JPH0569509B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

殿粉の液化中のうすめ液（thinning agent）と
して熱安定性α−アミラーゼの使用は砂糖甘味料
の製造において極めて重要である。殿粉物質の酵
素的液化は望ましくない副生成物の生成を減じ、
そしてまた塩の低レベルの使用を可能にし、この
ことは、最終グルコースシロツプ中の塩の高レベ
ルにはイオン交換樹脂によるその除去に対する追
加の製造コストが含まれるために望ましい。昇温
下で殿粉を液化するためのα−アミラーゼの如き
酵素の有用性は、熱にさらすとその非可逆的変性
を起こすために、主に酵素の熱安定性に依存す
る。この変性は生物触媒活性の安全な損失をもた
らす。好熱性微生物から得られる熱安定性α−ア
ミラーゼが殿粉を含む物質を殿粉水解物に加水分
解、液化及び／または転化するために用いられて
いた。例えば米国特許第3654081号及び同第
3912590号にはバチルス・リケニホルミス
（Bacillus licheniformis）種のバクテリアによつ
て産生された熱安定性α−アミラーゼを用いて高
温での殿粉の液化が記載されている。 多くの市販のα−アミラーゼ製品はバクテリア
源、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）、バチル
ス・リケニホルミス、バチルス・ステアロセルモ
フイルス（B.stearothermophilus）、バチルス・
コアギユランス（B.coagulans）から得られる。
菌・カビ類（fungal）のα−アミラーゼは、この
ものが一般に熱安定性酵素とみなされないため
に、高温での殿粉の液化において極めて限定され
た適用範囲しか有していない。 殿粉の酵素的液化は通常殿粉の酵素加水分解へ
の容易さを増すために昇温下で行われる。上記の
生物触媒活性の損失は液化工程に好ましい昇温下
で熱安定性α−アミラーゼを用いても起こり得
る。従つて、その熱安定性を増加させるために、
酵素に安定剤を加える。かくして、ウオーラーシ
ユタイン（Wallerstein）による米国特許第
905029号において、酵素法による殿粉の高温糖化
は殿粉を含む媒質に硫酸カルシウムの添加によつ
て高められることが開示されている。α−アミラ
ーゼを熱安定性にするためにカルシウムイオンの
使用が当該分野において一般に認められている
が、しかし、殿粉に塩を添加することに関連した
上記の問題の如き或る欠点を有する。 極く最近、米国特許第3654081号において、好
ましくは或るα−アミラーゼを含む水性殿粉スラ
リーにカルシウム及び／またはナトリウム塩を添
加することにより、殿粉を容易に且つ完全に液化
し得ることが開示されている。 米国特許第3912590号において、水性殿粉懸濁
液をバチルス・リケニホルミス種から得られたα
−アミラーゼによつて昇温下で処理することから
なる殿粉の組合わせた液化及びうすめに対する方
法が開示されている。 米国特許第4284722号はバチルス・ステアロセ
ルモフイルス種の細菌に由来する熱及び酸安定性
α−アミラーゼを特許請求している。 ペイス（Pace）等はジヤーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（Journal of Bio−
logical Chemistry）において、リゾチームの熱
及びグアニジン塩酸塩変性を、天然のリゾチーム
の活性部位に特異的に結合するトリ−Ｎ−アセチ
ルグルコースアミンの種々な濃度で研究し、そし
てその存在が熱及びグアニジン塩酸塩変性に対し
て蛋白質の容易に認め得る安定性をもたらすこと
を報告している。 塩素イオンをα−アミラーゼの水溶液に加え、
これにより或る程度熱安定性を与えることが見出
されたが、かかる添加の主な目的はPH値の調節で
ある。 米国特許第4497867号において、カルシウムイ
オン並びにホルメート、アセテート、プロピオネ
ート及びその混合物からなる群より選ばれる水溶
液カルボキシレートを酵素の溶液に添加すること
からなるサブテイリジン・カールスベルグ
（Subtilisin Carlsberg）によるプロテアーゼの保
