JPH0376583A - ヒトタンパク質のラン藻での発現方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明はヒト・スーパーオキシドジスムターゼ（以下、
ｈ−ＳＯＤと省略する）と実質的に同一のアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をらん藻
細胞内で発現させる方法に関する。

【従来の技術］ ヒト・スーパーオキシドディスムターゼ＜ｈ−５ＯＤ）
は生体内に生じる活性酸素（０２−”０．　、ＯＨ−な
ど）の濃度を低下させ、生体成分が非特異的に酸化され
るのを防ぐ機能をもつと考えられている。そのことから
、ｈ−ＳＯＤは炎症など活性酸素が関与する病気（例え
ば慢性関節リウマチ、変形性関節関節炎、放射線・紫外
線照射による障害、虚血部分への血液再流に伴う障害な
ど）に有効な治療薬として注目されている。

ヒト−赤血球Ｃｕ　／　Ｚ　ｎ　−Ｓ　ＯＤについては
そのアミノ酸配列が報告され［Ｊａｂｕｓｃｈ　ｅｔ　
ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｎ＋１ｓｔｒｙｓ　１９　（１９８０）　
２３１０〜２３１６、Ｂａｒｒａａｔ　ａｌ、、　ＦＥ
ＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　１２０　（１９８０）　５３
〜５５］　ｓまた、ダウン症候群患者に由来する樹立細
胞株より分離されたｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡの塩
基配列についても調べられている［Ｓｈｅｒｍａｎ、　
Ｌ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ％　８０　（１９８３）５４６５〜５
４６９］。また、ｈ−５ＯＤは遺伝子操作により大腸筒
、酵母での発現も報告されており、ＥＲ，−ム、　Ｈａ
ｌｌｅｗｅｌｌ　ｅＬ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１３、（６）　（１９８５）
　２０１７〜２０３４、Ｒ，Ａ。

Ｈａｌｌａｗｅｌｌ　　ｅｔ　　ａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、５　（１９８７）３６３〜３６６］　
、ｉ換えｂ　−Ｓ　ＯＤの大腸菌、酵母による大量生産
も可能になっている。

一方、らん藻細胞は、光と少量の無機塩類を含む水とが
あれば増殖することが可能であり、培養が簡単であるた
め、遺伝子操作のための宿主として好適であると考えら
れる。

従来、らん藻細胞を宿主として遺伝子操作を行った例と
しては、アナキステイス・ニデユランス（Ａｎａｃｙｓ
ｔｉｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）にアンピシリンおよびクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子、アナキステイス・ニデユ
ランスのｒＲＮＡ遺伝子およびリブロースニリン酸カル
ボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢ　ｉｓＣＯ）遺
伝子を導入したもの［Ｃ，Ｊ、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ　
ａｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｇａｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　
　１８４　：２４９　２５４（１９８１）；Ｓ、Ｓ、Ｇ
ｏｌｄｅｎａｎｄ　　Ｌ、Ａ、Ｓｈｅｒｍａｎ、　Ｊ　
、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　ｌ　５５　：　９６６
−９７２　（１９８３）　；Ｈ，Ｄａｎｉｅｌｌｅｔ　
ａｌ、、　Ａｒｃｈ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、　１５１
　：　５９−６４（１９８９）］、アナベナ（Ａ　ｎａ
ｈａｅｎａ）にクロラムフェニコール、ストレプトマイ
シン、ネオマイシンおよびエリスロマイシン耐性遺伝子
を導入しｔ；もの［Ｃ，Ｐ、　Ｗｏｌｋ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｅｉ、ＵｓＡ
　　８１：１５６１−１５６５　（１９８４）］、シネ
コシステイス（Ｓ　ｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）にカナ
マイシン耐性遺伝子を導入したもの［Ｆ　、　Ｃｈａｕ
ｖａｔ　ａｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｏｎ
ｅｔ、２１６：５１−５９　（１９８９）］等が知られ
ているが、原子動物であるらん藻細胞にヒト又は動物の
遺伝子を組み込み、それを発現させることに成功した例
は未だ報告されていない。

本発明者らは、遺伝ｆ組換え技術によるｈ−ｓＯＤ遺伝
子の発現のための宿主としてらん藻細胞を用いることに
着目し、鋭意研究を行なった結果、今回、ｈ−Ｓ　ＯＤ
遺伝子を成る種のベクターまたは発現能力を持つＤＮＡ
断片に導入し、得られる組換えプラスミドまたはＤＮＡ
断片でらん藻細胞を形質転換し、ｈ−５ＯＤを発現させ
ることに成功し、本発明を完成するＩこ至つた。

かくして、本発明によれば、ヒト・スーパーオキシドジ
スムターゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列が導入された組換えプ
ラスミドまたは発現能力をもつＤＮＡ断片で形質転換さ
れたらん藻細胞を培地で培養することを特徴とするらん
藻細胞における上記ポリペプチドの発現方法が提供され
る。

ヒト・スーパーオキシドジスムターゼ（ｈ−５ＯＤ）は
、１５３個のアミノ酸から構成されるポリペプチドであ
り、そのポリペプチド部分のアミノ酸配列は次のとおり
である。

０ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　
　ｌｉｅ　　ｌｉｅ　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ０ Ｇｌｕ　　Ｇｉｎ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　　Ａ
ｓｎ　Ｇｕｙ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｌｙｓ０ Ｖａｔ　　Ｔｒｐ　Ｇｕｙ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　　Ｌ
ｙｓ　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　ＧＬｕ０ Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｈｉｓ　　Ｇｕｙ　　Ｐｈｅ　　
Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　Ｈｉｓ　　Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ０ Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　Ｇ
ｌｙ　Ｃｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　ＡｌａＧｌｙ　
　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　　ｐＨｅ　　Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　Ｌ
ｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ０ Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇ
ｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ０ Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ｌａｕ　　Ｇｕｙ　　
Ａｓｎ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ０Ｏ Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　　Ｖａｔ　　Ａｌａ　　Ａ
ｓｐ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　ｌｉｅ　Ｇｌｕ１０ Ａｓｐ　Ｓｅｒ　　Ｖａｔ　　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　　Ｌｅ
ｕ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　Ｈｉｓ２０ Ｃｙｓ　ｌｉｅ　［ｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌ
ｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｎ　Ｈｉｓ３０ Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　
Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｇｕｙ４０ Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ａｌａｌ５０ Ｇｌｙ　Ｓｓｒ　　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　Ｃｙ
ｓ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｔ　　ｌｉｅ　Ｇｌｙｌｉｅ　　
Ａｌａ　　Ｇｉｎ 本明細書において「ヒト・スーパーオキシドジスムター
ゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
」とは、上記アミノ酸配列を有するｈ−５ＯＤポリペプ
チドの他に、ｈ−Ｓ　ＯＤとしての酵素活性を実質的に
失なうことがない範囲内で、上記１５３個のアミノ酸の
一部（一般には５個以下、好ましくは２個以下）が他の
アミノ酸と置き換ったｈ−Ｓ　ＯＤに類縁するポリペプ
チド（以下、ｈ−Ｓ　ＯＤ類縁体という）をも包含する
意味で使用するものである。そのようなｈ−Ｓ　ＯＤ類
縁体の具体例としては、例えば、 （ａ）　　ｈ　−Ｓ　ＯＤの６番目のシスティン残基（
Ｃｙｓ）がアラニン残基（Ａ　ｌａ）に置き換ったもの
（特願昭６３−３１１０１３号明細書参照）、 （ｂ）　　ｈ−Ｓ　ＯＤのＩｌ１番目のシスティン残基
（Ｃｙｓ）がセリン残基（Ｓ　ｏｒ）に置き換ったもの
（特公昭６２−１３０６８１Ｑｌ［書参照）、 （ｃ）　　ｈ　−Ｓ　ＯＤの６番目のシスティン残基（
Ｃｙｓ）がアラニン残基（Ａｌａ）に、そして１１１番
目のシスティン残基（Ｃｙｓ）　カセリン残基にそれぞ
れ置き換ったもの（特公昭６３−２７３４７３明細書参
照） 等が挙げられる。

