としてひろく
家畜動物一般に適用できる可能性がある。また腸管から
吸収されるのは成長ホルモンに限らずタンパク質一般に
及ぶと考えられる。従って他の生理活性タンパク質の経
口投与法ともなる可能性がある。
ターがラン藻シネココッカス中でも機能するという我々
の新しい知見に基づくものであるが、本来シネココッカ
ス遺伝子が持っているプロモーターを使ってｓＧＨ遺伝
子を発現してもよい。シネココッカスはラン藻の中で最
も原始的な単細胞生物のひとつであり、生活環境に対し
て非常に優れた耐久能力を持っている。細胞壁はキチン
質に富み、非常に厚い。また、一様に小孔 (〜70nm) が
分布している。細胞壁を構成するペプチドグリカン層
(１-10nm)は１00℃の４％ＳＤＳでも溶解しない。した
がって、細胞壁はｓＧＨにとってマイクロカプセルのよ
うなもので、これによって保護されると同時に、外にし
み出ることも可能になる。ここではサケ成長ホルモンに
注目して、経口から腸への運搬体としたが、腸管で吸収
するのは魚だけでなく、哺乳動物においても同じである
ので、本発明は成長ホルモンの経口投与法としてひろく
家畜動物一般に適用できる可能性がある。また腸管から
吸収されるのは成長ホルモンに限らずタンパク質一般に
及ぶと考えられる。従って他の生理活性タンパク質の経
口投与法ともなる可能性がある。
【００１１】本発明で得られるサケ成長ホルモンを含む
ラン藻シネココッカス菌体を投与する魚類としては特に
限定はされないが、例えばニジマス、サケ等があげられ
る。また、このサケ成長ホルモンを含むラン藻シネココ
ッカス菌体の魚類への投与は、菌体をそのままでもよ
く，あるいは魚の餌に混合して投与してもよい。そし
て、その投与量は凡そ10-6／ｇ週である。
ラン藻シネココッカス菌体を投与する魚類としては特に
限定はされないが、例えばニジマス、サケ等があげられ
る。また、このサケ成長ホルモンを含むラン藻シネココ
ッカス菌体の魚類への投与は、菌体をそのままでもよ
く，あるいは魚の餌に混合して投与してもよい。そし
て、その投与量は凡そ10-6／ｇ週である。
【００１２】
【発明の効果】本発明によりラン藻シネココッカス菌体
中にサケ成長ホルモンを効率的に製造することができ
た。そして、このサケ成長ホルモンを含むラン藻シネコ
コッカス菌体を魚類に投与することにより魚類の成育を
顕著に促進することができた。以下、本発明を実施例に
より具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例
によりその技術的範囲が限定されるものではない。
中にサケ成長ホルモンを効率的に製造することができ
た。そして、このサケ成長ホルモンを含むラン藻シネコ
コッカス菌体を魚類に投与することにより魚類の成育を
顕著に促進することができた。以下、本発明を実施例に
より具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例
によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００１３】
【実施例】図１に従ってSynecococcus sp. PCC7002の内
在プラスミドｐＡＱ１を用いるｓＧＨ発現のプラスミド
ベクターの構築を示す。この株はパスツール研究所カル
チャーコレクションに PCC7002として保存されている。 （１) Synecococcus sp. PCC7002の菌株を培地A (J. Ph
ysiol., 9, 427 (1973）) ３00mlに加え、500ml のエー
レンマイヤーフラスコ中で蛍光燈照射下、１％CO 2 の空
気を通じながら、ＯＤ550 2.0に至るまで培養した。 （２) 得られる培養液を遠心分離にかけ集菌し、菌体0.
