JPH0570440B2 - - Google Patents
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-
- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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-
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Description
技術分野
本発明は液状検体中の酵素活性を検出するため
の粒子凝集に基づく診断方法に関する。 背景技術 酵素をその基質と反応させると生成物を生ずる
ことは知らている。酵素は基質との反応で消費さ
れずに生成物を更に繰返し自由に生成するので真
の触媒である。生成物の生成速度はターンオーバ
ー数（turnover number）と呼ばれ、酵素ごとに
異なつた数値である。実際には、酵素活性は酵素
ターンオーバーの結果として変化する基質または
生成物の分光光度測定法による吸光度をモニター
することにより極めて都合よく検出される。一部
の天然に存在する基質および／またはそれらの相
対応する生成物は容易に利用しうる吸光度ピーク
をもたないため酵素活性の分光光度法検出が困難
となることが知られている。場合によつては酵素
活性検出のために合成基質を設計することができ
る。 合成基質は発色性または発螢光性となるよう、
酵素により触媒された場合に光学的に検出可能な
基質および／または生成物の変化が生じるように
設計することができる。酵素活性検出目的に合成
基質を用いる際の最も顕著な制約はかかる基質を
所望の酵素に対し必ずしも製造し得ない点であ
る。有用な合成基質を適正に設計するには各々特
定の酵素の触媒的諸性質を詳細に知る必要があ
る。例えば、トロンビンまたは困子Xaに対する
合成発色性基質がトロンビンまたは因子Xa活性
の検出用に設計されている。これらの合成基質
は、これら酵素の発色に基づく検定法において天
然基質のフイブリノーゲンに置き代わるものであ
る。 被分析物（analyte）を検出するためのイムノ
アツセイは知られている。いわゆる不均質
（heterogenous）イムノアツセイは当該被分析物
と実質的に同じ抗体に対する免疫学的性質を有す
る標識抗原の存在下に抗体を被分析物とインキユ
ベートすることを伴うことがある。抗体に結合す
るかあるいは溶液中に遊離している標識抗原の量
を、適当な分離手順を踏んだ後に、被分析物の存
在量の尺度として測定する。このような検定法
は、最初にR.S.YalowおよびS.A.Bersonにより
1959年（「Nature」184：1648）に報告された。
ラジオイムノアツセイ（放射免疫測定法）と呼ば
れるこの検定法は標識として放射性核種を利用し
た。貯蔵上、取扱い上そして安全上自明な問題の
ある放射性核種に代わつて標識として酵素を用い
たことがvan WeemenおよびSchuursにより報告
された（「FEBS Letters」、15巻、232（1971）お
よび米国特許第3791932号明細書参照〕。この技術
にはvam WeemenおよびSchuusの基本テーマに
基づく多くのバリエーシヨンがみられる。 多エピトープ性抗原物質が多エピトープ受容体
を有する粒子を凝集して凝集体を生成しうること
は知らている（たとえばそれぞれインフルエンザ
ウイルスおよびヒツジ赤血球）。これらの凝集体
は光散乱型測定器を用いて検出できる。液状検体
中の抗原およびハプテンを検出するための凝集阻
害検定法が知られている。典型的には、抗原また
はハプテンで被覆された高屈折性粒子と多価抗体
の結合が検体中の抗原またはハプテンにより拮抗
的に阻害される（米国特許第4401765号明細書参
照）。これらの検定法の感度は一般に10-7〜
10-9Mの濃度範囲の抗原およびハプテンに限られ
る。 酵素を標識として用いるイムノアセイでなおも
問題なのは、10-10M以下の濃度の被分析物は比
較的短時間、典型的には30分以下、好ましくは10
分以下で検出できない点である。高ターンオーバ
ー数の酵素が信号発生を最大にするために標識と
して用いられている。かかる酵素にはβ−ガラク
トシターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アル
カリ性ホスフアターゼ、グルコースオキシダー
ゼ、β−ラクタマーゼおよびウレアーゼが含まれ
る。発色性基質をこれら酵素を用いれば感度を約
10-10Mとすることができる。発螢光性基質を用
いれば一段と大きな感度が得られよう。しかしな
がら、すべての生物学的検体は発螢光性基質測定
を干渉しうる螢光物質、例えばポルフイリンを含
有する。この欠点は、付加的な検体処理、詳細に
は、結合物を酵素標識コンプレツクスから分離す
ることにより克服できる。干渉性の螢光物質はこ
の分離の際に除去されうるが、結合酵素標識コン
プレツクスのみの測定しか行えないという制約が
ある。 酵素使用高感度イムノアツセイは、高ターンオ
ーバ数の酵素および合成基質を用いたとしても至
適感度を得るのには、検出可能なレベルの酵素的
に生成する発色団または螢光発生団の発生に望ま
しくない時間、すなわち大ざつぱにいつて30〜90
分が必要とされる。 当技術分野では検体中の低レベルの酵素活性を
短時間、典型的には10分以下で検出する方法が常
に要請されている。天然または合成基質のいずれ
からも容易に測定しうる生成物が生じない場合の
酵素活性を測定する方法に対しても要請がある。 発明の開示 前述の要請は本発明によつて満たされる。すな
わち、本発明は第１の観点においては、 (1) (i) リガンドを表面に付着した高屈折性粒
子、 (ii) そのリガンドに対し特異的で少くとも２つ
のリガンドに結合しうる結合パートナー（該
結合パートナーと粒子が結合したリガンドと
は凝集を可能にする濃度で存在させる）、お
よび (iii) 酵素の基質（酵素、基質、リガンドおよび
結合パートナーは、酵素と基質いとの反応に
より結合パートナーに対してリガンドと拮抗
する生成物が生成するようなものとする） よりなる凝集系を形成し、 (2) 前記凝集系を検体と接触させて結合パートナ
ーに対しリガンドと拮抗する生成物を生成さ
せ、 (3) 前記凝集系の物性（その物性は凝集の関数で
ある）を測定し、そして (4) 測定値を検体中に最初に存在していた酵素量
に関連づけること よりなる液状検体中の酵素を検出するための凝集
に基づく方法である。 第２の観点では、本発明は、 (1) 酵素と被分析物に結合しうる第１結合パート
ナーとよりなる接合体（conjugate）に検体を
接触させ、それによつて一部の接合体は被分析
物に結合させて複合体を形成させそして残余の
接合体を被分析物と結合していない遊離接合体
とし、 (2) その遊離接合体を複合体から分離し、 (3) 遊離接合体または複合体のいずれかを、 (i) リガンドを表面に付着した高屈折性粒子、 (ii) そのリガンドに対し特異的で少くとも２つ
のリガンドに結合しうる第２結合パートナー
（該第２結合パートナーとリガンドとは凝集
を可能にする濃度が存在せしめる）、および (iii) 酵素の基質（酵素、基質、リガンドおよび
第２結合パートナーは、酵素と基質との反応
により第２結合パートナーに対してリガンド
と拮抗する生成物が生成するようなものとす
る） よりなる凝集系を接触させ (4) 凝集系の物性（その物性は凝集の関数であ
る）を測定し、そして (5) 測定値を液状検体中に最初に存在していた被
分析物量に関連づける ことよりなる、液状検体中の被分析物を検出する
ための凝集に基づく測定方法である。 第３の観点おいて、本発明は (1) (i) 酵素と反応した際にリガンドに転化され
うる基質を表面に被覆せしめた高屈折性粒
子、および (ii) そのリガンドに対し特異的で少くとも２つ
のリガンドに結合しうるが基質には結合しえ
ない結合パートナーよりなる凝集系を形成
し、 (2) 該凝集系を検体と接触させて基質をリガンド
に転化し、 (3) 該凝集系の物性（それは凝集の関数である）
を測定し、そして (4) 測定値を検体中に最初に存在していた酵素量
に関連づける ことにより液状検体中の酵素を検出するための凝
集、に基づく方法である。 第４の観点において、本発明は (1) 酵素と被分析物に結合しうる第１結合パート
ナーとよりなる接合体に検体を接触させ、それ
によつて一部の接合体は被分析物に結合させて
複合体を形成させ、そして残余の接合体を被分
析物と結合していない遊離接合体とし、 (2) その遊離接合体を複合体から分離し、 (3) 遊離接合体または複合体のいずれかを、 (i) 酵素と反応した際にリガンドに転化されう
る基質を表面に被覆せしめた高屈折性粒子、
および (ii) そのリガンドに対し特異的で少くとも２つ
のリガンドに結合しうるが基質には結合しえ
ない結合パートナーよりなる凝集系と接触さ
せ、 (4) 凝集系の物性（それは凝集の関数である）を
測定し、そして (5) 測定値を検体中に最初に存在していた酵素量
に関連づける ことよりなる液状検体中の被分析物を検出するた
めの凝集に基づく方法である。 本発明の詳細な前述 阻害方式において、本発明は結合可能な物質、
すなわちリガンドを表面に有する高屈折性粒子よ
りなる凝集系を用いる。リガンドに対し特異反応
性を有する結合パートナーを高屈折性粒子と反応
させる。その結合パートナーは多価、すなわち、
少くとも２つのリガンドと結合することができ
る。結合パートナーは高屈折性粒子の実質的凝集
を与える濃度で用いられる。凝集が生じるのは多
価結合パートナーが架橋剤として働いて２つの粒
子を連結するからである。凝集系はまた検出すべ
き酵素の基質を含有する。基質、酵素およびリガ
ンドは作用トリオ（operational trio）を形成す
るように選択されなければならない。詳細には、
検出すべき酵素が与えられた場合、そのリガンド
は、酵素−基質反応の生成物と実質的に同じ結合
パートナーに対する性質を有するように選択しな
ければならない。この条件は、酵素−基質反応の
生成物が結合パートナーに対してリガンドと拮抗
し、それによつて凝集反応への参画に利用しうる
結合パートナー量が減少することを保証する。操
作にあたつては、検体を凝集系と接触させそして
その後の凝集阻害量を酵素不含対照例と比較して
測定する。一観点において、酵素は溶液中遊離状
態とすることができ、そして酵素量は直接凝集か
または凝集阻害のいずれかによつて測定できる。
あるいはまた、酵素は抗体分子、抗原またはハプ
テン分子，核酸プローブなどへの標識であつても
よく、その場合には、凝集阻害がそれが標識とし
て働く物質の直接の尺度となる。後者のケースの
一例として、被分析物含有検体を酵素と被分析物
と反応性の結合パートナーとの接合体と接触させ
る。この接合体は、検体と接触させる前に、酵素
とそれが標識として作用する物質とを共有結合さ
せることにより製造しておくことができる。この
接合体は、酵素を結合パートナーに対し直接にか
または適宜のスペーサ・アームを通して結合さ
せ、そして酵素活性、および結合パートナーのそ
の相当する被分析物を結合する能力を保存する既
知の方法により製造される。酵素を抗体に直接共
有結合させることが望ましくない場合には、アビ
ジン標識酵素とビオチン標識結合パートナーの特
異結合を含む他の手段により適宜の接合体を製造
することもできる。このアビジン／ビオチン標識
は、検体と接触させる前かあるいは検体と接触さ
せるのと同時に、標識酵素と被分析物結合パート
ナーとをインキユベートすることにより接合体の
形成、製造を可能にする。あるいはまた、酵素と
結合パートナーの接合体は、検体、標識結合パー
トナーおよび標識酵素を任意の所望の順序で順次
に添加することにより形成することができる。す
べての場合に、結合パートナーにより与えられる
結合部位総数は被分析物に対してモル過剰であ
る。接合体の一部は被分析物に結合し、そして残
りの部分は遊離したまま残る。結合または遊離接
合体のいずかを凝集系と接触させて凝集を阻害す
る。 直接凝集方式では、高屈折性粒子の表面には、
リガンドよりはむしろ酵素の基質が付着してい
る。それらの粒子を酵素と反応させると基質はリ
ガンドに転化される。次いで結合パートナーは別
体粒子を架橋して凝集を生ぜしめることができ
る。この場合にも、酵素は検体中遊離状態で存在
することができ、その場合には凝集現象はその酵
素の直接の測定尺度であり、あるいは酵素は抗
体、抗原またはハプテン、核酸プローブ等への標
識であつてもよく、その場合には凝集現象はそれ
が標識として作用する物質の間接的な測定尺度で
ある。 本発明の方法を用いて検出できる酵素にはβ−
ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスフアターゼ、
西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ラクタマーゼが含
まれるが、これらに限定されるものではない。 生物学的試料中の物質の間接的測定尺度として
用いられる場合、かかる試料としては例えば血
液、脳脊髄液、血清、血漿、痰、尿、臭洗浄液、
生殖器及び咽喉の綿棒試料、およびその他の生物
学的試料が挙げられる。 適切な高屈折性粒子は例えば、アガロース、ポ
リデキストラン、ポリアクリルアミドおよびポリ
マーラテツクスなどから製造できる。粒子の形状
は重要ではないが、球状粒子が最も製造しやす
く、凝集状態で最大の格子密度を与えるので好ま
しい。粒子の大きさはいく分重要である。球状粒
子の好ましい直径は、凝集阻害方式に対しては、
約30nm〜100nmである。最も好ましい粒子は米
国特許第4401765号明細書に記載されたものであ
る。上記米国特許の開示事項についてここで言及
してみる。これらの粒子は、好ましくは、ポリビ
ニールナフタレンおよびポリスチレンから製造さ
れた高屈折性球状ポリマー・コアを有する。該コ
ア表面には抗原ハプテン等が共有結合的に結合す
ることのできる反応性の殻が付着している。ポリ
マー粒子の粒径を調節するための都合のよい方法
は表面活性剤の使用量により粒径を調節できる種
（seed）乳濁液を調製する方法である。この種乳
濁液を調製後、付加的なモノマーおよび表面活性
剤を調節された速度で添加して種乳濁液中の粒子
のサイズを大きくすることができる。 ポリマー粒子の外殻ポリマーは、生物学的に興
味ある化合物と反応しうる官能基を有する広い範
囲のエチレン様不飽和モノマーから製造すること
ができる。所望により、外殻は他のエチレン様不
飽和モノマーを含むこともできる。殻ポリマーの
コアへの結合はコアポリマー中の残留エチレン様
不飽和基に官能性ポリマーをグラフト重合するこ
とにより行うことができるしまた、官能性モノマ
ーをコアの周囲で重合させて連続殻を形成するこ
とができる。好ましいモノマーとしては例えばエ
ポキシ基を含有するもの、例えばグリシジルメタ
クリレート、グリシジルアクリレート、ビニール
グリシジルエーテル、およびメタリルグリシジル
エーテルなどが挙げられる。他の官能性基として
例えばカルボキシル、ヒドロキシル、アミノおよ
びアルデヒドなどが挙げられる。 100nm以上、好ましくは1000nm〜100000nmの
範囲の直径を有する粒子を、前述の方法による肉
視凝集試験用に製造できる。これらの大型直径粒
子は、凝集状態の変化による凝集反応の際に易易
に見られる。直接凝集方式は、直接凝集の方が凝
集阻害よりも検出が容易なので、粒子凝集の肉視
検出に好ましい。 阻害方式では、適宜のリガンドを表面に付着し
た所望の組成を有する粒子を製造する。このリガ
ンドは物理的に吸着してもよいし、あるいは（直
接またはいわゆるスペーサ・アームを通して）共
有結合的に結合してもよい。誘導された表面への
化合物の共有結合による結合法は周知である
（Kiefer，「ImmunologicalMethods」、Lefkovits
＆Perris，eds.、ニユーヨーク：Academic
Press，1979，137参照）。直接凝集方式では粒子
は表面に基質を付着している。基質を共有結合的
に結合する方法はリガンドを結合する方法と類似
している。 本発明の凝集阻害方式を実行するには、酵素基
質反応が、結合パートナーに対しリガンドと拮抗
する生成物を生成しなければならない。更に、基
質は酵素によつて分解される前に結合パートナー
と実質的に反応性のあるものであつてはならな
い。例えばβ−ガラクトシダーゼの場合には、適
当な基質はｏ−ニトロフエニル−β−ガラクトピ
ラノシド（ONPG）であり、また適当な結合剤
は抗−ｏ−ニトロフエノールまたは抗−ニトロヒ
ドロキシ安息香酸（NHB）抗体である。β−ガ
ラクトシダーゼがｏ−ニトロフエニル−β−ガラ
クトピラノシドと反応すると、ｏ−ニトロフエニ
ル基とβ−ガラクトピラノシド部分との間の結合
が開裂され、遊離のｏ−ニトロフエノール分子が
生じる。前記抗体はｏ−ニトロフエノールには反
応性があるがｏ−ニトロフエニル−β−ガラクト
ピラノシドには反応性がない。ガラクトピラノシ
ド基は抗−ｏ−ニトロフエノール抗体とｏ−ニト
ロフエニル置換分（ONP）との結合を立体的に
妨害するものと思われる。しかしながら、基質の
酵素分解によつてその抗体と結合しうる生成物が
生成する。酵素、基質、リガンドおよび結合パー
トナーの間に必要な機能上の関係は、基質および
生成物によりえられる凝集速度の比較を示す第１
表のデータにより更に説明される。 データは、ONPGおよびONP同族体である３
−ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸（NHB）
の、抗−NHB抗体によるNHB被覆粒子凝集の
阻害能を比較することにより作成した。これらの
データは、ｏ−ニトロフエニルガラクトピラノシ
ドの濃度より約３桁程度も低いNHB濃度が等価
の阻害を生じることを示す。NHBは、β−ガラ
クトシダーゼによりONPGの加水分解によつて
生じた生成物に対する機能的等価物である。従つ
て基質の酵素分解がなければ、有意な凝集阻害は
ない。
の粒子凝集に基づく診断方法に関する。 背景技術 酵素をその基質と反応させると生成物を生ずる
ことは知らている。酵素は基質との反応で消費さ
れずに生成物を更に繰返し自由に生成するので真
の触媒である。生成物の生成速度はターンオーバ
ー数（turnover number）と呼ばれ、酵素ごとに
異なつた数値である。実際には、酵素活性は酵素
ターンオーバーの結果として変化する基質または
生成物の分光光度測定法による吸光度をモニター
することにより極めて都合よく検出される。一部
の天然に存在する基質および／またはそれらの相
対応する生成物は容易に利用しうる吸光度ピーク
をもたないため酵素活性の分光光度法検出が困難
となることが知られている。場合によつては酵素
活性検出のために合成基質を設計することができ
る。 合成基質は発色性または発螢光性となるよう、
酵素により触媒された場合に光学的に検出可能な
基質および／または生成物の変化が生じるように
設計することができる。酵素活性検出目的に合成
基質を用いる際の最も顕著な制約はかかる基質を