ヒト・スーパーオキシドジスムターゼと実質的に同一の
アミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、本件ポリペ
プチドという）をコードするＤＮＡ配列はそれ自体既知
の遺伝子操作技術によって容易に合皮することができ、
例えば下記の文献：（１）　日本生化学会編　「続生化
学講座ｌ遺伝子研究法■」　東京化学同人刊（１９８７
年）（２）村松正実編　「医学における遺伝子工学」東
京化学同人刊（１９８７午） 等の実験書に記載されている方法によって合皮すること
ができる。

このようにして合皮されるｈ　−５ＯＤをコードするＤ
ＮＡ配列の一例を示せば次のとおりである。

１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１０ＧＣＴ　　ＡＣＣＡＡＡＧＣＴＧ　　Ｔ
ＴＴＧＣＧＴＴＣＴ　　ＧＡＡＡＧＧＴＣＧＡ　　ＴＧ
ＧＴＴＴＣＧＡＣＡＡＡＣＧＣＡＡＧＡ　　ＣＴＴＴＣ
ＣＡ０ ＧＡＣＧＧＣＣＣＧＧＴＴＣＡＧＧＧＴＡＴＣＡＴ　　
ＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧ　　ＴＣＣ
ＣＡＴＡＧＴＡ　　ＧＴＴＧＡＡＧ０ ＧＡＡ　　ＣＡＧＡＡＡＧＡＡＴ　　ＣＴＡＡＣＧＧＴ
ＣＣＧＧＴＴＡＡＡＣＴ’ｒ　　ＧＴＣＴ’ｌ’ＴＣＴ
ＴＡ　　ＧＡ’ｌ”１”ＧＣＣＡＧＧ　　ＣＣＡＡＴ’
Ｍ’ＧＴＴ　　ＴＧＧＧＧＴＴＣＴＡ　　ＴＣＡＡＡＧ
ＧＣＣＴ　　ＧＡＣＣＧＡＡＣＡＡ　　ＡＣＣＣＣＡＡ
ＧＡ’ｌ’　　ＡＧＴ’ｌ’ＴＣＣＧＧＡ　　ＣＴＧＧ
ＡＴＴ０ ＧＧ’ｌ’　　ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴ　　？ＣＣＡＴＧ
ＴＴＣＡ　　ＴＧＡＡ’ｌ”Ｉ’ＴＣＣＡ　　ＧＡＣＧ
ＴＡＣＣＴＡ　　ＡＧＧＴＡＣＡＡＧ’ｌ’　　ＡＣＴ
ＴＡＡＡ０ ＧＧＴ　　ＧＡＣＡＡＣＡＣＴＧ　　ＣＡＧＧＴＴＧＣ
ＡＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＡ　　ＣＴＧ’ｌ’ＴＧＴＧＡ
ＣＧ’ｌ’ＣＣＡＡＣＧ’ｌ”Ｇ　　ＧＡＧＡＣＧ’ｌ
’０ ＧＧＧ　　ＣＣＴＣＡＴＴＴＣＡ　　ＡＣＣＣＧＣＴＧ
ＴＣＧＣＧ’ｒＡＡＡＣＣＣＧＧＡＧＴＡＡＡＧＴ　　
ＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧ　　ＣＧＣＡＴＴ’ｌ’０ ＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＣＧＡ　　ＡＡＧＡＣＧＡＡＧＡ
　　ＡＣＧ’ｌ’ＣＡＴＧＴＡＣＣＡＣＣＣＧＧＣＴ　
　ＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴ　　ＴＧＣＡＧＴＡ０ ＧＴＴ　’ＧＧＴＧＡＣ’ｌ’ＡＧＧ　　ＴＡＡＣＧＴ
ＴＡＣＣＧＣＴＧＡＣＣＡＡ　　ＣＣＡＣＴＧＡＴＣＣ
ＡＴＴＧＣＡＡＴＧＧ　　ＣＧＡＣＴＧ００ ＡＡＡＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＡＣＧＴＴＴＣＴ　
　ＡＴＣＧＡＡＴ？ＴＣＴＧＣＣＡＣＡＧＣＧ　　ＡＣ
ＴＧＣＡＡＡＧＡ　　’Ｉ’ＡＧＣＴＴ１０ ＧＡＣ’ｌ’　　ＣＴＧＴ↑Ａ？ＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴ
ＧＧ’ｌ”　　ＧＡＣＣＡ’Ｉ’ＣＴＧＡ　　ＧＡＣＡ
ＡＴＡＧＡＧ　　ＡＧＡＣＡＧＡＣＣＡ　　ＣＴＧＧＴ
Ａ２０ ＴＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＣＧ　　ＴＡＣＴＣＴＧＧＴ
Ｔ　　ＧＴＴＣＡＴＡＣＧＴ’ＡＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡ
ＴＧＡＧＡＣＣＡＡ　　ＣＡＡＧＴＡ３０ ＧＡＡＡ　　ＡＡＧＣＧＧＡＴＧＡ　　ＣＣＴＧＧＧＴ
ＡＡＡ　　ＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴ　　ＴＴＣＧＣＣＴＡ
ＣＴ　　ＧＧＡＣＣＣＡＴ’Ｉ”ｌ’　　ＣＣＡＣＣＡ
４０ ＴＴＧＣＴＣＣＴＴＡＧＡ’ｌ’Ｇ　ＧＴＴＴ’Ｉ’Ｇ
ＧＣＣＡ　ＴＴＧＣＧＡＣＣＡＡ　ＧＡＧＣＡＧＡＣＣ
Ｇ　ＴＡＣＧＣＣＡＣＡＡ　ＴＡＧＣＣＡＡＴＣＧＣＴ
ＣＡＧ ＡＴＧＣＧＡＧＴＣ なお、上記ＤＮＡ配列の上流側末端には適宜、よい。

上記ＤＮＡ配列はあくまでも一実施態様であり、前記の
アミノ酸配列をコードするものである限り、ＤＮＡ配列
は変更可能であることはいうまでもない。

また、前記（ａ）のｈ−Ｓ　ＯＤ類縁体をコードするＤ
ＮＡ配列の一例としては、上記ｈ−５ＯＤをに置き換え
たものを例示することができる。

このようにして合皮される本件ポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列は次いで適当なベクターまたは発現能力を
もつＤＮＡ断片に組み込む。そのために使用しうるベク
ターまたは発現可能なＤＮＡ断片としては、らん藻細胞
に導入可能なものであれば特に制限されるものではなく
広範囲の種類のベクターまたはＤＮＡ断片から選ぶこと
ができ、プラスミド及びウィルスから必要に応じて誘導
するこεができる。ベクターは単コピーベクター又は低
コピーもしくは高コピーベクターのいずれであってもよ
く、クローニング及び／又は発現のために機能するもの
である。ベクターに関しては多くの文献が存在し、また
、多くのベクターまたはＤＮＡ断片は商業的に入手可能
である。これらのベクターまたは発現可能なＤＮＡ断片
は通常、選択を可能にするマーカーを含有し、このマー
カーとしては細胞毒耐性、栄養要求性などがあり、しば
しば異なる特性をもたらす多数のマーカーを１ベクター
またはｌ　ＤＮＡ断片に使用される。また、発現ベクタ
ーまたは発現可能なＤＮＡ断片の場合には転写開始およ
び停止の再制御シグナルが存在する。