存中の貯蔵寿命を増す方法が開示されている。 米国特許第4318818号には、 (a) 洗浄表面活性剤０〜約75％； (b) 純粋な酵素、好ましくは蛋白質分解性酵素約
0.025〜約10％； (c) 低分子量の第一または第二アルコール０％〜
約60％； (d) 短鎖長のカルボン酸塩、好ましくはギ酸塩約
0.1％〜約10％； (e) カルシウムイオン0.1〜10ｍＭ／にするた
めに十分な量の可溶性カルシウム塩；及び (f) 残りは水 からなる安定化された水性酵素組成物を開示して
いる。 典型的な市販用の操作においては、殿粉を熱安
定性α−アミラーゼを用いて、80℃〜約110℃の
温度範囲及びPH値６以上で液化する。一般に、昇
温下で酵素を更に安定化するために、カルシウム
塩（50−150ppmCa⁺⁺）を加える。殿粉の酵素的
液化に対するこれらの条件には３つの欠点があ
る。第一に、PH値6.0以上及び80℃またはこれ以
上の温度で殿粉の加水分解は続いての転化工程の
際にマルトースの生成において生ずる殿粉の還元
基の異性化を促進し、最終グルコース収率の減少
を引き起こす。第二に、続いての果糖への転化に
対してグルコースを生成させるための液化した殿
粉の糖化に用いる最適PH値は一般にアスペルギル
ス属（Aspesgillus）タイプのグルコアミラーゼ
に対しては約4.5、そしてクモノスカビ属
（Rhizopus）タイプの酵素に対しては約5.0であ
る。かくして、殿粉をPH値6.0またはこれ以上で
液化する場合、グルコアミラーゼを用いて糖化を
行う前にPH値を降下させなければならない。この
PH値調節は酸の添加のために、生ずるグルコース
シロツプの塩含有量を増加させ、従つて過剰量の
塩を除去するために必要なイオン交換樹脂に対す
る経費を増加させる。PH値6.0またはこれ以下で
行う液化に対しては、更にカルシウムイオン（約
500ppmまで）を加えなければならない。このこ
とは、グルコースイソメラーゼを用いつ高果糖ト
ウモロコシシロツプの製造に使用する場合、殿粉
の糖化によつて生成したグルコースシロツプから
加えたカルシウムイオンの完全な除去を困難にす
る。 水溶液中のα−アミラーゼの熱安定性を増す新
規な方法を提供することが望ましく、そして該方
法を提供することが本発明の一目的である。更に
本発明の目的はこの方法によつて製造した安定化
されたα−アミラーゼ組成物を提供することであ
る。 更に本発明の目的は、カルシウムイオンを加え
る必要がなく、そしてカルシウムの低レベル（25
〜50ppm）で殿粉を液化するために使用し得るか
かる組成物を提供することである。 他の目的はPH値5.0程度の低さで殿粉の高温液
化に使用し得るかかる組成物を提供することであ
る。 本発明はバクテリア性α−アミラーゼの熱安定
性を増す方法である。本方法にはα−アミラーゼ
の水溶液の安定化量の両親媒性物質（amphiphi
−le）を加えることからなる。また本発明にはこ
の方法によつて安定化されたα−アミラーゼ溶液
及び殿粉の液化におけるその用途が含まれる。 本発明において有用なα−アミラーゼは、細胞
外酵素を発生させるために適当な微生物を栄養増
殖媒質中で培養することによつて製造される。両
親媒性物質安定化剤をバイオマス（biomass）の
除去または酵素溶液の濃縮前または後に加えるこ
とができる。しかしながら、典型的な実験におい
ては、微生物細胞を普通の方法、例えば遠心分離
によつて、デカンテーシヨン及び／または過に
よつてα−アミラーゼを含む媒質から除去する。
次に液を、所望の活性レベルを有する酵素の水
溶液を得るために、限外過及び真空蒸発を用い
て濃縮する。この溶液が好ましくは本発明の方法
によつて安定化された溶液である。 α−アミラーゼ溶液の熱安定性の増加はこの溶
液に両親媒性物質の安定化する量を添加すること
によつて達成される。両親媒性物質なる用語は有
極性（水溶性）のヘツド（head）及び非有極性
（非水溶性）のテイル（tail）を有する分子また
はイオンを意味する。加えて、両親媒性物質はそ
れ自体溶解反応を示すために各末端に対して十分
に大きくなければならない。両親媒性物質の一般
的構造式を次に示す：

【化】 式中、Ｘは有極性またはイオン性基、例えば
COO^-、NH₄ ⁺、OH、SO₄＝、SO₃＝または
