JPH0570480A - 造血細胞の増殖に対する選択的阻害効果を示す新規のオリゴペプチド、それを含んで成る医薬組成物及び新規オリゴペプチド及び組成物の調製方法 - Google Patents

造血細胞の増殖に対する選択的阻害効果を示す新規のオリゴペプチド、それを含んで成る医薬組成物及び新規オリゴペプチド及び組成物の調製方法

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JPH0570480A
JPH0570480A JP3223023A JP22302391A JPH0570480A JP H0570480 A JPH0570480 A JP H0570480A JP 3223023 A JP3223023 A JP 3223023A JP 22302391 A JP22302391 A JP 22302391A JP H0570480 A JPH0570480 A JP H0570480A
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バラージユ アンドラーシユ
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スシオエン イシユトバーン
Tamas Szirtes
シルテシユ タマーシユ
Lajos Kisfaludy
キシユフアルデイ ラヨシユ
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 造血細胞の増殖に対する選択的阻害効果を示
すオリゴペプチドに関する。 【構成】 下記式： （１）Glp −Glu −Asp −Cys(Acm)−Lys −OH 及び （２）Ｈ−Glu −Asp −Cys(Acm)−Lys −OH 〔式中、Ａｃｍはアセトアミドメチル基を表わす〕で表
わされるペプチド及びそれらの酸付加塩に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、下記式： （１）配列番号１ 及び （２）配列番号２ 〔式中、Ａｃｍはアセトアミドメチル基を表わす〕で表
わされる新規ペプチド、それらの酸付加塩、それらを含
んで成る医薬組成物及び新規ペプチド及び組成物の調製
方法に関する。
【０００２】新規ペプチドは、造血細胞の増殖を選択的
に阻害する。本発明はまた、造血細胞の増殖を選択的に
阻害するために前記ペプチド及び組成物による哺乳類
（ヒトを包含する）の処理を包含する。
【０００３】両オリゴペプチドは、天然源から単離され
た血液調節ペンタペプチドの類似体である。成熟した顆
粒球及びラット髄質（骨髄）の懸濁液からの低分子質量
因子の単離が最初にRytoemaa及びKiviniemi により説明
された。この因子は、イン ビトロ試験においてラット
造血細胞の増殖を阻害した〔Cell Tissue Kinet,. １，
329 及び341 (1968)〕。
【０００４】初めに命名されたように顆粒球カローン
は、細胞周期のＳ−相における増殖を遅め、そしてＳ1
−相においてそれを阻害することがわかっており〔Virc
hows Arch.Abt.B.Zellpath., 14, 293 (1973)〕、そし
てそれは細胞周期のＧ1 −相においてそれを阻害するこ
とがわかった〔In Vitro,４, 47 (1969) 〕。
【０００５】最近に均質的に精製された造血阻害因子
は、Cell Biol.Intereact.Rep., ４,337 (1980)に記載
された。この因子は、その構造に関しては、ヌクレオペ
プチドに属する。その単離、おおよその構造の分析及び
合成は最初に、Z.Naturforsch., 37.c, 1297 (1982) に
報告された。
【０００６】１９８６年、合成ペンタペプチド（配列番
号３）は、天然源から単離された物質と同じ生物学的効
果を示すことが発表された (Biological Regulation of
Cell Proliferation, Basega, Foa, Netcalfand Polli
版、 Raven Press, New York, 1986, 11ページ) 。
【０００７】これまで、血液調節ペプチドは、ヒト顆粒
球、ラット髄質及びウシ脾臓から単離されて来た。マウ
ス、ラット及びヒト細胞に対するその造血阻害効果は、