所望の酵素に対し必ずしも製造し得ない点であ
る。有用な合成基質を適正に設計するには各々特
定の酵素の触媒的諸性質を詳細に知る必要があ
る。例えば、トロンビンまたは困子Xaに対する
合成発色性基質がトロンビンまたは因子Xa活性
の検出用に設計されている。これらの合成基質
は、これら酵素の発色に基づく検定法において天
然基質のフイブリノーゲンに置き代わるものであ
る。 被分析物（analyte）を検出するためのイムノ
アツセイは知られている。いわゆる不均質
（heterogenous）イムノアツセイは当該被分析物
と実質的に同じ抗体に対する免疫学的性質を有す
る標識抗原の存在下に抗体を被分析物とインキユ
ベートすることを伴うことがある。抗体に結合す
るかあるいは溶液中に遊離している標識抗原の量
を、適当な分離手順を踏んだ後に、被分析物の存
在量の尺度として測定する。このような検定法
は、最初にR.S.YalowおよびS.A.Bersonにより
1959年（「Nature」184：1648）に報告された。
ラジオイムノアツセイ（放射免疫測定法）と呼ば
れるこの検定法は標識として放射性核種を利用し
た。貯蔵上、取扱い上そして安全上自明な問題の
ある放射性核種に代わつて標識として酵素を用い
たことがvan WeemenおよびSchuursにより報告
された（「FEBS Letters」、15巻、232（1971）お
よび米国特許第3791932号明細書参照〕。この技術
にはvam WeemenおよびSchuusの基本テーマに
基づく多くのバリエーシヨンがみられる。 多エピトープ性抗原物質が多エピトープ受容体
を有する粒子を凝集して凝集体を生成しうること
は知らている（たとえばそれぞれインフルエンザ
ウイルスおよびヒツジ赤血球）。これらの凝集体
は光散乱型測定器を用いて検出できる。液状検体
中の抗原およびハプテンを検出するための凝集阻
害検定法が知られている。典型的には、抗原また
はハプテンで被覆された高屈折性粒子と多価抗体
の結合が検体中の抗原またはハプテンにより拮抗
的に阻害される（米国特許第4401765号明細書参
照）。これらの検定法の感度は一般に10-7〜
10-9Mの濃度範囲の抗原およびハプテンに限られ
る。 酵素を標識として用いるイムノアセイでなおも
問題なのは、10-10M以下の濃度の被分析物は比
較的短時間、典型的には30分以下、好ましくは10
分以下で検出できない点である。高ターンオーバ
ー数の酵素が信号発生を最大にするために標識と
して用いられている。かかる酵素にはβ−ガラク
トシターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アル
カリ性ホスフアターゼ、グルコースオキシダー
ゼ、β−ラクタマーゼおよびウレアーゼが含まれ
る。発色性基質をこれら酵素を用いれば感度を約
10-10Mとすることができる。発螢光性基質を用
いれば一段と大きな感度が得られよう。しかしな
がら、すべての生物学的検体は発螢光性基質測定
を干渉しうる螢光物質、例えばポルフイリンを含
有する。この欠点は、付加的な検体処理、詳細に
は、結合物を酵素標識コンプレツクスから分離す
ることにより克服できる。干渉性の螢光物質はこ
の分離の際に除去されうるが、結合酵素標識コン
プレツクスのみの測定しか行えないという制約が
ある。 酵素使用高感度イムノアツセイは、高ターンオ
ーバ数の酵素および合成基質を用いたとしても至
適感度を得るのには、検出可能なレベルの酵素的
に生成する発色団または螢光発生団の発生に望ま
しくない時間、すなわち大ざつぱにいつて30〜90
分が必要とされる。 当技術分野では検体中の低レベルの酵素活性を
短時間、典型的には10分以下で検出する方法が常
に要請されている。天然または合成基質のいずれ
からも容易に測定しうる生成物が生じない場合の
酵素活性を測定する方法に対しても要請がある。 発明の開示 前述の要請は本発明によつて満たされる。すな
わち、本発明は第１の観点においては、 (1) (i) リガンドを表面に付着した高屈折性粒
子、 (ii) そのリガンドに対し特異的で少くとも２つ
のリガンドに結合しうる結合パートナー（該
結合パートナーと粒子が結合したリガンドと
は凝集を可能にする濃度で存在させる）、お
よび (iii) 酵素の基質（酵素、基質、リガンドおよび
結合パートナーは、酵素と基質いとの反応に
より結合パートナーに対してリガンドと拮抗
する生成物が生成するようなものとする） よりなる凝集系を形成し、 (2) 前記凝集系を検体と接触させて結合パートナ
ーに対しリガンドと拮抗する生成物を生成さ
せ、 (3) 前記凝集系の物性（その物性は凝集の関数で
ある）を測定し、そして (4) 測定値を検体中に最初に存在していた酵素量
に関連づけること よりなる液状検体中の酵素を検出するための凝集
に基づく方法である。 第２の観点では、本発明は、 (1) 酵素と被分析物に結合しうる第１結合パート
ナーとよりなる接合体（conjugate）に検体を
接触させ、それによつて一部の接合体は被分析
物に結合させて複合体を形成させそして残余の
接合体を被分析物と結合していない遊離接合体
とし、 (2) その遊離接合体を複合体から分離し、 (3) 遊離接合体または複合体のいずれかを、 (i) リガンドを表面に付着した高屈折性粒子、 (ii) そのリガンドに対し特異的で少くとも２つ
のリガンドに結合しうる第２結合パートナー
（該第２結合パートナーとリガンドとは凝集
を可能にする濃度が存在せしめる）、および (iii) 酵素の基質（酵素、基質、リガンドおよび
第２結合パートナーは、酵素と基質との反応
により第２結合パートナーに対してリガンド
と拮抗する生成物が生成するようなものとす
る） よりなる凝集系を接触させ (4) 凝集系の物性（その物性は凝集の関数であ
る）を測定し、そして (5) 測定値を液状検体中に最初に存在していた被
分析物量に関連づける ことよりなる、液状検体中の被分析物を検出する
ための凝集に基づく測定方法である。 第３の観点おいて、本発明は (1) (i) 酵素と反応した際にリガンドに転化され
うる基質を表面に被覆せしめた高屈折性粒
子、および (ii) そのリガンドに対し特異的で少くとも２つ
のリガンドに結合しうるが基質には結合しえ
ない結合パートナーよりなる凝集系を形成
し、 (2) 該凝集系を検体と接触させて基質をリガンド
に転化し、 (3) 該凝集系の物性（それは凝集の関数である）
を測定し、そして (4) 測定値を検体中に最初に存在していた酵素量
に関連づける ことにより液状検体中の酵素を検出するための凝
集、に基づく方法である。 第４の観点において、本発明は (1) 酵素と被分析物に結合しうる第１結合パート
ナーとよりなる接合体に検体を接触させ、それ
によつて一部の接合体は被分析物に結合させて
複合体を形成させ、そして残余の接合体を被分
析物と結合していない遊離接合体とし、 (2) その遊離接合体を複合体から分離し、 (3) 遊離接合体または複合体のいずれかを、 (i) 酵素と反応した際にリガンドに転化されう
る基質を表面に被覆せしめた高屈折性粒子、
および (ii) そのリガンドに対し特異的で少くとも２つ
のリガンドに結合しうるが基質には結合しえ
ない結合パートナーよりなる凝集系と接触さ
せ、 (4) 凝集系の物性（それは凝集の関数である）を
測定し、そして (5) 測定値を検体中に最初に存在していた酵素量
に関連づける ことよりなる液状検体中の被分析物を検出するた
めの凝集に基づく方法である。 本発明の詳細な前述 阻害方式において、本発明は結合可能な物質、
すなわちリガンドを表面に有する高屈折性粒子よ
りなる凝集系を用いる。リガンドに対し特異反応
性を有する結合パートナーを高屈折性粒子と反応
させる。その結合パートナーは多価、すなわち、
少くとも２つのリガンドと結合することができ
る。結合パートナーは高屈折性粒子の実質的凝集
を与える濃度で用いられる。凝集が生じるのは多
価結合パートナーが架橋剤として働いて２つの粒
子を連結するからである。凝集系はまた検出すべ
き酵素の基質を含有する。基質、酵素およびリガ
ンドは作用トリオ（operational trio）を形成す
るように選択されなければならない。詳細には、
検出すべき酵素が与えられた場合、そのリガンド
は、酵素−基質反応の生成物と実質的に同じ結合
パートナーに対する性質を有するように選択しな
ければならない。この条件は、酵素−基質反応の
生成物が結合パートナーに対してリガンドと拮抗
し、それによつて凝集反応への参画に利用しうる
結合パートナー量が減少することを保証する。操
作にあたつては、検体を凝集系と接触させそして
その後の凝集阻害量を酵素不含対照例と比較して
測定する。一観点において、酵素は溶液中遊離状
態とすることができ、そして酵素量は直接凝集か
または凝集阻害のいずれかによつて測定できる。
あるいはまた、酵素は抗体分子、抗原またはハプ
テン分子，核酸プローブなどへの標識であつても
よく、その場合には、凝集阻害がそれが標識とし
て働く物質の直接の尺度となる。後者のケースの
一例として、被分析物含有検体を酵素と被分析物
と反応性の結合パートナーとの接合体と接触させ
る。この接合体は、検体と接触させる前に、酵素
とそれが標識として作用する物質とを共有結合さ
せることにより製造しておくことができる。この
接合体は、酵素を結合パートナーに対し直接にか
または適宜のスペーサ・アームを通して結合さ
せ、そして酵素活性、および結合パートナーのそ
の相当する被分析物を結合する能力を保存する既
知の方法により製造される。酵素を抗体に直接共
有結合させることが望ましくない場合には、アビ
ジン標識酵素とビオチン標識結合パートナーの特
異結合を含む他の手段により適宜の接合体を製造
することもできる。このアビジン／ビオチン標識
は、検体と接触させる前かあるいは検体と接触さ
せるのと同時に、標識酵素と被分析物結合パート
ナーとをインキユベートすることにより接合体の
形成、製造を可能にする。あるいはまた、酵素と
結合パートナーの接合体は、検体、標識結合パー
トナーおよび標識酵素を任意の所望の順序で順次
に添加することにより形成することができる。す
べての場合に、結合パートナーにより与えられる
結合部位総数は被分析物に対してモル過剰であ
る。接合体の一部は被分析物に結合し、そして残
りの部分は遊離したまま残る。結合または遊離接
合体のいずかを凝集系と接触させて凝集を阻害す
る。 直接凝集方式では、高屈折性粒子の表面には、
リガンドよりはむしろ酵素の基質が付着してい
る。それらの粒子を酵素と反応させると基質はリ
ガンドに転化される。次いで結合パートナーは別
体粒子を架橋して凝集を生ぜしめることができ
る。この場合にも、酵素は検体中遊離状態で存在
することができ、その場合には凝集現象はその酵
素の直接の測定尺度であり、あるいは酵素は抗
体、抗原またはハプテン、核酸プローブ等への標
識であつてもよく、その場合には凝集現象はそれ
が標識として作用する物質の間接的な測定尺度で
ある。 本発明の方法を用いて検出できる酵素にはβ−
ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスフアターゼ、
西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ラクタマーゼが含
まれるが、これらに限定されるものではない。 生物学的試料中の物質の間接的測定尺度として
用いられる場合、かかる試料としては例えば血
液、脳脊髄液、血清、血漿、痰、尿、臭洗浄液、
生殖器及び咽喉の綿棒試料、およびその他の生物
学的試料が挙げられる。 適切な高屈折性粒子は例えば、アガロース、ポ
リデキストラン、ポリアクリルアミドおよびポリ
マーラテツクスなどから製造できる。粒子の形状
は重要ではないが、球状粒子が最も製造しやす
く、凝集状態で最大の格子密度を与えるので好ま
しい。粒子の大きさはいく分重要である。球状粒
子の好ましい直径は、凝集阻害方式に対しては、
約30nm〜100nmである。最も好ましい粒子は米
国特許第4401765号明細書に記載されたものであ
る。上記米国特許の開示事項についてここで言及
してみる。これらの粒子は、好ましくは、ポリビ
ニールナフタレンおよびポリスチレンから製造さ
れた高屈折性球状ポリマー・コアを有する。該コ
ア表面には抗原ハプテン等が共有結合的に結合す
ることのできる反応性の殻が付着している。ポリ
マー粒子の粒径を調節するための都合のよい方法
は表面活性剤の使用量により粒径を調節できる種
（seed）乳濁液を調製する方法である。この種乳
濁液を調製後、付加的なモノマーおよび表面活性
剤を調節された速度で添加して種乳濁液中の粒子
のサイズを大きくすることができる。 ポリマー粒子の外殻ポリマーは、生物学的に興
味ある化合物と反応しうる官能基を有する広い範
囲のエチレン様不飽和モノマーから製造すること
ができる。所望により、外殻は他のエチレン様不
飽和モノマーを含むこともできる。殻ポリマーの
コアへの結合はコアポリマー中の残留エチレン様
不飽和基に官能性ポリマーをグラフト重合するこ
とにより行うことができるしまた、官能性モノマ
ーをコアの周囲で重合させて連続殻を形成するこ
とができる。好ましいモノマーとしては例えばエ
ポキシ基を含有するもの、例えばグリシジルメタ
クリレート、グリシジルアクリレート、ビニール
グリシジルエーテル、およびメタリルグリシジル
エーテルなどが挙げられる。他の官能性基として
例えばカルボキシル、ヒドロキシル、アミノおよ
びアルデヒドなどが挙げられる。 100nm以上、好ましくは1000nm〜100000nmの
範囲の直径を有する粒子を、前述の方法による肉
視凝集試験用に製造できる。これらの大型直径粒
子は、凝集状態の変化による凝集反応の際に易易
に見られる。直接凝集方式は、直接凝集の方が凝
集阻害よりも検出が容易なので、粒子凝集の肉視
検出に好ましい。 阻害方式では、適宜のリガンドを表面に付着し
た所望の組成を有する粒子を製造する。このリガ
ンドは物理的に吸着してもよいし、あるいは（直
接またはいわゆるスペーサ・アームを通して）共
有結合的に結合してもよい。誘導された表面への
化合物の共有結合による結合法は周知である
（Kiefer，「ImmunologicalMethods」、Lefkovits
＆Perris，eds.、ニユーヨーク：Academic
Press，1979，137参照）。直接凝集方式では粒子
は表面に基質を付着している。基質を共有結合的
に結合する方法はリガンドを結合する方法と類似
している。 本発明の凝集阻害方式を実行するには、酵素基
質反応が、結合パートナーに対しリガンドと拮抗
する生成物を生成しなければならない。更に、基
質は酵素によつて分解される前に結合パートナー
と実質的に反応性のあるものであつてはならな
い。例えばβ−ガラクトシダーゼの場合には、適
当な基質はｏ−ニトロフエニル−β−ガラクトピ
ラノシド（ONPG）であり、また適当な結合剤
は抗−ｏ−ニトロフエノールまたは抗−ニトロヒ
ドロキシ安息香酸（NHB）抗体である。β−ガ
ラクトシダーゼがｏ−ニトロフエニル−β−ガラ
クトピラノシドと反応すると、ｏ−ニトロフエニ
ル基とβ−ガラクトピラノシド部分との間の結合
が開裂され、遊離のｏ−ニトロフエノール分子が
生じる。前記抗体はｏ−ニトロフエノールには反
応性があるがｏ−ニトロフエニル−β−ガラクト
ピラノシドには反応性がない。ガラクトピラノシ
ド基は抗−ｏ−ニトロフエノール抗体とｏ−ニト
ロフエニル置換分（ONP）との結合を立体的に
妨害するものと思われる。しかしながら、基質の
酵素分解によつてその抗体と結合しうる生成物が
生成する。酵素、基質、リガンドおよび結合パー
トナーの間に必要な機能上の関係は、基質および
生成物によりえられる凝集速度の比較を示す第１
表のデータにより更に説明される。 データは、ONPGおよびONP同族体である３
−ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸（NHB）
の、抗−NHB抗体によるNHB被覆粒子凝集の
阻害能を比較することにより作成した。これらの
データは、ｏ−ニトロフエニルガラクトピラノシ
ドの濃度より約３桁程度も低いNHB濃度が等価
の阻害を生じることを示す。NHBは、β−ガラ
クトシダーゼによりONPGの加水分解によつて
生じた生成物に対する機能的等価物である。従つ
て基質の酵素分解がなければ、有意な凝集阻害は
ない。
【表】
【表】
基質、酵素およびリガンドの任意の作用トリオ
を用いて最高感度の定量検定系を実現するには、
ある種の要件が満たされねばならないことは当業
者の理解するところであろう。基質は酵素の予想
濃度に対してモル過剰でなければならない。典型
的には、基質濃度は５〜10Km（ミカエリス定数）
程度である。この要件により一般に、一次動力学
が基質について観祭されること、および反応速度
が不充分な基質濃度により制限されないことが保
証される。当該酵素が検定の際に試薬として存在
する場合は、その酵素が系内に予測された濃度範
囲にわたつて存在することとなるので、適切な基
質レベルの決定は比較的簡明である。当該酵素が
検定の被分析物であつて、しかもまれであるか単
離し難いものでもある場合には、定量検定に好ま
しい動力学を維持するには適切な基質レベルを一
段と経験的に近似させることが必要かもしれな
い。先きに論じた酵素と基質の間の関係における
制約は、酵素の有無が重要となりうる定性的結果
にはさほど重大ではない。 もう一つの重要な考慮は結合パートナーの基質
との交叉反応性の程度である。定量および半定量
系で一次動力学を保証する所定レベルの基質はま
た、基質が酵素活性により生成される生成物より
も一段と高濃度で存在することを保証する。質量
作用の法則によれば有意の交叉反応性が存在すれ
ば、結合パートナーの基質への結合が示唆さよ
う。このため、直接凝集系の場合バツクグラウン
ド凝集は著しいものとなり、また阻害系では凝集
の非特異的阻害のレベルは受容され難いものとな
ろう。従つて、基質と生成物との間に少くとも２
〜３枚数の大きさの濃度差が存在する場合には、
最高検定感度を得るには、基質との交叉反応性が
ほとんどかあるいは全くない結合パートナーが選
択される。この要件により、直接凝集系にあつて
は極めて低レベルの生成物を検出でき、また阻害
系にあつては、極めて低レベルの生成物は結合パ
ートナー結合部位に対して粒子結合リガンドと効
果的に拮抗する。いずの系においても結合パート
ナーの交叉反応性を最小限度にした場合にのみ極
めて低レベルの生成物に対して粒子凝集状態の顕
著な変化をみることができる。大抵の酵素に対す
る定量条件下では、基質濃度は10-3〜10-6Mの範
囲、生成物は約10-6〜10-10Mの範囲となろう。 基質を高屈折性粒子の表面に付着させることの
必要な直接凝集方式では、開裂可能な結合が粒子
それ自体によつて酵素から立体障害を受けていな
いことが重要である。いわゆるスペーサー・アー
ムの使用は、開裂可能な結合と粒子表面との間に
障害を防止するのに充分な距離を置くことができ
る。 好ましい結合剤は抗体分子である。抗体がそれ
ぞれの抗原またはハプテンに対して極めて特異的
であることは知られている。更に、抗体は、製造
