JPH0568575A - 細胞の遺伝子的形質転換のための工程と装置 - Google Patents
細胞の遺伝子的形質転換のための工程と装置Info
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- JPH0568575A JPH0568575A JP2412223A JP41222390A JPH0568575A JP H0568575 A JPH0568575 A JP H0568575A JP 2412223 A JP2412223 A JP 2412223A JP 41222390 A JP41222390 A JP 41222390A JP H0568575 A JPH0568575 A JP H0568575A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
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- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】細胞、特に植物細胞を形質転換するための工程
とその工程の実施のために使用する装置を提供する。 【構成】カニュール４２の端部に出る液滴（ＤＮＡと金
粒子を懸濁している）ＴをＣＯ2 銃３１より射出される
ＣＯ2 の圧パルスにより霧の微滴にして、該微滴を絞り
管１７を通して該圧パルスにより加速して細胞支持台の
上に置いた細胞に衝撃させ、該金粒子の衝撃により該細
胞に小孔を空けて、該小孔より該ＤＮＡを該細胞内に通
過せしめて、該細胞を形質転換する。
とその工程の実施のために使用する装置を提供する。 【構成】カニュール４２の端部に出る液滴（ＤＮＡと金
粒子を懸濁している）ＴをＣＯ2 銃３１より射出される
ＣＯ2 の圧パルスにより霧の微滴にして、該微滴を絞り
管１７を通して該圧パルスにより加速して細胞支持台の
上に置いた細胞に衝撃させ、該金粒子の衝撃により該細
胞に小孔を空けて、該小孔より該ＤＮＡを該細胞内に通
過せしめて、該細胞を形質転換する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】発明の背景 本発明は、細胞中に粒子を挿入するための工程を実施す
るための装置と共に、細胞、特に植物細胞の遺伝子形質
転換のための工程に関する。
るための装置と共に、細胞、特に植物細胞の遺伝子形質
転換のための工程に関する。
【０００２】このような工程と該当する装置は例えば欧
州特許公開公報ＥＰ−Ａ−０２７０３５６号に記述され
ている。更に、本発明は、トランスジェニック植物の製
造のための本発明に従う工程の利用並びに該工程により
得られるトランスジェニック植物とその子孫にも関す
る。
州特許公開公報ＥＰ−Ａ−０２７０３５６号に記述され
ている。更に、本発明は、トランスジェニック植物の製
造のための本発明に従う工程の利用並びに該工程により
得られるトランスジェニック植物とその子孫にも関す
る。
【０００３】
【従来の技術】現在、組み換えＤＮＡ技術の手段による
植物の遺伝子型の遺伝子的操作のためには、多数の工程
と方法が入手でき；それらは多くの実験室でルーチン的
に使用されている。最も効果的に研究され、そしてもっ
とも頻繁に使用されている工程は疑いもなく、アグロバ
クター（Ａｇｒｏｂｃｔｅｒｉｕｍ）の形質転換系であ
る。アグロバクター細胞はそのＴｉ−プラスミドに大き
いＤＮＡ断片を有し、これは所謂Ｔ−ＤＮＡ領域と呼ば
れ、植物細胞の自然の形質転換では植物のゲノムに組み
込まれる。この自然の遺伝子伝達系は、植物の制御され
た形質転換のための遺伝子ベクター系として、いろいろ
な変換をした後に使用できるだろう。（チルトン，Ｍ
Ｄ，１９８３）。
植物の遺伝子型の遺伝子的操作のためには、多数の工程
と方法が入手でき；それらは多くの実験室でルーチン的
に使用されている。最も効果的に研究され、そしてもっ
とも頻繁に使用されている工程は疑いもなく、アグロバ
クター（Ａｇｒｏｂｃｔｅｒｉｕｍ）の形質転換系であ
る。アグロバクター細胞はそのＴｉ−プラスミドに大き
いＤＮＡ断片を有し、これは所謂Ｔ−ＤＮＡ領域と呼ば
れ、植物細胞の自然の形質転換では植物のゲノムに組み
込まれる。この自然の遺伝子伝達系は、植物の制御され
た形質転換のための遺伝子ベクター系として、いろいろ
な変換をした後に使用できるだろう。（チルトン，Ｍ
Ｄ，１９８３）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、アグロバクタ
ー形質転換系は下記の決定的な不利な点を有している。
即ち、アグロバクターの効果的範囲はある種の双子葉植
物と農業経済の観点からは無意味である単子葉植物（ハ
ーナルスチーンス他、１９８４；フーカース−ヴァン−
スログテレン他，１９８４）に限定される点である。こ
れは殆どの重要な栽培植物が有効な遺伝子伝達をするの
には至っていないことを意味する。更に、アグロバクタ
ーは病原菌であり、これはその宿主の植物ではガン様の
組織生長の形で特徴的な病徴を誘導するので、これは実
験室でのみにおいて厳重な安全管理のもとで操作される
ことになるであろう。
ー形質転換系は下記の決定的な不利な点を有している。
即ち、アグロバクターの効果的範囲はある種の双子葉植
物と農業経済の観点からは無意味である単子葉植物（ハ
ーナルスチーンス他、１９８４；フーカース−ヴァン−
スログテレン他，１９８４）に限定される点である。こ
れは殆どの重要な栽培植物が有効な遺伝子伝達をするの
には至っていないことを意味する。更に、アグロバクタ
ーは病原菌であり、これはその宿主の植物ではガン様の
組織生長の形で特徴的な病徴を誘導するので、これは実
験室でのみにおいて厳重な安全管理のもとで操作される
ことになるであろう。
【０００５】アグロバクター形質転換系の不利益を平均
化するために開発されたそして植物のプロトプラストに
外来のＤＮＡの伝達を目的にしている別の形質転換系、
例えばプロトプラスト中へのＤＮＡの直接遺伝子伝達
（パスズコースキー他、１９８４、ポトルカス他，１９
８６）、およびプロトプラスト中へのベクター−フリー
ＤＮＡの微注入（スタインビスとスタベル，１９８３；
モリカワとヤマダ，１９８５）と細胞中へのベクター−
フリーＤＮＡの微注入（ノムラとコマミネ，１９８６）
は、植物種の多数の植物プロトプラストからの、特にイ
ネ科の群からの全植物(entire plant)の再生は現時点で
は未だに多数の問題を与えているという範囲までで問題
があると考えなければならない。
化するために開発されたそして植物のプロトプラストに
外来のＤＮＡの伝達を目的にしている別の形質転換系、
例えばプロトプラスト中へのＤＮＡの直接遺伝子伝達
（パスズコースキー他、１９８４、ポトルカス他，１９
８６）、およびプロトプラスト中へのベクター−フリー
ＤＮＡの微注入（スタインビスとスタベル，１９８３；
モリカワとヤマダ，１９８５）と細胞中へのベクター−
フリーＤＮＡの微注入（ノムラとコマミネ，１９８６）
は、植物種の多数の植物プロトプラストからの、特にイ
ネ科の群からの全植物(entire plant)の再生は現時点で
は未だに多数の問題を与えているという範囲までで問題
があると考えなければならない。
【０００６】この別の形質転換系の別の不利益は、比較
的低い形質転換率、これは今でも1ないし５％の数値で
あるが、である。これらの低い形質転換率は、挿入され
るべきＤＮＡに標識（例えば抗生物質抵抗性遺伝子）を
付けることを必要にし、この標識により形質転換されて
いない多数の細胞から形質転換体を素早く選択すること
が可能になる。
的低い形質転換率、これは今でも1ないし５％の数値で
あるが、である。これらの低い形質転換率は、挿入され
るべきＤＮＡに標識（例えば抗生物質抵抗性遺伝子）を
付けることを必要にし、この標識により形質転換されて
いない多数の細胞から形質転換体を素早く選択すること
が可能になる。
【０００７】これは、特に単子葉植物の群の植物に関し
て、新しくて有用な性質を持つトランスジェニック植物
の、商業的に有効であり且つ経費的に有効な生産すら可
能にする満足できる形質転換の工程は入手できないこと
を意味している。従って、その分類上の位置とその分類
から生じる特殊性に関係なく、全ての植物の迅速な、有
効な且つ再現性のある形質転換を可能にする工程、そし
てこの工程により商業的にすらトランスジェニック植物
の有効且つ経済的な生産を保証できる工程を開発するこ
とは急務である。
て、新しくて有用な性質を持つトランスジェニック植物
の、商業的に有効であり且つ経費的に有効な生産すら可
能にする満足できる形質転換の工程は入手できないこと
を意味している。従って、その分類上の位置とその分類
から生じる特殊性に関係なく、全ての植物の迅速な、有
効な且つ再現性のある形質転換を可能にする工程、そし
てこの工程により商業的にすらトランスジェニック植物
の有効且つ経済的な生産を保証できる工程を開発するこ
とは急務である。
【０００８】これは、単子葉植物の群の植物、特にイネ
科の群の植物に関して特に真実である。このイネ科の植
物は、経済的に最も重要な栽培植物、例えばコムギ、オ
オムギ、ライ麦、オート麦、トウモロコシ、イネ、キビ
および同様のものを包含し、そして特にトランスジェニ
ックな単子葉植物の生産のために現在では満足できる工
程が入手できないので、非常に特別に経済的に重要であ
る。
科の群の植物に関して特に真実である。このイネ科の植
物は、経済的に最も重要な栽培植物、例えばコムギ、オ
オムギ、ライ麦、オート麦、トウモロコシ、イネ、キビ
および同様のものを包含し、そして特にトランスジェニ
ックな単子葉植物の生産のために現在では満足できる工
程が入手できないので、非常に特別に経済的に重要であ
る。
【０００９】この方向の最初の試みは、高級組織化単位
に、例えば無傷の組織体、胚または全体の、完全に生育
した植物に含有されている植物細胞へのＤＮＡの挿入に
基づくいろいろの、つい最近開発された形質転換工程か
ら成る。
に、例えば無傷の組織体、胚または全体の、完全に生育
した植物に含有されている植物細胞へのＤＮＡの挿入に
基づくいろいろの、つい最近開発された形質転換工程か
ら成る。
【００１０】これは、一方ではライ麦植物の若い開花へ
の外来のＤＮＡの注射を包含し（デラ ペナ他，１９８
７）；他方ではアグロバクターで伝達する「トウモロコ
シ−ストリーク ウイルス(maize streak virus)」によ
るトウモロコシ植物上へのウイルス感染を包含する（グ
リムスレイ他、１９８７）。
の外来のＤＮＡの注射を包含し（デラ ペナ他，１９８
７）；他方ではアグロバクターで伝達する「トウモロコ
シ−ストリーク ウイルス(maize streak virus)」によ
るトウモロコシ植物上へのウイルス感染を包含する（グ
リムスレイ他、１９８７）。
【００１１】しかし、これらの新しく開発された工程も
欠点を有する；斯くして例えば初めに上述した工程は現
在まで再現されていない。
欠点を有する；斯くして例えば初めに上述した工程は現
在まで再現されていない。
【００１２】再度、高級組織化単位内の植物細胞の形質
転換を含む別の方法は、形質転換されるべきＤＮＡを伴
う粒子による該細胞の衝撃に基づく。これらの高度に加
速された粒子の衝撃は、衝撃された細胞の細胞壁に孔を
生じ、この孔を通じて粒子は伴っているＤＮＡと共に細
胞に入る。
転換を含む別の方法は、形質転換されるべきＤＮＡを伴
う粒子による該細胞の衝撃に基づく。これらの高度に加
速された粒子の衝撃は、衝撃された細胞の細胞壁に孔を
生じ、この孔を通じて粒子は伴っているＤＮＡと共に細
胞に入る。
【００１３】これらの所謂微投射物の手段により、細胞
の多数は非常に速やかに達成されるであろう。微投射物
は過去に遺伝子の伝達に使用されている（クライン他，
１９８８；クリストウ他，１９８８；欧州特許公開公報
ＥＰ−Ａ−０２７０３５６号）そしてそれらはある問題
の定義に関しては適当であることが見出された。
の多数は非常に速やかに達成されるであろう。微投射物
は過去に遺伝子の伝達に使用されている（クライン他，
１９８８；クリストウ他，１９８８；欧州特許公開公報
ＥＰ−Ａ−０２７０３５６号）そしてそれらはある問題
の定義に関しては適当であることが見出された。
【００１４】しかし、商業的に購入可能である弾道(bal
listic) 装置は、例えば分裂組織の場合に於けるような
該当する小さい細胞を伴う小さい組織の衝撃のためには
特に不適当である。
listic) 装置は、例えば分裂組織の場合に於けるような
該当する小さい細胞を伴う小さい組織の衝撃のためには
特に不適当である。
【００１５】弾道工程において、金属粒子は発射されて
乾燥するので、数個のまたは多数の粒子の集合体が発射
されて、これらがが殆どの場合標本を深く傷つけて切り
裂く。この集合化の傾向は、粒子上のＤＮＡの結合によ
り更に促進される。
乾燥するので、数個のまたは多数の粒子の集合体が発射
されて、これらがが殆どの場合標本を深く傷つけて切り
裂く。この集合化の傾向は、粒子上のＤＮＡの結合によ
り更に促進される。
【００１６】通常、弾道工程の非常に高い粒子速度は大
きい操作距離を必要とし、これは粒子の強い拡散を招
く。粒子の速度は、既知の弾道の方法では大きい足場で
のみ達成できる。この方法では、粒子の強い拡散を改善
することを殆ど可能でない。
きい操作距離を必要とし、これは粒子の強い拡散を招
く。粒子の速度は、既知の弾道の方法では大きい足場で
のみ達成できる。この方法では、粒子の強い拡散を改善
することを殆ど可能でない。
【００１７】しかし、小さい細胞を伴う小さい組織の場
合は、高い形質転換率を得るために、狭く限定された標
的野に均一に分散した各々の粒子で標本が密度高く覆わ
れることを要求する。
合は、高い形質転換率を得るために、狭く限定された標
的野に均一に分散した各々の粒子で標本が密度高く覆わ
れることを要求する。
【００１８】粒子のパルスは可能な限り同じでなければ
ならない。即ち、いろいろな組織に受け入れられるよう
に、速度と質量、標本上の粒子密度および粒子速度を非
常に細かく制御することが可能でなければならない。
ならない。即ち、いろいろな組織に受け入れられるよう
に、速度と質量、標本上の粒子密度および粒子速度を非
常に細かく制御することが可能でなければならない。
【００１９】
【課題を解決するための手段】本発明の概要 これらの要求は、本発明の工程により、そして本発明の
装置により満たされる。有益な実施態様とそれからのよ
り以上の発展も記述する。
装置により満たされる。有益な実施態様とそれからのよ
り以上の発展も記述する。
【００２０】本発明の工程に従うと、高度に粉砕した粒
子状の微投射物、特に金粒子は、ＤＮＡ溶液とのけん濁
物として、圧衝撃により細かい霧に霧化される。
子状の微投射物、特に金粒子は、ＤＮＡ溶液とのけん濁
物として、圧衝撃により細かい霧に霧化される。
【００２１】霧の小滴は粒子とＤＮＡを含有し、それら
は粒子それ自体より僅かだけ大きい。霧は細い小孔また
は毛細管を通して該圧衝撃により加圧され、その際加速
される。細胞上への衝撃で、粒子は細胞膜と原形質膜に
孔を生じ、その孔を通じて霧の小滴中に同伴したＤＮＡ
が細胞内に入れるようになる。
は粒子それ自体より僅かだけ大きい。霧は細い小孔また
は毛細管を通して該圧衝撃により加圧され、その際加速
される。細胞上への衝撃で、粒子は細胞膜と原形質膜に
孔を生じ、その孔を通じて霧の小滴中に同伴したＤＮＡ
が細胞内に入れるようになる。
【００２２】直径１ｍｍ以内の標的表面上で、粒子密度
と粒子の速度は、広い範囲で微細に調節できる。本発明
に従う工程は、技術的に非常に簡単なそして経費効果的
な方法で操業でき、非常に信頼性高く操作できる。
と粒子の速度は、広い範囲で微細に調節できる。本発明
に従う工程は、技術的に非常に簡単なそして経費効果的
な方法で操業でき、非常に信頼性高く操作できる。
【００２３】本発明に従う工程の利用のための特に適当
なそしてその結果好ましいものは、少数の細胞による組
織の形成、特に、例えば例えば植物の新芽の分裂におい
て、原芽体および胚においてまたは胚形成細胞培地にお
いて存在するような分裂組織形成である。
なそしてその結果好ましいものは、少数の細胞による組
織の形成、特に、例えば例えば植物の新芽の分裂におい
て、原芽体および胚においてまたは胚形成細胞培地にお
いて存在するような分裂組織形成である。
【００２４】図面の簡単な説明 本発明の他の目的と利点は、下記の、図面を参考にした
好ましい実施態様の詳細な記述により明瞭になるであろ
う。図１は、本発明に従う工程の例示の実施態様の基本
的略図を示す。図２は、装置の本質的な部分を拡大した
縦断面図を示す。そして、図３は、図２の線III −III
で切断した断面図である。
好ましい実施態様の詳細な記述により明瞭になるであろ
う。図１は、本発明に従う工程の例示の実施態様の基本
的略図を示す。図２は、装置の本質的な部分を拡大した
縦断面図を示す。そして、図３は、図２の線III −III
で切断した断面図である。
【００２５】好ましい実施態様の詳細な記述 図面に見られる通り、本発明の装置は、断面図で示し
た、実質的に円筒状の加圧室１、それに続く標本室２、
加圧室内で圧衝撃を発生するための装置３そして標本室
に接続している吸引装置、例えば水噴射真空ポンプ５の
型式である吸引装置を包含する。
た、実質的に円筒状の加圧室１、それに続く標本室２、
加圧室内で圧衝撃を発生するための装置３そして標本室
に接続している吸引装置、例えば水噴射真空ポンプ５の
型式である吸引装置を包含する。
【００２６】圧衝撃を発生するための装置３は、ＣＯ2
供給円筒３２と共に後方に（示していない）装着してあ
るＣＯ2 銃３１を包含する。ＣＯ2 銃の代わりに、圧縮
空気銃も装着できる。更に、ＣＯ2銃はカートリッジで
操作してもよく、その際ＣＯ2 円筒は除いてもよい。
供給円筒３２と共に後方に（示していない）装着してあ
るＣＯ2 銃３１を包含する。ＣＯ2 銃の代わりに、圧縮
空気銃も装着できる。更に、ＣＯ2銃はカートリッジで
操作してもよく、その際ＣＯ2 円筒は除いてもよい。
【００２７】この装置が、数バールないし約数百バー
ル、または可能ならば更に高いバールの範囲内の加圧室
内で予め決められた大きさの高い一定不変の圧衝撃を発
生できるだけのことが本質である。更に、比較的高い繰
り返しの頻度（吐出：約１回／秒）で連続して圧衝撃の
多数を発生することが可能であるべきことが好ましい。
ル、または可能ならば更に高いバールの範囲内の加圧室
内で予め決められた大きさの高い一定不変の圧衝撃を発
生できるだけのことが本質である。更に、比較的高い繰
り返しの頻度（吐出：約１回／秒）で連続して圧衝撃の