１０ -13 モル／Ｌ以上の高い濃度で投与量依存性であ
る。それはほとんど副作用を有さない。それは、ヒト及
びマウス骨髄細胞に対して１０-15 〜１０-4モル／Ｌの
濃度範囲で毒性でなく、そして２種のマウス種に対して
９．１mg／動物〜１mg／動物の投与量で毒性でない〔 P
harmac.Ther., 44, 353 (1989)〕。
【０００８】前者の事実に基づけば、血液調節ペプチド
が、腫瘍疾患の処置のために使用される細胞増殖抑制剤
及び放射線により引き起こされる損傷から骨髄を保護す
るであろう未来の薬物として見なされ、しかも他の医薬
分野におけるその使用もまた、許容されることは驚くに
あたいしない。
【０００９】これまで合成されたいくつかの類似物は、
類似する生物学的活性を示すことが見出されなかった。
いくつかのデータは、アミノ末端ピログルタミン酸の他
にたった３個の官能アミノ酸から成るペンタペプチドの
構造的な解明に発生する困難、種々の合成路の問題及び
サンプルの生物学的活性のずれが、その構造のために化
合物の分解に対する感受性に密接に関係していることを
示唆する。
【００１０】Cancer Res., 50, 328 (1990)において、
著者は、メルカプト基を担持する化合物の酸化二量体化
及びくり返しての凍結／溶解下で水溶液におけるその不
活性化に注意を払っている。二量体化に対するその感受
性は、ダイマーの活性がモノマーの活性の反対である場
合、特に好都合でない〔Exp.Hematol., 12, ７(1984)；
Exp.Hematol., 16, 274 (1988)〕。
【００１１】ある合成サンプルの活性の欠失及び不活性
化についての説明は、文献に示されていない。本発明者
の意見によれば、これらの現象は、少なくとも部分的
に、アスパラギン酸を含む化合物の環の閉鎖、異性体化
及びエピマー化に帰する〔 J.Chem.Soc.Chem.Commun.,
1983, 505; Acta Chim.Hung., 124 , 919 (1987)；Pept
ides 1986 、編集者：Theodoropulos, de Gruyter, Ber
lin, 1987, 83; Coll.Czech.Chem.Commun., 54, 3360
(1989) 〕。
【００１２】ダイマー分子（配列番号４）の細胞増殖刺
激効果及び細胞増殖に対する配列番号５の無能性は、シ
ステインのメルカプト基が生物学的活性の誘引に有意な
役割を有することを示す。メルカプト基の存在の必要性
は、天然の配列番号３のペンタペプチドが０．１〜０．
３ｍモル／Ｌのメルカプトエタノールにおいてのみ増殖
を阻害でき、ところがメルカプトエタノールなしでは、
それは無能である事実により支持される。
【００１３】中でも、アセトアミドメチル基を含む配列
番号１及びアミノ末端で短くされた配列番号６が、骨髄
細胞の増殖に対して有意且つ選択的な阻害効果を示すこ
とは驚くべきである。細胞増殖に対する効果は、いくつ
かの方法により測定され得る。試験は、たとえば短期細
胞培養（ラット胸腺及び骨髄細胞）におけるＤＮＡ中へ
の 3Ｈチミジンの組込みを測定し又は半固体寒天培養に
おけるマウス骨髄細胞のコロニー形成能力を決定するこ
とができる。
【００１４】本発明の化合物は、次の試験にゆだねられ
る：短期培養に基づく試験 短期培養のために使用されるラット骨髄細胞は、体重４
０ｇの生後２週目のラットから単離された。動物を殺し
た後、大腿部の骨髄を分離し、そしていわゆるParker培
地“ＴＣ−１９９”（ＯＫＩの製品）に、１０％ウシ胎
児血清（Ｇｉｂｃｏの製品）と一緒に懸濁した。３×１
０6 個の細胞芽骨髄細胞／mLから成る懸濁液から取られ
たサンプルを、蒸気により飽和された二酸化炭素５体積
％を含んで成る雰囲気下で３７℃で４時間、試験物質の
存在下で、B 5060EK Heraeusインキュベーター内でそれ
自体インキュベートした（対照）。
【００１５】インキュベーションの３時間目において、
７２１ MBq／mLの比活性の３６ KBq／mLの 3Ｈ−Ｔｄｒ
チミジン（UWVR, Praha の製品) を添加した。６０分
後、２×１００μＬのアリコートのサンプルを、ピペッ
トで Whatman 3MMフィルター紙に取り、そしてそのフィ