このような有利に利用できる発現用ベクターとしては、
例えばｐｔａｃ　１１　（ＡＴＣＣ３７１４５）　、ｐ
Ｌａｃ１２　（ＡＴＣＣ３７１３８）　、ｐＫＫ　２２
３−３などのｐｔａｃプロモーター［Ｈ，Ａ、　ｄｅＢ
ｏｅｒ　ｅ３ｔ、　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｅｉｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　　７８．２１　（１９
８３）］を含有するベクター、　ｐＡＨ５、ｐＡＨ９な
どのＡＤＣ１プロモーターを含有するベクター：プラス
ミドｐＳＶ　２などのＳＶ　４０系ベクター等が挙げら
れる。さらに、らん藻細胞用のベクターとして「植物遺
伝子操作技術−遺伝子組換え己細胞融合−」山口彦之監
修（シーエムシー刊）９８〜ｌｌＯ頁に記載されている
プラスミドｐＢＡｓ１８、ｐＵｃ１０４、ｐＵＣ１０５
、ｐＵｃ３０３等もまた使用可能である。

本件ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をらん藻細胞
に導入するためのベクターまたは発現可能なＤＮＡ断片
プロモーター、オペレーター　ＳＤ　（Ｓｈｉｎｅ−Ｄ
ａｌｇａｒｎｏ）配列、翻訳開始コドン；終止コドン、
ターミネータ−がこの順に配置されていることが必要で
ある。プロモーターは１つである必要はなく、２つのプ
ロモーターを縦列させ用いることも可能である。プロモ
ーターはｔａｃプロモーターの他、ｇｌｎＡｌｎ上−タ
ー（Ａ　ｎａｂａｅｎａ）　、ｐｓ２　Ｂプロモーター
（Ｆ　ｒｅｍｙｌｌａ）　、ｒｂｃプロモーター（Ａｎ
ａｃｙｓｃ、ｉｓ）　、　ｒＲＮ　Ａプロモータプロモ
ーター（Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ）　、ｃｐｃプロモーター
（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｅｕｓ、　Ａｎａｂａｅｎａ）
　、ｓｏｄプロモーター　（Ａ　ｎａｃｙｓｔｉｓ）な
どが挙げられる［Ｎ、Ｅ、Ｔｕｍｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ
、Ｎａｔｕｒｅ、　　３０６　　：　　３３７〜３４２
（１９８３）　　：　Ｂ、Ｍｕｌｌｉｇａｎ　　ｅｔ　
ａｔ、、Ｐｒｏｅ。

Ｎａｔ、１．Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８１　　（９
）　　：　　２６９３〜２６９７　（１９８４）；熊野
正信、杉浦畠弘、「遺伝Ｊ　３８　（１２）２６〜３１
（１９８４）；　　Ｓ、　　Ｅ、　　Ｃｕｒｔｉｓ、　
　Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　　　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ、　　１８：２２３−２４４　　（１９８８）　　；
Ｊ、Ｖ。

Ｄ　、　　Ｐ　ｌａｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｐｈｏ
ｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１８　　
：１７９−２０４　　（１９８８）　　８Ｎ、Ｔ、Ｄ。

Ｍａｒｓａｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｐｈｏｔｏｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１８　　：　　９
９−１３２　　（１９８８）　　；Ｄ、Ｅ、Ｌａｕｄｅ
ｎｂａｅｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅ
ｔ、２　１６　　：　　４５５−４６１　　（１９８９
）］　　。

一方、本件ポリペプチドが導入された組換えベクターま
たは発現可能なＤＮＡ断片を組み込むことのできるらん
藻細胞としては、例えばアナキスティス争ニデユランス
（Ａ　ｎａｃｙｓｔｉｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）、アグメ
ネルム・クオドルプリカトウム（Ａ　ｇｍｅｎｅｌＲｕ
ｍ　　ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｕｍ）　、アナベナ（
Ａ　１ａｂａｅｎａ）、ネンジュモ（Ｎｏｓｔｏｅ）　
、ユレモ（Ｏｓｅ　ｉ　ｌ　１ａｔｏｒ　ｉａ）、スピ
ルリナ（Ｓ　ｐｉｒｕｌｉｎａ）　、イトヒゲモ（Ｃａ
ｌｏＬｔｈｒｉｘ）　、フレミイエラ（Ｆ　ｒｅｍ＋ｙ
ｅｌｌａ）　、スイゼンジノリ　（Ａ　ｐｈａｎｏｔｈ
ｅｅｅ）　、アイミドリ（Ｂ　ｒａｅｈｙｔｒｉｅｈｉ
ａ）　ｓ　シネコシステイス（Ｓ　ｙｎｅｅｈｏｃｙｓ
ｔｉｓ）等が挙げられ、それぞれの宿主に適したベクタ
ーまたは発現可能なＤＮＡ断片を選択使用することによ
り、形質転換らん藻細胞を遺戒することができる。

本件ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と適当なベク
ターまｔ；はＤＮＡ断片とからの組換えプラスミドまた
は発現可能なＤＮＡ断片の遺戒もまた、遺伝子操作にお
ける周知の技術を用いて行なうことができ、例えば下記
の文献： （１）　　Ｔ、　ＭａｎｉａＬｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　−ａ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　−ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊、（２）　　
Ｌ、　Ｇ、　Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂａ５ｉｃ
　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ刊（３）　　Ｒａｙ　Ｗｕ
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ。

１０１、　Ａｃａｄｅ＋ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ刊等の実験
書に記載の方法によって造成することができる。

たとえば、適当に選択されるベクターまたは発現可能な
ＤＮＡ断片に化学合成した本件ポリペプチドをコードす
る遺伝子、形質発現調節遺伝子を含むＤＮＡ断片、合ｆ
ｌｔＤＮＡ断片を正しく組込むことにより目的の組換え
ＤＮＡが得られる。その概略を添付第１図に示す。ＤＮ
Ａ断片の連結順序は最終的に得られる組換えＤＮＡの構
造が目的とするものである限り特に制限されるものでは
ない。

このようにして遺戒される組換えプラスミドまたは発現
可能なＤＮＡ断片によって前述したらん藻細胞を形質転
換する。

得られる組換えＤＮＡによる宿主の形質転換はそれ自体
既知の方法によって行うことができる。

例えば遺伝子操作に関する多数の文献たとえば、（１）
　　高木東歌ら、「遺伝子操作マニュアル」講談社刊、 （２）高木東歌ら、「遺伝子操作実験法」講談社刊、 （３）　　Ｔ、　ＭａｎｉａＬｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　−ａ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　−ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｔ＋ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊、（４）　
　Ｌ、　Ｇ、　Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂａ５ｉ
ｃ　Ｍｅｔｂｏｄｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ、　Ｅｌｓａｖｉｅｒ刊などの実験書に記載の
方法従って行なうことができる。

例えば、ｂ−ＳＯＤをコードするＤＮＡ配列を有するｐ
ＫＫ２２３−３をアナキステイス・ニデュランスヘエレ
クトロポレーション法で導入し形質転換する。形質転換
体はアンピシリン耐性などにより選抜した後、イムノブ
ロッティング法により、所期の形質転換体が得られてい
ることを確認することができる。

このようにして調製される形質転換体は、光の照射下に
宿主細胞の増殖に応じたそれ自体既知の培地で培養する
ことにより本件ポリペプチドの発現を行わせる。培地は
適当量の鋼及び／又は亜鉛イオンを含むことが好ましい
。