多数を発生することが可能であるべきことが好ましい。
【００２８】加圧室１の構造は詳細に第２図に示した。
これは実質的には比較的厚い壁の耐圧の鋼鉄製の管１１
から成り、この管の長さは約５０ｍｍそしてその内径は
約３ｍｍであり、ほぼ水平位置に支持台６に固定されて
おりそしてその縦軸Ａの周りに回転することができる。
刃止めネジ６１は管１１をその好ましい位置に固定す
る。
これは実質的には比較的厚い壁の耐圧の鋼鉄製の管１１
から成り、この管の長さは約５０ｍｍそしてその内径は
約３ｍｍであり、ほぼ水平位置に支持台６に固定されて
おりそしてその縦軸Ａの周りに回転することができる。
刃止めネジ６１は管１１をその好ましい位置に固定す
る。
【００２９】鋼鉄管１１の後部末端には、図面の右方に
なるが、ＣＯ2 銃３１の銃口が適当な方法で直接装着さ
れている（図示していない）。
なるが、ＣＯ2 銃３１の銃口が適当な方法で直接装着さ
れている（図示していない）。
【００３０】テーパーリング１２は管１１の前部末端に
嵌め込まれ、Ｏ−リングで封止される。テーパーリング
は鋼鉄管の内径をその末端方向に円錐状に約半分に絞
る。
嵌め込まれ、Ｏ−リングで封止される。テーパーリング
は鋼鉄管の内径をその末端方向に円錐状に約半分に絞
る。
【００３１】鋼鉄管１１または加圧室の前面に、標本室
２の実質的にコップ状の基礎部分２１が、これは全体と
しては実質的に円筒状であるが、さし込みロックまたは
同様のもので、封止したまたは外せられる方法で装着さ
れている。基礎部分２１には、他のＯ−リング１５で差
し込んで締めつけることにより毛細管支持体１４を固定
するための円筒形の凹部２２があり、このＯ−リング１
５はテーパーリング１２の外側の正面の表面を封止す
る。毛細管１７は毛細管支持体１４に封入されて加圧室
の縦軸Ａに精確に合わせる。かくして、毛細管１７は加
圧室１の内面を標本室２の内面と連続する。換言すれ
ば、加圧室１は毛細管１７により形成されている絞り管
中に開口している。毛細管１７の代わりに、流れダイア
フラムまたは普通は小孔の型式の絞り管が備えられてい
てもよい。
２の実質的にコップ状の基礎部分２１が、これは全体と
しては実質的に円筒状であるが、さし込みロックまたは
同様のもので、封止したまたは外せられる方法で装着さ
れている。基礎部分２１には、他のＯ−リング１５で差
し込んで締めつけることにより毛細管支持体１４を固定
するための円筒形の凹部２２があり、このＯ−リング１
５はテーパーリング１２の外側の正面の表面を封止す
る。毛細管１７は毛細管支持体１４に封入されて加圧室
の縦軸Ａに精確に合わせる。かくして、毛細管１７は加
圧室１の内面を標本室２の内面と連続する。換言すれ
ば、加圧室１は毛細管１７により形成されている絞り管
中に開口している。毛細管１７の代わりに、流れダイア
フラムまたは普通は小孔の型式の絞り管が備えられてい
てもよい。
【００３２】標本室２は、前述の鋼鉄管１１に外せられ
るように取り付けられた基礎部分２１、および基礎部分
２１に外せられるように装着してあるもう一つの実質的
にコップ状の壁部分２３とから成り、もう一つのＯ−リ
ング２４はこの二つの部分を封鎖する。
るように取り付けられた基礎部分２１、および基礎部分
２１に外せられるように装着してあるもう一つの実質的
にコップ状の壁部分２３とから成り、もう一つのＯ−リ
ング２４はこの二つの部分を封鎖する。
【００３３】基礎部分２１から取り外すことのできる壁
部分２３中には、板状の細胞支持台２５が位置してお
り、これは鋼鉄製の弾性支持腕２６の上に取り付けられ
ている。その平らな表側の表面２５ａはその場所で衝撃
されるべき細胞を支えるのに役立ち、加圧室１の縦軸Ａ
に対して実質的に垂直に配置してある。
部分２３中には、板状の細胞支持台２５が位置してお
り、これは鋼鉄製の弾性支持腕２６の上に取り付けられ
ている。その平らな表側の表面２５ａはその場所で衝撃
されるべき細胞を支えるのに役立ち、加圧室１の縦軸Ａ
に対して実質的に垂直に配置してある。
【００３４】細胞支持台２５は、標本室２の取外しので
きる壁部分２３中に位置している２個の調節ネジ２７の
手段により、加圧室１の縦軸Ａの横方向の二つの垂直方
向に移動してもよいので、絞り管または毛細管に関係し
て調節できる。
きる壁部分２３中に位置している２個の調節ネジ２７の
手段により、加圧室１の縦軸Ａの横方向の二つの垂直方
向に移動してもよいので、絞り管または毛細管に関係し
て調節できる。
【００３５】２番目の調節ネジは図面の面に対して垂直
である。鋼鉄管１１に装着してある標本室２の基礎部分
２１には、水噴射真空ポンプ５または他の適当な吸引ま
たは真空装置のための連結継手２８が付けてある。
である。鋼鉄管１１に装着してある標本室２の基礎部分
２１には、水噴射真空ポンプ５または他の適当な吸引ま
たは真空装置のための連結継手２８が付けてある。
【００３６】基礎部分２１と取外しできる壁部分２３の
連結部には実質的に隙間が無いので、壁部分２３を移動
し元の場所に戻せば、絞り管１７に対する細胞支持台２
５の位置は変更できない。
連結部には実質的に隙間が無いので、壁部分２３を移動
し元の場所に戻せば、絞り管１７に対する細胞支持台２
５の位置は変更できない。
【００３７】加圧室１の前方中の鋼鉄管のジャケット１
中に、中空のニップル４１がネジ込まれ、それを通して
カニュール４２が放射状に鋼鉄管１１に挿入される。鋼
鉄製のカニュール（外径：約０．７５ｍｍ、内径：約
０．５ｍｍ）を保護し、封止するためにカニュールの上
に形成したビード(bead)４２ｂとＰＴＦＥ（テフロン）
製ガスケット４２ｃが付けられる。
中に、中空のニップル４１がネジ込まれ、それを通して
カニュール４２が放射状に鋼鉄管１１に挿入される。鋼
鉄製のカニュール（外径：約０．７５ｍｍ、内径：約
０．５ｍｍ）を保護し、封止するためにカニュールの上
に形成したビード(bead)４２ｂとＰＴＦＥ（テフロン）
製ガスケット４２ｃが付けられる。
【００３８】鋼鉄製カニュール４２の開口部４２ａを、
加圧室１の縦軸Ａの前面にしっかりと固定して、カニュ
ール４２（図１）から出る液滴Ｔは縦軸Ａ中に精確に位
置付けられる。
加圧室１の縦軸Ａの前面にしっかりと固定して、カニュ
ール４２（図１）から出る液滴Ｔは縦軸Ａ中に精確に位
置付けられる。
【００３９】説明のために、中空のニップル４１と鋼鉄
製カニュール４２は図２では鋼鉄管１１の下側から垂直
にその中へ開口しているように示されている。しかし実
際の操作では、図３に示してあるようにカニュール４２
は、上部から斜めに加圧室１内へ垂直線Ｖに対してαの
角度で開口している。
製カニュール４２は図２では鋼鉄管１１の下側から垂直
にその中へ開口しているように示されている。しかし実
際の操作では、図３に示してあるようにカニュール４２
は、上部から斜めに加圧室１内へ垂直線Ｖに対してαの
角度で開口している。
【００４０】角度αは必要に応じて、支持台６の中で鋼
鉄管１１を回転することにより調節してもよい（締めつ
けネジ６１により固定する）。
鉄管１１を回転することにより調節してもよい（締めつ
けネジ６１により固定する）。
【００４１】鋼鉄製カニュール４２は、チェックバルブ
４３の手段と計測シリンジ４５、スピンドル伝動装置
（マイクロメータースクリュウ）４６、ステップモータ
ー４７および足踏みスイッチ４８により作動する電気制
御装置４９からなるから成る計測器を伴うフレキシブル
管４４に接続している。
４３の手段と計測シリンジ４５、スピンドル伝動装置
（マイクロメータースクリュウ）４６、ステップモータ
ー４７および足踏みスイッチ４８により作動する電気制
御装置４９からなるから成る計測器を伴うフレキシブル
管４４に接続している。
【００４２】計測器は、そのものは常用のものでありこ
れ以上の説明を必要としないが、再現できる方法で且つ
広い調節できる限界内で、カニュール開口部４２ａから
出る液体（けん濁液）で滴にして、加圧室１中にカニュ
ール４２を通して、マイクロリッターの範囲内の液体の
分量を供給することができる。
れ以上の説明を必要としないが、再現できる方法で且つ
広い調節できる限界内で、カニュール開口部４２ａから
出る液体（けん濁液）で滴にして、加圧室１中にカニュ
ール４２を通して、マイクロリッターの範囲内の液体の
分量を供給することができる。
【００４３】装置の一般的操作法は下記の通りである。
【００４４】衝撃されるべき細胞は、下で説明した方法
で外した標本室２の壁部分２３により、細胞支持台２５
の表面２５ａに固定される。
で外した標本室２の壁部分２３により、細胞支持台２５
の表面２５ａに固定される。
【００４５】次いで、壁部分２３を基礎部分２１上に固
定し、標本室２を水噴射真空ポンプ５の手段により真空
にする。次いで、ＤＮＡ溶液と非常に微細な金粒子の形
でそれにけん濁した微投射物で充填した計測器４を作動
すると、カニュール４２の開口部４２ａで適当な大きさ
（下記の詳細な説明を参照）のけん濁液の小滴Ｔが生成
する。
定し、標本室２を水噴射真空ポンプ５の手段により真空
にする。次いで、ＤＮＡ溶液と非常に微細な金粒子の形
でそれにけん濁した微投射物で充填した計測器４を作動
すると、カニュール４２の開口部４２ａで適当な大きさ
（下記の詳細な説明を参照）のけん濁液の小滴Ｔが生成
する。
【００４６】次いでＣＯ2 銃を作動すると、実質的に加
圧室の縦方向Ａに伝播する予め決められた大きさの圧衝
撃が発生する。
圧室の縦方向Ａに伝播する予め決められた大きさの圧衝
撃が発生する。
【００４７】この圧衝撃は、カニュール開口部４２ａに
あるけん濁液の小滴Ｔを、金粒子とそれに固着している
ＤＮＡを含む細かい霧に霧化する。かくして金粒子は液
相からのＤＮＡを同伴し、それを持って行く。
あるけん濁液の小滴Ｔを、金粒子とそれに固着している
ＤＮＡを含む細かい霧に霧化する。かくして金粒子は液
相からのＤＮＡを同伴し、それを持って行く。
【００４８】今や、細かい霧は毛細管１７により形成さ
れている絞り管を通して圧衝撃により加圧され、その際
著しく加速される。
れている絞り管を通して圧衝撃により加圧され、その際
著しく加速される。
【００４９】今や、金粒子とそれに固着しているＤＮＡ
を含む毛細管１７より出る霧の小滴は、細胞支持台２５
に固定した細胞を、高い速度で非常に小さい散布円錐内
で衝撃し、それらを穿つ。
を含む毛細管１７より出る霧の小滴は、細胞支持台２５
に固定した細胞を、高い速度で非常に小さい散布円錐内
で衝撃し、それらを穿つ。
【００５０】装置と工程の適当な寸法のパラメーターに
より、ただ一個の粒子そして多くとも数個だけの粒子が
細胞を貫通し、それらを生きたままにしておけるという
ことが常時可能になるであろう。装置は極端に高い標的
精度（低分散効果）も保証する。
より、ただ一個の粒子そして多くとも数個だけの粒子が
細胞を貫通し、それらを生きたままにしておけるという
ことが常時可能になるであろう。装置は極端に高い標的
精度（低分散効果）も保証する。
【００５１】標本室２は（部分的に）真空になってい
る。これは絞り管１７から細胞支持台２５へ動いている
霧の小滴の衝突を減少する。
る。これは絞り管１７から細胞支持台２５へ動いている
霧の小滴の衝突を減少する。
【００５２】更に、小滴の大きさは最少になり、方向の
分散は減少する。
分散は減少する。
【００５３】更に加えて、（部分的な）真空は、細胞壁
にストレスを与え、この細胞壁は衝撃する粒子によりよ
りよく貫通される。
にストレスを与え、この細胞壁は衝撃する粒子によりよ
りよく貫通される。
【００５４】通常の水噴射ポンプ真空度（約５００ｍｍ
Ｈｇ）は通常は適当であるが、一方特殊な利用（例えば
もっと抵抗のある細胞膜の場合）のためには、更に高い
真空度（減圧）が可能である。
Ｈｇ）は通常は適当であるが、一方特殊な利用（例えば
もっと抵抗のある細胞膜の場合）のためには、更に高い
真空度（減圧）が可能である。
【００５５】上述したように、カニュール４２の末端は
加圧室１の縦軸Ａの正面に固定されているので、カニュ
ール開口部の開口部で生成するけん濁液の小滴は精確に
縦軸Ａ中に位置付けられている。
加圧室１の縦軸Ａの正面に固定されているので、カニュ
ール開口部の開口部で生成するけん濁液の小滴は精確に
縦軸Ａ中に位置付けられている。
【００５６】この方法により、小滴は縦軸に対して対称
的に位置することになり、これが更に標的精度を挙げ、
衝撃領域における粒子の分布状態が好ましくなる。
的に位置することになり、これが更に標的精度を挙げ、
衝撃領域における粒子の分布状態が好ましくなる。
【００５７】カニュール４２の開口部４２ａと毛細管１
７または小孔のダイアフラムの入り口の開口部との間の
距離ａ（図１）は比較的重要である。
７または小孔のダイアフラムの入り口の開口部との間の
距離ａ（図１）は比較的重要である。
【００５８】もしこの距離が短過ぎると、霧即ち個々の
霧の小滴が絞り管を通じて加圧されず、集合した液体フ
ィラメント(closed liquid filament)が絞り管から標本
室へ通過してしまう。
霧の小滴が絞り管を通じて加圧されず、集合した液体フ
ィラメント(closed liquid filament)が絞り管から標本
室へ通過してしまう。
【００５９】このような噴射は衝撃されるべき細胞の多
めの破壊を招くので、如何なる場合にも避けなければな
らない。
めの破壊を招くので、如何なる場合にも避けなければな
らない。
【００６０】実際の作業では、この距離は少なくとも５
−１０ｍｍになっていなければならず、この最少値もこ
の装置の他の部分の寸法に影響されるので、全ての場合
において実験して決定される。
−１０ｍｍになっていなければならず、この最少値もこ
の装置の他の部分の寸法に影響されるので、全ての場合
において実験して決定される。
【００６１】毛細管１７または一般の絞り管の出口末端
部と細胞支持台２５の間の操作距離ｂ（図１）；換言す
れば霧小滴が真空中を自由飛行する距離はそれ程重要で
はない。
部と細胞支持台２５の間の操作距離ｂ（図１）；換言す
れば霧小滴が真空中を自由飛行する距離はそれ程重要で
はない。
【００６２】実際的な値は、細胞の型と絞り管の性質に
よるが５ｍｍないし５ｃｍである。
よるが５ｍｍないし５ｃｍである。
【００６３】この操作距離は、衝突（部分的真空により
減少する）により粒子速度に影響を与え、拡散を通じて
標的領域の有効直径に影響を与える。約１０ｍｍの値が
好ましいことが判明した。
減少する）により粒子速度に影響を与え、拡散を通じて
標的領域の有効直径に影響を与える。約１０ｍｍの値が
好ましいことが判明した。
【００６４】上述したように、毛細管または流れダイア
フラムの両方、または一般的には小孔が、絞り管として
使用されてよい。
フラムの両方、または一般的には小孔が、絞り管として
使用されてよい。
【００６５】ダイアフラムとしては、例えば電子顕微鏡
で使用されているような白金イリジウム製のものを使用
してよい。
で使用されているような白金イリジウム製のものを使用
してよい。
【００６６】ダイアフラムの開口直径は例えば２０ない
し５００マイクロメーターまたは１ｍｍまで上がっても
よい。約７０−３００マイクロメーターの直径が好まし
い。
し５００マイクロメーターまたは１ｍｍまで上がっても
よい。約７０−３００マイクロメーターの直径が好まし
い。
【００６７】毛細管はガラスまたは金属（例えば鋼鉄）
から成っていてよい。内径の値はダイアフラムで挙げた
ものである。毛細管は０．１−２０ｍｍの長さであって
よく、好ましい値は１．０−１０ｍｍの範囲である。
から成っていてよい。内径の値はダイアフラムで挙げた
ものである。毛細管は０．１−２０ｍｍの長さであって
よく、好ましい値は１．０−１０ｍｍの範囲である。
【００６８】毛細管の長さに対する内径の比率は、流れ
抵抗を決める。従って、通常は毛細管が長い程、より大
きい内径を要する。
抵抗を決める。従って、通常は毛細管が長い程、より大
きい内径を要する。
【００６９】毛細管が長い程、霧粒子のための加速通路
がより大になりそして標本室への入口でそれらの最終速
度はより大きくなる。
がより大になりそして標本室への入口でそれらの最終速
度はより大きくなる。
【００７０】加圧室１中へ開口している部分でカニュー
ル４２が垂直線Ｖに対して傾斜している角度α（図３）
は、支持台６の中での管１の回転により調整してよい。
ル４２が垂直線Ｖに対して傾斜している角度α（図３）
は、支持台６の中での管１の回転により調整してよい。
【００７１】約１．２μｍないし１．５μｍの直径の金
粒子がＤＮＡ溶液のおりに攪拌なしにけん濁しているの
で、各々の計測した分量についてカニュール４２の開口
部での小滴中に実質的に同数の金粒子が存在するように
なるように角度を調節するのが好ましい。
粒子がＤＮＡ溶液のおりに攪拌なしにけん濁しているの
で、各々の計測した分量についてカニュール４２の開口
部での小滴中に実質的に同数の金粒子が存在するように
なるように角度を調節するのが好ましい。
【００７２】望ましくない角度αの場合、金粒子はその
系列の一番目の小滴（α：小さ過ぎる）または最後の小
滴（α：大き過ぎる）で凝縮する。
系列の一番目の小滴（α：小さ過ぎる）または最後の小
滴（α：大き過ぎる）で凝縮する。
【００７３】最適角度は粒子の寸法と溶液の粘度によ
り、実験的に決めなければならない。
り、実験的に決めなければならない。
【００７４】この装置の重要な構成要素は、カニュール
４２（またはそれに連なる管）にあるチェックバルブ４
３である。これは水晶製のバルブ座とサファイアー製の
バルブ球から成り、好ましくは垂直方向に向いている。
４２（またはそれに連なる管）にあるチェックバルブ４
３である。これは水晶製のバルブ座とサファイアー製の
バルブ球から成り、好ましくは垂直方向に向いている。
【００７５】チェックバルブ４３は、計測器４の他の部
品と同様に、空気泡を伴わない液体パラフィンで充填し
てある（品位７１７４、メルク社製、ダルムシュタッ
ト、ドイツ連邦共和国）。
品と同様に、空気泡を伴わない液体パラフィンで充填し
てある（品位７１７４、メルク社製、ダルムシュタッ
ト、ドイツ連邦共和国）。
【００７６】計測装置群４５−４９は、最大２０秒の時
間にわたり、約１μｌないし最大１０μｌの分量をポン
プ供給できれば、どのような構造のものでもよい。
間にわたり、約１μｌないし最大１０μｌの分量をポン
プ供給できれば、どのような構造のものでもよい。
【００７７】実際の構造では、１μｌないし最大４μｌ
の分量が、約１ｎｌないし約５０ｎｌのポンプ段階で計
測される。
の分量が、約１ｎｌないし約５０ｎｌのポンプ段階で計
測される。
【００７８】３方向のバルブが備えてあるのが好まし
く、この場合１ｍｌのシリンジを作動してもよく、パラ
フィンは順調に再充填され、量は調節される。