CONH₂を表わし、そしてＲは非有極性部分であ
る。かくして、異なる群の両親媒性物質がα−ア
ミラーゼの熱安定性に寄与する際に有用であるも
のとして考えられる。有用な両親媒性物質の例は
アルコール類、例えばエチルアルコール、プロピ
ルアルコール、ブチルアルコール、ベンジルアル
コール；アミン類、例えばベンジルアミン、ブチ
ルアミン、エチルアミン、ヘキシルアミン；及び
アミド類、例えばブチルアミド、アセトアミド、
フエニルアセトアミド、ベンズアミドである。い
かに本発明を操作するかの特定の理論を見出す意
図はないが、静電気的及び疎水性相互反応のため
に、両親媒性物質がα−アミラーゼの熱安定性に
寄与するものと思われる。好ましい具体例におい
ては、両親媒体性物質のイオン性基はイオン性部
分が式 Ｒ−COO^- 式中、ＲはＨまたは炭素原子２〜14個を含む脂
肪族もしくは芳香族基である、 によつて表わされるカルボキシレートである。更
に詳細には、Ｒはメチル、エチル、ｎ−もしくは
イソプロピル、ｎ−もしくはイソブチル、フエニ
ルまたは置換されたフエニルであることができ
る。カルボキシレートを含む両親媒性物質を対応
するカルボン酸の形態でα−アミラーゼの水溶液
に導入することができるが、しかし、酸塩と溶解
性を増加させるために、対応するカルボン酸の
塩、例えばナトリウムまたはカルシウム塩を用い
ることが好ましい。 典型的にはそのナトリウム塩型におけるカルボ
キシレートイオンをα−アミラーゼの水溶液に安
定化量、即ち、顕著な程度に熱不活性化に対して
酵素の耐性を増加させる量として加える。市販の
α−アミラーゼ調製物の分析により、該調製物は
実施例１に示した如く測定したMWUで表現して
酵素活性の100万単位当りアセテートイオン0.02
ｇまでを含有し得ることが示された。多分、アセ
テートイオンの存在はPH値調節のための酢酸の添
加による結果であり、この低濃度における存在は
α−アミラーゼに意味のある熱安定性を与えるた
めには不十分である。典型的には、アセテートの
濃度は、計算目的のためのα−アミラーゼに対し
て58000ダルトンの分子量を用いて、α−アミラ
ーゼ１モル当りアセテート少なくとも約2.89×
10³モルであるべきである、この値は酵素活性100
万単位当りアセテート0.24ｇに対応する。酵素の
有効な安定化に必要な他の両親媒性物質の最小レ
ベルは用いる特定の物質に応じて変わるであろう
が、しかし、実験せずに容易に決定することがで
きる。 安定化剤としてアセテートを用いる場合、安定
化されたα−アミラーゼ調整物の製造はアセテー
トイオンのナトリウム塩をα−アミラーゼの水性
濃厚液に、170000−180000MWU／mlを活性を有
する酵素濃厚液100mlに対して酢酸ナトリウム10
ｇの最終濃度になるように加えることによつて典
型的に行われる。他の具体例においては、両親媒
性物質対α−アミラーゼの当量比を与えるために
十分な量において、α−アミラーゼの添加前また
は後に、両親媒性物質を殿粉に加える。 本発明を実行する方法を以下の実施例によつて
更に説明する。 実施例 １ α−アミラーゼの試料を適当な栄養増殖媒質中
でバチルス・リケニホルミスの突然変異種（ブダ
ペスト条約に基きATCC53376として寄記されて
いる）を培養することによつて調整した。発酵
後、微生物細胞を普通の方法によつて、溶液中で
細胞外酵素を残して除去した。次に溶液を含む酵
素を限外過及び真空蒸発を用いて、340000−
360000MWU／ｇ〔モデイフアイド・ウオルゲム
ート単位（Modified Wohlgemuth Unit）／ｇ〕
の所望の活性レベルに濃縮した。 α−アミラーゼ活性を、殿粉−ヨウ素錯体の青
色相当還元を用いて得、可溶性殿粉の加水分解を
決定することによつて測定した。典型的な実験に
おいては、PH値5.4に緩衝した２％可溶性殿粉５
ml及び水４mlを適当に希釈した酵素14mlと共に、
40℃に保持された水浴中で培養した。時間を定め
た間隔で（酵素の添加から５〜30分間）、被検体
１mlを取り出し、希釈ヨウ素溶液５mlを含む管に
注入し、転倒によつて混合した。次に発色した色
をヘリツジ（Hellige）社製、ヘリツジNo.600−
DA昼光比色照明器で比較し、反応終点の接近及
びモデフアイド・ウオルゲムート単位として監視