アナキステイス・ニデユランスの場合、培地としてはＢ
Ｇ−１１培地、ＭＤＭ培地などが適しており、また培養
条件として、培養温度は一般に１０〜３０℃、好ましく
は２５℃付近が適しており、またｐＨは通常７〜８の範
囲及び光度は１０００〜３０００　ｌｕｘの範囲が適し
ている。このような条件下に培養は５〜２０日程度行な
うことができる。

また、培養は静置又は撹拌下に行なう。対数増殖期初期
に１〜２ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガクラドピ
ラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより誘発合成を
行なってもよい。

培養後の培養物からの産生された本件ポリペプチドの採
取はそれ自体既知の方法で行なうことができる。例えば
、培養後、遠心分離で細胞を集め、破砕したのち、通常
知られている方法、例えば塩析、秀析、イオン交換クロ
マトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、クロマ
トフオーカツシング、ハイドロ７オービツクインターラ
クシヨンクロマトグラフイー、アフィニティークロマト
グラフィー、電気泳動などの操作を適宜組合せることに
より本件ポリペプチドを分離回収することができる。

このようにして製造される本件ポリペプチドは、活性酸
素が関与する病気、例えば慢性関節リウマチ、変形性関
節炎、放射線・紫外線照射による障害、血行障害等の治
療、処置、予防のための医薬や化粧料等に利用すること
ができる。

次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ ［１］ｈ−３ＯＤ遺伝子の化学合或 （Ｉ　−１）　　オリゴヌク１〆オチドの合成および精
製完全鎖長（４７５ｂｐ）の遺伝子を作製するために１
７の断片に分け（第２図参照）、１７のオリゴヌクレオ
チド（３５ｂ〜６１ｂ）をＤＮＡシンセサイザー３８０
Ａ（アプライド・バイオシステムズ・ジャパン社製）を
用いてホスホアミダイト法にまり合成を行った。合成が
終了したシリカゲルカラムに２ｍ１２のアンモニア水（
２７％以上）を０゜５−ずつｉ５分おきに加え、オリゴ
ヌクレオチドをシリカ支持体より切り出しバイアルに捕
集した。

このバイアルにさらに１Ｉｌｄのアンモニア水を加え、
キャップおよびバラフィルム等によりシールして５５℃
で８時間以上加温し、塩基部分の保護基（アシル基）を
はずした。恒温槽よりバイアルを取り出し室温に戻した
後、キャップをはずし、減圧下で濃縮乾固した。乾固後
、残渣を２００μＱの０゜０１Ｍトリエチルアミン−酢
酸溶液（ＴＥＡＡ。

ｐＨ７５）に溶解し、ＡＭ−３１３−ＯＤＳ　（山村化
学研究新製）カラムを用いたＨＰＬＣでアセトニリル０
．１Ｍ　　ＴＥＡＡの濃度勾配による溶出を行いメイン
ビークを分取した。分取したメインビークを減圧下で濃
縮乾固した後、８０％酢酸（アセトニｉ・リル溶液）１
００μＱを加え、混合して室温に３０分間放置すること
により、５′未満のジメチルトリチル（ＤＭＴｒ）をは
ずし、ＯＨ基に変換した。３０分経過後、迅速に乾固し
、残渣を０．０１Ｍ　　ＴＥＡＡ　ＣｐＨ７，５）２０
０μＱに溶解し、等容のジエチルエーテルを加え、Ｄ　
Ｍ　Ｔ　ｒ基を抽出除去した。この溶液を減圧下で濃縮
乾固しｔ；後、１１０ＰＱの０．ＯＩＭ　　ＴＥＡＡ（
ｐＨ７，５）に溶解し、再びＨＰＬＣを用いて、分取、
精製を行った。分取したオリゴヌクレオチドを含む溶液
を減圧下で乾固した後、ｉｏ＋ｎＭｈリス塩酸−１ｍＭ
　　ＥＤＴＡ溶液（ＴＥ、ｐＨ８゜０）に溶解し、以下
の実験に使用した。

（Ｘ−２）　　合成オリゴヌクレオチドのキナーゼによ
るリン酸化 精製したオリゴヌクレオチドは完全鎖長ヒト型ＳＯＤ遺
伝子の５′末端に位置するＮｏ、ｌおよびＮｏ、１７を
瞼さ５′末端のリン酸化を行った。各オリゴヌクレオチ
ド４μｇを５０ｍＭトリス塩酸−１０ｍＭ　　ＭｇＣＱ
ｚ　　Ｏ，１ｍＭＥＤＴＡ−５ｍＭジチオスレイトール
（ＤＴＴ）−０，１ｍＭスペルミジン−１，７，ｕＭＡ
ＴＰ溶液（ｐＨ７，６）１２０ｐＱに混合し、Ｔ、ポリ
ヌクレオチドキナーゼ９単位（宝酒造社製）を添加し、
３７′Ｏで１５分間インキュベートした。次にＡＴＰを
終濃度１ｍＭになるように加え、再度Ｔ、ポリヌクレオ
ヂドキナーゼ９単位を添加し、３７℃で２５分間インキ
ュベートした。反応後、９０℃、５分間処理してＴ、ポ
リヌクレオチドキナーゼを失活させた。この溶液に等容
のフェノールを加え、撹拌したのち、１５０００ｒｐｍ
、４℃、２分間の遠心テ水Ｍヲｅ取した。この水層に等
容のクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：ｌ）
を加え、撹拌、遠心することによりフェノールを抽出除
去した。この水層に尾容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４
，８）ｊ−ｒよび２，５容のエタノールを加え、−２０
℃で２時間以上放置した。沈澱を１５０００　ｒｐｌＴ
ｌ、　４°Ｃ１７分間遠心して集め、−２０℃で冷した
７０％エタノールで２回洗浄し、減圧下でアルコール分
を除いた。残渣を１０μＱの１０ｍＭトリス塩酸−１ｇ
ａＭＥＤＴＡ溶液（ＴＥ、ｐＨ８，０）に溶解し、次の
実験に使用した。

（Ｉ−３）Ｔ、ＤＮＡリガーゼによる合成オリゴヌクレ
オチドの連結（ＤＮＡブロック ！−Ｖの作製） 完全鎖長遺伝子合成のために１７のオリゴヌクレオチド
を５つのブロック（Ｉ−Ｖ）に分け、Ｔ、ＤＮＡリガー
ゼにより連結した（第３図参照）。

各ブロックを構成するオリゴヌクレオチドのうち上下各
ストランドの５′末端に位置するオリゴヌクレオチド１
．５μｇ１その他のオリゴヌクレオチドｌμｇを５０ｍ
Ｍトリス塩酸−１０ｍＭ　　Ｍ　ｇＣＱｘ温溶液ｐＨ７
，６）８０μα中に混合した。この溶液を９０℃、５分
間加熱した後、２時間かけて４℃まで徐冷し、１００ｍ
Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）とｌＯｍＭＡＴＰを１
０μＱずつ加え、さらにＴ、ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社
製）２．５ｕｎｉｔＳを添加して４℃で１５時間インキ
ュベートした。