く、この場合１ｍｌのシリンジを作動してもよく、パラ
フィンは順調に再充填され、量は調節される。
【００７９】金粒子を含有するけん濁液をカニュール４
２に充填する（このためにカニュールを一時的に加圧室
１から外す。）。
２に充填する（このためにカニュールを一時的に加圧室
１から外す。）。
【００８０】けん濁液は、ポンプ供給した計量した液体
パラフィンによって置換されることにより間接的に搬送
される。けん濁液を伴うカニュール４２の充填容積は例
えば約３−４μｌである。
パラフィンによって置換されることにより間接的に搬送
される。けん濁液を伴うカニュール４２の充填容積は例
えば約３−４μｌである。
【００８１】霧化効果、換言すれば霧小滴の寸法は、加
圧室１内の圧衝撃の大きさによる。
圧室１内の圧衝撃の大きさによる。
【００８２】この圧衝撃の大きさは、絞り管中の気体の
速度もそしてかくして粒子速度そしてそのパルスも決定
する。
速度もそしてかくして粒子速度そしてそのパルスも決定
する。
【００８３】圧衝撃は数十バールと数百バールの間であ
ってよく、特に約５０バールの値である。
ってよく、特に約５０バールの値である。
【００８４】粒子の大きさは、大きさの手段により粒子
のパルスに直線的に影響する。
のパルスに直線的に影響する。
【００８５】基本的には、小さい粒子は衝撃を受けた細
胞の生き残りのためにはより好ましい。一方、大きい粒
子は細胞をより貫通できる。
胞の生き残りのためにはより好ましい。一方、大きい粒
子は細胞をより貫通できる。
【００８６】従って、粒子の最適の寸法は、細胞の各々
の型により実験的に決定される。
の型により実験的に決定される。
【００８７】実際的な粒子の寸法は、２０ｎｍないし５
μｍ、特に約１−２μｍ、更に特に約１．２−１．５μ
ｍである。
μｍ、特に約１−２μｍ、更に特に約１．２−１．５μ
ｍである。
【００８８】粒子の材質はそれ自体２次的である。しか
し、高い比重と化学反応における不活性（不活性材料）
は好ましい。
し、高い比重と化学反応における不活性（不活性材料）
は好ましい。
【００８９】粒子の寸法の分布が狭く、換言すれば粒子
の全てが実質的に同じ大きさであれば更に好ましい。
の全てが実質的に同じ大きさであれば更に好ましい。
【００９０】実際の業務では、簡単な方法で、寸法の広
い範囲の中での狭い許容範囲内で良い再現性をもって生
産できる粒子を使用するのが更に有利である。
い範囲の中での狭い許容範囲内で良い再現性をもって生
産できる粒子を使用するのが更に有利である。
【００９１】従って、金を粒子用の材料として使用する
のが好ましい。
のが好ましい。
【００９２】一定の大きさの金粒子は、良い再現性で、
写真用現像液による還元により四塩化金酸より製造して
もよい。
写真用現像液による還元により四塩化金酸より製造して
もよい。
【００９３】最初の溶液を希釈することにより、５μｍ
からコロイド領域（５μｍより小さい直径）の間の直径
の粒子を生産できる。
からコロイド領域（５μｍより小さい直径）の間の直径
の粒子を生産できる。
【００９４】現像工程を定着剤で停止することは、良い
再現性を持つ金粒子寸法のためおよび遠心分離と水によ
る洗浄により除去しなければならない水に易溶性の反応
生成物のために重要である。
再現性を持つ金粒子寸法のためおよび遠心分離と水によ
る洗浄により除去しなければならない水に易溶性の反応
生成物のために重要である。
【００９５】仕上げた金けん濁液をオートクレーブにか
ける。
ける。
【００９６】比較的重要な値は、けん濁液における粒子
の密度である。詰まるけん濁液は使用できない。
の密度である。詰まるけん濁液は使用できない。
【００９７】強く希釈したけん濁液は、余りにも多くの
空の小滴を産出し、細胞内を衝撃するのに充分でない。
空の小滴を産出し、細胞内を衝撃するのに充分でない。
【００９８】該当する細胞の型のために決めなければな
らないものの中に最適値がある。この目的は、ただ一個
の粒子でできるだけおおくの細胞を衝撃することであ
る。それ以上の数の粒子であると生き残りの細胞数を劇
的に減少せしめるからである。実際的な数値は約１０10
粒子／ｍｌである。
らないものの中に最適値がある。この目的は、ただ一個
の粒子でできるだけおおくの細胞を衝撃することであ
る。それ以上の数の粒子であると生き残りの細胞数を劇
的に減少せしめるからである。実際的な数値は約１０10
粒子／ｍｌである。
【００９９】「ショット」当たりの可能なけん濁液の体
積、即ち供給される小滴の体積は可能な限り高くあるべ
きである。
積、即ち供給される小滴の体積は可能な限り高くあるべ
きである。
【０１００】しかし、もし供給されるけん濁液の体積が
高すぎると、液が絞り管の中に蓄積し、細胞を酷く傷つ
ける集合した液体フィラメントが出るだろう。
高すぎると、液が絞り管の中に蓄積し、細胞を酷く傷つ
ける集合した液体フィラメントが出るだろう。
【０１０１】絞り管が約１００μｍの内径である場合の
実際値は約０．２μｌの小滴値である。この場合、０．
５μｌの値は高過ぎるということが見出されている。
実際値は約０．２μｌの小滴値である。この場合、０．
５μｌの値は高過ぎるということが見出されている。
【０１０２】概して、１０ｎｌと５００ｎｌの間の小滴
体積が使用されてよい。５０ｎｌと１５０ｎｌの間の小
滴体積が特に好ましい。
体積が使用されてよい。５０ｎｌと１５０ｎｌの間の小
滴体積が特に好ましい。
【０１０３】けん濁液中のＤＮＡの濃度は、飽和と極端
な希釈の間の広い範囲にわたって選択され得る。
な希釈の間の広い範囲にわたって選択され得る。
【０１０４】例えば約０．３μｇ／μｌの値は、ｐＢＩ
２２１とｐＨＰ２３プラスミドには適当である。プラス
ミドは直線状または「スーパコイル」状で存在していて
良い。基本的には、より高い形質転換率はより高いＤＮ
Ａ濃度より期待され得る。
２２１とｐＨＰ２３プラスミドには適当である。プラス
ミドは直線状または「スーパコイル」状で存在していて
良い。基本的には、より高い形質転換率はより高いＤＮ
Ａ濃度より期待され得る。
【０１０５】もしもダイアフラムの型式で絞り管が使用
されるならば、約７０μｍのダイアフラムの内径で、霧
小滴の大きさは最少０．２μｌのけん濁液小滴体積であ
る。
されるならば、約７０μｍのダイアフラムの内径で、霧
小滴の大きさは最少０．２μｌのけん濁液小滴体積であ
る。
【０１０６】小滴が小さいということは、飛行中の衝突
と衝撃における粒子の破壊効果、そして衝撃点における
傷害の危険の観点からは、肝要なことである。これは毛
細管形式の絞り管の場合も明らかに真実である。
と衝撃における粒子の破壊効果、そして衝撃点における
傷害の危険の観点からは、肝要なことである。これは毛
細管形式の絞り管の場合も明らかに真実である。
【０１０７】霧小滴の大きさはけん濁液小滴の体積にも
よりそしてそれにより影響される。
よりそしてそれにより影響される。
【０１０８】細胞中へ導入されるべきＤＮＡは、通常は
けん濁液の液相に自由に溶解している。しかし、ある場
合には、例えばスペルミンまたはラクトフェリンの手段
により金粒子上にプラスミドを取り付ける変形をするこ
とは有利になるであろう。
けん濁液の液相に自由に溶解している。しかし、ある場
合には、例えばスペルミンまたはラクトフェリンの手段
により金粒子上にプラスミドを取り付ける変形をするこ
とは有利になるであろう。
【０１０９】標的領域の寸法、即ちその中に粒子の８０
％以上が衝撃する領域は、絞り管の大きさと性質（毛細
管の内径、長さ等々）、操作距離ｂと真空度による。
％以上が衝撃する領域は、絞り管の大きさと性質（毛細
管の内径、長さ等々）、操作距離ｂと真空度による。
【０１１０】内径３００μｍと長さ１０ｍｍの毛細管、
１０ｍｍの操作距離と上述の水噴射真空ポンプでは、最
大０．７ｍｍの極端に小さい標的直径が得られる。
１０ｍｍの操作距離と上述の水噴射真空ポンプでは、最
大０．７ｍｍの極端に小さい標的直径が得られる。
【０１１１】細胞が衝撃されそして金粒子が細胞を貫通
する有効な領域は、もっと小さい。
する有効な領域は、もっと小さい。
【０１１２】これは細胞壁の粘着性にもよる。
【０１１３】標的領域の粒子密度は、操作距離、真空度
（分散度）、供給するけん濁液の密度、絞り管の内径と
毛細管の長さによる。
（分散度）、供給するけん濁液の密度、絞り管の内径と
毛細管の長さによる。
【０１１４】標的領域上の粒子密度は、精確に一個の粒
子により可能な限り多くの細胞が衝撃されるように調節
されるべきである。他のパラメーターはこうなるように
調節されるべきである。
子により可能な限り多くの細胞が衝撃されるように調節
されるべきである。他のパラメーターはこうなるように
調節されるべきである。
【０１１５】細胞の衝撃の間、気体流は絞り管から出て
細胞を衝撃するので、細胞支持台の上に細胞の取り付け
の保証は大切なことである。
細胞を衝撃するので、細胞支持台の上に細胞の取り付け
の保証は大切なことである。
【０１１６】例えば、サーマノックス（ラブ−テック部
門、イエールス・ラボラトリ−、ネーパーヴィレ ＩＬ
６０５４０）上に２％アガロースが下塗りとして使用
されて良い。
門、イエールス・ラボラトリ−、ネーパーヴィレ ＩＬ
６０５４０）上に２％アガロースが下塗りとして使用
されて良い。
【０１１７】アガロースは１ｍｍの厚さで注がれ、１０
ｍＭＣａＣｌ2 を含有する。 細胞はこのアガロースに
４％のアルギン酸塩により固定される。アルギン酸塩は
室温でＣａ2+の存在下固化する。約１時間後に、重合は
完了する。
ｍＭＣａＣｌ2 を含有する。 細胞はこのアガロースに
４％のアルギン酸塩により固定される。アルギン酸塩は
室温でＣａ2+の存在下固化する。約１時間後に、重合は
完了する。
【０１１８】この方法で固定された細胞は気体流により
吹き飛ばされない。
吹き飛ばされない。
【０１１９】この取り付け工程は、滅菌の方法で容易に
実行でき、迅速であり、細胞が培地に戻されて移植され
るまで細胞への適当な水の補給を保証する。
実行でき、迅速であり、細胞が培地に戻されて移植され
るまで細胞への適当な水の補給を保証する。
【０１２０】本発明の工程は滅菌条件で行われる。
【０１２１】金粒子、ＤＮＡ溶液および全ての溶液そし
て細胞と接触するこの装置の部品は、オートクレーブ処
理、滅菌ろ過または７０％のエタノールによる拭き取り
または吹き付けにより無菌に保たれる。
て細胞と接触するこの装置の部品は、オートクレーブ処
理、滅菌ろ過または７０％のエタノールによる拭き取り
または吹き付けにより無菌に保たれる。
【０１２２】全ての装置は滅菌ベンチに置かれる。加圧
室とダイアフラムまたは毛細管は時々（頻繁に使用され
る時は、１日に１ないし２回）７０％エタノールで吹き
付けられる。
室とダイアフラムまたは毛細管は時々（頻繁に使用され
る時は、１日に１ないし２回）７０％エタノールで吹き
付けられる。
【０１２３】これに加えて、けん濁液のカニュールは時
々オートクレーブにかけられる。基本的にはこれ以上の
滅菌操作を必要としない。
々オートクレーブにかけられる。基本的にはこれ以上の
滅菌操作を必要としない。
【０１２４】上述したように、標本室の壁部分２３は、
細胞支持台２５と調節ネジ２７と共に、取外しできる。
細胞支持台２５と調節ネジ２７と共に、取外しできる。
【０１２５】この方法では、衝撃されるべき細胞を、縮
小(reduction) および縦軸（基本的な射出方向）に対し
て一直線上に配列することは非常に簡単である。
小(reduction) および縦軸（基本的な射出方向）に対し
て一直線上に配列することは非常に簡単である。
【０１２６】２％アガロース中への試験的照射は標的領
域を印付ける。
域を印付ける。
【０１２７】次いで、標本室の壁部分２３は取り外さ
れ、装着し、方向付けそして実体顕微鏡(stereomicrosc
ope) の下で、機械的台の上で予め決められた方法で位
置付けられる。
れ、装着し、方向付けそして実体顕微鏡(stereomicrosc
ope) の下で、機械的台の上で予め決められた方法で位
置付けられる。
【０１２８】今や機械的台は調節されて、標的点が接眼
レンズの目盛り中の中心点に位置付けられる。
レンズの目盛り中の中心点に位置付けられる。
【０１２９】細胞は今や目盛り上の即ち標的領域上の２
個の調節ネジの手段により、一直線上に配置される。異
なった方法でも、一直線上へ行ってよいのは明瞭であ
る。
個の調節ネジの手段により、一直線上に配置される。異
なった方法でも、一直線上へ行ってよいのは明瞭であ
る。
【０１３０】本発明の工程のそして装置の利点は明確で
ある：即ち極端に小さい領域上への各々の粒子の均一な
分布が得られる。
ある：即ち極端に小さい領域上への各々の粒子の均一な
分布が得られる。
【０１３１】標的上のそして衝撃されている細胞上の粒
子密度、粒子のパルスそして標的領域の直径は広い範囲
にわたって微調節され得る。
子密度、粒子のパルスそして標的領域の直径は広い範囲
にわたって微調節され得る。
【０１３２】ＤＮＡは粒子と連結、または粒子上に沈澱
していてはならないが、これはあり得る。
していてはならないが、これはあり得る。
【０１３３】これに加えて、装置は操作するのに非常に
簡単であり、その設計は経済的である。
簡単であり、その設計は経済的である。
【０１３４】トランスジェニック植物を製造するための
上述の工程は、その各々の部分の段階の全てと共に、本
発明の一部分である。
上述の工程は、その各々の部分の段階の全てと共に、本
発明の一部分である。
【０１３５】本発明の工程は、その植物の分類上の位置
に係わらず、どの植物の細胞に対しても共通して利用で
きる。
に係わらず、どの植物の細胞に対しても共通して利用で
きる。
【０１３６】特に適当なかくして本発明の範囲の中で好
ましいものは、組織、特に少数細胞の組織、しかし特
に、例えば植物の新芽の分裂において、原芽体および胚
においてまたは胚形成細胞培地において存在するような
分裂組織における細胞の使用である。
ましいものは、組織、特に少数細胞の組織、しかし特
に、例えば植物の新芽の分裂において、原芽体および胚
においてまたは胚形成細胞培地において存在するような
分裂組織における細胞の使用である。
【０１３７】しかし明らかに、例えば各々の細胞、接合
子、細胞集積体、植物器官、組織、カルスのような他の
如何なる適当な植物細胞は、本発明の工程で使用され得
る。
子、細胞集積体、植物器官、組織、カルスのような他の
如何なる適当な植物細胞は、本発明の工程で使用され得
る。
【０１３８】本発明の工程は、例えば、動物細胞または
菌細胞、単離できる細胞または高等組織化構造の部分、
藻の細胞、単細胞原虫類の細胞、等々のような真核細胞
にも適用できる。
菌細胞、単離できる細胞または高等組織化構造の部分、
藻の細胞、単細胞原虫類の細胞、等々のような真核細胞
にも適用できる。
【０１３９】本発明の工程は、細菌細胞またはシアノバ
クテリア細胞のような原核細胞にも適用できる。
クテリア細胞のような原核細胞にも適用できる。
【０１４０】好ましい細胞は、腸内細菌細胞、特に大腸
菌およびセラチア(Serratia)細胞、アグロバクター細
胞、バチルス(Bacillus)細胞、特にバチルス・チューリ
ジエンシスおよびバチルス・セレウス細胞、ストレプト
ミセス細胞、シュウドモナス細胞等々から成る群から選
ばれた細菌細胞である。
菌およびセラチア(Serratia)細胞、アグロバクター細
胞、バチルス(Bacillus)細胞、特にバチルス・チューリ
ジエンシスおよびバチルス・セレウス細胞、ストレプト
ミセス細胞、シュウドモナス細胞等々から成る群から選
ばれた細菌細胞である。
【０１４1 】形質転換するＤＮＡとしては、自然のＤＮ
Ａ配列および組み換えＤＮＡ技術の手段により人工的に
合成されたハイブリド遺伝子構造の両方も適用され得
る。
Ａ配列および組み換えＤＮＡ技術の手段により人工的に
合成されたハイブリド遺伝子構造の両方も適用され得
る。
【０１４２】本発明の広い範囲は、先ず第１に組み換え
ＤＮＡ分子を包含し、これは植物形質転換体の有用な且
つ望ましい性質に導くＤＮＡ配列を含有する。
ＤＮＡ分子を包含し、これは植物形質転換体の有用な且
つ望ましい性質に導くＤＮＡ配列を含有する。
【０１４３】これらの好ましいものは、有用なそして所
望の性質をコードしている一つまたは若干数の遺伝子配
列を包含し且つ植物中で活性のある発現シグナルの調節
制御の支配下にある組み換えＤＮＡ分子であるので、形
質転換された植物細胞における該遺伝子配列の発現は保
証される。
望の性質をコードしている一つまたは若干数の遺伝子配
列を包含し且つ植物中で活性のある発現シグナルの調節
制御の支配下にある組み換えＤＮＡ分子であるので、形
質転換された植物細胞における該遺伝子配列の発現は保
証される。
【０１４４】従って、植物細胞中で発現され且つ植物に
有用なおよび／または所望の性質、例えば病原菌（例え
ば病原性のカビ、細菌、ウイルス等）に対する抵抗の増
加性、化合物［例えば除草剤（例えばトリアジン系、ス
ルホニルウレア系、イミダゾリノン系、トリアゾールピ
リミジン系、ビアラホス、グリホサート、等々）、殺虫
剤と他の殺生物剤］に対する抵抗性、有害な［内因の(e
ndophatic)または大気中］環境の影響（例えば熱、寒
冷、風、特に極端な土壌の特徴、湿度、乾燥、浸透圧的
ストレス、等々）に対する抵抗性を付与するか；または
葉、種子、根茎、根、茎等々に保存または貯蔵される物
質を増加したまたは改善した構成物に誘導するようなこ
れらの遺伝子は、本発明の工程中で使用するのに適当で
ある。
有用なおよび／または所望の性質、例えば病原菌（例え
ば病原性のカビ、細菌、ウイルス等）に対する抵抗の増
加性、化合物［例えば除草剤（例えばトリアジン系、ス
ルホニルウレア系、イミダゾリノン系、トリアゾールピ
リミジン系、ビアラホス、グリホサート、等々）、殺虫
剤と他の殺生物剤］に対する抵抗性、有害な［内因の(e
ndophatic)または大気中］環境の影響（例えば熱、寒
冷、風、特に極端な土壌の特徴、湿度、乾燥、浸透圧的
ストレス、等々）に対する抵抗性を付与するか；または
葉、種子、根茎、根、茎等々に保存または貯蔵される物
質を増加したまたは改善した構成物に誘導するようなこ
れらの遺伝子は、本発明の工程中で使用するのに適当で
ある。
【０１４５】トランスジェニック植物により生産できる
可能性のある所望の物質は、例えばタンパク質、デンプ
ン、砂糖、アミノ酸、アルカロイド、香り、脂肪等を包
含きする。
可能性のある所望の物質は、例えばタンパク質、デンプ
ン、砂糖、アミノ酸、アルカロイド、香り、脂肪等を包
含きする。
【０１４６】同様にして、本発明の工程により、アルカ
ロイド、ステロイド、ホルモン、免疫調整剤および他の
生理的に活性のある物質のような医薬的に受容できる活