ルター紙を、氷で冷却された５重量％の過塩素酸溶液、
次にエタノール及びジエチルエーテルによりそれぞれ５
分間洗浄し、次に乾燥せしめた。
【００１６】フィルター紙の放射能を、 Packard-TriCa
rb型の液体シンチレーション分光計において５ｇ／Ｌの
２，５−ジフェニルオキサゾール及び０．３ｇ／Ｌの
１，４−ビス（２−（５−フェニル）−オキサゾリル）
−ベンゼンを含んで成るトルエン基材の混合物中で測定
した。分当たりのエントリーの数を測定した。個々のサ
ンプルのエントリーの数を、未処理の対照の数と比較
し、そして未処理の対照の百分率として表わした。その
結果によれば、１０-7モル／Ｌの配列番号３及び１０-7
モル／Ｌの配列番号６の存在下で、細胞培養物への 3Ｈ
チミジンの組込みは、それぞれ３２％、及び２２％に低
下した。
【００１７】長期細胞培養に基づく試験 長期培養のためには、マウス骨髄から単離された細胞を
半固体寒天培養に用いた。生後２〜３カ月の雄のＣ５７
Ｂ１マウスから得られた大腿部の１．５×１０5 個の骨
髄細胞を、“McCoy 5A”培地（Ｇｉｂｃｏの製品）１mL
に懸濁し、次にウマ血清（Ｇｉｂｃｏの製品）２０体積
％、Ｌ−細胞ＣＳＦ（リンパ球の上清液から調製された
コロニー刺激因子；Pharmacological Institute of the
Medical University of Debrecen, Hungaryの製品) １
６体積％及び寒天−寒天０．１８重量％を添加した。
【００１８】半固体培地１００μＬを、上記方法で７日
間、Micropet細管中で培養し、次にコロニーを、４０倍
の倍率の Zeiss-Cytoplast立体顕微鏡下で計数した。そ
の結果は、未処理対照に比較してのコロニーの数の％低
下率として与えられる。試験は、０．２５ｍモル／Ｌの
メルカプトエタノール（＋ＭＥ）の存在下で及びメルカ
プトエタノール（−ＭＥ）の不在下で行なわれた。
【００１９】結果は次の表に要約される：
【表１】
【００２０】上記表において、（Ａ）は配列番号３を表
わし、（１）は配列番号１を示し、そして（２）は配列
番号２を示す。チミジン試験に使用される細胞培養物は
短命のものであり、そしてそれらの細胞のみのＤＮＡ変
性が測定され、ここでそれらの細胞は試験の４時間目に
おいて細胞周期のＳ−相で存在する（細胞はこの時点で
放射性チミジンを受ける）。この部分は細胞の約２５〜
３０％である。他の細胞はＧ0 ，Ｇ1 ，Ｇ2 又はＭ相で
存在する。
【００２１】従って、チミジン試験により測定される阻
害は、それがコロニー試験で達成され得るよりも弱い。
すなわち、後者の試験においては、標的細胞は、処理後
１週間培養されており、従って阻害はお互い蓄積され又
はお互い減じることさえできる。アミノ末端でピログル
タミン酸を欠くテトラペプチド（配列番号２）は、ひじ
ょうにめずらしい態様で挙動する。それは半固体寒天培
養物の形成を１０-14 〜１０-6モル／Ｌの濃度範囲で２
５〜６５％阻害するが、それは、 3Ｈチミジンの組込み
の測定によれば、ラットの骨髄又は胸腺細胞のいづれか
の増殖を阻害しなかった。
【００２２】チミジンの組込み及びコロニーの形成の両
者を阻害する配列番号１のペンタペプチドは、造血幹細
胞（ＣＦＵｓ）に影響を及ぼし、そして骨髄幹細胞（Ｃ
ＦＵｃ）並びに骨髄前駆体細胞、骨髄芽球、前骨髄球及
び骨髄球に対する影響を有する。配列番号２のテトラペ
プチドは、後者の細胞に対する効果を有さないが、しか
しながら、それはひじょうに高い選択性でコロニー形成
骨髄幹細胞（ＣＦＵｃ）の増殖を阻害し、すなわちそれ
は細胞系及び区画(compartment) 特異性のものである。
【００２３】化合物のイン ビトロ毒性を考慮しての細
胞芽骨髄細胞により実施される51Ｃｒ−放射試験におい
ては、本発明の両ペプチドは、非毒性であることがわか
った。イン ビボ活性を測定するために、本発明の化合
物を、体重４０ｇのラットに腹腔内投与した。対照に比
較して、骨髄の有糸分裂の４０％低下が観察され、従っ
て、増殖のイン ビボ阻害はまた有意であると思われ
る。
【００２４】アセトアミドメチル基の存在は、生物学的
活性の点からのみならず、また化学的観点から好都合で
あり、なぜならばそれは遊離メルカプト基を担持する分
子の頻繁な不安定性及び一部、その不安定性に起因す