反応液を等容のフェノールで処理し、クロロホルム抽出
を２回行いフェノールを除去した。この溶液に３倍容の
ｎ−ブタノールを加え、撹拌、遠心して濃縮し、残余の
ｎ−ブタノールをクロロホルムにより抽出除去した。こ
の溶液にＸ容の電気泳動用マーカー（０，２５％ブロモ
フェノールブルー　０．２５％キシレンシアツール、３
０％グリセロール）を加え、８％ポリアクリルアミドゲ
ルにのせ、８９ｍＭトリスホウ酸−２ｍＭ　　ＥＤＴＡ
（ＴＢＥ、ｐＨ８，０）緩衝液ｆ２００Ｖ、４時間電気
泳動を行った。泳動後、ゲルを０．５μｇ／ｍＱのエチ
ジウムブロマイド溶液（ＴＢＥ中）に１５分間浸漬し、
ＤＮＡの染色を行った。染色したゲルをトランスイルミ
ネーター上にのせ、紫外線をあて目的とするＤＮＡを含
むバンドを切り出した。

このゲルを５Ｔ１１１１用のデイスポーサブル注射筒に
入れ、１８Ｇの針をつけ、ゲルを針先から押し出すこと
により細かく砕いた。細かく砕いたゲルを１゜５ｍ１２
用エツペンドル７チユーブに入れ、２０ｎ＋Ｍトリス塩
酸−１，５ｍＭ　　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，０）５００
μＱを加え、３７°Ｃで１晩浸漬することにより目的の
ＤＮＡを抽出した。抽出液にトリエチルアミンを終濃度
が１０ｍＭになるように加え、０．１Ｍ）リス塩酸−１
０ｍＭ）リエチルアミンー１ｍＭ　　ＥＤＴＡ溶液（ｐ
Ｈ７，７）で平衡化した核酸精製用カートリッジＮｅｎ
５ｏｒｂ２０　（Ｄｕ　ｐｏｎｄ社製）に通すことによ
りＤＮＡを吸着させた。カートリッジに３１１ＩＱの０
．１Ｍトリス塩酸−ＩＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７，７）＄
５よび滅菌水を流して洗浄した後、ＤＮＡを５０％メタ
ノール（高速液体クロマト用）溶液として溶出した。溶
出液を減圧下で濃縮乾固した後、残渣をｌＯμａの滅菌
水に溶解した。

（Ｉ−４）Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるブロックの連結一
完全鎖長遺伝子の作製 前記（１−３）で連結した５つのＤＮＡブロック（■、
■、■、■、■）を第３図に示すように２つずつＴ、Ｄ
ＮＡリガーゼにより連結し、完全鎖長のヒト型ＳＯＤ遺
伝子を作製した。

隣合せの２ブロツクをそれぞれ０．５μｇずつ５ＱｍＭ
）リス塩酸−１０ｍＭ　　Ｍ　ｇ　ＣＱｘ浴溶液ｐＨ７
。

６）４０μａに混合し、３７℃で３０分間インキュベー
トした後、４℃まで３０分間で除冷した。

この溶液にｌｏＯｍＭ　　ＤＴＴ、ｌＯｍＭＡＴＰをお
のおの５μαずつ加え、さらにＴ、ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造社製）１０ｕｎｉｔｓを添加して４℃、１５時間反
応させた。この反応液に等容のフェノール−クロロホル
ム−イソアミルアルコール（２５：２４：ｌ）を加え撹
拌、遠心して水層を得た。

これに電気泳動用マーカーを尾容加え、６％ポリアクリ
ルアミドゲルにのせＴＨＥ緩衝液で２００Ｖ、６時間電
気泳動を行った。泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド
染色した後、トランスイルミネーター上で目的とするＤ
ＮＡバンドを切り出した。切り出したゲルから（１−３
）と同様にＤＮＡを抽出し、Ｎｅｎ５ｏｒｂ２０を用い
て精製した。

（１−５）　　完全鎖長遺伝子のクローニング１）完全
鎖長ヒト型ＳＯＤ遺伝子約ｌμｇを１２０μＱの５３ｍ
Ｍトリス塩酸−１０ｍＭ　　Ｍ　ｇＣＱｘ　−０，１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ−５ｍＭ　　ＤＴＴ−０，１ｍＭスペル
ミジン−１，７℃Ｍ　　ＡＴＰ溶液（ｐＨ７，６）と混
合し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）　
９　ｕｎｉｔｓを添加し、３７℃、１５分間インキュベ
ートした。次にＡＴＰを終濃度１ｍＭになるように加え
、再度Ｔ、ポリヌクレオチドキナーゼ９ｕｎｉｔｓを添
加し、３７℃で２５分間インキュベートした。反応後、
等量のフェノール：クロロホルム：イソアミル　アルコ
ール（２５：２４：ｌ）を加え撹拌したのち１５０００
ｒｐｍ、２分間の遠心で水層を得た。この水層に等量の
クロロホルムを加え撹拌、遠心することにより残余のフ
ェノールを抽出除去した。この水層に尾容の３Ｍ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ４，８）および２．５容のエタノールを
加え、−２０℃で２時間以上放置した。

沈澱を１５００Ｏｒｐｍ、４℃で７分間遠心して集め一
２０℃に冷した７０％エタノールで２回洗浄し、減圧下
でアルコール分を除いた。こうして０゜８℃ｇのリン酸
化ヒト型ＳＯＤ遺伝子が得られ、４０μａのＴＥに溶解
し、次の実験に使用した。

２）　リン酸化ヒト型ＳＯＤ遺伝子３０ｎｇおよび制限
酵素、１４１ｎｄｌｌＴ　、、Ｂ　ａｌｌｌＨＩで切断
したｐｕｃ１３　２８０ｎｇを７−５μｃの０．１Ｍト
リス塩酸−５ｍＭ　　ＭｇＣＱｚ溶液に混合し、６０ｐ
ＱのＴ　ａｋａｒａｌｉｇａｔｉｏｎ　　Ｋ　ｉｔ　（
宝酒造社製）Ａ液を加え、よく撹拌した。この溶液に７
．５ｔｔＱのｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋ　ｉＬＢ液を加えよ
く撹拌した後、１６℃で３０分間インキニーベートした
。反応後、この溶液をＥ。

ｅｏｌｉ　　ＪＭ１０９株の形質転換に使用した。

３）ヒト型ＳＯＤ遺伝子を挿入したｐＵｃ１３４０ｎｇ
（１０ｐＱ’）に５０ｍＭ　　ＣａＣ（２，処理したＥ
。

ｃｏ１ｉＪＭ１０９株の細胞懸液２００／ＪＩ２を加え
、おだやかに混合した。混合液を氷水中で３０分間揮ン
キュベートした後、さらに４２℃で３分間インキュベー
トしてＤＮＡを細胞中にとりこませた。

この懸濁液に１ｍ１２の２　Ｘ　Ｙ　ＴｍｅｄｉｕＩｌ
ｌ（１５ｇ／　Ｑバクトドリプトン、ｌＯｇ／Ｑ酵母抽
出エキス、５ｇ／Ｑ　　ＮａＣ（１）を加え、振盪しな
がら３７℃で１時間インキニーベートした。この細胞懸
濁液を２５．５０．１００，２００および４００／７１
２εす２ＸＹＴ寒天培地（５０μｇ／＋ｍｆｆアンピシ
リン、４０ｎ＋ｇ／Ｑ５−ブロモー４−クロロ−３−イ
ンドリル−β−Ｄ−チオガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）　
、２３．８３ｍｇ／Ｑイングロビルーβ−Ｄ−チオガラ
クシトシド（ＩＰＴＧ）、１．５％寒天を含む）上にプ
レートした。このプレートを３７°０で２４時間インキ
ュベートし、得られた白いコロニーを新しい２ＸＹＴ寒
天培地（アンピシリン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ、１．５
％寒天を含む）にスポットして３７°Ｃで１晩培養する
ことにより単離した。