性物質をコードしている遺伝子も導入できる。
ロイド、ステロイド、ホルモン、免疫調整剤および他の
生理的に活性のある物質のような医薬的に受容できる活
性物質をコードしている遺伝子も導入できる。
【０１４７】例えば細胞毒に対する抵抗性は、細胞毒を
解毒する酵素をコードし、植物細胞中で発現される遺伝
子の伝達により得られてよい。このような細胞毒を解毒
する酵素の例として下記のようなものが挙げられる。
解毒する酵素をコードし、植物細胞中で発現される遺伝
子の伝達により得られてよい。このような細胞毒を解毒
する酵素の例として下記のようなものが挙げられる。
【０１４８】カナマイシン、ハイグロマイシン(hygromy
cine) および他のアミノグルコシド系抗生物質の解毒に
寄与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼのタイ
プIIまたはアミノグルコシド- ホスホトランスフェラー
ゼのタイプIV；
cine) および他のアミノグルコシド系抗生物質の解毒に
寄与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼのタイ
プIIまたはアミノグルコシド- ホスホトランスフェラー
ゼのタイプIV；
【０１４９】トリアジン類、スルホニル尿素類および他
の除草剤を解毒することで知られているグルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ、チトクローム Ｐ−４５０ま
たは他の異化作用的に有効な酵素。
の除草剤を解毒することで知られているグルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ、チトクローム Ｐ−４５０ま
たは他の異化作用的に有効な酵素。
【０１５０】細胞毒に対する抵抗性も、植物中で「標的
酵素」（細胞毒による攻撃の位置）（このものは、細胞
毒の活性に対して抵抗する。）のある種の形で発現する
遺伝子により伝達される。
酵素」（細胞毒による攻撃の位置）（このものは、細胞
毒の活性に対して抵抗する。）のある種の形で発現する
遺伝子により伝達される。
【０１５１】例えば、アセトヒドロキシアシッドシンタ
ーゼ(acetohydroxyacidsyntase) の変種（これは、この
酵素の特定の代謝段階に影響するスルホニル尿素類、イ
ミダゾリノン類または他の除草剤の阻止作用に対して非
感受性である。）のようなもの；
ーゼ(acetohydroxyacidsyntase) の変種（これは、この
酵素の特定の代謝段階に影響するスルホニル尿素類、イ
ミダゾリノン類または他の除草剤の阻止作用に対して非
感受性である。）のようなもの；
【０１５２】またはグリホサートの阻害作用に対して非
感受性であることが示されたＥＰＳＰシンターゼの変形
のようなものである。
感受性であることが示されたＥＰＳＰシンターゼの変形
のようなものである。
【０１５３】例えば上記の場合、クロロプラストのよう
な正確な細胞の区画に運搬できるような形で、これらの
変形した標的酵素を発現するのは有利であろう。
な正確な細胞の区画に運搬できるような形で、これらの
変形した標的酵素を発現するのは有利であろう。
【０１５４】ある場合には、遺伝子生産物をミトコンド
リア、液胞、小胞または他の細胞領域、可能ならば細胞
間隙（アポプラスト）にすら向けることは更に有利であ
ろう。
リア、液胞、小胞または他の細胞領域、可能ならば細胞
間隙（アポプラスト）にすら向けることは更に有利であ
ろう。
【０１５５】カビのある種に対する抵抗性は、例えば植
物組織中でキチナーゼを発現する遺伝子の導入により得
られるだろう。
物組織中でキチナーゼを発現する遺伝子の導入により得
られるだろう。
【０１５６】数多くの植物病原性の菌が、それらの菌糸
および胞子の構造の肝要な成分としてキチンを含有す
る。それら菌の例は担子菌類（黒穂病とウドンコ病
菌）、子のう菌類および不完全菌［アルターナリア(Alt
ernaria)とビポラリス(Bipolaris)、エキセロフィラム
ターシカム（Exerophilum turcium)、コレトトリカム
(Colletotricum) 、グレオサーコスポラ(Gleocercospor
a)、サーコスポラ(Cercospora)を含む］である。
および胞子の構造の肝要な成分としてキチンを含有す
る。それら菌の例は担子菌類（黒穂病とウドンコ病
菌）、子のう菌類および不完全菌［アルターナリア(Alt
ernaria)とビポラリス(Bipolaris)、エキセロフィラム
ターシカム（Exerophilum turcium)、コレトトリカム
(Colletotricum) 、グレオサーコスポラ(Gleocercospor
a)、サーコスポラ(Cercospora)を含む］である。
【０１５７】ｉｎ ｖｉｔｒｏ で、菌糸体の生長を決
定する病原体の位置ではキチナーゼは阻害されるであろ
う。
定する病原体の位置ではキチナーゼは阻害されるであろ
う。
【０１５８】構成的にまたは病原菌の浸入に対する感応
として、キチナーゼを発現する植物の葉または根は、多
くのいろいろの菌の感染に対して防護されている。
として、キチナーゼを発現する植物の葉または根は、多
くのいろいろの菌の感染に対して防護されている。
【０１５９】状況によっては、病原菌の感染に対して普
通の感応として多くの植物に出現する誘導発現と比較す
ると構成的発現の方がより有利であろう。というのは構
成的発現の場合は、新規合成の遅れの時期を待つべきと
いうことなしに、キチナーゼは即座に高い濃度で存在す
るからである。
通の感応として多くの植物に出現する誘導発現と比較す
ると構成的発現の方がより有利であろう。というのは構
成的発現の場合は、新規合成の遅れの時期を待つべきと
いうことなしに、キチナーゼは即座に高い濃度で存在す
るからである。
【０１６０】虫に対する抵抗性は、例えば成虫とおよび
／またはその幼虫のための毒物である、例えばバチルス
チューリジエンシスの結晶性タンパク質のようなポリ
ペプチドをコードしている遺伝子により伝達される。
／またはその幼虫のための毒物である、例えばバチルス
チューリジエンシスの結晶性タンパク質のようなポリ
ペプチドをコードしている遺伝子により伝達される。
【０１６１】タンパク質に対する抵抗性を伝達するタン
パク質の第２の群は、プロテアーゼ阻止剤である。
パク質の第２の群は、プロテアーゼ阻止剤である。
【０１６２】プロテアーゼの阻止剤は、通常は野菜保存
の構造の一般的成分である。
の構造の一般的成分である。
【０１６３】ダイズから単離され精製されたボーマン−
バークのプロテアーゼは、トネブリオ(Tonebrio)の幼虫
の腸のプロテアーゼ［バーク他（１９６３）］を阻止す
ることが示されている。
バークのプロテアーゼは、トネブリオ(Tonebrio)の幼虫
の腸のプロテアーゼ［バーク他（１９６３）］を阻止す
ることが示されている。
【０１６４】ササゲからのトリプシン阻止剤をコードし
ている遺伝子はヒルダー他（１９８７）により記述され
ている。
ている遺伝子はヒルダー他（１９８７）により記述され
ている。
【０１６５】従って、本発明の工程において使用するた
めの第１の遺伝子は、形質転換した細胞、特に植物にお
いてそれらから発達した組織に防護的影響を誘導するも
のであり、その防護的影響とは例えば病原菌（例えば病
原性のカビ、細菌、ウイルス等）に対する強化した抵抗
性、化合物［例えば除草剤（例えばトリアジン系、スル
ホニルウレア系、イミダゾリノン系、トリアゾールピリ
ミジン系、ビアラホス、グリホサート、等々）、殺虫剤
と他の殺生物剤］に対する抵抗性、有害な［内因の(end
ophatic) または大気の］環境の影響（例えば熱、寒
冷、風、好ましくない土壌の条件、湿度、乾燥、等々）
に対する抵抗性を付与する。
めの第１の遺伝子は、形質転換した細胞、特に植物にお
いてそれらから発達した組織に防護的影響を誘導するも
のであり、その防護的影響とは例えば病原菌（例えば病
原性のカビ、細菌、ウイルス等）に対する強化した抵抗
性、化合物［例えば除草剤（例えばトリアジン系、スル
ホニルウレア系、イミダゾリノン系、トリアゾールピリ
ミジン系、ビアラホス、グリホサート、等々）、殺虫剤
と他の殺生物剤］に対する抵抗性、有害な［内因の(end
ophatic) または大気の］環境の影響（例えば熱、寒
冷、風、好ましくない土壌の条件、湿度、乾燥、等々）
に対する抵抗性を付与する。
【０１６６】本発明の範囲の中で使用される遺伝子は、
葉、種子、根茎、根、茎等々に保存または貯蔵される物
質の形成を増加するように誘導するようなそれらを包含
する。
葉、種子、根茎、根、茎等々に保存または貯蔵される物
質の形成を増加するように誘導するようなそれらを包含
する。
【０１６７】トランスジェニック植物により生産できる
可能性のある所望の物質は、例えばタンパク質、デンプ
ン、砂糖、アミノ酸、アルカロイド、フラビン、香り、
着色剤、脂肪等を包含する。
可能性のある所望の物質は、例えばタンパク質、デンプ
ン、砂糖、アミノ酸、アルカロイド、フラビン、香り、
着色剤、脂肪等を包含する。
【０１６８】同様にして、本発明の工程により、アルカ
ロイド、ステロイド、ホルモン、免疫調整剤および他の
生理的に活性のある物質のような医薬的に受容できる活
性物質をコードしている遺伝子も導入できる。
ロイド、ステロイド、ホルモン、免疫調整剤および他の
生理的に活性のある物質のような医薬的に受容できる活
性物質をコードしている遺伝子も導入できる。
【０１６９】本発明の範囲内にあると考えられる遺伝子
は、かくして公知の遺伝子を包含きするが、それらに限
定されることはない。その例は、トウモロコシからのゼ
イン(zein)遺伝子、オート麦からのアヴェニン(avenin)
遺伝子、イネからのグルテリン遺伝子のような植物の特
定遺伝子；インシュリン遺伝子、ソマトスタチン遺伝
子、インターロイキン遺伝子、ｔ−ＰＡ遺伝子、等々の
ような哺乳動物の特定遺伝子；またはＮＰＴII遺伝子、
等々のような微生物起源の遺伝子、それと共にインシュ
リン遺伝子のような合成遺伝子、等々である。
は、かくして公知の遺伝子を包含きするが、それらに限
定されることはない。その例は、トウモロコシからのゼ
イン(zein)遺伝子、オート麦からのアヴェニン(avenin)
遺伝子、イネからのグルテリン遺伝子のような植物の特
定遺伝子；インシュリン遺伝子、ソマトスタチン遺伝
子、インターロイキン遺伝子、ｔ−ＰＡ遺伝子、等々の
ような哺乳動物の特定遺伝子；またはＮＰＴII遺伝子、
等々のような微生物起源の遺伝子、それと共にインシュ
リン遺伝子のような合成遺伝子、等々である。
【０１７０】自然に発生する、有用なそして所望の性質
をコードしている構造遺伝子に加えて、化学的または遺
伝子工学的手法による特定の方法で改変された遺伝子
も、本発明で使用されてもよい。
をコードしている構造遺伝子に加えて、化学的または遺
伝子工学的手法による特定の方法で改変された遺伝子
も、本発明で使用されてもよい。
【０１７１】更に、本発明の広い概念は、全く化学的合
成により合成された遺伝子も包含する。
成により合成された遺伝子も包含する。
【０１７２】従って、本発明内の使用のための適当な遺
伝子またはＤＮＡとしては、合成遺伝子またはＤＮＡと
共に、相同およびヘテロガウス(heterogous)遺伝子また
はＤＮＡが使用されてもよい。
伝子またはＤＮＡとしては、合成遺伝子またはＤＮＡと
共に、相同およびヘテロガウス(heterogous)遺伝子また
はＤＮＡが使用されてもよい。
【０１７３】合成遺伝子の例としては、インシュリン遺
伝子が挙げられる。
伝子が挙げられる。
【０１７４】本発明の範囲では、更に所謂「アンチ−セ
ンス(anti-sense)」ＤＮＡも使用されてもよい；これら
は植物細胞中で活性のある発現シグナルと作動できるよ
うに組み合わしてＲＮＡ分子を生産するようにする。そ
してこのＲＮＡ分子は「センス」ＤＮＡによりコードさ
れたｍＲＮＡの少なくとも一部分に相補的であり従って
それに結合できる。この方法によりある種のＲＮＡの該
当するタンパク質への翻訳が阻害されるかまたは少なく
とも限定される。このようにして選別された遺伝子の遺
伝子発現の効果的な制御が可能である工程が今や存在す
ることになる。
ンス(anti-sense)」ＤＮＡも使用されてもよい；これら
は植物細胞中で活性のある発現シグナルと作動できるよ
うに組み合わしてＲＮＡ分子を生産するようにする。そ
してこのＲＮＡ分子は「センス」ＤＮＡによりコードさ
れたｍＲＮＡの少なくとも一部分に相補的であり従って
それに結合できる。この方法によりある種のＲＮＡの該
当するタンパク質への翻訳が阻害されるかまたは少なく
とも限定される。このようにして選別された遺伝子の遺
伝子発現の効果的な制御が可能である工程が今や存在す
ることになる。
【０１７５】本発明で使用できるＤＮＡ配列は、専らゲ
ノムのｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡからのみ構成されてい
てもよい。
ノムのｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡからのみ構成されてい
てもよい。
【０１７６】他の可能性は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮ
Ａもおよび／または合成ＤＮＡの両方から成るハイブリ
ドＤＮＡ配列の構造である。
Ａもおよび／または合成ＤＮＡの両方から成るハイブリ
ドＤＮＡ配列の構造である。
【０１７７】この場合に、ｃＤＮＡはゲノムのＤＮＡと
同じ遺伝子を起源にしてもよく、またはｃＤＮＡとゲノ
ムのＤＮＡの両方が異なる遺伝子を起源にしてもよい。
同じ遺伝子を起源にしてもよく、またはｃＤＮＡとゲノ
ムのＤＮＡの両方が異なる遺伝子を起源にしてもよい。
【０１７８】しかし、両方の場合、ゲノムのＤＮＡおよ
び／またはｃＤＮＡは、各々それ自身において、同種の
または異種の遺伝子から合成されてもよい。
び／またはｃＤＮＡは、各々それ自身において、同種の
または異種の遺伝子から合成されてもよい。
【０１７９】ＤＮＡ配列が２種以上の遺伝子の部分を含
有するならば、該遺伝子は一個または同じ生物から、異
なる種もしくは同型の変種または同じ属の異なる種か
ら、または同種またはもう一つ別の分類的単位（界）か
ら起源してもよい。
有するならば、該遺伝子は一個または同じ生物から、異
なる種もしくは同型の変種または同じ属の異なる種か
ら、または同種またはもう一つ別の分類的単位（界）か
ら起源してもよい。
【０１８０】植物細胞における該構造遺伝子の発現を保
証するために、コードしてある遺伝子配列が植物細胞中
で機能できる発現配列と作動できる方法で最初に連結し
ていると有利である。
証するために、コードしてある遺伝子配列が植物細胞中
で機能できる発現配列と作動できる方法で最初に連結し
ていると有利である。
【０１８１】コードしているＤＮＡ配列（構造遺伝子）
の発現の誘導をもたらすことのできる全てのプロモータ
ーと全てのターミネーターは、ハイブリド遺伝子配列の
構成要素として使用されてもよい。
の発現の誘導をもたらすことのできる全てのプロモータ
ーと全てのターミネーターは、ハイブリド遺伝子配列の
構成要素として使用されてもよい。
【０１８２】特に適当なのは、植物または植物ウイルス
を起源にする発現シグナルである。
を起源にする発現シグナルである。
【０１８３】適当なプロモーターとターミネーターは、
カリフラワーのモザイクウイルスの遺伝子（ＣａＭＶ）
または相同のＤＮＡ配列であり、これは該発現シグナル
の特徴的な性質をまだ示す。
カリフラワーのモザイクウイルスの遺伝子（ＣａＭＶ）
または相同のＤＮＡ配列であり、これは該発現シグナル
の特徴的な性質をまだ示す。
【０１８４】細菌の発現シグナルも適当であり、特にア
グロバクター チュメファシエンス(Agrobacterium tum
efaciens) のＴｉ−プラスミドからのノパリン−シンタ
ーゼ(nopaline-synthase) 遺伝子(nos) のまたはオクト
ピン−シンターゼ（octopine-synthase)遺伝子(ocs) が
適当である。
グロバクター チュメファシエンス(Agrobacterium tum
efaciens) のＴｉ−プラスミドからのノパリン−シンタ
ーゼ(nopaline-synthase) 遺伝子(nos) のまたはオクト
ピン−シンターゼ（octopine-synthase)遺伝子(ocs) が
適当である。
【０１８５】本発明において好ましいものは、ＣａＭＶ
ゲノムの３５Ｓおよび１９Ｓ発現シグナルまたはそれら
の相同体であり、これらは該遺伝子からマニアチス他
（１９８２）による実施例のために記述されているよう
な分子生物学的方法の手段により単離され、コードして
いるＤＮＡ配列に連結する。
ゲノムの３５Ｓおよび１９Ｓ発現シグナルまたはそれら
の相同体であり、これらは該遺伝子からマニアチス他
（１９８２）による実施例のために記述されているよう
な分子生物学的方法の手段により単離され、コードして
いるＤＮＡ配列に連結する。
【０１８６】３５Ｓおよび１９Ｓ発現シグナルの相同体
は、本発明の中では、配列が僅かに異なるに係わらず、
当初の配列と実質的に相同であり、同じ機能をする配列
であると定義される。
は、本発明の中では、配列が僅かに異なるに係わらず、
当初の配列と実質的に相同であり、同じ機能をする配列
であると定義される。
【０１８７】本発明に従うと、３５Ｓ転写制御配列の出
発物質は、例えば遺伝子カードのヌクレオチド６８０８
−７６３２［フランク ジー．他（１９８０）］を含む
ＣａＭＶ「Ｓ」株のＳｃａＩ断片が使用されてもよい。
発物質は、例えば遺伝子カードのヌクレオチド６８０８
−７６３２［フランク ジー．他（１９８０）］を含む
ＣａＭＶ「Ｓ」株のＳｃａＩ断片が使用されてもよい。
【０１８８】１９Ｓプロモーターと５′の非−翻訳領域
は、ＣａＭＶ遺伝子カードのＰｓｔＩ（位置５３８６）
とＨｉｎｄIII 位置（位置５８５０）の間のゲノム断片
上に位置する［ホーン他（１９８２）］。
は、ＣａＭＶ遺伝子カードのＰｓｔＩ（位置５３８６）
とＨｉｎｄIII 位置（位置５８５０）の間のゲノム断片
上に位置する［ホーン他（１９８２）］。
【０１８９】該当するターミネーターと３′の非−翻訳
領域は、ＣａＭＶゲノムの位置７３４２と７６４３の間
のＥｃｏＲＶ／ＢｇIII 断片上に位置する。
領域は、ＣａＭＶゲノムの位置７３４２と７６４３の間
のＥｃｏＲＶ／ＢｇIII 断片上に位置する。
【０１９０】本発明で更に好ましいものは、ＣａＭＶ株
ＣＭ１８４１の発現シグナルであり、その全ヌクレオチ