した酵素活性を監視した。１モデイフアイド・ウ
オルゲムート単位（MWU）は次の式を用いて、
分析条件下で30分以内に可溶性殿粉１mlを定めら
れた青色値に糊精化する活性である： MWU／ｇ＝100×30／Ｔ×Ｗ 式中、 100＝各培養混合中の殿粉のmg数 30＝定義された糊精化時間、分 Ｔ＝終点に到達するために必要な時間、分 Ｗ＝希釈酵素被検体１mlの培養混合物に加えた酵
素の重量、ｇ 酢酸ナトリウム（CH₃COONa）を、溶液のPH
値を5.8に保持しながら、適当に希釈した
（340000MWU／ml）…1700MWU／mlまたは蛋
白質0.2mg／ml）酵素溶液に種々な量で加えた。
各溶液の酵素活性をすでに述べた如くして測定し
た。次に酵素溶液を90℃に10分間加熱した。加熱
後、酢酸ナトリウムの添加がα−アミラーゼの熱
安定性にいかなる効果があつたかを調べるため
に、活性を再び測定した。酢酸ナトリウムの種々
なレベルに対するこの実験結果を第１表に示し
た。

【表】 第１表から、酢酸ナトリウム型としてアセテー
トイオンの添加はα−アミラーゼの熱安定性を高
めることを決定することができる。更に、認めら
れた安定化は酵素活性100万単位当り酢酸Na最大
2.35ｇまでのアセテート濃度増加によつて増加
し、この濃度レベルで、熱安定性は再び降下し
た。 実施例 ２ モノカルボン酸のナトリウム塩、例えばギ酸ナ
トリウム（HCOONa）、酢酸ナトリウム
（CH₃COONa）、プロピオン酸ナトリウム
（CH₃CH₂COONa）及び酪酸ナトリウム
（CH₃CH₂CH₂COONa）を蛋白質40mg／mlを含む
酵素溶液（α−アミラーゼ活性340000MWU／
ml）最終濃度1.22Mまで加えた。 適当な希釈後（１×100）、酵素溶液、PH値5.8、
を95℃に加熱し、酵素の熱安定性を加熱後に種々
な間隔で、希釈した酵素の残存活性を決定するこ
とによつて測定した。50％不活性化を起こすため
に必要な時間（半減期ｔ1/2）を培養時間に対す
る百分率残存活性の対数プロツトから計算した。
この計算結果を第１図に示した。第１図から、α
−アミラーゼの熱安定化において、脂肪族鎖長の
増加による効果を知ることができる。脂肪族鎖長
の増加は、95℃、PH値5.8での水溶液中の酵素の
熱安定性の増大において比例的増加をもたらし
た。酵素の熱安定化は次の順序に従つた： ホルメート＜アセテート＜プロピオネート＜ブ
チレート。 95℃、PH値5.8でホルメート処理した酵素の半
減期は、同一条件下での対照の1.8分と比較して、
6.3分であつた。しかしながら、ホルメートにお
ける水素に対して非有極性メチル基の導入によ
り、酵素の熱安定性に顕著な増加を起こした（半
減期＝10.5分）。更にアルキル鎖の長さの増加は
試験条件下で酵素の半減期において最少増加のみ
をもたらした（1.4分／CH₂基）。かくして、非有
極性脂肪族鎖（テイル）及び有極性カルボキシレ
ート基（ヘツド）を含む化合物は高温での変性か
ら酵素を保護することを知ることができた。 実施例 ３ 本実験においては、また非有極性芳香族基を含
む有機酸を試験した。安息香酸ナトリウム
（C₆H₅COONa）、フエニル酢酸ナトリウム
（C₆H₅CH₂COONa）、フエニルプロピオン酸ナト
リウム（C₆H₅CH₂CH₂COONa）及びジフエニル
酢酸ナトリウム（C₁₂H₁₀CHOONa）を酵素溶液
（蛋白質40mg／ml、α−アミラーゼ活性、
340000MWU／ml）に最終濃度1.22Mまで加え
た。またこれらの芳香族酸は95℃、PH値5.8でα
−アミラーゼの熱安定性に著しい増加をもたらし
た。この実験結果を第２表に要約した；この表か
ら、安息香酸は試験した芳香族カルボン酸の中で
安定化に対して最小値を示し、一方ジフエニル酢
酸アニオンは最大値を示すことがわかつた。

【表】 実施例 ４ 酢酸ナトリウムを蛋白質40mg／mlを含むα−ア
ミラーゼ濃厚液（α−アミラーゼ活性、
340000MWU／ml）に最終濃度1.22M（10％ｗ／
ｖ）まで加えた。次に水酸化ナトリウムを用い
て、酵素水溶液のPH値を5.0、5.6、6.0、7.0、8.0
及び9.0に調節した。30分後、酵素を更に希釈し
（１×100倍）、種々な時間間隔で95℃に加熱し、