2g を得た。この菌体0.2g からアルカリ法 (村松正實
編：ラボマニュアル遺伝子工学、丸善 (1988))によりプ
ラスミド30μｇを分離した。このプラスミド溶液をアガ
ロース電気泳動にかけて、最小サイズのバンドを切り取
り、ジーンクリーン (バイオラッド) で精製してｐＡＱ
１ ３μｇを得た。 （３) E.coliプラスミドｐＢＲ３２２ (ファルマシア社
製) ５μｇに制限酵素 HindIII (宝酒造社製) 10ユニッ
トを加え、処理して該プラスミドを切断し、アルカリフ
ォスファターゼ(Calf in stestine タカラ) で脱リン酸
化処理をし、次いでジーンクリーンで精製した。またｐ
ＡＱ１ 3μｇをHindIII 5 ユニットで切断し、ジーンク
リーンで精製した。この両者にＴ４ＤＮＡリガーゼ (宝
酒造社製)10ユニットを加え、処理して両者を接続し
た。このライゲーション混合液を用いて、E.coli DH5α
MCR (Bethesda Research Lab. 社製) をカルシウム法に
より形質転換した。この形質転換されたE.coli DH5αMC
R を含む液をアンピシリン50μg/ml含有プレートに播い
て形質転換株を選抜した。このE.coli形質転換株を10ml
培養して上記と同じ方法でプラスミドｐＡＱＥ１を10μ
g 得た。 ４) E.coliのｓＧＨ発現ベクターｐｓＧＨＩＢ−２ (Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4306-4310 (1985)) 10
μg に DraＩの20ユニットとBgl II 3ユニットを加え消
化して、PtrpとｓＧＨ遺伝子、及びリポプロテインター
ミネーターの入ったＤＮＡセグメントを得た。一方先の
ｐＡＱＥ１ 10μｇを同様に処理してPvu IIとBam HIの
セグメントを得た。両者を同様な方法でライゲーション
し、E.coliの形質転換を行って増殖し、その組み換えプ
ラスミドｐＱＳＧ１, 10μg を得た。 ５) Synechococcus sp. PCC7002 株をＯＤ550 0.5-1.0
になるまで生育させる。この培養液１mlにプラスミドｐ
ＱＳＧ１を５μg/mlの濃度になるように加え、37℃、20
00lxの蛍光燈下で、１％CO2 雰囲気に90分置いた。この
培養液を１％寒天-medium A プレートに塗布し、減光
下、30℃ 48時間培養した。その後アンピシリン (2.５
μg/ml) を含む0.６％寒天を重層して37℃ 2000lx の蛍
光燈下で培養し、コロニーの形成で形質転換株を得た。
在プラスミドｐＡＱ１を用いるｓＧＨ発現のプラスミド
ベクターの構築を示す。この株はパスツール研究所カル
チャーコレクションに PCC7002として保存されている。 （１) Synecococcus sp. PCC7002の菌株を培地A (J. Ph
ysiol., 9, 427 (1973）) ３00mlに加え、500ml のエー
レンマイヤーフラスコ中で蛍光燈照射下、１％CO 2 の空
気を通じながら、ＯＤ550 2.0に至るまで培養した。 （２) 得られる培養液を遠心分離にかけ集菌し、菌体0.
2g を得た。この菌体0.2g からアルカリ法 (村松正實
編：ラボマニュアル遺伝子工学、丸善 (1988))によりプ
ラスミド30μｇを分離した。このプラスミド溶液をアガ
ロース電気泳動にかけて、最小サイズのバンドを切り取
り、ジーンクリーン (バイオラッド) で精製してｐＡＱ
１ ３μｇを得た。 （３) E.coliプラスミドｐＢＲ３２２ (ファルマシア社
製) ５μｇに制限酵素 HindIII (宝酒造社製) 10ユニッ
トを加え、処理して該プラスミドを切断し、アルカリフ
ォスファターゼ(Calf in stestine タカラ) で脱リン酸
化処理をし、次いでジーンクリーンで精製した。またｐ
ＡＱ１ 3μｇをHindIII 5 ユニットで切断し、ジーンク
リーンで精製した。この両者にＴ４ＤＮＡリガーゼ (宝
酒造社製)10ユニットを加え、処理して両者を接続し
た。このライゲーション混合液を用いて、E.coli DH5α
MCR (Bethesda Research Lab. 社製) をカルシウム法に
より形質転換した。この形質転換されたE.coli DH5αMC
R を含む液をアンピシリン50μg/ml含有プレートに播い
て形質転換株を選抜した。このE.coli形質転換株を10ml
培養して上記と同じ方法でプラスミドｐＡＱＥ１を10μ
g 得た。 ４) E.coliのｓＧＨ発現ベクターｐｓＧＨＩＢ−２ (Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4306-4310 (1985)) 10
μg に DraＩの20ユニットとBgl II 3ユニットを加え消
化して、PtrpとｓＧＨ遺伝子、及びリポプロテインター
ミネーターの入ったＤＮＡセグメントを得た。一方先の