ド配列はガードナー他（１９８１）により記述されてい
る。
ＣＭ１８４１の発現シグナルであり、その全ヌクレオチ
ド配列はガードナー他（１９８１）により記述されてい
る。
【０１９１】使用されてもよい植物プロモーターの他の
効果的な例は、過剰生産する植物プロモーターである。
効果的な例は、過剰生産する植物プロモーターである。
【０１９２】プロモーターの型は、所望の生産物の遺伝
子をコードしている遺伝子配列と共に作動できるように
連結している範囲では該遺伝子配列の発現を伝達できる
ものでなければならない。
子をコードしている遺伝子配列と共に作動できるように
連結している範囲では該遺伝子配列の発現を伝達できる
ものでなければならない。
【０１９３】本発明で使用される過剰生産植物プロモー
ターは、ダイズからのリブロース−１，５−ビスホスフ
ェート−カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）の
プロモーター並びにクロロフィル−ａ／ｂ−結合タンパ
ク質のプロモーターである。
ターは、ダイズからのリブロース−１，５−ビスホスフ
ェート−カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）の
プロモーター並びにクロロフィル−ａ／ｂ−結合タンパ
ク質のプロモーターである。
【０１９４】これら２種のプロモーターは、それらが光
により真核植物細胞中で誘発されるというその性質で知
られている。［例えば、植物の遺伝子工学、農業の展望
(Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Pe
rspective)、キャシモア, Ａ. （１９８３）を参照］
により真核植物細胞中で誘発されるというその性質で知
られている。［例えば、植物の遺伝子工学、農業の展望
(Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Pe
rspective)、キャシモア, Ａ. （１９８３）を参照］
【０１９５】キメラ遺伝子構成のために使用されてもよ
い追加の調節ＤＮＡ配列は、例えば、誘発または抑制の
意味で植物組織中で同伴するＤＮＡの転写を調節できる
配列を含む。
い追加の調節ＤＮＡ配列は、例えば、誘発または抑制の
意味で植物組織中で同伴するＤＮＡの転写を調節できる
配列を含む。
【０１９６】例えば、植物ホルモン、熱ショック、化合
物、病原、酸素欠乏、光、等々のようないろいろの内的
または外的要因により誘発されるということで知られて
いる個々の植物遺伝子がある。
物、病原、酸素欠乏、光、等々のようないろいろの内的
または外的要因により誘発されるということで知られて
いる個々の植物遺伝子がある。
【０１９７】植物ホルモンによる遺伝子の調節の例とし
ては、アブシジン酸（ＡＢＳ）に就いて言及しなければ
ならず、この化合物は胚葉期(embryonal) 後期のワタに
おけるｍＲＮＡを過剰に誘発することで知られている。
ては、アブシジン酸（ＡＢＳ）に就いて言及しなければ
ならず、この化合物は胚葉期(embryonal) 後期のワタに
おけるｍＲＮＡを過剰に誘発することで知られている。
【０１９８】他の例はジヘレリン酸（ＧＡ３）であり、
これはヒマの実とオオ麦の糊粉層でリンゴ酸のシンター
ゼの転写、α−アミラーゼのアイソザイムを誘発する。
これはヒマの実とオオ麦の糊粉層でリンゴ酸のシンター
ゼの転写、α−アミラーゼのアイソザイムを誘発する。
【０１９９】マメの葉におけるグルカナーゼとキチナー
ゼの活性は、ストレスホルモンのエチレンにより多少は
増加し得る。
ゼの活性は、ストレスホルモンのエチレンにより多少は
増加し得る。
【０２００】キチナーゼの場合は、この誘発効果はキチ
ナーゼ遺伝子のプロモーターの手段により誘発効果は制
御され、これはマメ(Phaseolus vulgaris)のキチナーゼ
遺伝子からのプロモーターを使用している報告者の実験
により示されている。
ナーゼ遺伝子のプロモーターの手段により誘発効果は制
御され、これはマメ(Phaseolus vulgaris)のキチナーゼ
遺伝子からのプロモーターを使用している報告者の実験
により示されている。
【０２０1 】ダイズの熱ショック感受性タンパク質の調
節は、詳細に研究されている。
節は、詳細に研究されている。
【０２０２】植物を４０℃で数時間処理すると、所謂、
熱−ショックタンパク質のデノボ(de novo) 合成を起こ
す。この間に多数の遺伝子が単離され、その調節が詳細
に解析された。
熱−ショックタンパク質のデノボ(de novo) 合成を起こ
す。この間に多数の遺伝子が単離され、その調節が詳細
に解析された。
【０２０３】これらの遺伝子の発現は第１に転写レベル
で制御される。
で制御される。
【０２０４】もしも、例えば、ｈｐｓ７０遺伝子のプロ
モーターは、ネオマイシンホスホトラスフェラーゼII
（ＮＰＴII）遺伝子と融合すれば、この方法で得られた
キメラ遺伝子は熱ショックにより誘発できる（スペナ
他，１９８５）。
モーターは、ネオマイシンホスホトラスフェラーゼII
（ＮＰＴII）遺伝子と融合すれば、この方法で得られた
キメラ遺伝子は熱ショックにより誘発できる（スペナ
他，１９８５）。
【０２０５】植物中で誘発できる遺伝子のもう一つの群
は、光調節遺伝子、特にリブロース−１，５−ビスホス
フェート−カルボキシラーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）の小サ
ブユニットの核がコードしている遺伝子を含有してい
る。
は、光調節遺伝子、特にリブロース−１，５−ビスホス
フェート−カルボキシラーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）の小サ
ブユニットの核がコードしている遺伝子を含有してい
る。
【０２０６】モレリ他（１９８５）はエンドウからのＲ
ＵＢＩＳＣＯ遺伝子の５′近接(flanking)配列が、もし
もこれが報告者の配列とキメラの型式で結合するなら
ば、該遺伝子に光誘発性を伝達できることを示してい
る。
ＵＢＩＳＣＯ遺伝子の５′近接(flanking)配列が、もし
もこれが報告者の配列とキメラの型式で結合するなら
ば、該遺伝子に光誘発性を伝達できることを示してい
る。
【０２０７】この観察は、例えばクロロフィルａ／ｂ結
合タンパク質のような、他の光誘導遺伝子に迄拡げられ
た。
合タンパク質のような、他の光誘導遺伝子に迄拡げられ
た。
【０２０８】トウモロコシのアルコールデヒドロゲナー
ゼ遺伝子（ａｄｈ−遺伝子）は、強力に研究された対象
である。
ゼ遺伝子（ａｄｈ−遺伝子）は、強力に研究された対象
である。
【０２０９】ａｄｈｌ−ｓ遺伝子は、トウモロコシから
単離され、もしも一時的に形質転換された組織が嫌気性
の条件に曝された場合、５′近接ＤＮＡの一部分がキメ
ラの報告者の遺伝子（例えば、クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ；ＣＡＴ）の発現を誘発でき
ることを示した［ホワード他（１９８７）］。
単離され、もしも一時的に形質転換された組織が嫌気性
の条件に曝された場合、５′近接ＤＮＡの一部分がキメ
ラの報告者の遺伝子（例えば、クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ；ＣＡＴ）の発現を誘発でき
ることを示した［ホワード他（１９８７）］。
【０２１０】調節されてもよいＤＮＡ配列の他の群は、
化学的に調節される配列に関わり、この配列は例えばタ
バコのＰＲ（「病原に関わるタンパク質」）タンパク質
遺伝子に存在し、化学調節剤の手段により誘発される。
化学的に調節される配列に関わり、この配列は例えばタ
バコのＰＲ（「病原に関わるタンパク質」）タンパク質
遺伝子に存在し、化学調節剤の手段により誘発される。
【０２１１】上で引用した調節され得るＤＮＡ配列は、
例えば天然または合成起源の両方でよいか、または天然
と合成の配列の混合物から成っていてもよい。
例えば天然または合成起源の両方でよいか、または天然
と合成の配列の混合物から成っていてもよい。
【０２１２】植物中で発現できる完全なＤＮＡ配列を形
成するために、それ自体知られている手段でいろいろな
配列の細片を互いに連結することができる。
成するために、それ自体知られている手段でいろいろな
配列の細片を互いに連結することができる。
【０２１３】適当な方法は、例えば相同する細片を持つ
ＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの組み換えと、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏでの制限断片の連結を含む。
ＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの組み換えと、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏでの制限断片の連結を含む。
【０２１４】ハイブリド遺伝子の構成は、適当なクロー
ニングベクターにスプライシングし、次いで適当な宿主
を形質転換することにより、非常に早くそして簡単に増
幅され得る。
ニングベクターにスプライシングし、次いで適当な宿主
を形質転換することにより、非常に早くそして簡単に増
幅され得る。
【０２１５】クローニングベクターとしては、普通は宿
主に適応する種に起源する複製と制御の配列を持つプラ
スミドまたはウイルス（バクテリオファージ）ベクター
が使用される。
主に適応する種に起源する複製と制御の配列を持つプラ
スミドまたはウイルス（バクテリオファージ）ベクター
が使用される。
【０２１６】クローニングベクターは通常は、複製の起
源と形質転換された宿主細胞に表現型選別特性、特に抗
生物質またはある種の除草剤に対する抵抗性を導入する
特定遺伝子を持つ。
源と形質転換された宿主細胞に表現型選別特性、特に抗
生物質またはある種の除草剤に対する抵抗性を導入する
特定遺伝子を持つ。
【０２１７】形質転換されたベクターは、宿主細胞中で
の形質転換の後でこれらの表現型の標識の手段により選
別される。
の形質転換の後でこれらの表現型の標識の手段により選
別される。
【０２１８】本発明で使用されてもよい選択できる表現
型の標識は、本発明の対象を限定することなしに、例え
ば、アムピシリン、テトラサイクリン、ハイグロマイシ
ン(hygromycin)、カナマイシン、メトトレキセート、Ｇ
４１８およびネオマイシンを包含する。
型の標識は、本発明の対象を限定することなしに、例え
ば、アムピシリン、テトラサイクリン、ハイグロマイシ
ン(hygromycin)、カナマイシン、メトトレキセート、Ｇ
４１８およびネオマイシンを包含する。
【０２１９】本発明内の宿主細胞として原核のは使用さ
れてもよく、これらは細菌の宿主、例えばアグロバクタ
ー チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)
、大腸菌、Ｓ．typhimurium およびセラチア マーセ
シンス(Serratia marcescens)、並びにシアノバクテリ
アのようなものである。
れてもよく、これらは細菌の宿主、例えばアグロバクタ
ー チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)
、大腸菌、Ｓ．typhimurium およびセラチア マーセ
シンス(Serratia marcescens)、並びにシアノバクテリ
アのようなものである。
【０２２０】酵母、菌糸を形成する菌および植物細胞の
ような真核の宿主も本発明に使用されてもよい。
ような真核の宿主も本発明に使用されてもよい。
【０２２1 】ハイブリド遺伝子構成を、例えばマニアチ
ス他（１９８２）により記述されている標準の手法の手
段により、適当なクローニングベクター中にスプライシ
ングする。
ス他（１９８２）により記述されている標準の手法の手
段により、適当なクローニングベクター中にスプライシ
ングする。
【０２２２】この工程において、ベクターとスプライシ
ングされるべきＤＮＡは、適当な制限酵素の手段により
初めに切断される。
ングされるべきＤＮＡは、適当な制限酵素の手段により
初めに切断される。
【０２２３】適当な制限酵素は、例えばブラント末端を
持つ断片を生成するもので、例えばＳｍａＩ，ＨｐａＩ
およびＥｃｏＲＶのようなもの、または付着末端を形成
する他の酵素、例えばＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩおよびＢａ
ｍＨＩである。
持つ断片を生成するもので、例えばＳｍａＩ，ＨｐａＩ
およびＥｃｏＲＶのようなもの、または付着末端を形成
する他の酵素、例えばＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩおよびＢａ
ｍＨＩである。
【０２２４】互いに対して相補的であるブラント末端を
持つ断片または付着末端を持つそれらは、連続的に一様
のＤＮＡ分子の形である適当なリガーゼを使用して再度
連結されてよい。
持つ断片または付着末端を持つそれらは、連続的に一様
のＤＮＡ分子の形である適当なリガーゼを使用して再度
連結されてよい。
【０２２５】ブラント末端は、懸垂している付着末端を
持つＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのクレ
ノー断片を使用して該当する相補的ヌクレオチドでギャ
ップを満たすことによっても合成され得る。
持つＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのクレ
ノー断片を使用して該当する相補的ヌクレオチドでギャ
ップを満たすことによっても合成され得る。
【０２２６】一方、付着末端は、例えばターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用する、所
望のＤＮＡ配列と切断したベクター分子の末端とへの相
補的ホモポリマーの尾部の付着により；または合成オリ
ゴヌクレオチド配列（リンカー）を添加して、制限切断
部位を運びそして次に該当する酵素で切断することによ
り人工的に製造され得る。
キシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用する、所
望のＤＮＡ配列と切断したベクター分子の末端とへの相
補的ホモポリマーの尾部の付着により；または合成オリ
ゴヌクレオチド配列（リンカー）を添加して、制限切断
部位を運びそして次に該当する酵素で切断することによ
り人工的に製造され得る。
【０２２７】クローニングベクターとベクターにより形
質転換された宿主細胞は、通常はベクターのコピー数を
増やすのに使用される。
質転換された宿主細胞は、通常はベクターのコピー数を
増やすのに使用される。
【０２２８】高いコピー数では、ハイブリド遺伝子構造
を持つベクターを単離し、植物細胞中へのキメラ遺伝子
の導入のためにそれを準備することは可能である。
を持つベクターを単離し、植物細胞中へのキメラ遺伝子
の導入のためにそれを準備することは可能である。
【０２２９】更に別の工程の段階では、これらのプラス
ミドは、所望の遺伝子生産物のためにコーディングして
いる構造遺伝子または調節機能を持つコーディングして
いないＤＮＡ配列、例えば「アンチ−センス」ＤＮＡを
植物細胞中に挿入または所望により、植物ゲノム中に組
み込むために使用される。
ミドは、所望の遺伝子生産物のためにコーディングして
いる構造遺伝子または調節機能を持つコーディングして
いないＤＮＡ配列、例えば「アンチ−センス」ＤＮＡを
植物細胞中に挿入または所望により、植物ゲノム中に組
み込むために使用される。
【０２３０】従って、本発明の他の目的は、そのゲノム
に組み込まれている該構造遺伝子または他の所望の遺伝
子または遺伝子断片または他の有用なＤＮＡ配列を含有
する植物の受容細胞の製造に関する。
に組み込まれている該構造遺伝子または他の所望の遺伝
子または遺伝子断片または他の有用なＤＮＡ配列を含有
する植物の受容細胞の製造に関する。
【０２３１】かくして、本発明の広い概念は、トランス
ジェニック植物、特に本発明の上述の工程の手段により
形質転換された繁殖性のトランスジェニック植物と母性
植物の形質転換による新規のそして所望の性質または性
質群をまだ発揮するそれらの無性または有性的子孫をも
包含する。
ジェニック植物、特に本発明の上述の工程の手段により
形質転換された繁殖性のトランスジェニック植物と母性
植物の形質転換による新規のそして所望の性質または性
質群をまだ発揮するそれらの無性または有性的子孫をも
包含する。
【０２３２】従って、「トランスジェニック植物の無性
または有性的子孫」とは、本発明の定義により、例えば
細胞融合または変種の選別によるような既知の工程の手
段により得られる全ての突然変異体と変種を包含し；そ
してこれは当初の形質転換した植物の特徴ある性質を発
揮し並びに形質転換した植物物質の全ての交叉または融
合生成物をいまだ生産する。
または有性的子孫」とは、本発明の定義により、例えば
細胞融合または変種の選別によるような既知の工程の手
段により得られる全ての突然変異体と変種を包含し；そ
してこれは当初の形質転換した植物の特徴ある性質を発
揮し並びに形質転換した植物物質の全ての交叉または融
合生成物をいまだ生産する。
【０２３３】本発明の別の目的は、トランスジェニック
植物の増殖物質に関する。
植物の増殖物質に関する。
【０２３４】トランスジェニック植物の増殖物質は本発
明に関して、ｉｎ ｖｉｖｏ または ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ で有性または無性的に増殖され得るいずれかの植物
物質として定義される。
明に関して、ｉｎ ｖｉｖｏ または ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ で有性または無性的に増殖され得るいずれかの植物
物質として定義される。
【０２３５】本発明の範囲内で特に好ましいものは、プ
ロトプラスト、細胞、カリ(calli)、組織、器官、種
子、胚（芽）、花粉、卵細胞、接合子、並びにトランス
ジェニック植物から得られる増殖物質の他のいずれかで
ある。
ロトプラスト、細胞、カリ(calli)、組織、器官、種
子、胚（芽）、花粉、卵細胞、接合子、並びにトランス
ジェニック植物から得られる増殖物質の他のいずれかで
ある。
【０２３６】例えばトランスジェニック植物を起源にす
る花卉、茎、果実、葉、根のような植物の部分または本
発明の工程の手段により前代に形質転換しそして従って