単離した白いコロニーを２ｍＱの２ＹＴ溶液培地（５０
μｇ／ｍＱアンピシリンを含む）に白金耳で植え付け３
７℃で１晩培養した。培養液を１ｍ＋２とり１．５容エ
ツベンドル７チユーブに移し、１５００　Ｏｒｐｍ、　
３０秒間遠心して細胞を集めた。集めた細胞を１＋＋＋
ＱのＳ　Ｅ　Ｔ　ｂｕｆｆｅｒ　（２０％ショ糖、５０
Ｉ！１Ｍトリス塩酸、５０ｍＦｖｉ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ
７゜６）に懸濁し、１５０００ｒｐｍ、１分間遠心して
洗浄した。この細胞を再び１５０μＱの５ＥＴｂｕｆｆ
ｅｒに懸濁し、５ｐ（ｌのＲＮａｓｅ溶液（１０ｍｇ／
−リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）、０．１Ｍ酢酸す
１−リウム、０．３ｍＭ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ４，８）を
加えポルテックスミキサーで十分混合した。これに３５
０μａの溶菌液（１％ＳＤＳ、０．２ＮＮａＯＩ４）を
加え、チューブを逆さにすることによりおだやかに撹拌
し、完全に溶菌させた。この溶菌液を氷水中でｌＯ分間
インキュベ−トシた後、２ＦｉＯｐＱの酢酸ナトリウム
（ｐＨ４，８）を加え、十分混合し、さらに氷水中に３
０分間放置した。

この混合液を１５０００ｒｐｎ＋、４℃で１０分間遠心
してＳＤＳおよび染色体ＤＮＡを沈澱として除いた。上
溝を別のエッペンドルフチューブにＳＬ、、等量のイン
プロパツールを加えよく混合し、１５０００ｒｐｍ、　
４°０で７分間遠心してプラスミドＤＮＡを沈Ｒｋして
集めた。沈澱を苗木に溶解し、一部を制御酵素Ｈｉｎｄ
ｌｌｌ、ＢａｍＨＩ処理し、１．２％ａｇａｌ−ｏｓｅ
ゲル電気泳動を行い４７５ｂｐのＤＮＡ断片がｐＵＣ１
３に導入されていることを確認した。このようにして得
られた組換えプラスミドをｐＵＣ１３−ｈ−５ＯＤと命
名する。

■。ｈ−Ｓ　ＯＤ発現用ベクターの構築（１１−１）ｈ
−３ＯＤ遺伝子の調製 ｐＵＣｌ　３−ｈ−９ＯＤ　　ＤＮＡを５ＤＳ−アルカ
リ法および塩化セシウムーエヂジウムブロマイド平衡密
度句配遠心分離法（Ｂ、　ＰｅｒｂａＬ　Ａ。

Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ｇａ１ｄｅ　　ｔｏ　　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ１４０−１４４、Ｊ　
ｏｈｏｎ　　Ｗ　１ｌｅｙ　　ａｎｄ　　Ｓ　ｏｎｓＩ
　ｎｃ、刊）により大量に調製した。調製したｐＵＣ１
３−ｈ−５ＯＤ　　ＤＮＡ　　８０ｔｔＱＣ４０ｐｇ）
と５　Ｘ　Ｈ１ｎｄｌｕ切断用バツフアー（５０ｍＭト
リス塩酸、３５ｍＭ　　ＭｇＣＯ２，３００＋ｎＭ　　
ＮａＣＱ。

ｐＨ７，５）３０μｌ！及びＨｉｎｄｌｌｌ（宝酒造社
製）８０　ｕｎｉｔｓに水を加えて１５０／７Ｑとした
エッベンドルフチューブ（１，５ｍ１２用）を１０本用
意し、３７″０で３時間反応させた。反応後、フェノー
ル：りａロホルム（１８１）、クロロホルム処理シ、丸
容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）　、２．５容の
エタノールを加え、−２０℃で２時間以上放置した。生
じたＤＮＡの沈澱を１５０００　ｒｐｍ。

４°Ｃで１０分間遠心し、７０％エタノールで洗浄後、
減圧乾固させた。残渣を５５０μＱの滅菌水に溶解し、
５つのチューブに１１０μαずつ分注した。それぞれの
チューブに５ＸＥｃｏＲＩ切断用バツフアー（２５０ｍ
Ｍトリス塩酸、３５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２！、５００ｍＭ
　　ＮａＣＱ、３５ｍＭ　　２−メルカプトエタノール
、０．０５％ウシ血清アルブミン）３０μｆｆ及びＥｃ
ｏＲＩ（宝酒造社製）　１００ｕｎｉｔｓに水を加えて
１５０μＱとし、３７℃で３時間反応させた。反応後、
フェノール：クロロホルム（ｌ：ｌ）処理エタノール沈
澱してＤＮＡを回収した。

目的とするｈ−３ＯＤ遺伝子（ＨｉｎｄＩ［−ＥｃｏＲ
Ｉ％約５００　ｂｐ）を２％アガロースゲルによる電気
泳動を行って分離し、核酸精製用カートリッジＮｅｎ５
ｏｒｂ２０　（Ｄｕｐｏｎｄ社）を用いて精製した。

■−２，）（ｉｌｃｌｌ−Ｈｉｎｄｌ［［断片の合皮Ｓ
　ｈｉｎｅ　　Ｄ　ａｌｇａｒｎｏ　（Ｓ　／　Ｄ　）
配列を含む発現調節領域の合皮のために４つのオリゴヌ
クレオチド（第４図参照）をホスホアミダイト法により
化学合成し、高速液体クロマトグラフィーにより精製し
た。５′末端をＴ、ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰ
でリン酸化し、ｃ、　　１．５３μｇ、ｃ。

１．８３μｇ、Ｖｌ　　　Ｏ，７３μｇ、Ｖ２　　０．
５６／Ｊｇを８０ｐＱの５０ｍＭトリス塩酸−ＩＱｍＭ
ＭｇＣＱ２溶液に混合した。この溶液を９０℃、５分間
加熱した後、２時間かけて４℃まで除冷し、１００ｍＭ
ジチオスレイトール、１０ｍＭ　　ＡＴＰをｌＯμαず
つ加え、さらにＴ、ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）　２
．５ｕｎｉｔｓを添加して４℃で１５時間インキュベー
トした。反応液を７エノール：クロロホルム、クロロホ
ルム処理し、ＤＮＡをエタノール沈澱して回収した。

（ｎ−３）ｈ−５ＯＤ遺伝子（Ｈ１ｎｄＩ［Ｉ　−Ｅ　
ｃｏＲＩ　）と合皮ＤＮＡ断片（Ｈｉｎｃｌ［−Ｈｌｎ
ｄｌ［［）の連結 ｌｌ−２で調製した合皮ＤＮＡ断片（Ｈｉｎｃｎ　−Ｈ
ｌｎｄｌｌｌ）　０．６　ｔｔｇとｈ−Ｓ　ＯＤ遺伝子
４．１℃ｇを５０ｍＭトリス塩酸−１０ｍＭ　　ＭｇＣ
１２１−１０ｍＭジチオスレイトール−１１Ｍ　　ＡＴ
Ｐ溶液（ｐＨ７。

６）に混合し、Ｔ、　　ＤＮＡリガーゼ３μｎ１Ｌｓを
添加して２０μａとした。この反応液を１０℃で１５時
間インキュベートした後、６５℃で１（１間熱処理して
反応を止めた。目的のＤＮＡ断片（約５７０　ｂｐ）を
２％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＤＮＡ精
製用キットＧ　ｅｎｅｃｌｅａｎ＠　（Ｂ１０１０１社
製）を用いて精製した。