ｐＡＱＥ１ 10μｇを同様に処理してPvu IIとBam HIの
セグメントを得た。両者を同様な方法でライゲーション
し、E.coliの形質転換を行って増殖し、その組み換えプ
ラスミドｐＱＳＧ１, 10μg を得た。 ５) Synechococcus sp. PCC7002 株をＯＤ550 0.5-1.0
になるまで生育させる。この培養液１mlにプラスミドｐ
ＱＳＧ１を５μg/mlの濃度になるように加え、37℃、20
00lxの蛍光燈下で、１％CO2 雰囲気に90分置いた。この
培養液を１％寒天-medium A プレートに塗布し、減光
下、30℃ 48時間培養した。その後アンピシリン (2.５
μg/ml) を含む0.６％寒天を重層して37℃ 2000lx の蛍
光燈下で培養し、コロニーの形成で形質転換株を得た。
【００１４】このSynechococcus sp. PCC7002 の形質転
換株はSynechococcus sp. PCC7002(sQSG1) として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託し、その寄託番号は
微工研菌寄第12356号である。 （６) こうして得たSynechococcus sp. PCC7002 の形質
転換株はまず、アンピシリンを含まない培地A で一日間
培養し、次に、アンピシリン0.５μg/ml含む培地A 培地
を重層し増殖させた。
換株はSynechococcus sp. PCC7002(sQSG1) として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託し、その寄託番号は
微工研菌寄第12356号である。 （６) こうして得たSynechococcus sp. PCC7002 の形質
転換株はまず、アンピシリンを含まない培地A で一日間
培養し、次に、アンピシリン0.５μg/ml含む培地A 培地
を重層し増殖させた。
【００１５】この形質転換株の菌体中に蓄積されたｓＧ
Ｈの検出はイムノブロッテイン法により、次のように行
った。Synechoccocus sp. PCC7002 の形質転換株の培養
液３00mlをＯＤ550 1.0 で集菌し、５mlの緩衝液Ａに懸
濁し、３00W の超音波ホモジナイザーで10分間処理し
た。これを15000rpm、10分間遠心分離し、沈澱を2.5ml
緩衝液Ａに懸濁し、10μｌをＳＤＳ電気泳動にかけた。
次にゲル上のタンパクをＰＶＤＦメンブレン (バイオッ
ド) に電気泳動的に転写した。このメンブレンを薄いポ
リエチレン袋に入れて、３％ゼラチン溶液を加えて１時
間インキュベートした後、まずｓＧＨのモノクローナル
抗体 (マウス) の１％ゼラチン溶液を加えて２時間イン
キュベートし、次にパーオキシダーゼでラベルした抗マ
ウス・ヤギ抗体 (バイオラッド) を加えて更に60分間イ
ンキュベートした。発色はナフトール誘導体 (コニカイ
ムノステインＨＲＰ、コニカ)を用いて行った。ＳＤＳ
電気泳動でコントロールとして流した市販のｓＧＨ(協
和発酵) と比べると、同じ位置である、約25KDa にバン
ドが検出された。
Ｈの検出はイムノブロッテイン法により、次のように行
った。Synechoccocus sp. PCC7002 の形質転換株の培養
液３00mlをＯＤ550 1.0 で集菌し、５mlの緩衝液Ａに懸
濁し、３00W の超音波ホモジナイザーで10分間処理し
た。これを15000rpm、10分間遠心分離し、沈澱を2.5ml
緩衝液Ａに懸濁し、10μｌをＳＤＳ電気泳動にかけた。
次にゲル上のタンパクをＰＶＤＦメンブレン (バイオッ
ド) に電気泳動的に転写した。このメンブレンを薄いポ
リエチレン袋に入れて、３％ゼラチン溶液を加えて１時
間インキュベートした後、まずｓＧＨのモノクローナル
抗体 (マウス) の１％ゼラチン溶液を加えて２時間イン
キュベートし、次にパーオキシダーゼでラベルした抗マ
ウス・ヤギ抗体 (バイオラッド) を加えて更に60分間イ
ンキュベートした。発色はナフトール誘導体 (コニカイ
ムノステインＨＲＰ、コニカ)を用いて行った。ＳＤＳ
電気泳動でコントロールとして流した市販のｓＧＨ(協
和発酵) と比べると、同じ位置である、約25KDa にバン
ドが検出された。
【図１】ｓＧＨの発現のためのシヤトルベクターの構築
図。
図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ２３Ｋ 1/165 Ｂ 7110−2Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/18 (Ｃ１２Ｎ 15/74 Ｃ１２Ｒ 1:19 1:89） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:89） (72)発明者 小嶋 洋之 大阪府池田市伏尾台２―９―１，１―506 (72)発明者 山野 尚子 大阪府大阪市平野区平野西３―９―１， 803 (72)発明者 伊藤 菁莪 東京都千代田区大手町一丁目６番１号 協 和醗酵工業株式会社内 (72)発明者 杉本 整治 東京都千代田区大手町一丁目６番１号 協 和醗酵工業株式会社内