トランスジェニック細胞の少なくとも一部分を含有する
その子孫も、本発明の目的である。
る花卉、茎、果実、葉、根のような植物の部分または本
発明の工程の手段により前代に形質転換しそして従って
トランスジェニック細胞の少なくとも一部分を含有する
その子孫も、本発明の目的である。
【０２３７】本発明の工程は全ての植物、特に被子植物
と裸子植物の分類上の群のそれらの形質転換に適当であ
る。
と裸子植物の分類上の群のそれらの形質転換に適当であ
る。
【０２３８】裸子植物の中では、毬果植物の群の植物が
特に興味がある。
特に興味がある。
【０２３９】被子植物の中では落葉性の樹木と灌木に加
えて、ナス科、アブラナ科、キク科、ユリ科、ヴィタシ
アエ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）、アカザ科、ルタシアエ科
（Ｒｕｔｃｅａｅ）、ネギ科、アマリリダシアエ科（Ａ
ｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、ラン科、ヤシ科、ブロ
メリアシアエ科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）、ルビア
シアエ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、テアシアエ科（Ｔｈ
ｅａｃｅａｅ）、ムサシアエ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、
アオイ科またはイネ科の植物、そしてマメ科の植物そし
てここでは特にマメ科（Ｐａｐｉｌｉｏｎａｃｅａｅ）
の植物が特に興味のあるそれらである。
えて、ナス科、アブラナ科、キク科、ユリ科、ヴィタシ
アエ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）、アカザ科、ルタシアエ科
（Ｒｕｔｃｅａｅ）、ネギ科、アマリリダシアエ科（Ａ
ｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、ラン科、ヤシ科、ブロ
メリアシアエ科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）、ルビア
シアエ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、テアシアエ科（Ｔｈ
ｅａｃｅａｅ）、ムサシアエ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、
アオイ科またはイネ科の植物、そしてマメ科の植物そし
てここでは特にマメ科（Ｐａｐｉｌｉｏｎａｃｅａｅ）
の植物が特に興味のあるそれらである。
【０２４０】好ましいのは、ナス科、アブラナ科および
イネ科の例である。
イネ科の例である。
【０２４１】本発明の範囲内の標的作物は、下記の群か
ら選択されたものである：フラガリス（Ｆｒａｇａｒｉ
ａ）、ハス（Ｌｏｔｕｓ）、メジカゴ（Ｍｅｄｉｃａｇ
ｏ）、オノブリキス（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）、トリホ
リウム（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、トリゴネラ（Ｔｒｉｇ
ｏｎｅｌｌａ）、ヴィグナ（Ｖｉｇｎａ）、カンキツ
（Ｃｉｔｒｕｓ）、リナム（Ｌｉｎｕｍ）、ゲラニウム
（Ｇｅｒａｎｉｕｍ）、マニホット（Ｍａｎｉｈｏ
ｔ）、ダウカス（Ｄａｕｃｕｓ）、アラビドプシス（Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃ
ａ）、ラファナス（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、からし（Ｓｉ
ｎａｐｉｓ）、アトロパ（Ａｔｒｏｐａ）、トウガラシ
（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、朝鮮アサガオ（Ｄａｔｕｒ
ａ）、ヒョシアムス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、リコパ
ーション（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ）、タバコ（Ｎｉｃ
ｏｔｉａｎａ）、ナス科（Ｓｏｌａｎｕｍ）、つくばね
あさがお（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔ
ａｌｉｓ）、マジョラナ（Ｍａｊｏｒａｎａ）、シンコ
リウム（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）、ヘリアンタス（Ｈｅｌ
ｉａｎｔｈｕｓ）、ラクタス（Ｌａｃｔｕｓ）、ブロマ
ス（Ｂｒｏｍｕｓ）、ゴシピウム（Ｇｏｓｓｉｐｉｕ
ｍ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）、きんぎょ
そう属（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、ヘメオカリス（Ｈ
ｅｍｅｏｃａｌｌｉｓ）、ネメシア（Ｎｅｍｅｓｉ
ａ）、ペラゴニウム（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ）、パニ
カム（Ｐａｎｉｃｕｍ）、ペニセタム（Ｐｅｎｉｓｅｔ
ｔｕｍ）、ラナンカラス（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）、ゼ
ネシオ（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、ザルピグロシス（Ｓａｌｐ
ｉｇｌｏｓｓｉｓ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、ブ
ロワリア（Ｂｒｏｗａｌｌｉａ）、グリシン（Ｇｌｙｃ
ｉｎｅ）、ロリウム（Ｌｏｌｉｕｍ）、ジー（Ｚｅ
ａ）、トリチカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、もろこし（Ｓ
ｏｒｇｈｕｍ）、サツマイモ属（Ｉｐｏｍｏｃｅａ
ｅ）、トケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ）、シクラメ
ン（Ｃｙｃｌａｍｅｎ）、マラス（Ｍａｌｕｓ）、プル
ナス（Ｐｒｕｎｕｓ）、バラ（Ｒｏｓａ）、ルバス（Ｒ
ｕｂｕｓ）、ポプラス（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、ザンタラム
（Ｓａｎｔａｌｕｍ）、アリウム（Ａｌｌｉｕｍ）、リ
リウム（Ｌｉｌｉｕｍ）、スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓ
ｕｓ）、アナナス（Ａｎａｎａｓ）、アラキス（Ａｒａ
ｃｈｉｓ）、ファゼオラス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）およ
びピサム（Ｐｉｓｕｍ）。
ら選択されたものである：フラガリス（Ｆｒａｇａｒｉ
ａ）、ハス（Ｌｏｔｕｓ）、メジカゴ（Ｍｅｄｉｃａｇ
ｏ）、オノブリキス（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）、トリホ
リウム（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、トリゴネラ（Ｔｒｉｇ
ｏｎｅｌｌａ）、ヴィグナ（Ｖｉｇｎａ）、カンキツ
（Ｃｉｔｒｕｓ）、リナム（Ｌｉｎｕｍ）、ゲラニウム
（Ｇｅｒａｎｉｕｍ）、マニホット（Ｍａｎｉｈｏ
ｔ）、ダウカス（Ｄａｕｃｕｓ）、アラビドプシス（Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃ
ａ）、ラファナス（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、からし（Ｓｉ
ｎａｐｉｓ）、アトロパ（Ａｔｒｏｐａ）、トウガラシ
（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、朝鮮アサガオ（Ｄａｔｕｒ
ａ）、ヒョシアムス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、リコパ
ーション（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ）、タバコ（Ｎｉｃ
ｏｔｉａｎａ）、ナス科（Ｓｏｌａｎｕｍ）、つくばね
あさがお（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔ
ａｌｉｓ）、マジョラナ（Ｍａｊｏｒａｎａ）、シンコ
リウム（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）、ヘリアンタス（Ｈｅｌ
ｉａｎｔｈｕｓ）、ラクタス（Ｌａｃｔｕｓ）、ブロマ
ス（Ｂｒｏｍｕｓ）、ゴシピウム（Ｇｏｓｓｉｐｉｕ
ｍ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）、きんぎょ
そう属（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、ヘメオカリス（Ｈ
ｅｍｅｏｃａｌｌｉｓ）、ネメシア（Ｎｅｍｅｓｉ
ａ）、ペラゴニウム（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ）、パニ
カム（Ｐａｎｉｃｕｍ）、ペニセタム（Ｐｅｎｉｓｅｔ
ｔｕｍ）、ラナンカラス（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）、ゼ
ネシオ（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、ザルピグロシス（Ｓａｌｐ
ｉｇｌｏｓｓｉｓ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、ブ
ロワリア（Ｂｒｏｗａｌｌｉａ）、グリシン（Ｇｌｙｃ
ｉｎｅ）、ロリウム（Ｌｏｌｉｕｍ）、ジー（Ｚｅ
ａ）、トリチカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、もろこし（Ｓ
ｏｒｇｈｕｍ）、サツマイモ属（Ｉｐｏｍｏｃｅａ
ｅ）、トケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ）、シクラメ
ン（Ｃｙｃｌａｍｅｎ）、マラス（Ｍａｌｕｓ）、プル
ナス（Ｐｒｕｎｕｓ）、バラ（Ｒｏｓａ）、ルバス（Ｒ
ｕｂｕｓ）、ポプラス（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、ザンタラム
（Ｓａｎｔａｌｕｍ）、アリウム（Ａｌｌｉｕｍ）、リ
リウム（Ｌｉｌｉｕｍ）、スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓ
ｕｓ）、アナナス（Ａｎａｎａｓ）、アラキス（Ａｒａ
ｃｈｉｓ）、ファゼオラス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）およ
びピサム（Ｐｉｓｕｍ）。
【０２４２】特に適当であり、従って本発明の工程の応
用に好ましいものは、胚および／または分裂の構造であ
り、これは単離されていてもよく、全体植物の組織の中
に存在していてもよい。
用に好ましいものは、胚および／または分裂の構造であ
り、これは単離されていてもよく、全体植物の組織の中
に存在していてもよい。
【０２４３】一方、胚および／または分裂の構造の構造
から始まる全体植物の再生は多くの単子葉植物にとって
可能になったので、下記の植物も本発明の中で使用され
てもよい：ロリウム（Ｌｏｌｉｕｍ）、ジー（Ｚｅ
ａ）、トリチカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、もろこし（Ｓ
ｏｒｇｈｕｍ）、サッカラム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、
ブロマス（Ｂｒｏｍｕｓ）、イネ、カラスムギ（Ａｖｅ
ｎａ）、ホルデウム（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、セカレ（Ｓｅ
ｃａｌｅ）およびセタリア（Ｓｅｔａｒｉａ）。
から始まる全体植物の再生は多くの単子葉植物にとって
可能になったので、下記の植物も本発明の中で使用され
てもよい：ロリウム（Ｌｏｌｉｕｍ）、ジー（Ｚｅ
ａ）、トリチカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、もろこし（Ｓ
ｏｒｇｈｕｍ）、サッカラム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、
ブロマス（Ｂｒｏｍｕｓ）、イネ、カラスムギ（Ａｖｅ
ｎａ）、ホルデウム（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、セカレ（Ｓｅ
ｃａｌｅ）およびセタリア（Ｓｅｔａｒｉａ）。
【０２４４】形質転換した植物細胞から成長した成熟植
物は、その種子の生産のために自家交配する。
物は、その種子の生産のために自家交配する。
【０２４５】種子のあるものは、確立された遺伝法則に
正確に従った比率で、有用なかつ所望の性質をコードし
ている遺伝子を含有する。
正確に従った比率で、有用なかつ所望の性質をコードし
ている遺伝子を含有する。
【０２４６】これらの種子は、トランスジェニック植物
の生産に使用できる。
の生産に使用できる。
【０２４７】同型接合系は、自家受粉の繰り返しと同系
統の生産により得られてよい。
統の生産により得られてよい。
【０２４８】これらの同系統は、ハイブリドを生産する
のにも使用されてもよい。
のにも使用されてもよい。
【０２４９】この工程において、該外来遺伝子を含有す
る同系統は、生産のために他の同系統と交配する。
る同系統は、生産のために他の同系統と交配する。
【０２５０】
【実施例】本発明の一般的な説明に続いて；個々に示し
た以外は、限定することなしに本発明を説明するために
個々の実施例を参考にする。
た以外は、限定することなしに本発明を説明するために
個々の実施例を参考にする。
【０２５１】なんら制限のない実施態様。
【０２５２】１．ＤＮＡ／金粒子けん濁液の製造 １．１ プラスミド 下記の形質転換の試験では、β−グルクロニダーゼの酵
素を発現するｐＢＩ２２１が使用される。
素を発現するｐＢＩ２２１が使用される。
【０２５３】このプラスミドは、クロンテック、パロ
アルト、シーエーからおよびジェノフィット、ジェネバ
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；ＧＥ
ＮＯＦＩＴ，Ｇｅｎｅｖａ）から得られる。
アルト、シーエーからおよびジェノフィット、ジェネバ
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；ＧＥ
ＮＯＦＩＴ，Ｇｅｎｅｖａ）から得られる。
【０２５４】その構造と組成に関する詳しい資料は、ジ
ェファーソン他（１９８６）による刊行物に含まれる。
ェファーソン他（１９８６）による刊行物に含まれる。
【０２５５】下記に詳細に記載してある形質転換におい
ては、プラスミドｐＢＩ２２１は約１．２５μｇＤＮＡ
／μｌＨ2 Ｏの濃度で「スーパー−コイル」の構造で使
用さる。
ては、プラスミドｐＢＩ２２１は約１．２５μｇＤＮＡ
／μｌＨ2 Ｏの濃度で「スーパー−コイル」の構造で使
用さる。
【０２５６】ＤＮＡ溶液は、−２０℃で保存され、そし
て使用直前に解凍される。
て使用直前に解凍される。
【０２５７】１．２ 金粒子の製造 急角度にテーパーを付けた１５ｍｌのプラスチック製遠
心分離管に入れた１０ｍｌの１％塩化金酸［ＨＡｕＣｌ
4 ・３Ｈ2 Ｏ；メルク社Ｎｏ．１５８２］水溶液に、２
００μｌの希釈してない写真現像液［例えば、「ロンジ
アル」］（ＡＧＦＡ）をピペットで速やかに（＜１０
ｓ）添加する。
心分離管に入れた１０ｍｌの１％塩化金酸［ＨＡｕＣｌ
4 ・３Ｈ2 Ｏ；メルク社Ｎｏ．１５８２］水溶液に、２
００μｌの希釈してない写真現像液［例えば、「ロンジ
アル」］（ＡＧＦＡ）をピペットで速やかに（＜１０
ｓ）添加する。
【０２５８】次いで、全液を短時間振る。
【０２５９】室温に３０ｓ保持した後、２ｍｌの写真用
定着剤［例えば「イルホスピード（「Ｉｌｆｏｓｐｅｅ
ｄ」、市販のマスター溶液、その１部を４部の蒸留水で
希釈した；イルホード（Ｉｌｆｏｒｄ） 写真会社］の
添加により還元反応を停止する。
定着剤［例えば「イルホスピード（「Ｉｌｆｏｓｐｅｅ
ｄ」、市販のマスター溶液、その１部を４部の蒸留水で
希釈した；イルホード（Ｉｌｆｏｒｄ） 写真会社］の
添加により還元反応を停止する。
【０２６０】けん濁液を５分間、２．２ｋｘｇ［スイン
グローター、例えばヴリスト ラボフーゲ（Ｖｈｒｉｓ
ｔ Ｌａｂｏｆｕｇｅ），ヘラエウス（ＨＥＲＡＥＵ
Ｓ）］で遠心分離し、上澄液を除き、残さを１．５ｍｌ
のＨ2 Ｏに再けん濁し、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄ
ｏｒｆ）容器に移す。
グローター、例えばヴリスト ラボフーゲ（Ｖｈｒｉｓ
ｔ Ｌａｂｏｆｕｇｅ），ヘラエウス（ＨＥＲＡＥＵ
Ｓ）］で遠心分離し、上澄液を除き、残さを１．５ｍｌ
のＨ2 Ｏに再けん濁し、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄ
ｏｒｆ）容器に移す。
【０２６１】残った定着剤の塩を２回目の遠心分離によ
り除く（１０ｋｘｇ，エッペンドルフ遠心分離、角度固
定ローター）。
り除く（１０ｋｘｇ，エッペンドルフ遠心分離、角度固
定ローター）。
【０２６２】残さを１．１ｍｌのＨ2 Ｏに再けん濁し、
次いで２個の液にして１バール、１２０℃でオートクレ
ーブする。
次いで２個の液にして１バール、１２０℃でオートクレ
ーブする。
【０２６３】オートクレーブしたけん濁液は金粒子を
０．５（±０．１）ｘ１０9 個／ｍｌ含有する。
０．５（±０．１）ｘ１０9 個／ｍｌ含有する。
【０２６４】平均の粒子直径は１．６±０．０１μｍ
（平均値の標準誤差）であり、最大の粒子直径は２．５
μｍ（約５０個について２．５個）である。
（平均値の標準誤差）であり、最大の粒子直径は２．５
μｍ（約５０個について２．５個）である。
【０２６５】オートクレーブしたけん濁液は冷蔵庫に保
管され、使用直前にのみ再けん濁される。
管され、使用直前にのみ再けん濁される。