る、生物学的試験結果の有意なずれを排除するからであ
る。
【００２５】知っている限り、これらは、Ａｃｍ基を含
んで成る最初の生物学的活性メルカプト化合物である。
それらの特別な利点は、それらが遊離メルカプト基を担
持する化合物に比べて、空気下での酸化にほとんど敏感
でなく、従ってそれらはより一層安定し、そして通常の
条件下でより長く貯蔵され得ることである。本発明の配
列番号１及び２のオリゴペプチドの追加の利点は、それ
らが、類似する活性を示す高分子量ポリペプチドとは異
なって、液相又は固相において比較的単純な合成により
調製され得ることである〔Nature, 344 , 442 (199
0)〕。
【００２６】本発明によれば、配列番号１及び２のペプ
チドは、軽いアシドリシスにより除去できる基により非
反応性アミノ及びカルボキシル官能基をブロックし、そ
してアセトアミドメチル基によりシステイン残基のメル
カプト基を保護しながら、α−アミノ基の連続的活性エ
ステル結合及び塩基触媒された遊離解除を用いて、Ｃ−
末端アミノ酸誘導体から開始して、配列番号１及び２の
ペプチドの保護された中間体を段階的に鎖延長し；次に
軽いアシドリシスによりそれらの保護された中間体をブ
ロック解除し；そして所望により配列番号１及び２の遊
離オリゴペプチドをそれらの酸付加塩に転換することに
よって調製される。
【００２７】合成の間、アミノ保護基の選択的な除去、
次に合成の最後で、たぶん一段階ですべての酸感受性保
護基の除去を可能にする、保護基のそのような組合せが
使用される。ペプチド結合は、活性エステルにより、好
ましくはペンタフルオロフェニルエステル（−ＯＰｆ
ｐ）法により形成される(Synthesis, 1983, 325)。
【００２８】続いてペプチド結合に構築されるべきα−
アミノ基の過渡的な保護のために、塩基により切断でき
る９−フルオレニルメチル−オキシ−カルボニル基（Ｆ
ｍｏｃ）が好ましくは使用される。リシンのε−アミノ
基、配列番号２のオリゴペプチドのグルタミン酸のアミ
ノ基及び場合によっては、配列番号１のオリゴペプチド
のピログルタミン酸のアミド−窒素が好ましくは、ｔ−
ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基により保護される。側
鎖における及びカルボキシル末端での非活性化カルボキ
シル基の保護のためには、好ましくはｔ−ブタノールに
よるエステル化が使用される。
【００２９】上記のようにして調製された保護ペプチド
から、保護基（但し、Ｓ−アセトアミドメチル基を除
く）が除かれ、次にこのようにして得られたオリゴペプ
チドは、場合によっては、塩形成のために適切なアニオ
ン−サイクルアニオン−交換樹脂の助けにより酸付加塩
に転換される。このように得られたペプチドは医薬的純
粋なものであり、それらは追加の精製を必要としない。
必要な場合、それらはシリカゲルカラム上で又はひじょ
うに効果的な液体クロマトグラフィーにより精製され得
る。
【００３０】溶液の形で得られたペプチドは、その溶液
を蒸発し又は凍結乾燥することによって回収され得る。
遊離ペプチドは、上記方法で塩に転換され得、好ましく
は、それは医薬的に許容できる酸付加塩に転換される。
そのような塩は、たとえば塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、
クエン酸、マレイン酸又はアミグダリン酸により形成さ
れる塩である。本発明のペプチド及びその酸付加塩は、
腫瘍疾患の治療において、アジュバンドとして通常の医
薬組成物の形で使用され得る。
【００３１】新規化合物の利点は、腫瘍疾患の治療のた
めに使用される薬物及び放射線の損傷効果を有意に阻害
する他に、それらはほとんど完全に無害であり、それら
は治療投与範囲でいづれの副作用も有さず又は薬物又は
放射線の量は、それらが投与される場合、高められ得る
ことである。配列番号１及び２のペプチドは、それ自体
又は塩の形で好ましくは医薬的な従来の形、たとえば固
体、液体又は半固体形で投与され得る。組成物が調製さ
れる場合、通常のキャリヤー、希釈剤、安定剤、pH調節
剤、浸透圧調節剤、配合を可能にし又は促進する添加剤
及び賦形剤が使用され得る。
【００３２】固体医薬組成物は、たとえば注射のための
粉末アンプルであり得る。液体組成物は、マイクロカプ