Claims (4)
- 【請求項１】 ラン藻シネココッカス由来のプラスミド
にE.coliのトリプトファンプロモーターとサケ成長ホル
モン遺伝子を導入した組み換えプラスミド - 【請求項２】 請求項１記載の組み換えプラスミドで形
質転換されたラン藻シネココッカスの形質転換体 - 【請求項３】 請求項２記載の形質転換されたラン藻シ
ネココッカスを培地に生育せしめて該ラン藻シネココッ
カスの菌体中においてサケ成長ホルモンを蓄積せしめる
ことを特徴とするサケ成長ホルモンの製造方法。 - 【請求項４】 請求項２記載の方法で得られたサケ成長
ホルモンを含むシネココッカスの菌体を魚類に投与する
ことを特徴とするサケ成長ホルモンの投与方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3232069A JPH0568572A (ja) | 1991-09-11 | 1991-09-11 | サケ成長ホルモンを生産するラン藻シネココツカス |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3232069A JPH0568572A (ja) | 1991-09-11 | 1991-09-11 | サケ成長ホルモンを生産するラン藻シネココツカス |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0568572A true JPH0568572A (ja) | 1993-03-23 |
Family
ID=16933503
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3232069A Pending JPH0568572A (ja) | 1991-09-11 | 1991-09-11 | サケ成長ホルモンを生産するラン藻シネココツカス |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0568572A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998042748A1 (fr) * | 1997-03-24 | 1998-10-01 | Hih.Biocenter Inc. | Nouveau polypeptide synthetique |
| KR100443843B1 (ko) * | 1999-05-28 | 2004-08-09 | 주식회사 알진텍 | 형질전환된 미세조류를 이용한 외래 단백질의 생합성 |
| JP2008528027A (ja) * | 2005-01-26 | 2008-07-31 | ユニヴェルシテイト レイデン | 移植細胞により産生されるホルモンを用いた魚の卵及び／又は魚の精子の発生及び成熟を改善するための手段及び方法 |
| CN114736842A (zh) * | 2022-05-06 | 2022-07-12 | 宁波大学 | 一种利用聚球藻基因的启动子检测水体营养盐生物可利用度的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58124799A (ja) * | 1982-01-19 | 1983-07-25 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ラン藻プラスミドｐＢＡ１及びその調製方法 |
| JPS6115699A (ja) * | 1984-06-29 | 1986-01-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 魚類の成長ホルモン遺伝子 |
| JPH0376583A (ja) * | 1989-08-16 | 1991-04-02 | Hagiwara Yoshihide | ヒトタンパク質のラン藻での発現方法 |
-
1991
- 1991-09-11 JP JP3232069A patent/JPH0568572A/ja active Pending
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| CN114736842A (zh) * | 2022-05-06 | 2022-07-12 | 宁波大学 | 一种利用聚球藻基因的启动子检测水体营养盐生物可利用度的方法 |
| CN114736842B (zh) * | 2022-05-06 | 2023-12-22 | 宁波大学 | 一种利用聚球藻基因的启动子检测水体营养盐生物可利用度的方法 |
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