残存酵素活性を測定した。PH値5.0及び5.5で、熱
安定性を85℃にて測定した。比較するために、酢
酸ナトリウムの不存在下における酵素の熱安定化
に関するPH値の影響を測定した。実験結果を第３
表に示した。

【表】 上記の結果からわかるすぐれた特色は次のこと
を示す： (1) カルボン酸基及び脂肪族または芳香族の非有
極性残存基を含む両親媒性物質によるα−アミ
ラーゼの処理は酵素の熱安定性において著しい
増加をもたらし； (2) 非有極性基の鎖長の増加は熱安定性を増加さ
せ； (3) 芳香族残基は脂肪族残基よりもより大きな効
果を有する。 本発明の特許権請求の可能性は特定の構造に基
づくものではないが、認められる安定化効果に必
要な本質的な構造は、酵素の有極性官能基によつ
て不活性化する有極性ヘツド及び非有機極性炭化
水素テイル（脂肪族または芳香族）からなること
によつて示された実験的証拠から明白である。ま
た炭化水素テイルは周りの水分子から酵素分子の
或る範囲を保護する場合もあり得る。これは酵素
分子に熱変性に対する構造的耐性のために必要な
堅さを与える。ホルメートイオン（HCOO^-）は
酢酸、プロピオン酸または酪酸によつて与えられ
るアニオンよりもかなり効果が少ないことが認め
られた。ホルメートアニオンにおける水素とバル
ク（bulk）中の水との相互作用は酵素及びアニ
オン間の相互作用を弱める傾向にあり、一方、ア
セテートにおけるメチル基は、熱安定化エネルキ
ーにおける著しい増加を示して、蛋白質の隣接疎
水性側鎖と相互作用し得る。試験した芳香族アニ
オンの中で安息香酸が最も有効性に乏しい。カル
ボキシル基及びベンゼン環間の結合の二重結合の
性質が、酵素分子の有極性残基との相互作用に対
して、カルボキシレートイオンの適応性を限定し
得ることが可能である。加えたカルボン酸塩によ
るα−アミラーゼの熱安定性を増加させるための
追加の安定化自由エネルギーを計算し、第４表に
示した。

【表】 ａ＝加えた配位子による相対安定化 ｂ＝安定化自由エネルギーは−Ｒ Ｔ In Ｆで
示され、ここに Ｔ＝368K Ｆ＝相対安定因子 Ｒ＝気体定数、1.987カロリー／モル／度ｔ 1/2°＝配位子の不存在下における半減期 第４表により、α−アミラーゼにカルボン酸塩
の添加はこの酵素の半減期を増加させるものと決
定づけることができる。加えた加工物の存在下に
おけるｔ1/2対その不存在下における（ｔ1/2°）
比として示される相対安定化因子はカルボン酸の
鎖長増加に伴なつて増加する。この相対安定化因
子は△G°＝−RT In Ｆの関係を用いて、追加の
安定化自由エネルギーに変えることができる：こ
こに、Ｔは酵素を加熱する温度（°Ｋ）であり、
Ｒは気体定数であり、そしてＦは相対安定化因子
である。ホルメートは0.9KCal／molの安定化自
由エネルギーを与える。これは酵素の正に帯電し
た基との静電的相互作用を介して主に生ずるもの
と考えられ、その効果は主にエントロピーであ
り、帯電した基による水分子の相互作用の解放に
起因する。ブチル基（ブチレートにおける）に起
因する約0.6KCal／molによる追加の安定化は強
化された疎水性相互作用から生じ、これはまた主
として自由エネルギーに対するエントロピー寄与
を有する。鎖長の影響が増加し、芳香族環は、こ
れらが最適相互作用部位に対して相互作用す分子
を向け得る意味で、相互作用における非常に静か
な反応相手である。いずれの場合においても、相
互作用は（弱いが）静電的及び疎水性成分によつ
て特異的であると思われる。個々の相互作用によ
つて与え得るよりも大きな安定化を与え得ること
は協同相互作用である。高温で長期間不活性を保
持するため、或いは高温露出に耐えるために、間
隔領域において、必ずしも活性部位に限らず、酵
素配座の強制を助ける全ての同様な領域におい
て、有効な分子が酵素と相互作用することが示さ
れた。表面の相互作用は決定されないが、ペンダ
ント非極性基の強化作用は相互作用の内部移行を
示す。 実施例 ５ 本発明の方法によつて安定化されたα−アミラ
ーゼは、マルトーデキストリンの製造及びグルコ
アミラーゼを用いる続いてのグルコースの製造に
おいて、殿粉の液化及び転化に対して殊に適して
いる。本実施例においては、米国特許第3654081