セルを含む注射可能な浸剤である。患者は、所望する量
の薬物を含んで成る医薬組成物により投与される。この
投与量は、病気の程度、患者の体重、投与路、毎日の処
理の数及び他の処理方法に依存する。適切な投与量は、
処理されるべく患者の知識を基に医者により決定され得
る。
【００３３】投与を単純にするためには、１回分又は数
回分、又は投与される薬物の半分、１／３，１／４の量
を含んで成る投与量単位を調製することが好ましい。本
発明の医薬組成物は一般的に、１回の投与量単位に１〜
２５０mgの活性成分を含む。もちろん、活性成分の量
は、前もって定義された上限又は下限を越えることがで
きる。本発明は、次の非制限的な例により詳しく説明さ
れる。
【００３４】本明細書に使用される略語は、一般的に許
容される略語に相当する〔Biochem.J., 219 , 345 (198
4)〕。すべてのアミノ酸はＬ−配置のものであり、従っ
てそれは別々に示されていない。アミノ酸分析データの
中で、“Ｔｉｎ”は、Ｓ−アセトアミドメチルシステイ
ンの加水分解の間に形成される４−チアゾリジンカルボ
ン酸を意味する。融点は、dr.Tottoliの装置(Buechi, S
witzerland) で決定された。
【００３５】薄層クロマトグラフィー試験は、次の溶媒
混合物（比は体積比を意味する）により、容易に製造さ
れたシリカゲル吸着剤上で行なわれた： “原液”：ピリジン／酢酸／水の２０：６：１１混合
物、 １）酢酸エチル／原液の９９：１混合物、 ２）酢酸エチル／原液の１９：５混合物、 ３）酢酸エチル／原液の９：１混合物、 ４）酢酸エチル／原液の４：１混合物、 ５）酢酸エチル／原液の２：３混合物、 ６）酢酸エチル／原液の１：４混合物、 ７）ｎ−ブタノール／原液の３：７混合物及び ８）ｎ−ブタノール／酢酸／酢酸エチル／水の１：１：
１：１混合物。 クロマトグラムは、塩素化の後、ニンヒドリン及び沃化
カリウム／トリジンによ現像された。
【００３６】高圧液体クロマトグラフィー測定は、種々
の波長の Labor-MIM 300型ＵＶ検出器、 Labor-MIMルー
プインゼクター、供給ポンプ及びGilson 8020 及び３０
２単位から成るマノメーター、並びに Radelkis OH−82
7 型のレコーダーを備えられた装置で行なわれた。
【００３７】分離は、４．６mmの外径を有する１５０cm
の長さのカラム（１０μｍの粒度のＣ18相(Labor MIM)
により充填されている）上で行なわれた。溶離液は、水
９７体積部、アセトニトリル３体積部及びトリフルオロ
酢酸０．４体積部から成った。測定は、１mL／分の流速
で行なわれ、溶液の吸光度は２２０nmで検出された。
【００３８】ペプチドの純度は、薄層クロマトグラフィ
ー及び液体クロマトグラフィーの両方法に基づいて９５
％を越えた。比旋光度は、Perkin-Elmer 241型の旋光計
で測定された。溶媒は除去され；そして蒸発は、すべて
の結合、４０℃以上の水浴上で回転真空蒸発器で行なわ
れた。
【００３９】標的化合物のアミノ酸分析は、 Biotronic
LC 5001装置で行なわれた。サンプルが、１１０℃で２
４時間、６モル／Ｌの塩酸溶液中で加水分解された。分
析の結果は、±５％の誤差内であった。加水分解の間、
主要部のＳ−アセトアミドメチルシステインは、４−チ
アゾリジンカルボン酸（Ｔｉｎ）に転換した。
【００４０】
【実施例】例１ 配列番号２ ５．８１ｇ（１０ｍモル）のFmoc−Cys −(Acm) −OPfp
及び３．５４ｇ（１０．５ｍモル）のＨ−Lys(Boc)− O
t Bu・HCl を、トリエチルアミン１．４７mL（１０．５
ｍモル）の存在下で、ジメチルホルムアミド２０mL中で
反応せしめる。４時間後、その反応混合物を酢酸エチル
１００mLにより希釈し、そしてこのようにして得られた
混合物を、水５０mL、１モル／Ｌの塩酸水溶液３×３０
mL，５％炭酸水素ナトリウム水溶液３×３０mLにより洗
浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥せしめ、そして真空
蒸発せしめる。
【００４１】蒸発残渣として得られた油状物を、加熱下
で酢酸エチル１５mLに溶解し、そしてその溶液をｎ−ヘ
キサン６０mLにより希釈した。その懸濁液を一晩冷たい