【０２６６】１．３ ＤＮＡ／金粒子混合物 使用直前に下記の成分をピペットで加えて一緒にする。 ｐＢＩ２２１の「スーパーコイルした」ＤＮＡ ３μｌ 金けん濁液 ６μｌ １００ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０ １μｌ １ｍＭ Ｎａ−ＥＤＴＡ １μｌ
【０２６７】対象液は、ｐＢＩ２２１プラスミドの代わ
りに水を含有する以外は、上記と同じ組成である。
りに水を含有する以外は、上記と同じ組成である。
【０２６８】一回の実験で、金けん濁液の１部を９部の
水で希釈する。
水で希釈する。
【０２６９】２．形質転換される植物物質の製造 ２．１ トウモロコシの胚 胚を未だ未熟のトウモロコシの穀粒から成熟前に単離
し、ペトリ皿中のムラシゲとスクーグ（１９６２）［表
１を参照］の方法に従う培地に置く。
し、ペトリ皿中のムラシゲとスクーグ（１９６２）［表
１を参照］の方法に従う培地に置く。
【０２７０】２．２ トウモロコシの胚の取り付け １０ｍＭ ＣａＣｌ2 の２％アガロースを、小さい滅菌
したサーマノックス(Thermanox) 皿［２２ｘ６０ｍｍ，
マイルスラボラトリース，ネーパーヴィレ，米国］に注
ぎ、一様の約１ｍｍの厚さのアガロース層を形成する。
したサーマノックス(Thermanox) 皿［２２ｘ６０ｍｍ，
マイルスラボラトリース，ネーパーヴィレ，米国］に注
ぎ、一様の約１ｍｍの厚さのアガロース層を形成する。
【０２７１】次いで、胚を４％アルギン酸塩の溶液の１
滴（＜１０μｌ）［例えば、滅菌したアルギン酸塩のろ
液，フルカ（Fluka)Ｎｏ．７１２３８］を使用してアガ
ロース上に取り付ける。この際、小鱗片が上方に向くよ
うに注意しなければならない。
滴（＜１０μｌ）［例えば、滅菌したアルギン酸塩のろ
液，フルカ（Fluka)Ｎｏ．７１２３８］を使用してアガ
ロース上に取り付ける。この際、小鱗片が上方に向くよ
うに注意しなければならない。
【０２７２】アルギン酸塩を、衝撃に先立って、湿潤室
内で２−３時間固化する。
内で２−３時間固化する。
【０２７３】胚をいろいろな方法で取り付けてもよい。
【０２７４】この場合の工程では、胚を、ヒモの輪を使
用して栄養液から取り出し、きちっと結び付け、濾紙を
使って過剰の液体を取り去り、実体顕微鏡の下でアガロ
ースの下塗り層に取り付ける。
用して栄養液から取り出し、きちっと結び付け、濾紙を
使って過剰の液体を取り去り、実体顕微鏡の下でアガロ
ースの下塗り層に取り付ける。
【０２７５】滅菌濾紙で過剰のアルギン酸塩を吸い取
る。
る。
【０２７６】次いで、アルギン酸塩を湿潤室内で２−３
時間固化する。
時間固化する。
【０２７７】４０個以上の胚が互いに隣接してアガロー
スの下塗り層に取り付けられてもよい。
スの下塗り層に取り付けられてもよい。
【０２７８】衝撃のすぐ前に、アガロース下塗り層を解
剖ナイフで切断し、そして滅菌した顕微鏡用スライド上
に、アガロース下塗り層と共に胚の各々が個々に置かれ
ているようにする。
剖ナイフで切断し、そして滅菌した顕微鏡用スライド上
に、アガロース下塗り層と共に胚の各々が個々に置かれ
ているようにする。
【０２７９】次いで、このスライドを、上述した装置の
部品２３の代わりに標本室中に挿入する。但し移動でき
る。
部品２３の代わりに標本室中に挿入する。但し移動でき
る。
【０２８０】水噴射ポンプの真空度の利用により、その
上に置いた胚と共にスライドが装置上に吸い付けられ
る。
上に置いた胚と共にスライドが装置上に吸い付けられ
る。
【０２８１】３． 衝撃の工程 ３．１ 標的 静止した目盛りは、衝撃軸の拡がりを標識する。目盛り
を開口部の上に置き、スライドを動かすことにより、胚
は軸中に入れる。
を開口部の上に置き、スライドを動かすことにより、胚
は軸中に入れる。
【０２８２】３．２ カニュールの装填 上述したカニュールに装填するために、これを一時的に
加圧室１から外す。
加圧室１から外す。
【０２８３】計測装置４５−４９における置換液体とし
て機能するパラフィン（メルクＮｏ．７１７４）をカニ
ュールの開口部においてそのメニスカスが現れる迄押し
出すようにして作動する。
て機能するパラフィン（メルクＮｏ．７１７４）をカニ
ュールの開口部においてそのメニスカスが現れる迄押し
出すようにして作動する。
【０２８４】用意した溶液の１μｌの滴をピペットでメ
ニスカスの上に置き、計測装置４５−４９を使用してカ
ニュール内に引き込む。
ニスカスの上に置き、計測装置４５−４９を使用してカ
ニュール内に引き込む。
【０２８５】カニュールはけん濁液の２−３μｌを保持
する。
する。
【０２８６】上述のようにして入れた最後の滴がカニュ
ール内に完全に消えた時に、メカニカスがカニュールの
末端部と平面になる迄、けん濁液のメニスカスを押し出
しそして次にカニュールを加圧室１中にねじ込む。
ール内に完全に消えた時に、メカニカスがカニュールの
末端部と平面になる迄、けん濁液のメニスカスを押し出
しそして次にカニュールを加圧室１中にねじ込む。
【０２８７】３．３ トウモロコシ胚中へのＤＮＡ／金
粒子を含有するけん濁液の射出 トウモロコシ胚中へのＤＮＡと金粒子を含有するけん濁
液の射出のために、下記のパラメーターを本発明に従う
装置上に設定する： −水噴射真空ポンプによる標本室２の真空化（約５００
ミリバール）， −射撃の間のＣＯ2 圧：２０℃において５７バール， −各射撃の持続時間：２ｍｓ， −作動距離（カニュール４２の開口部４２ａから標本
迄）：１０ｍｍ， −毛細管１７：長さ１０ｍｍおよび直径３００μｍのガ
ラス製毛細管， −カニュールと垂直線との間の角度α：９０°， −胚当たりの射撃数：１ないし５（表２参照）， −胚当たりの仕込み量：０．２μｌ， −様式： ａ）１回射撃： ０．２μｌのけん濁液（仕込み量）→
１回射撃 ｂ）５回射撃： ０．１μｌのけん濁液（仕込み量）→
２回射撃 ０．１μｌのけん濁液（仕込み量）→３回射撃
粒子を含有するけん濁液の射出 トウモロコシ胚中へのＤＮＡと金粒子を含有するけん濁
液の射出のために、下記のパラメーターを本発明に従う
装置上に設定する： −水噴射真空ポンプによる標本室２の真空化（約５００
ミリバール）， −射撃の間のＣＯ2 圧：２０℃において５７バール， −各射撃の持続時間：２ｍｓ， −作動距離（カニュール４２の開口部４２ａから標本
迄）：１０ｍｍ， −毛細管１７：長さ１０ｍｍおよび直径３００μｍのガ
ラス製毛細管， −カニュールと垂直線との間の角度α：９０°， −胚当たりの射撃数：１ないし５（表２参照）， −胚当たりの仕込み量：０．２μｌ， −様式： ａ）１回射撃： ０．２μｌのけん濁液（仕込み量）→
１回射撃 ｂ）５回射撃： ０．１μｌのけん濁液（仕込み量）→
２回射撃 ０．１μｌのけん濁液（仕込み量）→３回射撃
【０２８８】４．形質転換した胚の成育 ＤＮＡと金粒子を含有するけん濁液による衝撃の後、胚
をアルギン酸塩から取り出し、ムラシゲとスクーグ（１
９６２）［表１を参照］の方法に従う培地中で成育す
る。
をアルギン酸塩から取り出し、ムラシゲとスクーグ（１
９６２）［表１を参照］の方法に従う培地中で成育す
る。
【０２８９】この工程において、５ないし７個の胚を組
織培養プレート（蓋付）［２４個の凹み（直径１６ｍ
ｍ）を持つコスター(Costar)のプレート、コスター、ケ
ムブリッジ、米国］中の凹み中の０．５ｍｌの培地上に
置く。
織培養プレート（蓋付）［２４個の凹み（直径１６ｍ
ｍ）を持つコスター(Costar)のプレート、コスター、ケ
ムブリッジ、米国］中の凹み中の０．５ｍｌの培地上に
置く。
【０２９０】胚を内側の凹みだけに置き、一方、外側の
凹みを１ｍｌの水で満たすと、全ての系が湿潤室として
機能するので有利である。
凹みを１ｍｌの水で満たすと、全ての系が湿潤室として
機能するので有利である。
【０２９１】胚を室温でおよび昼の光［人工光で補充：
１５ｃｍの距離でオスラム（ＯＳＲＡＭ）Ｌ３６Ｗ／７
７フルオラ（Ｆｌｕｏｒａ）を照射］で４８時間成育す
る。
１５ｃｍの距離でオスラム（ＯＳＲＡＭ）Ｌ３６Ｗ／７
７フルオラ（Ｆｌｕｏｒａ）を照射］で４８時間成育す
る。
【０２９２】５．ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）の検
出 メンデル他（１９８９）により記述されている工程の改
変法により、β−グルクロニダーゼ遺伝子の一時的発現
が検出される。
出 メンデル他（１９８９）により記述されている工程の改
変法により、β−グルクロニダーゼ遺伝子の一時的発現
が検出される。
【０２９３】反応溶液： 溶液（ａ）： 各々の成分 マスター 体積 最終濃度 溶液 ─────────── ─────── ─────── ─────── Ｋ／Ｎａリン酸塩 ０．５Ｍ １０００μｌ リン酸塩緩衝液 ０．１Ｍ （ｐＨ７．０） Ｎａ−ＥＤＴＡ １００ｍＭ ５００μｌ １０ｍＭ トリトン−Ｘ １．０％ ５００μｌ ０．１％ ヘキサシアノ ５０ｍＭ ５００μｌ ５ｍＭ 鉄酸塩（II） ヘキサシアノ ５０ｍＭ ５００μｌ ５ｍＭ 鉄酸塩（III ） Ｈ2 Ｏ ２０００μｌ
【０２９４】溶液（ｂ）： 基質溶液：５０μｌのジメチルホルムアミドに溶解した
５ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−インドール−３−イ
ル−β−Ｄ−グルクロン酸［クロンテック ラボラトリ
ース(Clontech Labolatories) ，パロ アルト 米
国］。この基質溶液はいつも使用前に合成する。
５ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−インドール−３−イ
ル−β−Ｄ−グルクロン酸［クロンテック ラボラトリ
ース(Clontech Labolatories) ，パロ アルト 米
国］。この基質溶液はいつも使用前に合成する。
【０２９５】溶液（ｃ）：溶液（ａ）と（ｂ）を一緒に
混合し、すぐにＧＵＳの検出のために使用する。メンデ
ル他（１９８９）から偏向する場合は、０．１％の基質
濃度になる。
混合し、すぐにＧＵＳの検出のために使用する。メンデ
ル他（１９８９）から偏向する場合は、０．１％の基質
濃度になる。
【０２９６】ＧＵＳの検出のために、初めに、組織培養
プレートの凹みからピペットで胚を覆っている栄養液を
取り除き、各々場合について０．５ｍｌの溶液（ｃ）
（各々、５ないし７個の胚に充分である。）で置き換え
る。
プレートの凹みからピペットで胚を覆っている栄養液を
取り除き、各々場合について０．５ｍｌの溶液（ｃ）
（各々、５ないし７個の胚に充分である。）で置き換え
る。
【０２９７】次いで、蓋をした培養プレートを保温器中
で３７℃で２４時間保温する。
で３７℃で２４時間保温する。
【０２９８】２４時間後に、青色のスポットが胚の上に
観察され、これは胚細胞中のＧＵＳ活性の存在を示して
いる。
観察され、これは胚細胞中のＧＵＳ活性の存在を示して
いる。
【０２９９】スポット数を実体顕微鏡の下で計測する。
表２は例示する実験の結果を掲示しており、陽性の胚上
では１４個迄のスポットが計測されている。対照試験は
例外なしに陰性であった。
表２は例示する実験の結果を掲示しており、陽性の胚上
では１４個迄のスポットが計測されている。対照試験は
例外なしに陰性であった。
【０３００】６．細菌の形質転換
【０３０１】６．１ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換 ＪＭ１０１株［ヤニシ−ペロン他（１９８５）］の大腸
菌細胞を、例えばニトロセルロース上のＬＭ−培地［ミ
ラー（Miller）ＪＨ（１９７７）］のような標準的な培
地上で成育する。
菌細胞を、例えばニトロセルロース上のＬＭ−培地［ミ
ラー（Miller）ＪＨ（１９７７）］のような標準的な培
地上で成育する。
【０３０２】濾紙を約０．５ｃｍ四方の正方形に切断
し、射撃のために、２％アガロースの同じ大きさの塊の
上に層にして重ねる。
し、射撃のために、２％アガロースの同じ大きさの塊の
上に層にして重ねる。
【０３０３】試料を実施例２．２に記載したとおりの標
本室に挿入する。
本室に挿入する。
【０３０４】細菌細胞に、ｐＵＣ１８プラスミド［ヴィ
エイラとメッシング(Vieira and Messing)（１９８
２）］ＤＮＡと金粒子を含有するけん濁液を射出するた
めに；下記のパラメーターを本発明の装置上に設定し、
実験の間、不変に保持する：
エイラとメッシング(Vieira and Messing)（１９８
２）］ＤＮＡと金粒子を含有するけん濁液を射出するた
めに；下記のパラメーターを本発明の装置上に設定し、
実験の間、不変に保持する：
【０３０５】−水噴射真空ポンプによる標本室２の真空
化（約９００ミリバール）， −射撃の間のＣＯ2 圧：２０℃において５５バール， −各射撃の持続時間：２ｍｓ， −作動距離（カニュール４２の開口部４２ａから標本
迄）：表１参照， −毛細管１７：長さ１０ｍｍおよび直径２００μｍのガ
ラス製毛細管， −カニュールと垂直線との間の角度α：４５°， −様式：射撃は、各々の濾紙上の３箇所に向けられ、各
箇所を３回射撃（各射撃当たり２０ｎｌのＤＮＡ／粒子
けん濁液）する。
化（約９００ミリバール）， −射撃の間のＣＯ2 圧：２０℃において５５バール， −各射撃の持続時間：２ｍｓ， −作動距離（カニュール４２の開口部４２ａから標本
迄）：表１参照， −毛細管１７：長さ１０ｍｍおよび直径２００μｍのガ
ラス製毛細管， −カニュールと垂直線との間の角度α：４５°， −様式：射撃は、各々の濾紙上の３箇所に向けられ、各
箇所を３回射撃（各射撃当たり２０ｎｌのＤＮＡ／粒子
けん濁液）する。
【０３０６】けん濁液中のＤＮＡと粒子の濃度、粒子の
大きさおよび作動距離は、表１に従って実験の間変えら
れる。
大きさおよび作動距離は、表１に従って実験の間変えら
れる。
【０３０７】射出後に、試料を、濾紙から細菌を取り除
くために、液体ＬＭ−培地中で１時間にわたり保温す
る。
くために、液体ＬＭ−培地中で１時間にわたり保温す
る。
【０３０８】その後、細菌のけん濁液を、選別のために
アムピシリン［１００μｇ／ｍｌ］と１．５％寒天を補
給した固体ＬＭ−培地にプレートする。
アムピシリン［１００μｇ／ｍｌ］と１．５％寒天を補
給した固体ＬＭ−培地にプレートする。
【０３０９】２４時間保温した後で、コロニーを計測す
る（表１参照）。
る（表１参照）。
【０３１０】陽性のコロニーの選別は、プラスミド含量
のために分析される。
のために分析される。
【０３１１】プラスミドを細菌から単離し、ゲル上で展
開する。ＤＮＡの大きさを分子量標識［ＢＲＬ；ベスセ
ダ リサーチ ラボラトリース ライフテクノロジー(B
ethseda Research Labolatorie Life Technologies）；
５６１５ＳＡ／ＳＢ］および標準プラスミド［ＢａｍＨ
Ｉで切断したｐＵＣ１８；２．７ｋｂｐ］と対比して決
定する。
開する。ＤＮＡの大きさを分子量標識［ＢＲＬ；ベスセ
ダ リサーチ ラボラトリース ライフテクノロジー(B
ethseda Research Labolatorie Life Technologies）；
５６１５ＳＡ／ＳＢ］および標準プラスミド［ＢａｍＨ
Ｉで切断したｐＵＣ１８；２．７ｋｂｐ］と対比して決
定する。
【０３１２】全ての試験した陽性コロニーは、精確なプ
ラスミドｐＵＣ１８を包含する。
ラスミドｐＵＣ１８を包含する。
【０３１３】対照は、粒子であるがＤＮＡを伴わないも
ので射撃するか、または射撃なしにＤＮＡの残りの中で
培養する。これらの対照は、全く陰性であった。
ので射撃するか、または射撃なしにＤＮＡの残りの中で
培養する。これらの対照は、全く陰性であった。
【０３１４】細菌の直径は、粒子のそれより小さいの
で、粒子を取り込んだ細胞が生存しているということは
とてもあり得ないことである。
で、粒子を取り込んだ細胞が生存しているということは
とてもあり得ないことである。
【０３１５】従って、形質転換が起きた場合は、粒子は
細胞壁と膜を丁度引っ掻いただけで、プラスミドが後に
閉鎖する小さい開口部を通して流れ込むのを可能にし、
そして金粒子は外部に取り残されただけであると仮定さ
れるべきである。
細胞壁と膜を丁度引っ掻いただけで、プラスミドが後に
閉鎖する小さい開口部を通して流れ込むのを可能にし、
そして金粒子は外部に取り残されただけであると仮定さ
れるべきである。
【０３１６】大腸菌を培養するためのそして大腸菌のプ
ラスミドの単離と特徴付けのための上述の工程は標準の
手順であり、これらは当技術の熟練者にはよく知られて
おりそしてマニアチス他（１９８２）に詳細に記載され
ている。
ラスミドの単離と特徴付けのための上述の工程は標準の
手順であり、これらは当技術の熟練者にはよく知られて
おりそしてマニアチス他（１９８２）に詳細に記載され
ている。
【０３１７】６．ネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子による、微小カリ(microkalli)からのタバコ細
胞の形質転換
ゼ遺伝子による、微小カリ(microkalli)からのタバコ細
胞の形質転換
【０３１８】実施例１ないし５に記載した工程と同様に
して、タバコのカルスをネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼ遺伝子により形質転換する。
して、タバコのカルスをネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼ遺伝子により形質転換する。
【０３１９】植物ゲノム中への該遺伝子の安定な組み込
みは、サザンブロット解析法により実証された。
みは、サザンブロット解析法により実証された。
【０３２０】７．表表１： ホルモンを含有しないムラシゲとスクーグ（１９
６２）の培地［ＭＳＯ−２培地；ｐＨ５．８］
６２）の培地［ＭＳＯ−２培地；ｐＨ５．８］
【０３２１】
【０３２２】表２ ：実施例１ないし５に記載した形質転換の結果 処理胚数 形質転換数 形質転換頻度［％］ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ｐＢＩ２２１ １） １５ １ ６ ２） １８ ９ ５０ ３） ２３ ５ ２２ ──────────────────────────────────── 対照 １） ８ ０ ０ ２） １１ ０ ０ ３） ２０ ０ ０ ────────────────────────────────────
【０３２３】表２は３個の独立した試験を示している。 １）実験１では、けん濁液中の粒子濃度は約０．３ｘ１
０6 粒子／μｌである。この場合、一回だけの射撃で、
０．２μｌの体積のけん濁液が発射された。