号に記載された熱安定性α−アミラーゼを用い
て、殿粉を液化するために高温ジエツト・クツキ
ング法（jet cooking process）を用いた。典型
的な実験においては、トウモロコシ殿粉60ポンド
を水33に懸濁させ、35〜37％DSBの殿粉濃度
にし、酢酸を用いてPH値を5.0に調節した。
170000MWU／ml〔タカーサーム（Taka−
Therm）Ｌ−170〕活性を有する酢酸ナトリウム
10％で調製物化したタカーサーム （Taka−
Therm ）熱安定性α−アミラーゼを0.05％乾燥
固体基準（DSB）で加えた。次に殿粉スラリー
をパイロツト・プラント・スチーム・ジエツト・
クツカー（pilot plant steam jet cooker）中に
て140℃で15秒間ゼラチン化した。ゼラチン化し
た殿粉を95℃に保持された温度調節した容器中に
直接吹き込んだ。殿粉100ｇ当り20400MWUの総
濃度にするために0.10％DSBタカーサームＬ−
170000（10％酢酸ナトリウムで調製物化したもの）
を添加した後、液化を20分間続行し、次に85℃に
冷却した。次に殿粉を平均120分間85℃に保持し
た。液化期間中、標準滴定法を用いてデキストロ
ース当量（DE）を追跡した。 上記の実験をタカーサームＬ−170を用いて、
加えたカルシウム150ppmの存在下においてPH値
6.5で、そしてPH値5.0でカルシウム500ppmの存
在下においてくり返し行つた。いずれの場合にも
殿粉の逆変化は認められなかつた。その結果を次
の第５表に示した；表中「スピン残渣」なる用語
は遠心分離後に回収した未加水分解殿粉を示す。

【表】 残渣％
残渣％ 残渣％ 渣％

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ α−アミラーゼの水溶液に両親媒性物質を添
   加することからなるバクテリア性α−アミラーゼ
   の熱安定性を増大させる方法において、両親媒性
   物質が式 Ｒ−COO^- 式中、Ｒは炭素原子１〜14個を含む脂肪族また
   は芳香族基である、 で示され且つ計算上α−アミラーゼの分子量が
   58000ダントンであるとしてα−アミラーゼ１モ
   ル当りカルボキシレートが少なくとも2.89モルの
   濃度で存在し、そして水溶液が約50ppmより多い
   カルシウムイオンを含まず且つ炭素原子を１〜６
   個もつアルカノールを含まないことを特徴とする
   バクテリア性α−アミラーゼの熱安定性の増大方
   法。 ２ α−アミラーゼを枯草菌（Bacillus
   subtilis）、バチルス・リケニホルミス（B.
   licheniformis）、バチルス・ステアロセルモフイ
   ルス（B.stearothermophilus）またはバチルス・
   コアギユランス（B.coagulans）種の微生物から
   誘導する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 微生物がバチルス・リケニホルミス種である
   特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ Ｒがメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプ
   ロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、フエニルまた
   は置換されたフエニルである特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ５ カルボキシレート含有両親媒性物質をそのア
   ルカリ金属塩の型でα−アミラーゼの水溶液に加
   える特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ アルカリ金属がナトリウムである特許請求の
   範囲第５項記載の方法。 ７ 両親媒性物質がアセテートであり、該アセテ
   ートをα−アミラーゼ水溶液に、改変したウオル
   ゲムート単位で表わした酵素活性の100万単位当
   り少なくとも0.24ｇのアセテートイオン濃度にな
   るまで加える特許請求の範囲第１項記載の方法。