しやすくまた凝集に必要な多価を与える。モノク
ローナルおよびポリクローナルル抗体のいずれも
本発明に使用できる。 抗血清またはその他の体液、例えば抗リガンド
抗体を含有する腹水などは、凝集系に直接使用で
き、あるいは精製して免疫グロブリン画分、IgG
またはアフイニテイ精製IgG画分を提供すること
ができ、そしてそれらもすべて凝集系の結合パー
トナーとして使用することができる。IgM画分を
用いることも可能である。IgGの断片、例えばＦ
（ab′）2も使用できる。 検出されるべき特定の酵素が選択されれば、開
裂可能な結合のタイプを確認することができ、例
えばβ−グルコシダーゼの場合、その結合はβ−
ガラクトピラノシドともう１つの糖（グルコース
またはフラクトース）または適当な代替物例えば
ONPなどとの間のβ（１−４）エーテル結合であ
る。その結合を含む天然基質を同定することがで
き、あるいはその結合を含む合成基質を設計する
ことができる。次いでその酵素と基質の反応によ
り生じる生成物の化学的本体を定めることがで
き、またそのことは、実用的な系が形成されるよ
うに選択されねばならない適当な結合パートナー
の本体を定めることとなる。詳しくいえば、酵素
と基質の反応は結合パートナーに対して、リガン
ドと拮抗する生成物を生成するものでなければな
らない。酵素、基質および結合パートナーの実用
的な系の例を下記の第２表に示す。
を用いて最高感度の定量検定系を実現するには、
ある種の要件が満たされねばならないことは当業
者の理解するところであろう。基質は酵素の予想
濃度に対してモル過剰でなければならない。典型
的には、基質濃度は５〜10Km（ミカエリス定数）
程度である。この要件により一般に、一次動力学
が基質について観祭されること、および反応速度
が不充分な基質濃度により制限されないことが保
証される。当該酵素が検定の際に試薬として存在
する場合は、その酵素が系内に予測された濃度範
囲にわたつて存在することとなるので、適切な基
質レベルの決定は比較的簡明である。当該酵素が
検定の被分析物であつて、しかもまれであるか単
離し難いものでもある場合には、定量検定に好ま
しい動力学を維持するには適切な基質レベルを一
段と経験的に近似させることが必要かもしれな
い。先きに論じた酵素と基質の間の関係における
制約は、酵素の有無が重要となりうる定性的結果
にはさほど重大ではない。 もう一つの重要な考慮は結合パートナーの基質
との交叉反応性の程度である。定量および半定量
系で一次動力学を保証する所定レベルの基質はま
た、基質が酵素活性により生成される生成物より
も一段と高濃度で存在することを保証する。質量
作用の法則によれば有意の交叉反応性が存在すれ
ば、結合パートナーの基質への結合が示唆さよ
う。このため、直接凝集系の場合バツクグラウン
ド凝集は著しいものとなり、また阻害系では凝集
の非特異的阻害のレベルは受容され難いものとな
ろう。従つて、基質と生成物との間に少くとも２
〜３枚数の大きさの濃度差が存在する場合には、
最高検定感度を得るには、基質との交叉反応性が
ほとんどかあるいは全くない結合パートナーが選
択される。この要件により、直接凝集系にあつて
は極めて低レベルの生成物を検出でき、また阻害
系にあつては、極めて低レベルの生成物は結合パ
ートナー結合部位に対して粒子結合リガンドと効
果的に拮抗する。いずの系においても結合パート
ナーの交叉反応性を最小限度にした場合にのみ極
めて低レベルの生成物に対して粒子凝集状態の顕
著な変化をみることができる。大抵の酵素に対す
る定量条件下では、基質濃度は10-3〜10-6Mの範
囲、生成物は約10-6〜10-10Mの範囲となろう。 基質を高屈折性粒子の表面に付着させることの
必要な直接凝集方式では、開裂可能な結合が粒子
それ自体によつて酵素から立体障害を受けていな
いことが重要である。いわゆるスペーサー・アー
ムの使用は、開裂可能な結合と粒子表面との間に
障害を防止するのに充分な距離を置くことができ
る。 好ましい結合剤は抗体分子である。抗体がそれ
ぞれの抗原またはハプテンに対して極めて特異的
であることは知られている。更に、抗体は、製造
しやすくまた凝集に必要な多価を与える。モノク
ローナルおよびポリクローナルル抗体のいずれも
本発明に使用できる。 抗血清またはその他の体液、例えば抗リガンド
抗体を含有する腹水などは、凝集系に直接使用で
き、あるいは精製して免疫グロブリン画分、IgG
またはアフイニテイ精製IgG画分を提供すること
ができ、そしてそれらもすべて凝集系の結合パー
トナーとして使用することができる。IgM画分を
用いることも可能である。IgGの断片、例えばＦ
（ab′）2も使用できる。 検出されるべき特定の酵素が選択されれば、開
裂可能な結合のタイプを確認することができ、例
えばβ−グルコシダーゼの場合、その結合はβ−
ガラクトピラノシドともう１つの糖（グルコース
またはフラクトース）または適当な代替物例えば
ONPなどとの間のβ（１−４）エーテル結合であ
る。その結合を含む天然基質を同定することがで
き、あるいはその結合を含む合成基質を設計する
ことができる。次いでその酵素と基質の反応によ
り生じる生成物の化学的本体を定めることがで
き、またそのことは、実用的な系が形成されるよ
うに選択されねばならない適当な結合パートナー
の本体を定めることとなる。詳しくいえば、酵素
と基質の反応は結合パートナーに対して、リガン
ドと拮抗する生成物を生成するものでなければな
らない。酵素、基質および結合パートナーの実用
的な系の例を下記の第２表に示す。
【表】
テラーゼ
好ましいシステムは次のとおりである： (1) β−ガラクトシダーゼ、ONP−β−ガラク
トピラノシド、ｏ−ニトロフエノールおよび抗
−ｏ−ニトロフエノール抗体、および (2) アルカリ性ホスフアターゼ、ｐ−ニトロフエ
ニル−ホスフエート、ｐ−ニトロフエノールお
よび抗−ｐ−ニトロフエノール抗体。 前記第２表からわかるように、基質はその酵素
によつて開裂されて結合パートナーと反応性の少
くとも１つの生成物を生ずることのできる少くと
も１つの結合を与えるものでなければならない。
それら生成物の１つはリガンドとして働くように
選択される。一般に、リガンドはハプテン、すな
わち、抗−ハプテン抗体には結合しうるが直接に
は免疫応答を誘起し得ない小分子である。このリ
ガンドは既知の方法により適当な高分子担体に結
合して適宜の免疫原を形成することができる。形
成された免疫原を免疫能のある動物に注射して抗
−ハプテン免疫応答を誘起することができる。適
宜の免疫計画の後免疫動物から適当な抗血清ある
いは、認められたモノクローナル抗体産生法、例
えばKohlerとMilsteinによる方法「Nature」、
256：495、1975）に用いるのに適した免疫感作細
胞を得ることができる。 検出すべき所定の酵素に対し、その結合剤に対
するリガンドとして機能しうる分解生成物を与え
るよう基質を設計できれば、抗体以外の多価結合
剤を使用することができる。例えば、チロキシン
結合グロブリン（TBG）がチロキシンを結合す
ることが知られている。β−ガラクトシダーゼを
検出したいときは、その酵素と基質の反応から
TBGにより結合しうるチロキシンが生成するよ
う、チロキシンとガラクトピラノシドとの共有結
合接合体よりなる基質を設計することができる。
チロキシンのヒドロキシル基とガラクトピラノシ
ドのC1炭素のヒドロキシル基より形成されるエ
ーテル結合が適当な基質を与えるものと考えられ
る。本発明に有用であることが証されうる他の多
価結合剤にはＣ−反応性タンパク、アビジン、お
よびアミロイドＡタンパクが含まれる。 直接凝集または凝集阻害方式において、系の物
性、特に光学的性質は経時的に変化する。これら
検出可能な物性例には入射光の所定波長における
吸光度および、入射光線に対し所定角度で散乱さ
れる単色光の強度が含まれる。更に、凝集した高
屈折性粒子の粒度分布を測定することができる。 所定波長での吸光度は標準的な分光光度測定器
を用いて測定することができる。散乱光は比濁計
を用いて測定することができる。凝集した高屈折
率粒子は光学的または電気的な粒子計数器を用い
て測定することができる。好ましい方法は、試験
系の付加的成分による高い濁り分析信号および低
い干渉に基づいて選択される所定波長で吸光度を
測定する方法である。例えば、本発明の系がβ−
ガラクトシダーゼ、ONB−β−ガラクトピラノ
シド、ｏ−ニトロフエノールおよび抗−ニトロフ
エノール抗体よりなる場合、基質は340nmで顕著
な吸光度極大を有する。従つて、反応系を濁り分
析信号の測定に至適な波長である340nmでモニタ
ーした場合には、基質により干渉源がつくられる
ことになろう。その結果、基質からの吸光度寄与
を低減するために濁り分析信号は405nmでモニタ
ーされる。 次に本発明を以下の実施例により説明するが、
本発明はそれらに限定されるものではない。 実施例 １ β−ガラクトシダーゼ活性の測定 次の実施例は、本発明により提供される方法に
より４分以内に2.5×10-4単位／mlという少量の
β−ガラクトシダーゼが測定可能であることを示
す。この実施例で用いた高屈折性粒子は、ポリビ
ニールナフタンの中間殻とポリグリシジルメタク
リレートの外殻を有するポリスチンコアであつ
た。結合剤は、ハプテンの３−ニトロ−４−ヒド
ロキシ安息香酸に対して調製された抗体とした。
この抗体は、ｏ−ニトロフエノールと顕著に交叉
反応した。リガンドは３−ニトロ−４−ヒドロキ
シ安息香酸とし、これをそのカルボキシル基を通
して、高屈折性粒子上のポリグリシジルメタクリ
ートの外殻に共有結合した。β−ガラクトシダー
ーゼの基質はｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシドとした。この方法は凝集阻害方式
で行つた。凝集速度は２つの所定時点で、吸光度
を405nmで測定することにより測定した。 Ａ NHB：タンパク接合体の合成 キーホール・リンペツト・ヘモシアニン
（keyhole limpet hemocyanin、略してKLH）
（750mg、Calbiochem−Behring）を10mlの0.05M
重炭酸ナトリウム緩衝液（PH9.0）に溶解し、そ
して前記重炭酸塩緩衝液を用いて、徹底的に透析
した。ONPの同族体である３−ニトロ−４−ヒ
ドロキシ安息香酸（NHB）（64mg）を５mlのジ
メチルホルムアミドに溶解しそして４℃に冷却し
た。この溶液に、81mgの１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび
43mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し
た。その溶液を４℃で18時間撹拌した。次いで透
折済みのKLH溶液をジメチルホルムアミド溶液
に添加し、PHを0.2N水酸化ナトリウムで8.5に調
節し、そしてその溶液を４℃で８時間インキユベ
ートした。次にその反応混合物を脱イオン水で透
析して未反応物質を除去し、そして接合物を４℃
で貯蔵する前に凍結乾燥した。 担体タンパクとして牛血清アルブミン（BSA）
を用いる別個の接合体を500mgのBSAを用いて同
じ方法で調製した。 Ｂ ポリクローナル抗−NHB抗体 ３匹の家兎（New Zealand White 雌）に、
1.0mlの完全フロインドアジユバンド中に懸濁し
た0.25mgのNHB：KLH接合体（前記Ａの部で合
成）を皮下注射した。不完全フロインドアジユバ
ントを用いて前述の如く、約21日間隔で３回ブー
スター注射を行つた。各ブースター注射に先立
ち、そら家兎から採血し、そして後述のＤの部に
記載のポリマー粒子試剤を用いて米国特許第
4401765号明細書に記載されているような粒子強
化比濁分析式阻害イムノアツセイにより、血清の
ｏ−ニトロフエノール交叉反応性抗体を試験し
た。 Ｃ ポリビニルナフタレン／ポリグリシジルメタ
クリリレートコア／殻ポリマー粒子の製造 ポリスチン乳濁液を４エレンマイエルフラス
コ中室温（20℃）で製造した。次の成分を順次添
加した。すなわち、400ｇのDupanol WAQE〔30
％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液のDu
Pontグレード〕を2.5の脱イオン水に添加し、
次いで50mlのスチレン、20ｇのメタ重亜硫酸ナト
リウム、10ｇの過硫酸カリウム（200mlの水に溶
解）、そして125mlの硫酸第一鉄溶液（0.6ｇの硫
酸第一鉄・五水和物および0.25ｇの硫酸を500ml
の窒素パージ済み脱イオン水に溶解）を添加し
た。その乳濁液混合物を撹拌しそして窒素で覆つ
た。10分後、375mlのスチンに溶解した25ｇの
Aerosol OT−100（American Cynamid社製）を
30ml／分の速度で添加した。その混合物を一夜撹
拌した。１：100に希釈したその乳濁液のサンプ
ルは340nmで0.171の光学密度を有していた。 ポリビニールナフタレンは、磁気撹拌器および
還流凝縮器を設けた250ml丸底フラスコ中で製造
した。その丸底フラスコを沸騰水溶に入れた。ポ
リスチレンコア粒子上にポリビニールナフタレン
中間殻を与えるために、上記のように製造した
1.8mlのポリスチレン乳濁液を98mlの水に添加し
そして95℃に加熱した。この混合物を次いで11.7
ｇの２−ビニールナフタレン（Aldrich
Chemical社製、昇化およびジクロロメタン溶液
中塩基性アルミナでのクロマトグラフイにより精
製）、300mgの重炭酸ナトリウムおよび90mgの過硫
酸カリウムに添加した。２−ビニールナフタレン
の融解後直ちにその混合物に４mlの10％ドデシル
硫酸ナトリウムを0.3ml／分の速度で混入させた。
SDS混入開始の１時間後に重合は完了した。水に
１：5000希釈した後の生成物の340nmでの光学密
度は0.155であつた。平均粒子直径は電子顕微鏡
により74nmと測定された。モノマーのポリマー
への転化率は、残留モノマーのガスクロマトグラ
フイ測定により、99.6％であることがわかつた。 そのポリビニールナフタレン／ポリスチレン粒
子上にポリグリシジルメタクリレートの外殻を形
成した。グリシジルメタクリレートの重合は前記
と同じ装置で行つた。104mlのポリビニールナフ
タレン／ポリスチレン粒子を沸騰水溶中で加熱し
た。100mgの過硫酸カリウムおよび2.06mlのグリ
シジルメタクリレート（Aldrich Chemical社製）
を添加した。20分後にその混合物を冷却した。グ
リシジルメタクリレートモノマーのポリマーへの
転化率は、未反応モノマー濃度の測定により99.0
％であることがわかつた。水に１：5000希釈した
後の生成物の340nmで測定した光学密度は0.154
であつた。 Ｄ NHBのポリマー粒子への結合 ｏ−ニトロフエノールの同族体である３−ニト
ロ−４−ヒドロキシ安息香酸（NHB、144mg）
および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド（156mg）を５mlのジメ
チルスルホキシドに溶解しそして室温で２時間放
置した。もう一つの５ml容のジメチルスルホキシ
ドに420mgの２，2′−オキソビス（エチルアミ
ン）・ジ塩酸塩を添加した。次にそれら２つの溶
液を合一しそして室温で約72時間インキユベート
した。 前述の如く製造したNHB接合体溶液（0.333
ml）および0.06mlの10％ｗ／ｖ GAFAC RE−
610：水溶液（ GAFAC RE−610はGAF
Corp.製の陰イオン表面活性剤である）を4.4mlの
5mM燐酸ナトリウム緩衝液（PH8.0）に希釈し
た。この溶液のPHをPH10.0〜10.1に調整しそして
1.2mlのコア／殻ポリマー粒子（前記Ｃの部参照）
を反応系に添加した。その混合物を３時間70℃に
加熱しそして室温まで放冷した。その粒子剤を
0.1％ GAFAC 含有の15nM燐酸ナトリウム緩
衝液（PH7.0）で希釈した。それら粒子を90分間
20000rpmで遠心分離してペレツトを形成し、そ
して上澄を捨てた。粒子を前記煉酸塩／
GAFAC 溶液に再懸濁しそして再遠心分離し
た。その遠心分離と再懸濁を全部で４回繰返して
未反応NHB接合体を除去した。最終洗浄の後、
その粒子剤を0.1％ GAFAC 含有の15mM燐酸
ナトリウム緩衝液（PH7.0）中で全容量を10mlと
した。 Ｅ β−ガラクトシダーゼ活性（従来技術） すべての検定はaca 個別（discrete）臨床分
析器（Du pont社製）で37℃で行つた。 酵素β−ガラクトシダーゼ（Sigma Chemical社
製）の原液を製造元の測定した活性基準で4.5×
103単位／mlの濃度で調製した。そのβ−ガラク
トシダーゼ原液の連続希釈液を4.5×103〜4.5×
10-3単位／mlの範囲にわたつて調製した。各β−
ガラクトシダーゼ希釈液の0.05ml試料をaca 分
析試験パツクに自動的に注入し次いで３％のポリ
エチレングコール8000，0.1％GAFAC および
2mMの塩化マグネシウムを含む0.15Mホスフエ
ート緩衝液（PH7.8）4.95mlを注入した。次にそ
のパツクの内容物を37℃に加熱し、そして酵素反
応をｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（ONPG）を0.1mMの最終濃度となるよ
う添加することにより開始した。酵素活性は
ONPG添加の29秒後および46秒後における
405nmでの吸光度差（変化速度）を測定すること
により測定した。 Ｆ 本発明の凝集阻害方式を用いたβ−ガラクト
シダーゼ活性 Ｅの部で調製したβ−ガラクトシダーゼ連続希
釈液をこらの実験にも用いた。各β−ガラクトシ
ダーゼ希釈液の0.05ml試料をaca 分析試験パツ
クに自動的に注入し、次いで３％ポリエチレング
リコール8000、0.1％GAFAC および2mM塩化
マグネシウムを含有する0.15Mホスフエート緩衝
液（PH7.8）4.95mlを注入した。そのパツクの内
容物を37℃に加熱し、そして最初の４つのパツク
凹部の試剤を放出した。この時点での反応混合物
は0.1mM ONPGと、前記Ｄの部で合成された
NHB粒子試剤の固体分0.016％からなつていた。
比濁分析阻害反応は、3.5分後に前記Ｂの部で調
製した学兎抗−NHB抗血清0.008mlを添加するこ
とにより開始した。粒子凝集よる濁度増加は、抗
体添加の29秒後および46秒後の405nmにおける吸
光度差（変化速度）として測定された。第３表は
従来技術の方法と本発明の方法とよりなるβ−ガ
ラクトシダーゼ活性のデータを示す。 第表のデータは、従来技術の方法が0.25〜2.5
単位／mlの感度を有したのに対し、本発明により
提供される方法は約2.5×10-4単位／mlの感度を
有する（これはほぼ1000倍の増加に相当する）こ
とを示している。
好ましいシステムは次のとおりである： (1) β−ガラクトシダーゼ、ONP−β−ガラク
トピラノシド、ｏ−ニトロフエノールおよび抗
−ｏ−ニトロフエノール抗体、および (2) アルカリ性ホスフアターゼ、ｐ−ニトロフエ
ニル−ホスフエート、ｐ−ニトロフエノールお