まま維持し、次に濾過し、そして沈殿物をｎ−ヘキサン
により洗浄する。従って、４．４ｇ（活性エステルにつ
いて計算して６３％）のFmoc−Cys(Acm)−Lys(Boc)− O
t Buを得る。 融点：１１０〜１１３℃、 〔α〕D 20：−２２．８゜（ｃ＝１．０、エタノー
ル）、 Ｒf ２：０．６０。
【００４２】上記ジペプチド１．０ｇ（２．２９ｍモ
ル）を、ジメチルアミン１０％を含むジメチルホルムア
ミド溶液１５mLにより処理し、次にその反応混合物を真
空下で蒸発し、ｎ−ヘキサンをいくつかの部分に分け
て、油状残渣上に注ぎ、次に上清液をデカントし、最後
に、沈殿物をジメチルホルムアミド１０mLに溶解する。
【００４３】その溶液に、１．５ｇ（２．６ｍモル）の
Fmoc− Asp(Ot Bu) −OPfpを添加し、１時間後、その反
応混合物を真空蒸発し、ｎ−ヘキサンを数回に分けて、
蒸発残渣として得られた油状物上に注ぎ、次に上清液を
デカントし、最後にジイソプロピルエーテルの添加によ
り結晶化する。
【００４４】このようにして、１．５２ｇ（７６．１
％）のFmoc− Asp(Ot Bu) −Cys(Acm)−Lys(Boc)− Ot
Buを得る。少量のサンプルを酢酸エチルから再結晶化す
る。このサンプルの物理的特徴は次の通りである： 融点：１２４〜１２５℃、 〔α〕D 20：−３１．８°（ｃ＝１．０、エタノー
ル）、 Ｒf ３：０．７０。
【００４５】上記で得られたトリペプチド１．４ｇ
（１．６１ｍモル）を、前記のようにして、ジメチルア
ミン１０％を含むジメチルホルムアミド溶液により処理
する。反応混合物の蒸発後、残渣として得られた油状物
に、ｎ−ヘキサンを数回、注ぎ、次に上清液をデカント
し、最後にジメチルホルムアミド６mLに溶解し、そして
０．８３ｇ（１．７５ｍモル）の Boc−Glu (Ot Bu) −
OPfpと反応せしめる。
【００４６】１．５時間後、その反応混合物を蒸発し、
残渣を溶出のために混合物 No.１を用いることによっ
て、３０mLのシリカゲルから調製されたカラム上でクロ
マトグラフィー処理にゆだねる。純粋な画分を集め、真
空下で蒸発し、蒸発残渣として得られた油状物を、ジイ
ソプロピルエーテル及びｎ−ヘキサンの混合物中で固化
する。このようにして、非晶質の配列番号７（１．２２
ｇ，８１．３％）を得る。 〔α〕D 20：−４２．２゜（ｃ＝１．０、エタノー
ル）、 Ｒf ２：０．４５。
【００４７】上記のようにして得られた保護テトラペプ
チド１．１５ｇ（１．２４ｍモル）を、酢酸溶液下で４
モル／Ｌの塩化水素溶液２５mLにより処理する。３０分
後、上清液を捨て、エーテルを残渣上に注ぎ、上清液を
デカントし、水１５mLに溶解し、そしてアセテートサイ
クルのＤｏｗｅｘ２×８アニオン交換樹脂により処理す
る。
【００４８】溶液を真空蒸発し、そして残渣をエタノー
ルにより単離する。粗生成物を、溶離剤として混合物 N
o.５を用いることによって、シリカゲル３０ｇから調製
されたカラム上でクロマトグラフィー処理する。純粋な
画分を集め、蒸発し、そして残渣を水及びエタノールの
混合物から再結晶化する。このようにして、０．２８ｇ
（４０．０％）の非晶質の配列番号２を得、そしてこれ
は汚染物として２〜３％の配列番号８を含む。 〔α〕D 20：−３３．７゜（ｃ＝０．６、水）、 Ｒf ６：０．３５、 Ｒf ８：０．２５。 アミノ酸分析： Ｌｙｓ＝０．９２（１），Ａｓｐ＝１．０４（１），Ｇ
ｌｕ＝１．０４（１），Ｃｙｓ＝０．３６（１），Ｔｉ
ｎ＝０．３２，ＮＨ3 ＝０．６３。
【００４９】例２ 配列番号１ ４．５ｇ（５．１７ｍモル）のFmoc− Asp(Ot Bu) −Cy
s(Acm)−Lys(Boc)− O t Buを、ジメチルアミン１０％を
含むジメチルホルムアミド溶液４０mLにより処理する。
１０分後、その反応混合物を真空蒸発し、ｎ−ヘキサン
をその残渣上に数回注ぎ、次に上清液をデカントする。
固形物質をジメチルホルムアミド２０mLに溶解し、そし
て３．５５ｇ（６．０ｍモル）のFmoc− Glu(Ot Bu) −
OPfpと反応せしめる。
【００５０】１時間後、その反応混合物を蒸発し、残渣
を酢酸エチル１０mLに溶解し、次にその溶液をジイソプ
ロピルエーテル５０mmにより希釈する。次の日、その懸
濁液を濾過する。このようにして、４．４６ｇ（８１．