（Ｉｆ　　４）　　ｔａｃプロモーター遺伝子の調整Ｌ
ａｃプロモーターを有する大腸曹発現用ベクターｐＫＫ
２２３−３（ファルマシア社より購入）を５ＤＳ−アル
カリ法と塩化セシウム−エチジウムブロマイド平衡密度
勾配遠心法により大量調製シタ。ｐＫＫ２２３−３ＤＮ
Ａ溶液３ＯＮ４（８０ｉｔｇ　　ＤＮＡ）　、５ＸＢａ
ｏ＋ＨＩ切断用バッファー（５０ＩＩＩＭトリス塩酸、
３５　ｍＭ　　ＭｇＣＩ２１．５゜ＯｍＭ　　ＮａＣＬ
　　Ｉ　０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．０５％
ウシ血清アルブミン、ｐＨ８，０）４０ｔｔＱ及びＢａ
ｍＨＩ（宝酒造社製）　２４０ｕｎｉｔｓに水を加えて
２００μＱとしたエツペンドル７チューブ１０本を用意
し、３０’Ｏで３時間反応させた。反応後、フェノール
：クロロホルム、クロロホルム処理し、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱して回収した。目的のＤＮＡ断片（２６９ｂｐ
）を２％アガロースゲル電気泳運により分離し、ゲルか
らＤＮＡを電気的に溶出し、核酸精製用カートリッジＮ
ｅｎ５ｏｒｂ２０　（Ｄｕｐｏｎｄ社製）を用いて精製
した。

精製したＤＮＡ断片８μｇを５ＸＨｉｎｃｌ［切断用バ
ッファー（５０ｍＭトリス塩酸、３５　ｍＭ　　Ｍ　ｇ
ＣＬ３００ｍＭ　　ＮａＣＱ、　　３５ａ＋Ｍ　　２−
メルカプトエタノール、ｐＨ８，０）　９．ｕｆｆｉ及
びＨｉｎｃｌＩ（宝酒造社製）　３０ｕｎｉｔｓにＨ！
Ｏを加えて４５μｍ２として、３７℃で２時間反応させ
た。反応後、６５℃で１０分間熱処理し、２．５％アガ
ロースゲル電気泳動して、目的のＤＮＡ断片（１９１ｂ
ｐ）を分離し、Ｎｅｎ５ｏｒｂ２０を用いて精製した。

（ＩＩ−５）　　ｔａｃプロモーター遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ　−ＨｌｎｃＩ［）とＨｉｎｃｌｒ　−ＥｃｏＲＩ断
片の連結 ｔａｃプロモーター遺伝子（１９１ｂＰ）０．５．ｕｇ
。

Ｈ１ｎｃｌ［−Ｅ　ｃｏＲＩ断片１．５μｇを１０ｍＭ
）リス塩酸−１ｍＭ　　ＥＤＴＡ−３００ｍＭ　　Ｎａ
ＣＱ溶液（ｐＨ８，０）９．６８＃Ｑに混合し、Ｔ　ａ
ｋａｒａ　　ｌ　ｉｇａｔｉｏｎ　　ｋｉｔ　（宝酒造
）Ｂ液９．６８μｇを加え、２６℃で１時間反応させた
。反応後、ＤＮＡをエタノール沈澱して回収しＩ；。得
られたＤＮＡを２０ＥＱのＢａｍＨＩ切断用バッファー
（ｌｏ＋ｎＭｈリス塩酸、７ＩＩＩＭＭｇＣＱ２、ｌ　
ＯＯｍＭ　ＮａＣｆｆ、　２１１１Ｍ　２−メルカプト
エタノール、０．０１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ８，
０）に混合し、ＢａｍＨＩにｕｎｉｔ、ｓを加え、３０
℃で２時間反応させた。反応後、６０°０で１０分間熱
処理して反応を停止させ　Ｉ：　。

（ｎ−６）　　プラスミド（ｐＫＫ２２３−３）のアル
カリ７オス７アターゼ処理 ｐＫＫ２２３−３をＢａｍＨＩ処理して得られた約４３
２０ｂｐのＤＮＡ断片１０μｓを１００μａの５０１１
ＩＭトリス塩酸（ｐＨ８，０”）に混合し、１０μＱの
アルカリ７オスブアターゼ溶液（０，５ｕｎｉｔＳアル
カリフォスファターゼ（宝酒造社製）、１０ｍＭ　ト　
リ　ス塩酸、　５　０ｍＭ　　　　ＮａＣＱ、　　　ｌ
　　ＩＩＩＭ　　　　Ｚｎ５ＯいｐＨ７，５）を加え、
３７℃で１時間インキュベートした。反応後、さらに１
０μＱのアルカリ７オスフアターゼ溶液を加え６５袖で
１５分間インキュベートし、２ｐＱの２５０ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡを加え反応を停止させた。ＤＮＡはエタノール沈
澱し５て集め０．２μｇ／μａになるようにｌＱｍＭト
リス塩酸−１＋ｎＭ　ＥＤＴＡ　（ＴＥ、ｐＨ８，０）
に溶解し、次の実験に使用した。

（ＩＩ−７）ｐＫＫ２３３−３とＢａｍＨＩ−ＢａｍＨ
Ｉ（プロモーターとｈ−Ｓ　ＯＤ遺伝子）の連結 ＢａｍＨ１−ＢａｍＨＩ　７ラグメント（■−５で調製
）　５ＯＤｇ、　ｐＫＫ２２３−３　（ＩＮ−６で調製
）２８０ｎｇをｌ　ｌ　、４　ｐＱのＴＥに混合し、４
５．６ｐａのＴａｋａｒａ　　ｌｉｇａｔｉｏｎ　　Ｋ
ｉｔ　Ａ液および１１゜４μＱの８液を加えて１６℃で
２時間反応させた。

反応後、この液をＥ、ｅｏｌｉ　　１Ｍ１０５株の形質
転換に用いた。

ＩＩｌ、　ｐＫＫｈ−５ＯＤ　ｌ　Ｏの大量調製（Ｉｌ
ｌ−１）ｐＫＫｈ−５ＯＤ　１０による大腸菌ＪＭ１０
５株の形質転換 ５０頂ＱのＬＢ培地（１０ｇ　　Ｂａｅｔｏ　　トリプ
トン、５　ｇ　　Ｂ　ａｅｔｏ　　酵母抽出液、１０ｇ
　　ＮａＣＱ）でＯ，Ｄ、６　Ｏ０＝０．３〜０．５ま
で培養した大腸菌ＪＭ１０５株を８００　Ｏｒｐｍ、　
４℃で５分間遠心して集め、２５ｍ１２の１０ｍＭ　　
ＮａＣＱで洗浄した。洗浄後、細胞を２５ｍ１２の冷た
い５０ｍＭＣａＣＱ２に懸濁させた。この懸濁液を氷水
中に２０分間放置しｔこ後、ただちに細胞を遠心して（
５００Ｑ　ｒｐｍ、１０分）集めた。集めた細胞を再び
５ｍ１２の冷たい５０ｍＭ　　ＣａＣＬにおだやかに懸
濁し、４時間水冷することによりコンピテント細胞を得
た。このコンピテント細胞懸濁液２００μＱに５ＯＤｇ
のＩ）ＫＫＩＩ　−ＳＯＤ　１０を加え、Ｏ″０で６０
分間、ついで４２°Ｃで２分間熱処理し、ベクターを細
胞に取り込まＪＣｊ：た。この細胞液に２−の１−　Ｂ
培地を加え、３７℃で１時間振盪培養した後、５０／Ｊ
　ｇ／　ｍＱのアンピシリンを含む２ＹＴ寒天培地（１
５ｇＢａｅｔｏ　　トリプトン、ｌＯｇ　　Ｂａｅｔｏ
酵母抽出液、５ｇ　　ＮａＣＱＳ　１．５％寒天）にブ
レーティングし、３７°Ｃで１晩培養した。このように
して得うれたコロニーからプラスミドを調製し、制限酵
素地図を解析することによって目的のプラスミドを保持
していることを確認した。