よび抗−ｐ−ニトロフエノール抗体。 前記第２表からわかるように、基質はその酵素
によつて開裂されて結合パートナーと反応性の少
くとも１つの生成物を生ずることのできる少くと
も１つの結合を与えるものでなければならない。
それら生成物の１つはリガンドとして働くように
選択される。一般に、リガンドはハプテン、すな
わち、抗−ハプテン抗体には結合しうるが直接に
は免疫応答を誘起し得ない小分子である。このリ
ガンドは既知の方法により適当な高分子担体に結
合して適宜の免疫原を形成することができる。形
成された免疫原を免疫能のある動物に注射して抗
−ハプテン免疫応答を誘起することができる。適
宜の免疫計画の後免疫動物から適当な抗血清ある
いは、認められたモノクローナル抗体産生法、例
えばKohlerとMilsteinによる方法「Nature」、
256：495、1975）に用いるのに適した免疫感作細
胞を得ることができる。 検出すべき所定の酵素に対し、その結合剤に対
するリガンドとして機能しうる分解生成物を与え
るよう基質を設計できれば、抗体以外の多価結合
剤を使用することができる。例えば、チロキシン
結合グロブリン（TBG）がチロキシンを結合す
ることが知られている。β−ガラクトシダーゼを
検出したいときは、その酵素と基質の反応から
TBGにより結合しうるチロキシンが生成するよ
う、チロキシンとガラクトピラノシドとの共有結
合接合体よりなる基質を設計することができる。
チロキシンのヒドロキシル基とガラクトピラノシ
ドのC1炭素のヒドロキシル基より形成されるエ
ーテル結合が適当な基質を与えるものと考えられ
る。本発明に有用であることが証されうる他の多
価結合剤にはＣ−反応性タンパク、アビジン、お
よびアミロイドＡタンパクが含まれる。 直接凝集または凝集阻害方式において、系の物
性、特に光学的性質は経時的に変化する。これら
検出可能な物性例には入射光の所定波長における
吸光度および、入射光線に対し所定角度で散乱さ
れる単色光の強度が含まれる。更に、凝集した高
屈折性粒子の粒度分布を測定することができる。 所定波長での吸光度は標準的な分光光度測定器
を用いて測定することができる。散乱光は比濁計
を用いて測定することができる。凝集した高屈折
率粒子は光学的または電気的な粒子計数器を用い
て測定することができる。好ましい方法は、試験
系の付加的成分による高い濁り分析信号および低
い干渉に基づいて選択される所定波長で吸光度を
測定する方法である。例えば、本発明の系がβ−
ガラクトシダーゼ、ONB−β−ガラクトピラノ
シド、ｏ−ニトロフエノールおよび抗−ニトロフ
エノール抗体よりなる場合、基質は340nmで顕著
な吸光度極大を有する。従つて、反応系を濁り分
析信号の測定に至適な波長である340nmでモニタ
ーした場合には、基質により干渉源がつくられる
ことになろう。その結果、基質からの吸光度寄与
を低減するために濁り分析信号は405nmでモニタ
ーされる。 次に本発明を以下の実施例により説明するが、
本発明はそれらに限定されるものではない。 実施例 １ β−ガラクトシダーゼ活性の測定 次の実施例は、本発明により提供される方法に
より４分以内に2.5×10-4単位／mlという少量の
β−ガラクトシダーゼが測定可能であることを示
す。この実施例で用いた高屈折性粒子は、ポリビ
ニールナフタンの中間殻とポリグリシジルメタク
リレートの外殻を有するポリスチンコアであつ
た。結合剤は、ハプテンの３−ニトロ−４−ヒド
ロキシ安息香酸に対して調製された抗体とした。
この抗体は、ｏ−ニトロフエノールと顕著に交叉
反応した。リガンドは３−ニトロ−４−ヒドロキ
シ安息香酸とし、これをそのカルボキシル基を通
して、高屈折性粒子上のポリグリシジルメタクリ
ートの外殻に共有結合した。β−ガラクトシダー
ーゼの基質はｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシドとした。この方法は凝集阻害方式
で行つた。凝集速度は２つの所定時点で、吸光度
を405nmで測定することにより測定した。 Ａ NHB：タンパク接合体の合成 キーホール・リンペツト・ヘモシアニン
（keyhole limpet hemocyanin、略してKLH）
（750mg、Calbiochem−Behring）を10mlの0.05M
重炭酸ナトリウム緩衝液（PH9.0）に溶解し、そ
して前記重炭酸塩緩衝液を用いて、徹底的に透析
した。ONPの同族体である３−ニトロ−４−ヒ
ドロキシ安息香酸（NHB）（64mg）を５mlのジ
メチルホルムアミドに溶解しそして４℃に冷却し
た。この溶液に、81mgの１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび
43mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し
た。その溶液を４℃で18時間撹拌した。次いで透
折済みのKLH溶液をジメチルホルムアミド溶液
に添加し、PHを0.2N水酸化ナトリウムで8.5に調
節し、そしてその溶液を４℃で８時間インキユベ
ートした。次にその反応混合物を脱イオン水で透
析して未反応物質を除去し、そして接合物を４℃
で貯蔵する前に凍結乾燥した。 担体タンパクとして牛血清アルブミン（BSA）
を用いる別個の接合体を500mgのBSAを用いて同
じ方法で調製した。 Ｂ ポリクローナル抗−NHB抗体 ３匹の家兎（New Zealand White 雌）に、
1.0mlの完全フロインドアジユバンド中に懸濁し
た0.25mgのNHB：KLH接合体（前記Ａの部で合
成）を皮下注射した。不完全フロインドアジユバ
ントを用いて前述の如く、約21日間隔で３回ブー
スター注射を行つた。各ブースター注射に先立
ち、そら家兎から採血し、そして後述のＤの部に
記載のポリマー粒子試剤を用いて米国特許第
4401765号明細書に記載されているような粒子強
化比濁分析式阻害イムノアツセイにより、血清の
ｏ−ニトロフエノール交叉反応性抗体を試験し
た。 Ｃ ポリビニルナフタレン／ポリグリシジルメタ
クリリレートコア／殻ポリマー粒子の製造 ポリスチン乳濁液を４エレンマイエルフラス
コ中室温（20℃）で製造した。次の成分を順次添
加した。すなわち、400ｇのDupanol WAQE〔30
％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液のDu
Pontグレード〕を2.5の脱イオン水に添加し、
次いで50mlのスチレン、20ｇのメタ重亜硫酸ナト
リウム、10ｇの過硫酸カリウム（200mlの水に溶
解）、そして125mlの硫酸第一鉄溶液（0.6ｇの硫
酸第一鉄・五水和物および0.25ｇの硫酸を500ml
の窒素パージ済み脱イオン水に溶解）を添加し
た。その乳濁液混合物を撹拌しそして窒素で覆つ
た。10分後、375mlのスチンに溶解した25ｇの
Aerosol OT−100（American Cynamid社製）を
30ml／分の速度で添加した。その混合物を一夜撹
拌した。１：100に希釈したその乳濁液のサンプ
ルは340nmで0.171の光学密度を有していた。 ポリビニールナフタレンは、磁気撹拌器および
還流凝縮器を設けた250ml丸底フラスコ中で製造
した。その丸底フラスコを沸騰水溶に入れた。ポ
リスチレンコア粒子上にポリビニールナフタレン
中間殻を与えるために、上記のように製造した
1.8mlのポリスチレン乳濁液を98mlの水に添加し
そして95℃に加熱した。この混合物を次いで11.7
ｇの２−ビニールナフタレン（Aldrich
Chemical社製、昇化およびジクロロメタン溶液
中塩基性アルミナでのクロマトグラフイにより精
製）、300mgの重炭酸ナトリウムおよび90mgの過硫
酸カリウムに添加した。２−ビニールナフタレン
の融解後直ちにその混合物に４mlの10％ドデシル
硫酸ナトリウムを0.3ml／分の速度で混入させた。
SDS混入開始の１時間後に重合は完了した。水に
１：5000希釈した後の生成物の340nmでの光学密
度は0.155であつた。平均粒子直径は電子顕微鏡
により74nmと測定された。モノマーのポリマー
への転化率は、残留モノマーのガスクロマトグラ
フイ測定により、99.6％であることがわかつた。 そのポリビニールナフタレン／ポリスチレン粒
子上にポリグリシジルメタクリレートの外殻を形
成した。グリシジルメタクリレートの重合は前記
と同じ装置で行つた。104mlのポリビニールナフ
タレン／ポリスチレン粒子を沸騰水溶中で加熱し
た。100mgの過硫酸カリウムおよび2.06mlのグリ
シジルメタクリレート（Aldrich Chemical社製）
を添加した。20分後にその混合物を冷却した。グ
リシジルメタクリレートモノマーのポリマーへの
転化率は、未反応モノマー濃度の測定により99.0
％であることがわかつた。水に１：5000希釈した
後の生成物の340nmで測定した光学密度は0.154
であつた。 Ｄ NHBのポリマー粒子への結合 ｏ−ニトロフエノールの同族体である３−ニト
ロ−４−ヒドロキシ安息香酸（NHB、144mg）
および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド（156mg）を５mlのジメ
チルスルホキシドに溶解しそして室温で２時間放
置した。もう一つの５ml容のジメチルスルホキシ
ドに420mgの２，2′−オキソビス（エチルアミ
ン）・ジ塩酸塩を添加した。次にそれら２つの溶
液を合一しそして室温で約72時間インキユベート
した。 前述の如く製造したNHB接合体溶液（0.333
ml）および0.06mlの10％ｗ／ｖ GAFAC RE−
610：水溶液（ GAFAC RE−610はGAF
Corp.製の陰イオン表面活性剤である）を4.4mlの
5mM燐酸ナトリウム緩衝液（PH8.0）に希釈し
た。この溶液のPHをPH10.0〜10.1に調整しそして
1.2mlのコア／殻ポリマー粒子（前記Ｃの部参照）
を反応系に添加した。その混合物を３時間70℃に
加熱しそして室温まで放冷した。その粒子剤を
0.1％ GAFAC 含有の15nM燐酸ナトリウム緩
衝液（PH7.0）で希釈した。それら粒子を90分間
20000rpmで遠心分離してペレツトを形成し、そ
して上澄を捨てた。粒子を前記煉酸塩／
GAFAC 溶液に再懸濁しそして再遠心分離し
た。その遠心分離と再懸濁を全部で４回繰返して
未反応NHB接合体を除去した。最終洗浄の後、
その粒子剤を0.1％ GAFAC 含有の15mM燐酸
ナトリウム緩衝液（PH7.0）中で全容量を10mlと
した。 Ｅ β−ガラクトシダーゼ活性（従来技術） すべての検定はaca 個別（discrete）臨床分
析器（Du pont社製）で37℃で行つた。 酵素β−ガラクトシダーゼ（Sigma Chemical社
製）の原液を製造元の測定した活性基準で4.5×
103単位／mlの濃度で調製した。そのβ−ガラク
トシダーゼ原液の連続希釈液を4.5×103〜4.5×
10-3単位／mlの範囲にわたつて調製した。各β−
ガラクトシダーゼ希釈液の0.05ml試料をaca 分
析試験パツクに自動的に注入し次いで３％のポリ
エチレングコール8000，0.1％GAFAC および
2mMの塩化マグネシウムを含む0.15Mホスフエ
ート緩衝液（PH7.8）4.95mlを注入した。次にそ
のパツクの内容物を37℃に加熱し、そして酵素反
応をｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（ONPG）を0.1mMの最終濃度となるよ
う添加することにより開始した。酵素活性は
ONPG添加の29秒後および46秒後における
405nmでの吸光度差（変化速度）を測定すること
により測定した。 Ｆ 本発明の凝集阻害方式を用いたβ−ガラクト
シダーゼ活性 Ｅの部で調製したβ−ガラクトシダーゼ連続希
釈液をこらの実験にも用いた。各β−ガラクトシ
ダーゼ希釈液の0.05ml試料をaca 分析試験パツ
クに自動的に注入し、次いで３％ポリエチレング
リコール8000、0.1％GAFAC および2mM塩化
マグネシウムを含有する0.15Mホスフエート緩衝
液（PH7.8）4.95mlを注入した。そのパツクの内
容物を37℃に加熱し、そして最初の４つのパツク
凹部の試剤を放出した。この時点での反応混合物
は0.1mM ONPGと、前記Ｄの部で合成された
NHB粒子試剤の固体分0.016％からなつていた。
比濁分析阻害反応は、3.5分後に前記Ｂの部で調
製した学兎抗−NHB抗血清0.008mlを添加するこ
とにより開始した。粒子凝集よる濁度増加は、抗
体添加の29秒後および46秒後の405nmにおける吸
光度差（変化速度）として測定された。第３表は
従来技術の方法と本発明の方法とよりなるβ−ガ
ラクトシダーゼ活性のデータを示す。 第表のデータは、従来技術の方法が0.25〜2.5
単位／mlの感度を有したのに対し、本発明により
提供される方法は約2.5×10-4単位／mlの感度を
有する（これはほぼ1000倍の増加に相当する）こ
とを示している。
【表】
実施例 ２
ジゴキシンの測定
以下の実施例は、本発明により提供される方法
が検体中の0.5ng／mlという少量のジゴキシンを
測定できることを示す。本発明の第２の観点を例
示するこの実施例では、被分析物はジゴキシンで
ある。第１結合パートナーは抗−ジゴキシンＦ
（ab′）2抗体断片とし、これを酵素β−ガラクトシ
ダーゼに結合して接合体を形成した。結合接合体
の遊離接合体からの分離は、ウワバインで被覆架
橋デキステランのビーズを用いたアフイニテイカ
ラムを用いて行つた。高屈折性粒子は、ポリビニ
ールナフタレンの中間殻とポリグリシジルメタク
リレートの外殻を有するポリスチレンコアを含有
した。そのリガンドは４−アミノ−２−ニトロフ
エノールとした。第２結合パートナーはキーホー
ル・リンペツト・ヘモシアニンに結合された３−
ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸よりなる免疫原
に対して調製されたモノクローナル抗体とした。
この抗体はｏ−ニトロフエノールに対し高い交叉
反応性を示した。基質は、ｏ−ニトロフエニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドとした。この方法は
凝集阻害方式で行つた。凝集速度は、２つの所定
の時点で405nmにおける光学密度を測定すること
により測定した。 Ａ 抗体−酵素接合体の合成 ジゴキシン−特異抗体をウワバイン−ヒト血清
アルブミン（HSA）免疫収着剤を用いて家兎全
血清から直接免疫精製した。 ウワバインは、タンパク（HSA）スペーサ
ー・アームを通してアガロースマトリツクスに結
合した。第１段階ではウワバイン−アルブミン接
合体を合成した。ウワバイン（0.56ミリモルを20
mlの水に溶解）をメタ過沃素酸ナトリウム（1.02
ミリモル）を用い室温で１時間暗所で酸化した。
定量的な酸化は、酢酸エチル：メタノール：
H2O（75：25：１）中で展開されるシリカゲルＧ
プートでの薄層クロマトグラフイにより確認し
た。過剰の過沃素酸塩はその水性混合物を
DOWEX AG−１×８イオンの３mlカラムに通
すことによつて除去した。ウワバインの定量的回
収は次の放射標識（トリチウム化した）ウワバイ
ンにより確認した。酸化されたウワバインの溶液
を0.4mlの５％Na2CO3の添加によりPH9.5に緩衝
し、そして20mlのHSA溶液（28mg／ml）と合一
した。45分後、接合体を20mlの水に用時溶解した
0.3ｇ水素化ホウ素ナトリウムの添加により還元
した。３時間後、８mlの1M蟻酸を添加してその
PHを6.5まで下げた。PH6.5（で１時間後、そのPH
を1MNH4OHでPH7.5まで上げた。全反応溶液を
徹底的に蒸留水に対して透析し、次いで最終的
に、0.015M燐酸ナトリウム緩衝液、PH7.8、
0.15M NaClに対して透析した。その接合体を
Amicon PM−30膜で4.2mg／mlまで濃縮した。
タンパク濃度は、当該技術分野において周知の
Lowry法により測定した。 そのウワバイン−HSA接合体をBio−Radマニ
ユアルに記載の手順を用いてAffi−Gel 10（Bio
−Rad Laboratories製）に固定した。 Affi−Gel 10（25ml）を75mlの氷冷水で洗浄し
た。そのゲルを透析済みのウワバイン−HSA接
合体に添加しそして揺動器上で４℃で一夜混合し
た。過剰の活性エステル基は室温で１時間0.1ml
の1Mエタノールアミン（PH8.0）を添加すること
によりクエンチした。最後にそのゲルを蒸留水で
充分洗浄し、次いで順次500mlの0.5M NaCl、
400mlの0.1Mグリシン（PH2.5）、300mlの2.5M
NH4SCN、1000mlのホスフエート緩衝食塩水で
洗浄した。ウワバイン・アフイニテイ樹脂を６ml
の床容量となるまでカラム（0.7×15cm）内に充
填し、そしてホスフエート緩衝食塩水で平衡し
た。抗血清（単因子抗体濃度4.5mg／mlのCappel
抗ジゴキシン血清10ml）を１ml／分の流速でカラ
ムにかけた。そのカラムを280nmにおける吸光度
が基線（0.01）に達するまでホスフエート緩衝食
塩水で洗浄した。次に60mlの3M NH4SCN（PH
7.5）を用いて抗体をカラムから溶出しそして直
ちに４×２入れ換えのホスフエート緩衝食塩水
に対し４℃で透析した。 アフイニテイ精製抗ジゴキシン抗体（27ml）を
Amicon撹拌セル装置（PM−30膜）で2.7mlに濃
度した。最終タンパク濃度は10mg／mlであつた。
その試料を1000mlの0.1M酢酸ナトリウム（PH
4.5）に対して４℃で４時間透析した。透析後、
同じ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解したペプシンの
10mg／ml溶液0.02mlを添加し、そして温度を37℃
まで20時間高めた。この消化時間後、試料を手短
かに遠心分離することにより清澄化し、次いで
0.015M燐酸ナトリウム（PH7.4）、0.15M NaCl
（ホスフエート緩衝食塩水）で平衡したSephadex
Ｇ−150カラム（1.5×90cm）でのクロマトグラフ
イにかけた。ゲル電気泳動により同定されるＦ
（ab′）2断片含有カラム画分をプールし（19.2ml）
次いで加圧過（PM−30 Amicon膜）により
2.7mlまで濃縮した。 １mlのアフイニテイ精製抗ジゴキシンＦ（ab′）2
断片（0.015M燐酸ナトリウム、0.15M NaCl、
1mM EDTA、（PH7.0）中タンパク濃度2.85mg／
ml）をジメチルホルムアミドに溶解したスクシン
イミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）の
60mM溶液0.0091mlと23〜25℃で混合した。60分
後、その溶液を同じ燐酸ナトリウム−NaCl−
EDTA溶液中で平衡したSephadex Ｇ−25カラ
ム（1.5×30cm）で脱塩することによつて反応を
止めた。ボイド（void）容量で溶出した蛋白を集
め、Amicon撹拌セル濃縮器（PM−30膜）を用
いて１mlまで濃縮した。１mlの0.05M Tris