８％）の配列番号９を得る。 融点：１１１〜１１５℃、 〔α〕D 20：−３８．４゜（ｃ＝１．０、エタノー
ル）、 Ｒf ２：０．７０、 Ｒf ４：０．９０。
【００５１】上記保護されたテトラペプチド１．６０ｇ
（１．５２ｍモル）を、ジメチルアミン１０％を含むジ
メチルホルムアミド溶液１５mLにより処理し、次に反応
混合物を真空蒸発し、そしてｎ−ヘキサンを、蒸発残渣
として得られた油状物上に数回注ぎ、次に上清液をデカ
ントする。このようにして得られた遊離テトラペプチド
（Ｒf ４＝０．３５）を、ジメチルホルムアミド８mLに
溶解し、そして０．５９ｇ（２．０ｍモル）のＧｌｐ−
ＯＰｆｐと反応せしめる。１時間後、その反応混合物を
蒸発し、そして残渣をエーテルにより単離する。
【００５２】このようにして、１．０ｇ（６９．７％）
の配列番号１０を得る。 融点：１５８〜１６０℃、 〔α〕D 20：−４２．７゜（ｃ＝１．０、エタノー
ル）、 Ｒf ４：０．５５。 上記保護されたテトラペプチド０．９０ｇ（０．９５ｍ
モル）を、酢酸溶液中、４モル／Ｌの塩化水素溶液１０
mLにより３０分間処理し、次に上清液を捨て、そして残
渣をエーテルにより単離する。粗生成物を、溶離剤とし
て混合物No.８を用いることによって、シリカゲル２０
ｇから調製されたカラム上でクロマトグラフィー処理す
る。純粋な画分を集め、蒸発し、次に残渣を、エタノー
ル及び酢酸エチルの混合物から次にメタノール及び酢酸
エチルの混合物から沈殿せしめる。
【００５３】このようにして、０．３３ｇ（５１．４
％）の配列番号１のペンタペプチドを得る。 〔α〕D 20：−２２．８゜（ｃ＝１．０、エタノー
ル）、 Ｒf ７：０．３５。 アミノ酸分析： Ｌｙｓ＝１．０（１），Ａｓｐ＝０．９８（１），Ｇｌ
ｕ＝２．０３（１），Ｇｙｓ＝０．３１（１），Ｔｉｎ
＝０．４５，ＮＨ3 ＝０．７２。
【００５４】例３ 配列番号１ ０．９０ｇ（２．７５ｍモル）の配列番号９を、ジメチ
ルアミン１０％を含むジメチルホルムアミド２５mLによ
り処理する。１０分後、その反応混合物を蒸発し、ｎ−
ヘキサンを蒸発残渣として得られた油状物上に数回注
ぎ、次にその懸濁液をデカントする。固形物質をジメチ
ルホルムアミド１５mLに溶解し、そして１．３０ｇ
（３．３ｍモル）の Boc−Gly −OPfpと反応せしめる。
１時間後、反応混合物を蒸発し、残渣をジイソプロピル
エーテルにより単離する。このようにして、２．６２ｇ
（９１．２％）の配列番号１１を得る。 融点：９６〜１０１℃、 〔α〕D 20：−４７．０゜（ｃ＝１．０、メタノー
ル）、 Ｒf ５：０．４０。
【００５５】上記保護されたペンタペプチド２．５０ｇ
（２．３９ｍモル）を、トリフルオロ酢酸４０mL及びア
ニゾール５mLの混合物により室温で２時間処理する。そ
の反応混合物を１０mLの体積に蒸発し、次に残渣をエー
テルにより希釈する。その懸濁液を濾過し、沈殿物をエ
ーテルにより十分に洗浄し次に乾燥の後、水３０mLに溶
解する。
【００５６】前記溶液を、アセテートサイクルのＤｏｗ
ｅｘ ２×８アニオン交換樹脂１０mLにより処理し、次
にその樹脂を濾過し、そして濾液を真空蒸発する。残渣
をエタノール及びメタノールの混合物から再結晶化す
る。このようにして、配列番号１のベンタペプチド０．
９５ｇ（５８．８％）を得る。 〔α〕D 20：−５３．７゜（ｃ＝１．０、メタノール）
【００５７】例４ 注射用粉末アンプル 配列番号１のペンタペプチド５００mg及びラクトース
９．５ｇを、注射用製剤のために適切な蒸留水８０mLに
溶解し、メチルｐ−ヒドロキシベンゾエート０．１ｇを
添加し、次にその溶液の体積を前記蒸留水により１００
mLに補充する。その均質溶液を濾過減菌し、それぞれ１
mLをバイアル中に満たし、凍結乾燥せしめ、次にバイア
ルをポリマーストッパーにより密封する。
【００５８】このようにして、活性成分５mgを含む粉末
アンプルを得る。粉末アンプル中の活性成分含有量が上
記と異なる場合、ラクトースの量が、ラクトース及び活
性成分の全量が溶液１００mLに対して計算されて約１０
ｇであるべきであるように好ましくは選択される。ラク
トースの代わりに、同じ量のマンニトールがまた使用さ
れ得る。薬物が投与される場合、粉末は、等張溶液の調
製を可能にするような量の塩化ナトリウム水溶液に溶解
される。