ＩＶ、ｈ−５ＯＤ　　ｇｅｎｅのラン藻　Ａ　ｎａｅｙ
ｓｔｉｓｎｉｄｕｌａｎｓ　　６３０１　ｓ　Ｒ２によ
る発現（ＩＶ　−１）　　Ａ　、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ６
３０１　（Ｓ　ｙｎｎｅｃｈｏｃｏｅｕｓｓＰ　ＣＣ６
３０１）およびＲ２株 （Ｓ　ｙｎｎｅｅｈｏｅｏｅｕｓｓ　Ｐ　ＣＣ７９４２
）の形質転換 ７５１１ＩＱの液体培地（ＢＧ−１１本）で１５〜３０
日間培養した細胞を８０００ｒｐｍ、　５分間遠心して
集め、７５ｒｎＱの新しい培地に移す。これを光照射下
で１〜３日間培養する。この細胞を８００Ｑ　ｒｐｍで
５分間遠心して集め、１ｍＭ　　ｌ１ｅｐｅｓ（ｐＨ７
，０）２０頂Ｑおよびｉｏ＋ｄ、さらに形質転換用緩衝
液（２７２ＩＩ＋Ｍ　　ショ糖、３ｍＭリン酸カリウム
（ｐＨ７−４）、１５％グリセロール）５ｍ１２で遠心
洗浄する。得られた細胞のベレットを形質転換用ｂｕｆ
ｆｅｒに懸濁し、Ｉ　Ｏ”ｃｅｌｌｓ／　ｍ０以上の濃
度（好ましくは２　Ｘ　Ｉ　Ｏ”ｃｅｌｌｓ／ｍＱ）に
調整し、形質転換用試料とした。

形質転換は津島製作所社製細胞融合装置Ｓ　Ｓ　Ｈ−ｌ
を用いたエレクトロボーレーション法によって行った。

上記で調製した試料を５０μαずつエツベンドルフチュ
ーブに分注し、氷冷する。これにｌ〜２μＱのＤＮＡ溶
液（終濃度が２０〜３０μｇ／ｍＱになるようにｐＫＫ
ｈ−５ＯＤＩＯをＴＥ緩衝液に溶解したもの）を加え、
撹拌したのち、エレクトロチャンバーに移す。ただちに
５００μｓｅｃ。

７　、５　ｋＶ／　ｃｍの条件でパルスをかけ、ＤＮＡ
を細胞中にとりこませる。パルス処理した細胞をすばや
（１，９＋ｎ１２のＢＧ−１１培地に移し、暗所でｌ晩
振盪培養する。この細胞を１００〜２００μαずつＢＧ
−１１寒天培地（１ｍＭ　　Ｎａ、Ｓ　、０、．１、ｏ
Ｐｇ／ｍｆｆアンピシリン、１．５％ａｇａｒを含む）
にまき、光照射下（２０００ルクス）で７〜１０日間培
養する。出現してまたコロニーを新しい寒天培地に移し
、ｈ−Ｓ　ＯＤの発現を調べる。

本ＢＧ−１１培地の組成（１１２中） ＮａＮＯ，１，５ｇ Ｋ　ｚ　ＨＰ　Ｏ４４０ｍｇ Ｍｇ５０１７　Ｈｚｏ　　　　　　　７５ｍｇＣａＣ（
２，・　２　ＨＩＯ３６ｍｇ Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍ
ｇＮａ２ＣＯ３５ｎｇ クエン酸アンモニウム鉄　　　６ｍｇ クエン酸　　　　　　　　　　６ｍｇ Ｈｓ　Ｂ　Ｏｓ　　　　　　　　　　　２−８６ｍｇＭ
ｎＣｆｆ、　・４　Ｈ，０１，８１ｍｇＺｎ５Ｏ，・７
　Ｈｚｏ　　　　　　　Ｏ，２２２ｍｇＮａ、ＭｏＯ１
２Ｈ！０　　　　　０．０２１＋ｏｇＣｕＳＯ１５Ｈｚ
ｏ　　　　　　　０．０８ｍｇＣｏ（Ｎ　Ｏり！　・６
　Ｈｚｏ　　　　　０．０２９５ｍｇ（ＩＶ　−２）　
　ｈ−Ｓ　ＯＤの検出形質転換で得られたコロニーを培
養した寒天プレート上に１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＢＧ−１１をしみ
こませたニトロセルロース膜（アマジャム社製、Ｈｙｂ
ｏｎｄＣ）をのせ、光照射下で１日培養した。

培養後、はがしたニトロセルロース膜を０．３％Ｈ，Ｏ
，を含む５０％メタノールに２０分間ひたし、内性のペ
ルオキシダーゼを失活させた。さらに、この膜を０．５
％グルタルアルデヒド、０．０５％ノニデットＰ−４０
を含むｌｏｍＭ　　ＰＢＳに４℃で１晩処理することに
より膜上のタンパクの固定を行った。

膜に固定されたＡ　、　ｎ１ｄｕｌａｎｓタンパク中の
ｈ−５ＯＤを抗ヒトＳＯＤを用いた酵素抗体により検出
した。上記の膜を５％スキムミルク、０．１％ツイーン
２０を含むＴＢＳ（２０ｍＭトリス塩酸、０．９％Ｎａ
Ｃｆｆ１ｐＨ７，４）に３７°Ｃで２時間処理した。こ
の膜を洗浄液（０，１％ＢＳＡを含むＴＢＳ）で１５分
間（５分×３）洗い、ｌ／１０００抗ｈ−３ＯＤ（ヤギ
ＩｇＧＳＢｉｎｄｉｎｇ　　５ｉｔｅ社製）、１％ＢＳ
Ａを含むとともに室温で２時間インキュベートする。次
に、同様に膜を洗浄した後、１／１０００ペルオキシダ
ーゼ抗ヤギＩ　ｇＧ　（Ｃａｐｐｅ１社製）、１％ＢＳ
Ａを含むＴＢＳで室温、２時間インキュベートした。膜
を洗浄液で２０分間（５分×４）洗浄した後、１０ｍｇ
ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）１５μ（ｌの３２％Ｈ２
Ｏ２を含む４０ｍＱの０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７，
４）で染色させた。

その結果、１００個のコロニーのうち２３個のコロニー
が茶褐色に染まり、ｈ−ＳＯＤの発現を確認した。

【図面の簡単な説明】

第１図は組換プラスミドの調製のための製造工程図であ
り、 第２図はｈ−Ｓ　ＯＤ遺伝子の化学合成における該遺伝
子のＤＮＡ断片の塩基配列図であり、第３図はｈ　−Ｓ
　ＯＤ遺伝子の作製方法を示す工程図であり、 第４図は発現調節領域の合皮のための工程図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ヒト・スーパーオキシドジスムターゼと実質的に同
   一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡ配列が導入された組換えプラスミドまたは発現可能
   なＤＮＡ断片で形質転換されたらん藻細胞を培地で培養
   することを特徴とするらん藻細胞における上記ポリペプ
   チドの発現方法。