HCl、0.15M NaCl、1mM MgCl2（PH7.5）に溶
解した24mgのβ−ガラクトシダーゼをＦ（ab′）2−
SMCCアダクトに添加しそして４℃で20時間反応
させた。２−メルカプトエタノールの0.1M溶液
0.01mlを４℃で１時間添加することにより反応を
止めた。Ｆ（ab′）2−β−ガラクトシダーゼ接合体
は、４℃で0.05M Tris−HCl、0.15M NaCl、
1mM MgCl2（PH7.5）中で平衡したSepharose4B
カラム（1.5×90cm）でのクロマトグラフイによ
り未反応β−ガラクトシダーゼから分離した。 Ｂ ウワバイン樹脂の合成 ウワバインを牛血清アルブミン（BSA）を介
してSephadex Ｇ−10に至適割合で結合した。 ウワバイン−BSAを５ｇのウワバイン・10水
和物を500mlの熱蒸留水（70℃）に溶解すること
により調製した。その溶液を25℃まで放冷し、
7.3ｇのメタ過沃素酸ナトリウムを添加した後暗
所で２時間25℃で連続的に混合した。次にその混
合物を250mlのDowex（1X8）陰イオン交換樹脂
床に通すことにより酸化を止めた。溶出液を集め
そして1M燐酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）に溶解
した牛血清アルブミンの溶液（10ｇ／500ml）と
合一した。25℃で１時間後、0.64ｇのナトリウム
シアノボロハイドライドを撹拌しながら添加しそ
してその混合物を25℃で72時間インキユベートさ
せた。未結合ウワバインはそのウワバイン−
BSA接合体溶液を蒸留水の流水に対し24時間、
次いで20容の0.015M燐酸ナトリウム緩衝液（PH
7.0）に対し４℃で透析することにより混合物か
ら除去した。その接合体溶液の最終イオン強度
を、Sephadex樹脂に結合する前に14.6ｇのNaCl
を添加することにより0.25Mに調節した。 Sephadex Ｇ−10（420ｇ（Pharmacie Fine
Chemicals製）を2000mlの蒸留水中で１時間膨潤
させた。樹脂微細物を３×2000mlの水を用いて傾
瀉および再懸濁を行うことにより除去した。次に
20ｇの溶存メタ過沃素酸ナトリウムを含む1000ml
の水に再懸濁液により酸化した。10分後に、樹脂
を５×2000mlの水、次いで4000mlの0.25M燐酸ナ
トリウム緩衝液（PH7.0）を用いて洗浄した。傾
瀉した樹脂を1000mlのウワバイン−BSA溶液
（前記の如く調整したもの）に再懸濁し、25℃で
１時間混合させ、次いで0.66ｇのナトリウムシア
ノボロハイドライドと混合した。72時間後、その
樹脂を4000mlの0.1％ドデシル硫酸ナトリウムの
水溶液、12の蒸留水、次いで4000mlの0.15M燐
酸ナトリウム緩衝液（PH7.1）を用いて充分洗浄
した。最終的な樹脂は、Du Pont aca 個別臨
床分析器での自動分析に用いるため小カラム
（0.5×７cm）に充填したスラリーとした。 Ｃ モノクローナル抗・NHB抗体 ｏ−ニトロフエノールに対し交叉反応性を示す
抗体の産生に用いられる３−ニトロ−４−ヒドロ
キシ安息香酸／KLH接合体の合成は実施例１の
Ａの部に記載されている。 １ マウス免疫 ２匹のBALB／Ｃ系マウスにそれぞれ、0.1mg
の、完全フロインドアジユバント0.25mlに乳化さ
れたNHB−KLH（全容量はマウス１匹あたり0.5
ml）を腹腔内注射した。21日間隔でブースター注
射を５回行つた（不完全フロインドアジユバント
中に0.1mgのNHB−KLHを含む）。６回目のブー
ストは５回目のブースターから49日後に投与し
た。最終的な（７回目）のブーストは６回目のブ
ーストの21日後とした。融合は最終的ブーストの
４日後に行つた。 ２ 融 合 脾臓を無菌的に除去し、そしてそら脾臓をワイ
ヤーメツシユを通すことによつて単一細胞懸濁液
を調製した。脾臓細胞を3.5×107個のP3Ag8.653
ネズミ骨髄腫細胞（脾細胞：骨髄腫細胞＝4.5：
１の比）と融合した。1.8mlポリエチレングリコ
ール（PEG）溶液（42％ｖ／ｖ PEG3350、45.2
％培地および7.5％ジメチルスルホキシド）を、
血清不含培地で洗浄済みの骨髄腫および脾細胞の
ペレツトに添加することにより融合を行つた。そ
の混合物を１分間放置した。次に１mlの血清不含
培地を１分間かけてゆつくりと添加した。次に40
mlの血清不含培地を５分間かけて添加した。
HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび
チミジン）と牛胎児血清を含む40mlのIscove培地
中のフイーダー細胞（腹腔浸出液マクロフアー
ジ）を添加した。総量80mlを20個の96ウエル微量
滴定プレートにとつた。１週間の培養後（７％
CO2インキユベータ）にクローンが検出された。 ３ スクリーニング 融合の４週間後に上澄を収獲した。粒子増強比
濁分析イムノアツセイ（米国特許第4401765号明
細書参照）を用いてそらを抗体活性についてスク
リーニングした。NHB粒子試剤（実施例１のＤ
の部で得た0.05mlの粒子試剤を10mlの緩衝液に添
加）を含む0.075mlの緩衝液（150mMホスフエー
ト、３％PEG8000、0.1GAFAC 、2mM
MgCl2）（PH7.8）を入れた微量滴定ウエルに上澄
（0.025ml）を添加した。そのプレートの内容物を
37℃で５分間インキユベートし、次いで粒子の凝
集を調べた。700クローンのうちから全部で９個
の陽性セルラインが検出された。次にこれら上澄
を、その培養上澄の添加前にNHB−BSAを微量
滴定ウエル内の粒子試剤緩衝液に添加することに
より遊離NHB−BSAを結合する能力についてス
クリーニングした。９個のクローンはすべて、凝
集を行つた際凝集阻害（濁りの欠除）を示した。 ４ クローニング それらのセルラインを半制限（semi−
limiting）希釈（ウエルあたり略１個の細胞）で
クローンした。更にアリコートの細胞を亡失に対
するセーフガードとして液体窒素中で凍結してお
いた。フイーダー細胞（腹腔マクロフアージ）を
用いて増殖を促進した。クローンが充分大きくな
つたら、培養上澄を前述のＣ(3)の部に記載の如く
抗体について再試験した。 次に興味ある細胞を厳密なポアツソン統計を用
い、制限希釈でのクローニングに対し選択した。
ウエル内に充分な数の細胞が存在するようになつ
たら、上澄を再び抗体について試験した。次にリ
クローンを貯蔵のため凍結した。 ５ 鎖組成 次のセルラインにより産生された抗体のＨ鎖組
成を特異試剤を用いた寒天ゲルでの二重拡散によ
り測定した。 セルライン Ｈ鎖アイソタイプ ２／１ γ3 ２／２ γ1 ２／３ γ1 ２／４ γ1 ２／５ γ1 ２／６ γb ２／７ γ1 ２／８ γ1 Ｄ NHB同族体のポリマー粒子への結合 ４−アミノ−２−ニトロフエノール（ANP）
の0.5M溶液を385mgを５mlのジメチルスルホキシ
ドに溶解することにより調製した。その0.5M
ANP溶液（0.2ml）を、0.12mlの10％GAFAC
を含む7.75mlの5mM燐酸ナトリウム（PH8.0）に
添加した。その混合物のPHを10.0〜10.1に調整し
た。次に1.93mlのコア／殻ポリマー粒子（実施例
１、Ｃの部）をANP混合物に添加しそして70℃
まで３時間加熱した。得られた粒子試剤を、
15mM燐酸ナトリウム、0.1％GAFAC （PH7.0）
に希釈しそして冷凍遠心器で20000rpmで90分間
遠心分離することにより洗浄した。この洗浄手順
は全部で５回行つた。最終洗浄の後、その粒子試
剤ペレツトを、15mM燐酸ナトリウム緩衝液、
0.1％GAFAC （PH7.0）中で全量を10mlとした。
その粒子試剤を２のホスフエート／GAFAC
洗浄用緩衝液に対して一夜透析した。 Ｅ アフイニテイカラム介在イムノアツセイを用
いたジゴキシン検定 すべてのアツセイはaca 個別臨床分析器で37
℃で行つた。等容のジゴキシン含有ヒト血清試料
と前記Ａの部で調製した抗体−酵素接合体を混合
しそして25℃で15分間インキユベートした。イン
キユベーシヨン後、0.4mlアリリコートのその試
料混合物をaca 分析試験パツクに自動注入しそ
してパツクへツダーのカラム（前記Ｂの部）を通
して溶出した。試料の後に２mlの0.15Mホスフエ
ート緩衝液（PH7.8）が続いた。カラム溶出速度
は0.034ml／秒とした。次にそのパツクにニード
ル位置２（これはカラムをバイパスする）におい
て更に2.60mlの水を充填した。次にそのパツクの
内容物を37℃に加熱し、そして最初の４個のパツ
ク凹部中の試剤を放出した。この時点での反応混
合物は100mM HEPES緩衝液、50mMホスフエ
ート緩衝液（PH7.6）および2mM塩化マグネシウ
ムからなつていた。3.5分後にONPGを反応混合
物に最終濃度が2mMとなるよう添加することに
より酵素反応を開始した。酵素活性は、ONPG
添加の29秒および46秒後の405nmでの吸光度差
（変化速度）を測定することにより測定した。 Ｆ 粒子凝集阻害を用いたジゴキシン検定の増幅 すべてのアツセイはaca 個別臨床分析器で37
℃で行つた。血清試料とＡの部で調製された抗体
−酵素接合体とを等容ずつ混合しそして25で15分
間インキユベートした。インキユベーシヨン後、
0.04mlアリコートのその試料混合物をaca 分析
試験パツクに自動注入し、そしてパツクヘツダー
のカラム（前記Ｂの部）を通して溶出した。試料
の後に２mlの0.15Mホスフエート緩衝液（PH7.8）
が続いた。カラム溶出速度は0.034ml／秒とした。
次にそのパツクにニードル位置２（これはカラム
をバイパスする）において更に2.96mlの0.15Mホ
スフエート緩衝液（PH7.8）を充填した。次にそ
のパツクの内容物を37℃に加熱しそして最初の４
個のパク凹部中の試剤を放出した。この時点で反
応混合物は4.96mlのホスフエート緩衝液（PH
7.8）、0.1％GAFAC 、1.46％（ｗ／ｖ）
PEG8000および0.02％（ｗ／ｖ）ポリマー粒子固
体分（前記Ｄの部）からなつていた。3.5分後に
モノクローナル抗−NHB腹水液（0.009ml、クロ
ーン2/4）の添加により比濁測定阻害反応を開始
した。粒子凝集による濁度増加を、抗体添加の29
秒および46秒後の405nmにおける吸光度差（変化
速度）として測定した。第４表は未増幅イムノア
ツセイ結果および本発明の方法を用いた増幅結果
の比較データを示す。この比較により本発明は試
料のサイズを１／10に減少させることができると同 時に信号生成を約５倍増大させることができるこ
とを示している。
が検体中の0.5ng／mlという少量のジゴキシンを
測定できることを示す。本発明の第２の観点を例
示するこの実施例では、被分析物はジゴキシンで
ある。第１結合パートナーは抗−ジゴキシンＦ
（ab′）2抗体断片とし、これを酵素β−ガラクトシ
ダーゼに結合して接合体を形成した。結合接合体
の遊離接合体からの分離は、ウワバインで被覆架
橋デキステランのビーズを用いたアフイニテイカ
ラムを用いて行つた。高屈折性粒子は、ポリビニ
ールナフタレンの中間殻とポリグリシジルメタク
リレートの外殻を有するポリスチレンコアを含有
した。そのリガンドは４−アミノ−２−ニトロフ
エノールとした。第２結合パートナーはキーホー
ル・リンペツト・ヘモシアニンに結合された３−
ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸よりなる免疫原
に対して調製されたモノクローナル抗体とした。
この抗体はｏ−ニトロフエノールに対し高い交叉
反応性を示した。基質は、ｏ−ニトロフエニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドとした。この方法は
凝集阻害方式で行つた。凝集速度は、２つの所定
の時点で405nmにおける光学密度を測定すること
により測定した。 Ａ 抗体−酵素接合体の合成 ジゴキシン−特異抗体をウワバイン−ヒト血清
アルブミン（HSA）免疫収着剤を用いて家兎全
血清から直接免疫精製した。 ウワバインは、タンパク（HSA）スペーサ
ー・アームを通してアガロースマトリツクスに結
合した。第１段階ではウワバイン−アルブミン接
合体を合成した。ウワバイン（0.56ミリモルを20
mlの水に溶解）をメタ過沃素酸ナトリウム（1.02
ミリモル）を用い室温で１時間暗所で酸化した。
定量的な酸化は、酢酸エチル：メタノール：
H2O（75：25：１）中で展開されるシリカゲルＧ
プートでの薄層クロマトグラフイにより確認し
た。過剰の過沃素酸塩はその水性混合物を
DOWEX AG−１×８イオンの３mlカラムに通
すことによつて除去した。ウワバインの定量的回
収は次の放射標識（トリチウム化した）ウワバイ
ンにより確認した。酸化されたウワバインの溶液
を0.4mlの５％Na2CO3の添加によりPH9.5に緩衝
し、そして20mlのHSA溶液（28mg／ml）と合一
した。45分後、接合体を20mlの水に用時溶解した
0.3ｇ水素化ホウ素ナトリウムの添加により還元
した。３時間後、８mlの1M蟻酸を添加してその
PHを6.5まで下げた。PH6.5（で１時間後、そのPH
を1MNH4OHでPH7.5まで上げた。全反応溶液を
徹底的に蒸留水に対して透析し、次いで最終的
に、0.015M燐酸ナトリウム緩衝液、PH7.8、
0.15M NaClに対して透析した。その接合体を
Amicon PM−30膜で4.2mg／mlまで濃縮した。
タンパク濃度は、当該技術分野において周知の
Lowry法により測定した。 そのウワバイン−HSA接合体をBio−Radマニ
ユアルに記載の手順を用いてAffi−Gel 10（Bio
−Rad Laboratories製）に固定した。 Affi−Gel 10（25ml）を75mlの氷冷水で洗浄し
た。そのゲルを透析済みのウワバイン−HSA接
合体に添加しそして揺動器上で４℃で一夜混合し
た。過剰の活性エステル基は室温で１時間0.1ml
の1Mエタノールアミン（PH8.0）を添加すること
によりクエンチした。最後にそのゲルを蒸留水で
充分洗浄し、次いで順次500mlの0.5M NaCl、
400mlの0.1Mグリシン（PH2.5）、300mlの2.5M
NH4SCN、1000mlのホスフエート緩衝食塩水で
洗浄した。ウワバイン・アフイニテイ樹脂を６ml
の床容量となるまでカラム（0.7×15cm）内に充
填し、そしてホスフエート緩衝食塩水で平衡し
た。抗血清（単因子抗体濃度4.5mg／mlのCappel
抗ジゴキシン血清10ml）を１ml／分の流速でカラ
ムにかけた。そのカラムを280nmにおける吸光度
が基線（0.01）に達するまでホスフエート緩衝食
塩水で洗浄した。次に60mlの3M NH4SCN（PH
7.5）を用いて抗体をカラムから溶出しそして直
ちに４×２入れ換えのホスフエート緩衝食塩水
に対し４℃で透析した。 アフイニテイ精製抗ジゴキシン抗体（27ml）を
Amicon撹拌セル装置（PM−30膜）で2.7mlに濃
度した。最終タンパク濃度は10mg／mlであつた。
その試料を1000mlの0.1M酢酸ナトリウム（PH
4.5）に対して４℃で４時間透析した。透析後、
同じ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解したペプシンの
10mg／ml溶液0.02mlを添加し、そして温度を37℃
まで20時間高めた。この消化時間後、試料を手短
かに遠心分離することにより清澄化し、次いで
0.015M燐酸ナトリウム（PH7.4）、0.15M NaCl
（ホスフエート緩衝食塩水）で平衡したSephadex
Ｇ−150カラム（1.5×90cm）でのクロマトグラフ
イにかけた。ゲル電気泳動により同定されるＦ
（ab′）2断片含有カラム画分をプールし（19.2ml）
次いで加圧過（PM−30 Amicon膜）により
2.7mlまで濃縮した。 １mlのアフイニテイ精製抗ジゴキシンＦ（ab′）2
断片（0.015M燐酸ナトリウム、0.15M NaCl、
1mM EDTA、（PH7.0）中タンパク濃度2.85mg／
ml）をジメチルホルムアミドに溶解したスクシン
イミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）の
60mM溶液0.0091mlと23〜25℃で混合した。60分
後、その溶液を同じ燐酸ナトリウム−NaCl−
EDTA溶液中で平衡したSephadex Ｇ−25カラ
ム（1.5×30cm）で脱塩することによつて反応を
止めた。ボイド（void）容量で溶出した蛋白を集
め、Amicon撹拌セル濃縮器（PM−30膜）を用
いて１mlまで濃縮した。１mlの0.05M Tris
HCl、0.15M NaCl、1mM MgCl2（PH7.5）に溶
解した24mgのβ−ガラクトシダーゼをＦ（ab′）2−
SMCCアダクトに添加しそして４℃で20時間反応
させた。２−メルカプトエタノールの0.1M溶液
0.01mlを４℃で１時間添加することにより反応を
止めた。Ｆ（ab′）2−β−ガラクトシダーゼ接合体
は、４℃で0.05M Tris−HCl、0.15M NaCl、
1mM MgCl2（PH7.5）中で平衡したSepharose4B
カラム（1.5×90cm）でのクロマトグラフイによ
り未反応β−ガラクトシダーゼから分離した。 Ｂ ウワバイン樹脂の合成 ウワバインを牛血清アルブミン（BSA）を介
してSephadex Ｇ−10に至適割合で結合した。 ウワバイン−BSAを５ｇのウワバイン・10水
和物を500mlの熱蒸留水（70℃）に溶解すること
により調製した。その溶液を25℃まで放冷し、
7.3ｇのメタ過沃素酸ナトリウムを添加した後暗
所で２時間25℃で連続的に混合した。次にその混
合物を250mlのDowex（1X8）陰イオン交換樹脂
床に通すことにより酸化を止めた。溶出液を集め
そして1M燐酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）に溶解
した牛血清アルブミンの溶液（10ｇ／500ml）と
合一した。25℃で１時間後、0.64ｇのナトリウム
シアノボロハイドライドを撹拌しながら添加しそ
してその混合物を25℃で72時間インキユベートさ
せた。未結合ウワバインはそのウワバイン−
BSA接合体溶液を蒸留水の流水に対し24時間、
次いで20容の0.015M燐酸ナトリウム緩衝液（PH
7.0）に対し４℃で透析することにより混合物か
ら除去した。その接合体溶液の最終イオン強度
を、Sephadex樹脂に結合する前に14.6ｇのNaCl
を添加することにより0.25Mに調節した。 Sephadex Ｇ−10（420ｇ（Pharmacie Fine
Chemicals製）を2000mlの蒸留水中で１時間膨潤
させた。樹脂微細物を３×2000mlの水を用いて傾
瀉および再懸濁を行うことにより除去した。次に
20ｇの溶存メタ過沃素酸ナトリウムを含む1000ml
の水に再懸濁液により酸化した。10分後に、樹脂
を５×2000mlの水、次いで4000mlの0.25M燐酸ナ
トリウム緩衝液（PH7.0）を用いて洗浄した。傾