０6 粒子／μｌである。この場合、一回だけの射撃で、
０．２μｌの体積のけん濁液が発射された。
【０３２４】２）実験２では、けん濁液中の粒子濃度は
約０．３ｘ１０6粒子／μｌである。２ｘ０．１μｌの
けん濁液の分量を５回の射撃に分配する。
約０．３ｘ１０6粒子／μｌである。２ｘ０．１μｌの
けん濁液の分量を５回の射撃に分配する。
【０３２５】３）実験３では、けん濁液中の粒子濃度は
約０．３ｘ１０5粒子／μｌである。２ｘ０．１μｌの
けん濁液の分量を５回の射撃に分配する。
約０．３ｘ１０5粒子／μｌである。２ｘ０．１μｌの
けん濁液の分量を５回の射撃に分配する。
【０３２６】
【０３２７】記号説明： ａ：正方形濾紙の数（＝試料数，各々９回射撃） ｂ：実験当たりの射撃総回数 ｃ：ＤＮＡ−粒子けん濁液中のプラスミドの濃度，単
位：μｇ／μｌ ｄ：粒子の直径，単位：μｍ
位：μｇ／μｌ ｄ：粒子の直径，単位：μｍ
【０３２８】ｅ：粒子濃度，単位：人工グレイ−ステッ
プ(arbitrary grey steps) ｆ：操作距離、絞り管の先端から試料の表面までの距離
をｍｍ単位で提示 ｇ：陽性コロニー数 ｈ：陽性コロニー数を含む試料の％ ｉ：試料当たりの陽性コロニーの最大数
プ(arbitrary grey steps) ｆ：操作距離、絞り管の先端から試料の表面までの距離
をｍｍ単位で提示 ｇ：陽性コロニー数 ｈ：陽性コロニー数を含む試料の％ ｉ：試料当たりの陽性コロニーの最大数
【０３２９】参考文献 １．バーク他，Biochime Biophy,s.Acta,67:326-238,19
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9,1983 ４．クリストン他，Plant Physiol.,87:671-674,1998 ５．デ ラ ペナ他, Nature,325:274-276,1987
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84 １０．ヒルダー ＶＡ他，Nature,330:160-163,1987
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【０３３１】１１．ホーンＴ他，”Molecular Biology
of Plant Tumors"，Academic Press,549-560,1982 １２．フーカース−ヴァン−スログテルン他，Nature,3
11: 763-764,1984 １３．ハワード他，Planta，170:535,1987 １４．ジェファーソン他,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,83:
8447-8451,1986 １５．クライン他，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:4305-
4309,1988
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【０３３２】１６．マニアチス他，Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Labolatories,1982 １７．メンデル他，Theor.Appl.Genet.,78:31-34,1989 １８．ミラー ＪＨ，Experiments in Molecular Genet
ics,1972,Cold Spring Harbor Labolatory,New York,第
３版，1977,p.433 １９．モレリ他，Nature,315:200,1985 ２０．モリカワ Ｈとヤマダ Ｙ,Plant Cell Physio
l.,26:229-236,1985
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【０３３３】２１．ムラシゲとスクーグ，Physiol.Plan
t.,15:473,1962 ２２．ノムラ Ｋとコマミネ Ａ，Plant Sci.,44:53-5
8,1986 ２３．パズコースキ Ｊ他，EMBO J,3:2717-2722,1984 ２４．ポトルカス Ｉ他，［フリーリング Ｍ（編
纂），Plant Genetics,A.R.,Liss Inc.,New York,pp.18
1-199,1986］に記載の「プロトプラストへの直接遺伝子
伝達：植物ゲノムの安定な変換のための効果的且つ一般
に利用できる方法」 ２５．スペナ他，EMBO J,4: 2736,1985
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伝達：植物ゲノムの安定な変換のための効果的且つ一般
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【０３３４】２６．スタインビス ＨＨとステーブル
Ｐ，Protoplasma,116:223-227,1983 ２７．ヴィエイラとメッシング，Gene 19:259-268,1982 ２８．ヤニシ−ペロン他，Gene 33:103,1985 ２９．欧州特許公開公報EP-A０２７０３５６
Ｐ，Protoplasma,116:223-227,1983 ２７．ヴィエイラとメッシング，Gene 19:259-268,1982 ２８．ヤニシ−ペロン他，Gene 33:103,1985 ２９．欧州特許公開公報EP-A０２７０３５６
【０３３５】本発明が、その精神または本質的な特徴か
ら離れることなしに他の個々の実施態様具体的に表現で
きることは、当技術の通常の熟練者により理解されるで
あろう。
ら離れることなしに他の個々の実施態様具体的に表現で
きることは、当技術の通常の熟練者により理解されるで
あろう。
【０３３６】従って、ここで開示した実施態様は如何な
る観点からも説明するためのものであって限定するため
のものではない。
る観点からも説明するためのものであって限定するため
のものではない。
【０３３７】本発明の範囲は、詳細な説明よりもどちら
かというと特許請求の範囲により示されるものであり、
そして特許請求の範囲と同格の意味と範囲内に来るもの
は、その範囲内に包含されるものと意図されるものであ
る。
かというと特許請求の範囲により示されるものであり、
そして特許請求の範囲と同格の意味と範囲内に来るもの
は、その範囲内に包含されるものと意図されるものであ
る。
【図１】 本発明に従う工程の例示の実施態様の基本的
略図を示す。
略図を示す。
【図２】 装置の本質的な部分を拡大した縦断面図を示
す。
す。
【図３】 図２の線III −III で切断した断面図であ
る。
る。
Ａ・・縦軸Ａ、Ｔ・・カニュールの先端部にある小滴、
ｂ・・操作距離、１・・加圧室、２・・標本室、３・・
圧衝撃発生装置、４・・計測装置群、５・・水噴射真空
ポンプ、６・・支持台、１１・・加圧室の管、１２・・
テーパーリング、１３・・Ｏ−リング、１４・・毛細管
支持体、１５・・Ｏ−リング、１７・・絞り管（毛細管
またはダイアフラム）、２１・・基礎部分、２２・・凹
部、２３・・壁部分、２５・・細胞支持台、２５ａ・・
細胞支持台２５の表面、２６・・弾性支持腕、２７・・
調節ネジ、２８・・真空装置連結継手、３１・・ＣＯ2
銃、３２・・ＣＯ2 供給円筒、４１・・中空のニップ
ル、４２・・カニュール、４２ａ・・開口部、４３・・
チェックバルブ、４５・・計測シリンジ、４６・・スピ
ンドル伝動装置（マイクロメータースクリュウ）、４７
・・ステップモーター、６１・・刃止めネジ
ｂ・・操作距離、１・・加圧室、２・・標本室、３・・
圧衝撃発生装置、４・・計測装置群、５・・水噴射真空
ポンプ、６・・支持台、１１・・加圧室の管、１２・・
テーパーリング、１３・・Ｏ−リング、１４・・毛細管
支持体、１５・・Ｏ−リング、１７・・絞り管（毛細管
またはダイアフラム）、２１・・基礎部分、２２・・凹
部、２３・・壁部分、２５・・細胞支持台、２５ａ・・
細胞支持台２５の表面、２６・・弾性支持腕、２７・・
調節ネジ、２８・・真空装置連結継手、３１・・ＣＯ2
銃、３２・・ＣＯ2 供給円筒、４１・・中空のニップ
ル、４２・・カニュール、４２ａ・・開口部、４３・・
チェックバルブ、４５・・計測シリンジ、４６・・スピ
ンドル伝動装置（マイクロメータースクリュウ）、４７
・・ステップモーター、６１・・刃止めネジ
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 13/00 2121−4Ｂ (71)出願人 390023146 チバ−ガイギー アクチエンゲゼルシヤフ ト ＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ ＡＫＴＩＥＮＧＥ ＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ スイス国 4002 バーゼル クリベツクシ ユトラーセ 141 (72)発明者 クリストフ ザウター スイス国、8197 ラフツ、クリステゲツス リ ３ (72)発明者 ハインツ ヴアルドナー スイス国、8050 チユーリツヒ、リードグ ラベンヴエーグ 28 (72)発明者 インゴ ポトルクス スイス国、4312 マグデン、イム スチグ ラー 54
Claims (37)
- 【請求項１】細胞、特に植物細胞の遺伝子的形質転換の
ための工程であって；ＤＮＡ溶液に微投射物をけん濁
し；圧衝撃の結果として微投射物を溶液を伴う霧に微小
に霧化して、形質転換されるべき細胞の方向に、該溶液
から圧衝撃により該微投射物を加速し；そして、；ＤＮ
Ａを伴う微投射物のパルスで細胞を衝撃して、ＤＮＡが
細胞に入るのができるのに充分な程度に、形質転換され
るべき細胞を微投射物が貫通するかまたは少なくとも傷
つける段階を包含する工程。 - 【請求項２】該微投射物がマイクロメータの大きさの金
の粒子である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】該微投射物がマイクロメータの大きさのタ
ングステンの粒子である請求項１記載の方法。 - 【請求項４】霧化により生成した霧を加圧する段階を更
に付加し；且つ、微投射物とそれに固着しているＤＮＡ
を、絞り管を通じて、形質転換すべき細胞に方向付け、
且つ、絞り管はダイアフラムまたは毛細管であり、該霧
は、絞り管により、細胞に向けて加速されそして細胞上
に焦点が合わされている請求項１記載の工程。 - 【請求項５】形質転換されるべき細胞が、少なくとも微
投射物で該細胞を衝撃している間、少なくとも部分的に
真空になっている室内に位置付けられている請求項４記
載の方法。 - 【請求項６】ＤＮＡ溶液の一滴がその溶液にけん濁して
いる微投射物を伴いそして、次いでその該滴が圧衝撃に
より霧化される請求項５記載の工程。 - 【請求項７】滴が絞り管と細胞と一直線に並べられ、圧
衝撃の伝播の主な方向が該直線と一致している請求項６
記載の工程。 - 【請求項８】微投射物として、２０ｎｍないし５μｍ、
そして好ましくは１．２ないし１．５μｍの直径範囲で
あって実質的には均一の大きさである金の粒子が使用さ
れる請求項７記載の工程。 - 【請求項９】一滴の容積が１０−５００ｎｌ、そして好
ましくは５０−１５０ｎｌの範囲内にある請求項６記載
の工程。 - 【請求項１０】滴と絞り管の間の距離が、約５−２０ｍ
ｍの範囲内から選ばれ、かくして集合した液体フィラメ
ントが絞り管に入らないようになっている請求項６記載
の工程。 - 【請求項１１】垂直に比べて傾斜しているカニュールの
出口末端で滴を生成する別の段階（この段階において、
そのカニュールの垂直に対する角度は微投射物の大きさ
とけん濁している微投射物を含有するＤＮＡ溶液の粘度
の函数として選択され、その結果、連続している滴で
は、けん濁している微投射物の濃度は実質的に一定であ
る）を包含する請求項６記載の方法。 - 【請求項１２】絞り管が２０ないし３００μｍの範囲内
の自由流路直径を持つ請求項４記載の工程。 - 【請求項１３】絞り管として、１０ないし５００μｍの
内径と１ないし２０ｍｍの長さを持つ毛細管が使用され
る請求項４記載の工程。 - 【請求項１４】圧衝撃が２ないし１００００バール、そ
して好ましくは数十バールないし数百バールの間から選
ばれている請求項６記載の工程。 - 【請求項１５】μｌ当たり０．１μｇの若干数の濃度の
ＤＮＡが使用される請求項６記載の工程。 - 【請求項１６】細胞中へのＤＮＡを伴う粒子の導入のた
めの、特に該細胞の遺伝子的形質転換のための装置であ
って；形質転換されるべき細胞のための支持台；細胞支
持台に向かってＤＮＡを含有する粒子を加速するための
手段；粒子とＤＮＡを含有するけん濁液の予め決められ
た体積の計量をするための手段を包含し、 粒子を加速するための手段が該体積のけん濁液を微細の
霧に霧化しそして該霧が細胞支持台に向かって加速され
ている装置。 - 【請求項１７】実質的に縦方向の加圧室であって、その
一方の端に圧衝撃を発生するための装置が配置されてお
り、他の一方は絞り管中に開口しており、 絞り管から一定の距離をおいて絞り管と共に一直線上に
あって該加圧室の延長線上に細胞支持台が置かれている
加圧室を更に包含し；且つ計測手段は、加圧室中に突出
しているカニュールを更に包含し；そしてカニュールの
開口部、絞り管および細胞支持台が、加圧室の縦軸に平
行な直線上に実質的に位置しているようになっている
か、または該縦軸に一致して位置しているようになって
いる請求項１６記載の装置。 - 【請求項１８】計測手段が、カニュールに供給しそして
カニュールの開口部において可変的に予め決められた体
積の一定量の滴の形成を可能にする可変計量装置を更に
包含する請求項１７記載の装置。 - 【請求項１９】カニュールが加圧室中へ開口している角
度が可変である請求項１８記載の装置。 - 【請求項２０】加圧室がその末端において、絞り管に向
かって該絞り管の側面上にテーパーしている請求項１９
記載の装置。 - 【請求項２１】加圧室をその縦軸の廻りにある限定され
た範囲で回転できるようになっている請求項１９記載の
装置。 - 【請求項２２】少なくとも部分的に真空にできる標本室
であって、その中に細胞支持台が位置し、そして吸引源
の接続管を備え、該標本室中に開口している絞り管を持
つ標本室を更に包含する請求項２１記載の装置。 - 【請求項２３】細胞支持台が、加圧室の縦軸に対して少
なくとも横方向に移動できるように標本室内に位置付け
られている請求項２２記載の装置。 - 【請求項２４】標本室が更に可動部分を有し、且つ標本
室の該可動部分内で細胞支持台を空間的に移動するため
に、その調整手段と一緒に細胞支持台を位置付けてある
請求項２３記載の装置。 - 【請求項２５】チェックバルブがカニュールにまたはそ
れに至る供給管に設置してある請求項２４記載の装置。 - 【請求項２６】圧衝撃を発生するための装置が圧縮空気
または圧縮気体により作動する装置のようなものである
銃である請求項２５記載の装置。 - 【請求項２７】絞り管がダイアフラムまたは毛細管であ
る請求項２５記載の装置。 - 【請求項２８】ダイアフラムの自由直径が約２０−３０
０μｍである請求項２７記載の装置。 - 【請求項２９】毛細管の内径が約１０−５００μｍであ
り、毛細管の長さが約１−２０ｍｍである請求項２７記
載の装置。 - 【請求項３０】絞り管からカニュールの開口部に至る距
離が約５−２０ｍｍである請求項２５記載の装置。 - 【請求項３１】該細胞が高級組織化植物単位の構成要素
として存在する請求項１記載の工程。 - 【請求項３２】該単位が少数の細胞の組織結合、特に分
裂組織結合である請求項３１記載の工程。 - 【請求項３３】ＤＮＡを伴う粒子が植物細胞の形質転換
に使用される請求項１６記載の装置。 - 【請求項３４】微投射物をＤＮＡ溶液にけん濁し；圧衝
撃の結果として微投射物を溶液を伴う霧に微小に霧化し
て、形質転換されるべき細胞の方向に、該溶液から圧衝
撃により該微投射物を加速し；そして、 ＤＮＡを伴う微投射物のパルスで細胞を衝撃して、形質
転換されるべき細胞を微投射物が貫通する；ことにより
形質転換された、単離されたまたは高級組織化単位とし
ての、トランスジェニック植物細胞。 - 【請求項３５】請求項３４記載の植物細胞から再生した
トランスジェニック植物。 - 【請求項３６】該細胞が細菌細胞である請求項１記載の
工程。 - 【請求項３７】ＤＮＡ溶液に微投射物をけん濁し；圧衝
撃の結果として微投射物を溶液を伴う霧に微小に霧化し
て、形質転換されるべき細胞の方向に、該溶液から圧衝
撃により該微投射物を加速し；そして、 ＤＮＡを伴う微投射物のパルスで細胞を衝撃して、微投
射物が、ＤＮＡ分子が細胞に入ることができるのに充分
な程度に、形質転換されるべき細胞の細胞壁または細胞
膜中に可逆的な開口部を生起させることにより、形質転
換された細菌細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH4562/89-9 | 1989-12-19 | ||
| CH456289 | 1989-12-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0568575A true JPH0568575A (ja) | 1993-03-23 |
Family
ID=4278390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2412223A Pending JPH0568575A (ja) | 1989-12-19 | 1990-12-19 | 細胞の遺伝子的形質転換のための工程と装置 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5976880A (ja) |
| EP (1) | EP0434616B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0568575A (ja) |
| AT (1) | ATE130371T1 (ja) |
| AU (1) | AU636422B2 (ja) |
| CA (1) | CA2032443A1 (ja) |
| DE (1) | DE59009881D1 (ja) |
| ES (1) | ES2079467T3 (ja) |
| HU (1) | HUT56141A (ja) |
| IE (1) | IE904582A1 (ja) |
| IL (1) | IL96689A0 (ja) |
| NZ (1) | NZ236486A (ja) |
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