瀉した樹脂を1000mlのウワバイン−BSA溶液
（前記の如く調整したもの）に再懸濁し、25℃で
１時間混合させ、次いで0.66ｇのナトリウムシア
ノボロハイドライドと混合した。72時間後、その
樹脂を4000mlの0.1％ドデシル硫酸ナトリウムの
水溶液、12の蒸留水、次いで4000mlの0.15M燐
酸ナトリウム緩衝液（PH7.1）を用いて充分洗浄
した。最終的な樹脂は、Du Pont aca 個別臨
床分析器での自動分析に用いるため小カラム
（0.5×７cm）に充填したスラリーとした。 Ｃ モノクローナル抗・NHB抗体 ｏ−ニトロフエノールに対し交叉反応性を示す
抗体の産生に用いられる３−ニトロ−４−ヒドロ
キシ安息香酸／KLH接合体の合成は実施例１の
Ａの部に記載されている。 １ マウス免疫 ２匹のBALB／Ｃ系マウスにそれぞれ、0.1mg
の、完全フロインドアジユバント0.25mlに乳化さ
れたNHB−KLH（全容量はマウス１匹あたり0.5
ml）を腹腔内注射した。21日間隔でブースター注
射を５回行つた（不完全フロインドアジユバント
中に0.1mgのNHB−KLHを含む）。６回目のブー
ストは５回目のブースターから49日後に投与し
た。最終的な（７回目）のブーストは６回目のブ
ーストの21日後とした。融合は最終的ブーストの
４日後に行つた。 ２ 融 合 脾臓を無菌的に除去し、そしてそら脾臓をワイ
ヤーメツシユを通すことによつて単一細胞懸濁液
を調製した。脾臓細胞を3.5×107個のP3Ag8.653
ネズミ骨髄腫細胞（脾細胞：骨髄腫細胞＝4.5：
１の比）と融合した。1.8mlポリエチレングリコ
ール（PEG）溶液（42％ｖ／ｖ PEG3350、45.2
％培地および7.5％ジメチルスルホキシド）を、
血清不含培地で洗浄済みの骨髄腫および脾細胞の
ペレツトに添加することにより融合を行つた。そ
の混合物を１分間放置した。次に１mlの血清不含
培地を１分間かけてゆつくりと添加した。次に40
mlの血清不含培地を５分間かけて添加した。
HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび
チミジン）と牛胎児血清を含む40mlのIscove培地
中のフイーダー細胞（腹腔浸出液マクロフアー
ジ）を添加した。総量80mlを20個の96ウエル微量
滴定プレートにとつた。１週間の培養後（７％
CO2インキユベータ）にクローンが検出された。 ３ スクリーニング 融合の４週間後に上澄を収獲した。粒子増強比
濁分析イムノアツセイ（米国特許第4401765号明
細書参照）を用いてそらを抗体活性についてスク
リーニングした。NHB粒子試剤（実施例１のＤ
の部で得た0.05mlの粒子試剤を10mlの緩衝液に添
加）を含む0.075mlの緩衝液（150mMホスフエー
ト、３％PEG8000、0.1GAFAC 、2mM
MgCl2）（PH7.8）を入れた微量滴定ウエルに上澄
（0.025ml）を添加した。そのプレートの内容物を
37℃で５分間インキユベートし、次いで粒子の凝
集を調べた。700クローンのうちから全部で９個
の陽性セルラインが検出された。次にこれら上澄
を、その培養上澄の添加前にNHB−BSAを微量
滴定ウエル内の粒子試剤緩衝液に添加することに
より遊離NHB−BSAを結合する能力についてス
クリーニングした。９個のクローンはすべて、凝
集を行つた際凝集阻害（濁りの欠除）を示した。 ４ クローニング それらのセルラインを半制限（semi−
limiting）希釈（ウエルあたり略１個の細胞）で
クローンした。更にアリコートの細胞を亡失に対
するセーフガードとして液体窒素中で凍結してお
いた。フイーダー細胞（腹腔マクロフアージ）を
用いて増殖を促進した。クローンが充分大きくな
つたら、培養上澄を前述のＣ(3)の部に記載の如く
抗体について再試験した。 次に興味ある細胞を厳密なポアツソン統計を用
い、制限希釈でのクローニングに対し選択した。
ウエル内に充分な数の細胞が存在するようになつ
たら、上澄を再び抗体について試験した。次にリ
クローンを貯蔵のため凍結した。 ５ 鎖組成 次のセルラインにより産生された抗体のＨ鎖組
成を特異試剤を用いた寒天ゲルでの二重拡散によ
り測定した。 セルライン Ｈ鎖アイソタイプ ２／１ γ3 ２／２ γ1 ２／３ γ1 ２／４ γ1 ２／５ γ1 ２／６ γb ２／７ γ1 ２／８ γ1 Ｄ NHB同族体のポリマー粒子への結合 ４−アミノ−２−ニトロフエノール（ANP）
の0.5M溶液を385mgを５mlのジメチルスルホキシ
ドに溶解することにより調製した。その0.5M
ANP溶液（0.2ml）を、0.12mlの10％GAFAC
を含む7.75mlの5mM燐酸ナトリウム（PH8.0）に
添加した。その混合物のPHを10.0〜10.1に調整し
た。次に1.93mlのコア／殻ポリマー粒子（実施例
１、Ｃの部）をANP混合物に添加しそして70℃
まで３時間加熱した。得られた粒子試剤を、
15mM燐酸ナトリウム、0.1％GAFAC （PH7.0）
に希釈しそして冷凍遠心器で20000rpmで90分間
遠心分離することにより洗浄した。この洗浄手順
は全部で５回行つた。最終洗浄の後、その粒子試
剤ペレツトを、15mM燐酸ナトリウム緩衝液、
0.1％GAFAC （PH7.0）中で全量を10mlとした。
その粒子試剤を２のホスフエート／GAFAC
洗浄用緩衝液に対して一夜透析した。 Ｅ アフイニテイカラム介在イムノアツセイを用
いたジゴキシン検定 すべてのアツセイはaca 個別臨床分析器で37
℃で行つた。等容のジゴキシン含有ヒト血清試料
と前記Ａの部で調製した抗体−酵素接合体を混合
しそして25℃で15分間インキユベートした。イン
キユベーシヨン後、0.4mlアリリコートのその試
料混合物をaca 分析試験パツクに自動注入しそ
してパツクへツダーのカラム（前記Ｂの部）を通
して溶出した。試料の後に２mlの0.15Mホスフエ
ート緩衝液（PH7.8）が続いた。カラム溶出速度
は0.034ml／秒とした。次にそのパツクにニード
ル位置２（これはカラムをバイパスする）におい
て更に2.60mlの水を充填した。次にそのパツクの
内容物を37℃に加熱し、そして最初の４個のパツ
ク凹部中の試剤を放出した。この時点での反応混
合物は100mM HEPES緩衝液、50mMホスフエ
ート緩衝液（PH7.6）および2mM塩化マグネシウ
ムからなつていた。3.5分後にONPGを反応混合
物に最終濃度が2mMとなるよう添加することに
より酵素反応を開始した。酵素活性は、ONPG
添加の29秒および46秒後の405nmでの吸光度差
（変化速度）を測定することにより測定した。 Ｆ 粒子凝集阻害を用いたジゴキシン検定の増幅 すべてのアツセイはaca 個別臨床分析器で37
℃で行つた。血清試料とＡの部で調製された抗体
−酵素接合体とを等容ずつ混合しそして25で15分
間インキユベートした。インキユベーシヨン後、
0.04mlアリコートのその試料混合物をaca 分析
試験パツクに自動注入し、そしてパツクヘツダー
のカラム（前記Ｂの部）を通して溶出した。試料
の後に２mlの0.15Mホスフエート緩衝液（PH7.8）
が続いた。カラム溶出速度は0.034ml／秒とした。
次にそのパツクにニードル位置２（これはカラム
をバイパスする）において更に2.96mlの0.15Mホ
スフエート緩衝液（PH7.8）を充填した。次にそ
のパツクの内容物を37℃に加熱しそして最初の４
個のパク凹部中の試剤を放出した。この時点で反
応混合物は4.96mlのホスフエート緩衝液（PH
7.8）、0.1％GAFAC 、1.46％（ｗ／ｖ）
PEG8000および0.02％（ｗ／ｖ）ポリマー粒子固
体分（前記Ｄの部）からなつていた。3.5分後に
モノクローナル抗−NHB腹水液（0.009ml、クロ
ーン2/4）の添加により比濁測定阻害反応を開始
した。粒子凝集による濁度増加を、抗体添加の29
秒および46秒後の405nmにおける吸光度差（変化
速度）として測定した。第４表は未増幅イムノア
ツセイ結果および本発明の方法を用いた増幅結果
の比較データを示す。この比較により本発明は試
料のサイズを１／10に減少させることができると同 時に信号生成を約５倍増大させることができるこ
とを示している。
【表】
実施例 ３
ヒト繊毛ゴナドトロピン（hCG）の測定
次の実施例は本発明により提供される方法が検
体中の臨床上有意レベルの被分析物ヒト繊毛ゴナ
ドトロピン（hCG）を測定できることを示す。 第１結合パートナーは抗−β−hCG抗体とし
た。結合接合体の遊離接合体からの分離は、hCG
で被覆された固体支持体を含むアフイニテイカラ
ムを用いて行つた。高屈折性粒子はポリビニール
ナフタレンの中間殻およびポリグリシジルメタク
リレートの外殻を有するポリスチレンコアを含有
した。リガンドは４−アミノ−２−ニトロフエノ
ールとした。第２結合パートナーは、キーホー
ル・リンペツト・ヘモシアニンに結合された３−
ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸よりなる免疫原
に対して調製されたモノクローナル抗体とした。
その抗体はｏ−ニトロフエノールおよび４−アミ
ノ−２−ニトロフエノールに対して極めて交叉反
応性であつた。基質はｏ−ニトロフエニル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシドとした。この方法は凝集
阻害方式で行つた。凝集速度は２つの所定時間に
おける405nmでの光学密度を測定することにより
測定した。 Ａ 抗体−酵素接合体の合成 ６mgのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（EIAグレー
ド、Boehringer−Mannheim社製）を３mlの
0.05Tris HCl（PH7.0）、0.14M NaCl 1mM
MgCl2、5mM EDTAに溶解し、次いで1.1μlの
Ｎ，N′−ジメチルホルムアミドに溶解した
14.7μgのｏ−フエニレン−ジマイミドと混合し
た。４℃で16時間後、その混合物を前述と同じ
Tris−NaCl−MgCl2−EDTA緩衝液を用いて
Sephadex Ｇ−25カラム（1.5×40cm）でのクロ
マトグラフイにかけた。重合したβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼをボイド容量画分からプールした。 β−ヒト絨毛ゴナドトロピン（β−hCG、
Hibritech社製）を１の0.015M燐酸ナトリウム
（PH7.0）、1.15M NaCl、1mM EDTAに対して４
℃で16時間透析した。透析の後、抗体を5.9μlの
Ｎ，N′−ジメチルホルムアミドに溶解した59μｇ
のスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド−メ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシートと20
〜23℃で１時間反応させた。その混合物を、
0.015M燐酸ナトリウム（PH7.0）、0.15M、NaCl、
1mM EDTA中で平衡させたSephadex Ｇ−25カ
ラム（1.5×40cm）に通すことによつて反応を止
めた。カラムのボイド容量に溶出するマレイミド
−IgGアダクトをプールしそして加圧過により
1.13mlに濃縮した。 1.13ml（0.61mg／ml）のそのマレイミド−IgG
を5.73mlの前記の重合させたβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ（0.87mg／ml）と組み合わせそして４℃で
20時間行つた。その混合物を加圧過により2.0
mlに濃縮しそして次に0.05M Tris HCl（PH7.5）、
0.15M NaCl、0.0001MMgCl2中で平衡させた
Sepharose4Bカラム（1.5×90cm）でのクロマト
グラフイに４℃でかけた。IgG−β−ガラクトシ
ダーゼ接合体はカラムのボイド容量として溶出し
た（β−hCGに対する微量滴定プレートELISA
検定により確認）。 Ｂ hCG樹脂の合成 ヒト絨毛ゴナドトロピン（hCG）（Organon
Inc.製）を１，1′−カルボニルジイミダゾール活
性化Fractogel TSK HW−65F（Pierce
Chemical社製）に結合した。hCG（19.2mg）を40
mlの0.1M炭酸ナトリウム緩衝液（PH8.5）に溶解
しそしてこの緩衝液に対して透析した。40mlの樹
脂固体分を１の冷炭酸塩緩衝液で洗浄した。透
析したhCG溶液を前記ゲルに添加しそして回転器
上で４℃で一夜混合した。次にそのゲルを前記炭
酸塩緩衝液で洗浄して未結合hCGを除去した。樹
脂上のすべての残留活性基を0.05M Tris緩衝液
（PH7.5）中0.1Mグリシン80mlを添加しそして４
℃で一夜インキユベートすることによつてブロツ
クした。最後に、その樹脂を0.01％アジ化ナトリ
ウム含有0.05M Tris（PH7.5）で徹底的に洗浄し
た。 Ｃ アフイニテイカラム介在イムノアツセイを用
いたhCGアツセイ Ａの部で得た抗体−酵素接合体（0.015ml）を
各種濃度のhCGを含有する個別試料1.2mlに添加
した。0.5％ヒト血清アルブミン含有0.05M Tris
緩衝液（PH7.2）にhCGを溶解することによりキ
ヤリブレータ（calibrators）を調製した。１時
間室温でインキユベーシヨンした後に、５mlのそ
の混合物を1.2mlの0.15Mホスフエート緩衝液
（PH7.1）を用いて0.01ml／秒の流速で２ml hCG
カラム（前記Ｂの部参照）に通した。そのカラム
に結合しなかつたすべての抗体酵素接合体を含有
する1.7ml画分を集めた。 抗体−酵素接合体活性の測定はすべてDu Pont
aca 個別臨床分析器で37℃で行つた。前記1.7ml
画分を1mM塩化マグネシウム含有0.1M燐酸ナト
リウム（PH7.8）3.3mlに添加した。1.5分間インキ
ユベーシヨンを行つた後、2.8mgのONPGおよび
0.11mlの3.4M β−メルカプトエタノールを添加
することによつて反応を開始させた。抗体−酵素
接合体によるｏ−ニトロフエノールの生成に起因
する吸光度を反応開始の3.5分後に405nmでの吸
光度から600nmでの吸光度を差引いた差として測
定した（終点測定）。 Ｄ 粒子凝集阻害を用いたhCGアツセイの増幅 抗体−酵素接合体のインキユベーシヨンおよび
hCG樹脂での分離をＣの部に記載のとおり行つ
た。抗体−酵素接合体活性の測定はすべてDu
Pont aca 個別臨床分析器で37℃で行つた。そ
の1.7mlカラム画分を集め、そして0.02mlアリコ
ートを、1.46％PEG8000、0.1％GAFAC 、0.06
％ONPGおよび2mM MgCl2を含有する0.15Mホ
スフエート緩衝液（PH7.8）4.98mlに添加した。
マウスモノクローナル抗−NHB腹水液（0.02ml、
クローン2/8）を添加し、そして3.5分間のインキ
ユベーシヨンの後、2.4％固体分を含有するAND
粒子試剤（実施例2.Dの部参照）0.05mlの添加に
より反応を開始させた。粒子凝集による濁度増加
を反応開始の29秒および46秒後の406nmでの吸光
度差（変化速度）として測定した。
体中の臨床上有意レベルの被分析物ヒト繊毛ゴナ
ドトロピン（hCG）を測定できることを示す。 第１結合パートナーは抗−β−hCG抗体とし
た。結合接合体の遊離接合体からの分離は、hCG
で被覆された固体支持体を含むアフイニテイカラ
ムを用いて行つた。高屈折性粒子はポリビニール
ナフタレンの中間殻およびポリグリシジルメタク
リレートの外殻を有するポリスチレンコアを含有
した。リガンドは４−アミノ−２−ニトロフエノ
ールとした。第２結合パートナーは、キーホー
ル・リンペツト・ヘモシアニンに結合された３−
ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸よりなる免疫原
に対して調製されたモノクローナル抗体とした。
その抗体はｏ−ニトロフエノールおよび４−アミ
ノ−２−ニトロフエノールに対して極めて交叉反
応性であつた。基質はｏ−ニトロフエニル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシドとした。この方法は凝集
阻害方式で行つた。凝集速度は２つの所定時間に
おける405nmでの光学密度を測定することにより
測定した。 Ａ 抗体−酵素接合体の合成 ６mgのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（EIAグレー
ド、Boehringer−Mannheim社製）を３mlの
0.05Tris HCl（PH7.0）、0.14M NaCl 1mM
MgCl2、5mM EDTAに溶解し、次いで1.1μlの
Ｎ，N′−ジメチルホルムアミドに溶解した
14.7μgのｏ−フエニレン−ジマイミドと混合し
た。４℃で16時間後、その混合物を前述と同じ
Tris−NaCl−MgCl2−EDTA緩衝液を用いて
Sephadex Ｇ−25カラム（1.5×40cm）でのクロ
マトグラフイにかけた。重合したβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼをボイド容量画分からプールした。 β−ヒト絨毛ゴナドトロピン（β−hCG、
Hibritech社製）を１の0.015M燐酸ナトリウム
（PH7.0）、1.15M NaCl、1mM EDTAに対して４
℃で16時間透析した。透析の後、抗体を5.9μlの
Ｎ，N′−ジメチルホルムアミドに溶解した59μｇ
のスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド−メ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシートと20
〜23℃で１時間反応させた。その混合物を、
0.015M燐酸ナトリウム（PH7.0）、0.15M、NaCl、
1mM EDTA中で平衡させたSephadex Ｇ−25カ
ラム（1.5×40cm）に通すことによつて反応を止
めた。カラムのボイド容量に溶出するマレイミド
−IgGアダクトをプールしそして加圧過により
1.13mlに濃縮した。 1.13ml（0.61mg／ml）のそのマレイミド−IgG
を5.73mlの前記の重合させたβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ（0.87mg／ml）と組み合わせそして４℃で
20時間行つた。その混合物を加圧過により2.0
mlに濃縮しそして次に0.05M Tris HCl（PH7.5）、
0.15M NaCl、0.0001MMgCl2中で平衡させた
Sepharose4Bカラム（1.5×90cm）でのクロマト
グラフイに４℃でかけた。IgG−β−ガラクトシ
ダーゼ接合体はカラムのボイド容量として溶出し
た（β−hCGに対する微量滴定プレートELISA
検定により確認）。 Ｂ hCG樹脂の合成 ヒト絨毛ゴナドトロピン（hCG）（Organon
Inc.製）を１，1′−カルボニルジイミダゾール活
性化Fractogel TSK HW−65F（Pierce
Chemical社製）に結合した。hCG（19.2mg）を40
mlの0.1M炭酸ナトリウム緩衝液（PH8.5）に溶解
しそしてこの緩衝液に対して透析した。40mlの樹
脂固体分を１の冷炭酸塩緩衝液で洗浄した。透
析したhCG溶液を前記ゲルに添加しそして回転器
上で４℃で一夜混合した。次にそのゲルを前記炭
酸塩緩衝液で洗浄して未結合hCGを除去した。樹
脂上のすべての残留活性基を0.05M Tris緩衝液
（PH7.5）中0.1Mグリシン80mlを添加しそして４
℃で一夜インキユベートすることによつてブロツ
クした。最後に、その樹脂を0.01％アジ化ナトリ
ウム含有0.05M Tris（PH7.5）で徹底的に洗浄し
た。 Ｃ アフイニテイカラム介在イムノアツセイを用
いたhCGアツセイ Ａの部で得た抗体−酵素接合体（0.015ml）を
各種濃度のhCGを含有する個別試料1.2mlに添加
した。0.5％ヒト血清アルブミン含有0.05M Tris
緩衝液（PH7.2）にhCGを溶解することによりキ
ヤリブレータ（calibrators）を調製した。１時
間室温でインキユベーシヨンした後に、５mlのそ
の混合物を1.2mlの0.15Mホスフエート緩衝液
（PH7.1）を用いて0.01ml／秒の流速で２ml hCG
カラム（前記Ｂの部参照）に通した。そのカラム
に結合しなかつたすべての抗体酵素接合体を含有
する1.7ml画分を集めた。 抗体−酵素接合体活性の測定はすべてDu Pont
aca 個別臨床分析器で37℃で行つた。前記1.7ml
画分を1mM塩化マグネシウム含有0.1M燐酸ナト
リウム（PH7.8）3.3mlに添加した。1.5分間インキ
ユベーシヨンを行つた後、2.8mgのONPGおよび
0.11mlの3.4M β−メルカプトエタノールを添加
することによつて反応を開始させた。抗体−酵素
接合体によるｏ−ニトロフエノールの生成に起因
する吸光度を反応開始の3.5分後に405nmでの吸
光度から600nmでの吸光度を差引いた差として測
定した（終点測定）。 Ｄ 粒子凝集阻害を用いたhCGアツセイの増幅 抗体−酵素接合体のインキユベーシヨンおよび
hCG樹脂での分離をＣの部に記載のとおり行つ
た。抗体−酵素接合体活性の測定はすべてDu
Pont aca 個別臨床分析器で37℃で行つた。そ
の1.7mlカラム画分を集め、そして0.02mlアリコ
ートを、1.46％PEG8000、0.1％GAFAC 、0.06
％ONPGおよび2mM MgCl2を含有する0.15Mホ
スフエート緩衝液（PH7.8）4.98mlに添加した。
マウスモノクローナル抗−NHB腹水液（0.02ml、
クローン2/8）を添加し、そして3.5分間のインキ
ユベーシヨンの後、2.4％固体分を含有するAND
粒子試剤（実施例2.Dの部参照）0.05mlの添加に
より反応を開始させた。粒子凝集による濁度増加
を反応開始の29秒および46秒後の406nmでの吸光
度差（変化速度）として測定した。
【表】
この表は、至適化さた終点測定からのデータ
と、至適化された粒子凝集検定（すなわち速度測
定）からのデータを比較している。この比較デー
タの示すように、本発明の方法は、未増幅反応に
参画する抗体−酵素接合体よりも85倍も低い濃度
の抗体−酵素接合体を凝集反応に参画させた場合
であつてさえ、良好な感度を与える。 実施例 ４ ヒト絨毛ゴナドトロピン（hCG）の測定 次の実施例に含まれる抗体−酵素接合体の合成
は実施例３、Ａの部に記載されている。ANP粒
子試剤および抗−NHB抗体はそれぞれ実施例
２、ＣおよびＤの部に記載されている。 Ａ hCGサンドイツチ検定（従来技術） hCG分子の抗原部位に対するモノクローナル抗
体で被覆されたプラスチツクビーズをHibritech
Incorporatedから商業的に入手しうるTandemTM
−Ｅ HCGキツトから得た。hCG標準は、
200mIU／mlのTANDEMTM−Ｅキヤリブレータ
を前記TANDEMTM−Ｅキツトと共に供与される
ゼロ希釈剤で希釈することにより調製した。抗体
−酵素接合体（0.005ml）および0.1mlの血清−
hCG試料またはhCG標準を0.1％GAFAC 含有
0.15Mホスフエート緩衝液（PH7.8）で予め洗浄
したTandemTM−Ｅ抗体ビーズ１個を含有するプ
ラスチツク管に添加した。室温で30分間170rpm
で回転させることにより混合を行つた。次にその
ビーズをその管内で0.15Mホスフエート、0.1％
GAFAC 緩衝液を２mlずつ用いて６回連続的に
洗浄し、次いで1mM MgCl2含有0.15Mホスフエ
ート（PH7.8）を2.0mlずつ用いて３回洗浄した。
最終洗浄液を傾瀉し、0.15Mホスフエート、
1.2mM MgCl2緩衝液に溶解した0.06％ONPG1.0
mlをそのビーズに添加した。30分間室温でインキ
ユベーシヨンした後、液体をビーズから除去する
ことにより反応を止めた。そのビースに結合した
抗体−酵素接合体によるONPの生成に起因する
吸光度を、Hewlett−Packard8450A分光光度計
を用い406nmで測定した。 Ｂ 粒子凝集阻害を用いたhCGサンドイツチ検定
の増幅 0.1％GAFAC 含有0.15Mホスフエート緩衝液
（PH7.8）で予め洗浄したTandemTM−Ｅ抗体ビー
ズ１個を含むプラスチツク試験管に抗体−酵素接
合体（0.002ml）および血清hCG試料（0.1ml）を
添加した。室温で90分間170rpmで回転させるこ
とにより混合を行つた。そのビースを試験管内
で、0.15Mホスフエート、0.1％GAFAC 緩衝液
を2.0mlずつ用いて６回連続的に洗浄し、次に
1.2mM MgCl2含有0.09Mホスフエート（PH7.8）
を2.0mlずつ用いて３回洗浄した。最終洗浄液を
傾瀉後、0.09Mホスフエート、1.2mM MgCl2緩
衝液に溶解した0.2mlの0.06％ONPGをそのビー
ズに添加した。室温で10分間インキユベーシヨン
している間に結合接合体によるONPへの基質タ
ーンオーバーが生じた。10分間のインキユベーシ
ヨンの後ビーズから液体を除くことによりONP
試料を得た。（試料中のONP濃度はhCG濃度に正
比例した）。hCG標準はＡの部に記載のとおりに
調製した。 ビーズ上澄中のONP濃度の測定はすべて
Cobas Bio Automated Centrifugal Analyzer
（Roche Diagnostic Systems製）で行つた。前
記のONP試料（0.08ml）を、1.5％PEG8000、0.1
％GAFAC 、2mM MgCl2および0.05％ANP粒
子試剤固体分（実施例２、Ｄの部）を含む0.12ml
の0.15Mホスフエート緩衝液（PH7.8）に添加し
た。60秒間のインキユベーシヨン時間の後、
0.001mlの抗−NHBマウスモノクローナル腹水液
（クローン2/7）を添加することにより反応を開始
した。粒子凝集による濁度増加を反応開始の10秒
から20秒後の405nmでの吸光度差（変化速度）と
して測定した。第６表は、サンドイツチ法と粒子
増幅サンドイツチ法よりなる血清hCG標準曲線の
データを示す。
と、至適化された粒子凝集検定（すなわち速度測
定）からのデータを比較している。この比較デー
タの示すように、本発明の方法は、未増幅反応に
参画する抗体−酵素接合体よりも85倍も低い濃度
の抗体−酵素接合体を凝集反応に参画させた場合
であつてさえ、良好な感度を与える。 実施例 ４ ヒト絨毛ゴナドトロピン（hCG）の測定 次の実施例に含まれる抗体−酵素接合体の合成
は実施例３、Ａの部に記載されている。ANP粒
子試剤および抗−NHB抗体はそれぞれ実施例
２、ＣおよびＤの部に記載されている。 Ａ hCGサンドイツチ検定（従来技術） hCG分子の抗原部位に対するモノクローナル抗
体で被覆されたプラスチツクビーズをHibritech
Incorporatedから商業的に入手しうるTandemTM
−Ｅ HCGキツトから得た。hCG標準は、
200mIU／mlのTANDEMTM−Ｅキヤリブレータ
を前記TANDEMTM−Ｅキツトと共に供与される
ゼロ希釈剤で希釈することにより調製した。抗体
−酵素接合体（0.005ml）および0.1mlの血清−
hCG試料またはhCG標準を0.1％GAFAC 含有
0.15Mホスフエート緩衝液（PH7.8）で予め洗浄
したTandemTM−Ｅ抗体ビーズ１個を含有するプ
ラスチツク管に添加した。室温で30分間170rpm
で回転させることにより混合を行つた。次にその
ビーズをその管内で0.15Mホスフエート、0.1％
GAFAC 緩衝液を２mlずつ用いて６回連続的に
洗浄し、次いで1mM MgCl2含有0.15Mホスフエ
ート（PH7.8）を2.0mlずつ用いて３回洗浄した。
最終洗浄液を傾瀉し、0.15Mホスフエート、
1.2mM MgCl2緩衝液に溶解した0.06％ONPG1.0
mlをそのビーズに添加した。30分間室温でインキ
ユベーシヨンした後、液体をビーズから除去する
ことにより反応を止めた。そのビースに結合した
抗体−酵素接合体によるONPの生成に起因する
吸光度を、Hewlett−Packard8450A分光光度計
を用い406nmで測定した。 Ｂ 粒子凝集阻害を用いたhCGサンドイツチ検定
の増幅 0.1％GAFAC 含有0.15Mホスフエート緩衝液
（PH7.8）で予め洗浄したTandemTM−Ｅ抗体ビー
ズ１個を含むプラスチツク試験管に抗体−酵素接
合体（0.002ml）および血清hCG試料（0.1ml）を
添加した。室温で90分間170rpmで回転させるこ
とにより混合を行つた。そのビースを試験管内
で、0.15Mホスフエート、0.1％GAFAC 緩衝液
を2.0mlずつ用いて６回連続的に洗浄し、次に
1.2mM MgCl2含有0.09Mホスフエート（PH7.8）
を2.0mlずつ用いて３回洗浄した。最終洗浄液を
傾瀉後、0.09Mホスフエート、1.2mM MgCl2緩
衝液に溶解した0.2mlの0.06％ONPGをそのビー
ズに添加した。室温で10分間インキユベーシヨン
している間に結合接合体によるONPへの基質タ
ーンオーバーが生じた。10分間のインキユベーシ
ヨンの後ビーズから液体を除くことによりONP
試料を得た。（試料中のONP濃度はhCG濃度に正
比例した）。hCG標準はＡの部に記載のとおりに
調製した。 ビーズ上澄中のONP濃度の測定はすべて
Cobas Bio Automated Centrifugal Analyzer
（Roche Diagnostic Systems製）で行つた。前
記のONP試料（0.08ml）を、1.5％PEG8000、0.1
％GAFAC 、2mM MgCl2および0.05％ANP粒
子試剤固体分（実施例２、Ｄの部）を含む0.12ml
の0.15Mホスフエート緩衝液（PH7.8）に添加し
た。60秒間のインキユベーシヨン時間の後、
0.001mlの抗−NHBマウスモノクローナル腹水液
（クローン2/7）を添加することにより反応を開始
した。粒子凝集による濁度増加を反応開始の10秒
から20秒後の405nmでの吸光度差（変化速度）と
して測定した。第６表は、サンドイツチ法と粒子
増幅サンドイツチ法よりなる血清hCG標準曲線の
データを示す。
【表】
【表】
サンドイツチ検定は、まず、被験hCG濃度範囲
にわたつて最高の感度を生じるように至適化し、
次に粒子増幅系を同じhCG範囲にわたつて最大の
粒子凝集阻害が得られる至適化した。データから
示されるようにサンドイツチ終点検定により10〜
25mIU hCGに相当する有意の吸光度変化が生
じ、一方、粒子増幅系により、0.2〜0.5mIU
hCGに相当する有意の吸光度変化が得られる。こ
のことは発色原信号検出に対して至適化されたサ
ンドイツチ終点検定に対し約50倍の感度向上を意
味する。 実施例 ５ 次の実施例は、本発明により提供される直接凝
集法を酵素活性測度に用いた例である。この実施
例において、高屈折性粒子はポリビニールナフタ
レンの中間殻とポリグリシジルメタクリレートの
外殻を有するポリスチンコアを有する。結合剤は
ハプテンの３−ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸
に対して調製された抗体が用いられよう。基質は
前記高屈折性粒子の外殻に共有結合的に結合しう
る３−ニトロ−４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル）安息香酸が用いられよう。酵素β−ガラ
クトシダーゼは粒子表面のガラクトピラノシル誘
導体を加水分解することになろう。次いで結合剤
の存在下に直接粒子凝集が生起しよう。凝集度は
肉眼的に観察して酵素活性の定性的な測定尺度を
得ることができ、あるいは溶液の物性変化を機器
により測定して定量的結果を得ることができよ
う。 Ａ ３−ニトロ−４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル）安息香酸の合成 この実施例では高屈折性粒子に結合しうるβ−
ガラクトシダーゼの基質を必要とする。リガンド
の３−ニトロ−４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル）安息香酸（NGB）はこの要件を満たす
であろう。このアナログの合成に適合し得る手順
の一例はD.H.Leabackにより、J.W.Woollenおよ
びP.G.Walkerによる論文のアペンデイスクに与
えられている〔「Clin.Chem.Acta.」（1965）12、
647、658参照〕。 アセトブロモガラクトース（１ｇ、2.44ミリモ
ル）および３−ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸
（0.40ｇ、2.20ミリモル）をメタノール（10ml）
に溶解しそして1N水酸化ナトリウム（2.2ml）を
撹拌しながら徐々に添加する。その混合物を室温
で16時間放置してからメタノールを減圧下に除去
するとシロツプが残る。次に、そのNGB物質は、
前記引用文献に記載の手順と同様により、ブロツ
ク除去および精製されよう。 Ｂ アミン変性ポリリマー粒子の合成 ジアミン２，２−オキシビス（エチルアミン）
ジ塩酸塩（420mg）および0.06mlの10％ｗ／
vGAFAC ／水溶液を4.7mlの5mM燐酸ナトリウ
ム緩衝液（PH8.0）に添加することができる。そ
の溶液のPHをPH10.0〜10.1に調節しそして1.2mlの
コア／殻ポリマー粒子（実施例１、Ｃの部）をそ
の混合物に添加する。その溶液を70℃に３時間加
熱しそして室温まで放冷する。その変性粒子を
0.1％GAFAC 含有15mM燐酸ナトリウム緩衝液
（PH7.0）で希釈する。それら粒子を18000rpmで
90分間遠心分離してペレツトを形成し、そして上
澄を傾瀉する。それら粒子をホスフエート／
GAFAC 溶液に再懸濁しそして再度遠心分離す
る。この遠心分離および再懸濁過程を全部で４回
繰り返して未反応ジアミンを除去する。最終的洗
浄の後、変性粒子をホスフエート／GAFAC 緩
衝液中で全容量１mlとする。 Ｃ NGBリガンドのアミン変性ポリマー粒子へ
の結合 Ａの部に記載したNGB基質（9.1mg、0.026ミリ
モル）を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド（5.2mg、0.027ミリモ
ル）を含有する0.17mlのジメチルスルホキシドに
溶解し、そして室温で２時間放置する。その
NGB溶液と0.06mlの10％ｗ／vGAFAC ／水溶
液は次に2.0mlの5mM燐酸ナトリウム緩衝液（PH
7.0）に希釈されることになろう。その溶液のPH
をPH7.0〜7.1に調整し、そして1.0mlのアミン変性
コア／殻粒子（前記Ｂの部）を反応系に添加す
る。その混合物を４℃に冷却しそして16時間イン
キユベートする。その粒子試剤を0.1％GAFAC
含有15mM燐酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）で
希釈する。それら粒子を18000rpmで90分間遠心
分離してペレツトを形成し、そして上澄を傾瀉す
る。それら粒子をホスフエート／GAFAC 溶液
に再懸濁しそして再度遠心分離する。この遠心分
離および再懸濁過程を全部で４回繰り返して未反
応NGBを除去する。最終的洗浄の後、リガンド
（基質）粒子をホスフエート／GAFAC 緩衝液
中で全容量10mlとする。 Ｄ 本発明の直接凝集方式を用いたβ−ガラクト
シダーゼ活性 実施例１（Ｅの部参照）で調製されたβ−ガラ
クトシダーゼ連続希釈液は検定に用いるのに適切
であろう。好都合の量の各β−ガラクトシダーゼ
希釈液を、0.15Mホスフエート緩衝液（PH7.8）、
0.1％GAFAC 、1.46％ｗ／vPEG8000および
0.02％固体分ｗ／ｖのリガンド粒子（前記Ｃの部
参照）よりなる混合物に添加する。反応温度はす
べての検定に対して等しくなければならず、そし
て便宜上選択されるが、25゜〜37℃が好ましい、
β−ガラクトシダーゼの検定混合物への添加によ
り、粒子表面の３−ニトロ−４−Ｏ−（β−Ｄ−
ガラクトピラノシル）安息香酸は３−ニトロ−４
−ヒドロキシ安息香酸に加水分解される。次に、
粒子上の加水分解生成物は結合するが未加水分解
リガンドは結合しない適宜濃度の抗体の存在下に
直接粒子凝集が行われることになろう。前記実施
例１および２で調製された抗−NHB抗体は、前
記実施例において３−ニトロ−４−ヒドロキシ安
息香酸結合ポリマー粒子の凝集を生起させること
が示されているので、これらの検定に用いるのに
適切であろう。抗−NHB抗体がβ−ガラクトシ
ダーゼの添加前または添加と同時に存在していれ
ば直接粒子凝集はリガンド加水分解と同時に生起
しうる。あるいはまた、その凝集反応は、抗−
NHB抗体の添加を遅らせることにより、β−ガ
ラクトシダーゼ添加後、任意の都合のよい時点で
開始させることができる。粒子凝集度は、定性的
または定量的結果の要請に応じて、肉眼的にある
いは機器的に測定することができる。
にわたつて最高の感度を生じるように至適化し、
次に粒子増幅系を同じhCG範囲にわたつて最大の
粒子凝集阻害が得られる至適化した。データから
示されるようにサンドイツチ終点検定により10〜
25mIU hCGに相当する有意の吸光度変化が生
じ、一方、粒子増幅系により、0.2〜0.5mIU
hCGに相当する有意の吸光度変化が得られる。こ
のことは発色原信号検出に対して至適化されたサ
ンドイツチ終点検定に対し約50倍の感度向上を意
味する。 実施例 ５ 次の実施例は、本発明により提供される直接凝
集法を酵素活性測度に用いた例である。この実施
例において、高屈折性粒子はポリビニールナフタ
レンの中間殻とポリグリシジルメタクリレートの
外殻を有するポリスチンコアを有する。結合剤は
ハプテンの３−ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸
に対して調製された抗体が用いられよう。基質は
前記高屈折性粒子の外殻に共有結合的に結合しう
る３−ニトロ−４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル）安息香酸が用いられよう。酵素β−ガラ
クトシダーゼは粒子表面のガラクトピラノシル誘
導体を加水分解することになろう。次いで結合剤
の存在下に直接粒子凝集が生起しよう。凝集度は
肉眼的に観察して酵素活性の定性的な測定尺度を
得ることができ、あるいは溶液の物性変化を機器
により測定して定量的結果を得ることができよ
う。 Ａ ３−ニトロ−４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル）安息香酸の合成 この実施例では高屈折性粒子に結合しうるβ−
ガラクトシダーゼの基質を必要とする。リガンド
の３−ニトロ−４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル）安息香酸（NGB）はこの要件を満たす
であろう。このアナログの合成に適合し得る手順
の一例はD.H.Leabackにより、J.W.Woollenおよ
びP.G.Walkerによる論文のアペンデイスクに与
えられている〔「Clin.Chem.Acta.」（1965）12、
647、658参照〕。 アセトブロモガラクトース（１ｇ、2.44ミリモ
ル）および３−ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸
（0.40ｇ、2.20ミリモル）をメタノール（10ml）
に溶解しそして1N水酸化ナトリウム（2.2ml）を
撹拌しながら徐々に添加する。その混合物を室温
で16時間放置してからメタノールを減圧下に除去
するとシロツプが残る。次に、そのNGB物質は、
前記引用文献に記載の手順と同様により、ブロツ
ク除去および精製されよう。 Ｂ アミン変性ポリリマー粒子の合成 ジアミン２，２−オキシビス（エチルアミン）
ジ塩酸塩（420mg）および0.06mlの10％ｗ／
vGAFAC ／水溶液を4.7mlの5mM燐酸ナトリウ
ム緩衝液（PH8.0）に添加することができる。そ
の溶液のPHをPH10.0〜10.1に調節しそして1.2mlの
コア／殻ポリマー粒子（実施例１、Ｃの部）をそ
の混合物に添加する。その溶液を70℃に３時間加
熱しそして室温まで放冷する。その変性粒子を
0.1％GAFAC 含有15mM燐酸ナトリウム緩衝液
（PH7.0）で希釈する。それら粒子を18000rpmで
90分間遠心分離してペレツトを形成し、そして上
澄を傾瀉する。それら粒子をホスフエート／
GAFAC 溶液に再懸濁しそして再度遠心分離す
る。この遠心分離および再懸濁過程を全部で４回
繰り返して未反応ジアミンを除去する。最終的洗
浄の後、変性粒子をホスフエート／GAFAC 緩
衝液中で全容量１mlとする。 Ｃ NGBリガンドのアミン変性ポリマー粒子へ
の結合 Ａの部に記載したNGB基質（9.1mg、0.026ミリ
モル）を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド（5.2mg、0.027ミリモ
ル）を含有する0.17mlのジメチルスルホキシドに
溶解し、そして室温で２時間放置する。その
NGB溶液と0.06mlの10％ｗ／vGAFAC ／水溶
液は次に2.0mlの5mM燐酸ナトリウム緩衝液（PH
7.0）に希釈されることになろう。その溶液のPH
をPH7.0〜7.1に調整し、そして1.0mlのアミン変性
コア／殻粒子（前記Ｂの部）を反応系に添加す
る。その混合物を４℃に冷却しそして16時間イン
キユベートする。その粒子試剤を0.1％GAFAC
含有15mM燐酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）で
希釈する。それら粒子を18000rpmで90分間遠心
分離してペレツトを形成し、そして上澄を傾瀉す
る。それら粒子をホスフエート／GAFAC 溶液
に再懸濁しそして再度遠心分離する。この遠心分
離および再懸濁過程を全部で４回繰り返して未反
応NGBを除去する。最終的洗浄の後、リガンド
（基質）粒子をホスフエート／GAFAC 緩衝液
中で全容量10mlとする。 Ｄ 本発明の直接凝集方式を用いたβ−ガラクト
シダーゼ活性 実施例１（Ｅの部参照）で調製されたβ−ガラ
クトシダーゼ連続希釈液は検定に用いるのに適切
であろう。好都合の量の各β−ガラクトシダーゼ
希釈液を、0.15Mホスフエート緩衝液（PH7.8）、
0.1％GAFAC 、1.46％ｗ／vPEG8000および
0.02％固体分ｗ／ｖのリガンド粒子（前記Ｃの部
参照）よりなる混合物に添加する。反応温度はす
べての検定に対して等しくなければならず、そし
て便宜上選択されるが、25゜〜37℃が好ましい、
β−ガラクトシダーゼの検定混合物への添加によ
り、粒子表面の３−ニトロ−４−Ｏ−（β−Ｄ−
ガラクトピラノシル）安息香酸は３−ニトロ−４
−ヒドロキシ安息香酸に加水分解される。次に、
粒子上の加水分解生成物は結合するが未加水分解
リガンドは結合しない適宜濃度の抗体の存在下に
直接粒子凝集が行われることになろう。前記実施
例１および２で調製された抗−NHB抗体は、前
記実施例において３−ニトロ−４−ヒドロキシ安
息香酸結合ポリマー粒子の凝集を生起させること
が示されているので、これらの検定に用いるのに
適切であろう。抗−NHB抗体がβ−ガラクトシ
ダーゼの添加前または添加と同時に存在していれ
ば直接粒子凝集はリガンド加水分解と同時に生起
しうる。あるいはまた、その凝集反応は、抗−
NHB抗体の添加を遅らせることにより、β−ガ
ラクトシダーゼ添加後、任意の都合のよい時点で
開始させることができる。粒子凝集度は、定性的
または定量的結果の要請に応じて、肉眼的にある
いは機器的に測定することができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (1) (i) リガンドを表面に付着した高屈折性
粒子、 (ii) そのリガンドに対し特異的で少くとも２つ
のリガンドに結合しうる結合パートナー（該
結合パートナーと粒子が結合したリガンドと
は凝集を可能にする濃度で存在せしめる）、
および (iii) 酵素の基質（酵素、基質、リガンドおよび
結合パートナーは、酵素と基質との反応によ
り結合パートナーに対してリガンドと拮抗す
る生成物が生成するようなものとする）より
なる凝集系を形成し、 (2) その凝集系を検体と接触させて結合パートナ
ーに対しリガンドと拮抗する生成物を生成せし
め、 (3) その凝集系の物性（その物性は凝集の関数で
ある）を測定し、そして (4) 測定値を検体中に最初に存在していた酵素量
に関連づける ことによりなる液状検体中の酵素を検出するため
の凝集に基づく方法。 ２ 酵素がβ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホ
スフアターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ラ
クタマーゼよりなる群から選択される特許請求の
範囲第１項記載の方法。 ３ 高屈折性粒子が本質的に球状である特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ４ 本質的に球状の粒子が30nm〜100000nmの範
囲の直径を有する特許請求の範囲第３項記載の方
法。 ５ 直径が30nm〜100nmの範囲である特許請求
の範囲第４項記載の方法。 ６ 高屈折性粒子がアガロース、ポリデキストラ
ン、ポリアクリルアミド、ポリスチレンおよびポ
リビニルナフタレンよりなる群から選択さた物質
よりなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７ 結合パートナーが少くとも２つのリガンド結
合部位を有する抗体である特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ８ 酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、基質が
ｏ−ニトロフエニル−β−ガラクトピラノシドで
あり、リガンドが３−ニトロ−４−ヒドロキシ安
息香酸またはｏ−ニトロフエノールであり、そし
て結合剤が抗−３−ニトロ−４−ヒドロキシ安息
香酸抗体である特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ９ 酵素がアルカリ性ホスフアターゼであり、基
質がｐ−ニトロフエニルホスフエートであり、リ
ガンドがｐ−ニトロフエノールであり、そして結
合剤が抗−ｐ−ニトロフエノール抗体である特許
請求の範囲第１項記載の方法。 １０ 物性が光学的性質である特許請求の範囲第
１項記載の方法。 １１ (1) 酵素と被分析物に結合しうる第１結合
パートナーとよりなる接合体に検体を接触さ
せ、それによつて一部の接合体を被分析物に結
合させて複合体を形成させそして残余の接合体
を被分析物と結合していない遊離接合体とし、 (2) その遊離接合体を複合体から分離し、 (3) 遊離接合体または複合体のいずれかを、 (i) リガンドを表面に付着した高屈折性粒子、 (ii) そのリガンドに対し特異的で少くとも２つ
のリガンドに結合しうる第２結合パートナー
（該第２結合パートナーと粒子が結合したリ
ガンドとは凝集を可能にする濃度で存在せし
める）、および (iii) 酵素の基質（酵素、基質、リガンドおよび
第２結合パートナーは、酵素と基質との反応
により第２結合パートナーに対してリガンド
と拮抗する生成物が生成するようなものとす
る） よりなる凝集系と接触させ、 (4) 凝集系の物性（その物性は凝集の関数であ
る）を測定し、そして (5) 測定値を液状検体中に最初に存在していた被
分析物量に関連づける ことよりなる液状検体中の被分析物を検出するた
めの凝集に基づく方法。 １２ 酵素がβ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性
ホスフアターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−
ラクタマーゼよりなる群より選択される特許請求
の範囲第１１項記載の方法。 １３ 第１結合パートナーが抗被分析物抗体であ
る特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １４ 高屈折性粒子が本質的に球状である特許請
求の範囲第１１項記載の方法。 １５ 本質的に球状の粒子が30nm〜100000nmの
範囲の直径を有する特許請求の範囲第１４項記載
の方法。 １６ 直径が30nm〜100nmの範囲にある特許請
求の範囲第１５項記載の方法。 １７ 高屈折性粒子がアガロース、ポリデキスト
ラン、ポリアクリルアミド、ポリスチンおよびポ
リビニルナフタレンよりなる群より選択された物
質よりなる特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １８ 第２結合パートナーが少くとも２つのリガ
ンド結合部位を有する抗体である特許請求の範囲
第１１項記載の方法。 １９ 酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、基質
がｏ−ニトロフエニル−β−ガラクトピラノシド
であり、リガンドが３−ニトロ−４−ヒドロキシ
安息香酸またはｏ−ニトロフエノールであり、そ
して第２結合パートナーが抗−３−ニトロ−４−
ヒドロキシ安息香酸抗体である特許請求の範囲第
１１項記載の方法。 ２０ 酵素がアルカリ性ホスフアターゼであり、
基質がｐ−ニトロフエニルホスフエートであり、
リガンドがｐ−ニトロフエノールであり、そして
結合剤が抗−ｐ−ニトロフエノール抗体である特
許請求の範囲第１１項記載の方法。 ２１ 物性が光学的性質である特許請求の範囲第
１１項記載の方法。 ２２ (1) (i) 酵素と反応した際にリガンドに転
化されうる基質を表面に被覆せしめた高屈折
性粒子、および (ii) そのリガンドに対し特異的で少くとも２つ
のリガンドに結合しうるが基質には結合しえ
ない結合パートナー よりなる凝集系を形成し、 (2) その凝集系を検体と接触させて基質をリガン
ドに転化し、 (3) 凝集の関数である凝集系の物性を測定し、そ
して (4) 測定値を検体中に最初に存在していた酵素量
に関連づける ことよりなる液状検体中の酵素を検出するための
凝集に基づく方法。 ２３ 酵素がβ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性
ホスフアターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−
ラクタマーゼよりなる群より選択される特許請求
の範囲第２２項記載の方法。 ２４ 高屈折性粒子が本質的に球状である特許請
求の範囲第２２項記載の方法。 ２５ 本質的に球状の粒子が30nm〜100000nmの
範囲の直径を有する特許請求の範囲第２４項記載
の方法。 ２６ 直径が30nm〜100nmの範囲にある特許請
求の範囲第２５項記載の方法。 ２７ 結合パートナーが少くとも２つの結合部位
を有する抗体である特許請求の範囲第２２項記載
の方法。 ２８ 酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、基質
が３−ニトロ−４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル）安息香酸であり、そして結合パートナー
が抗−（３−ニトロ）−４−ヒドロキシ安息香酸抗
体である特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２９ (1) 酵素と被分析物に結合しうる第１結合
パートナーとよりなる接合体に検体を接触さ
せ、それによつて一部の接合体を被分析物に結
合させて複合体を形成させ、そして残余の接合
体を被分析物と結合していない遊離接合体と
し、 (2) その遊離接合体を複合体から分離し、 (3) 遊離接合体または複合体のいずれかを (i) 酵素と反応した際にリガンドに転化されう
る基質を表面に被覆せしめた高屈折性粒子、
および (ii) そのリガンドに対し特異的で少くとも２つ
のリガンドに結合しうるが基質には結合しえ
ない結合パートナー よりなる凝集系と接触させ、 (4) 凝集の関数である凝集系の物性を測定し、そ
して (5) 測定値を検体中に最初に存在していた酵素量
に関連づける ことよりなる液体検体中の被分析物を検出するた
めの凝集に基づく方法。 ３０ 第１結合パートナーが抗被分析物抗体であ
る特許請求の範囲第２９項記載の方法。 ３１ 酵素がβ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性
ホスフアターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−
ラクタマーゼよりなる群より選択される特許請求
の範囲第２９項記載の方法。 ３２ 高屈折性粒子が本質的に球状である特許請
求の範囲第２９項記載の方法。 ３３ 本質的に球状の粒子が30nm〜100000nmの
範囲の直径を有する特許請求の範囲第３２項記載
の方法。 ３４ 直径が30nm〜100nmの範囲にある特許請
求の範囲第３３項記載の方法。 ３５ 高屈折性粒子がアガロース、ポリデキスト
ラン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、およ
びポリビニルナフタレンよりなる群から選択され
る物質よりなる特許請求の範囲第２９項記載の方
法。 ３６ 第２結合パートナーが少くとも２つのリガ
ンド結合部位を有する抗体である特許請求の範囲
第２９項記載の方法。 ３７ 酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、基質
が３−ニトロ−４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル）安息香酸であり、そして結合パートナー
が抗−（３−ニトロ−４−ヒドロキシ）安息香酸
抗体である特許請求の範囲第２９項記載の方法。 ３８ 物性が光学的性質である特許請求の範囲第
２９項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66848984A | 1984-11-05 | 1984-11-05 | |
| US668489 | 1984-11-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61115498A JPS61115498A (ja) | 1986-06-03 |
| JPH0570440B2 true JPH0570440B2 (ja) | 1993-10-05 |
Family
ID=24682504
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24424385A Granted JPS61115498A (ja) | 1984-11-05 | 1985-11-01 | 粒子凝集を用いた酵素活性の検出方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0181762B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61115498A (ja) |
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| DE (1) | DE3579887D1 (ja) |
| DK (1) | DK507385A (ja) |
| GR (1) | GR852668B (ja) |
| IE (1) | IE58762B1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5196306A (en) * | 1989-03-29 | 1993-03-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the detection or quantitation of an analyte using an analyte dependent enzyme activation system |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4401765A (en) * | 1981-09-01 | 1983-08-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Covalently bonded high refractive index particle reagents and their use in light scattering immunoassays |
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-
1985
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