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Glp−Glu −Asp −Cys(Acm)−Lys −OH 配列番号：２ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：Ｈ−Glu −Asp −Cys(Acm)−Lys −OH 配列番号：３ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Glp−Glu −Asp −Cys −Lys −OH 配列番号：４ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：(Glp−Glu −Asp −Cys −Lys −OH)2 配列番号：５ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Glp−Glu −Asp −Met −Lys −OH 配列番号：６ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：Ｈ−Glp −Glu −Asp −Cys(Acm)−Lys −OH 配列番号：７ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Boc− Glu(Ot Bu) − Asp(Ot Bu) −Cys(Acm)−
Lys(Boc)− Ot Bu 配列番号：８ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Glp−Asp −Cys(Acm)−Lys −OH 配列番号：９ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：Fmoc− Glu(Ot Bu) − Asp(Ot Bu) −Cys(Acm)−
Lys(Boc)− Ot Bu 配列番号：１０ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Glp− Glu(Ot Bu) − Asp(Ot Bu) −Cys(Acm)−
Lys(Boc)− Ot Bu 配列番号：１１ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Boc−Glp − Glu(Ot Bu) − Asp(Ot Bu) −Cys
(Acm)−Lys(Boc)− Ot Bu
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 タマーシユ シルテシユ ハンガリー国，ブダペスト ハー−1082， キシユハアルデイ ウツツア，21 (72)発明者 ラヨシユ キシユフアルデイ ハンガリー国，ブダペスト ハー−1026， リアドー ウツツア，６／ア

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記式： （１）配列番号１ 及び （２）配列番号２ 〔式中、Ａｃｍはアセトアミドメチル基を表わす〕で表
    わされる、造血細胞の増殖を選択的に阻害するペプチド
    及びそれらの酸付加塩。
  2. 【請求項２】 配列番号１で表わされるペプチド及びそ
    の酸付加塩。
  3. 【請求項３】 配列番号２で表わされるペプチド及びそ
    の酸付加塩。
  4. 【請求項４】 造血細胞の増殖を選択的に阻害する医薬
    組成物であって、１又は複数の医薬的に許容できる希釈
    剤、充填剤、安定剤、pH及び浸透圧影響剤、賦形剤及び
    配合を可能にし又は促進する添加剤と共に、治療的に有
    効な量で、遊離形又はそれらの酸付加塩形での配列番号
    １及び配列番号２の１又は複数のペプチドを含んで成る
    組成物。
  5. 【請求項５】 下記式： （１）配列番号１ 及び （２）配列番号２ 〔式中、Ａｃｍはアセトアミドメチル基を表わす〕で表
    わされる、造血細胞の増殖を選択的に阻害するペプチド
    及びそれらの酸付加塩を調製するための方法であって、 軽いアシドリシスにより除去できる基により非反応性ア
    ミノ及びカルボキシル官能基をブロックし、そしてアセ
    トアミドメチル基によりシステイン残基のメルカプト基
    を保護しながら、α−アミノ基の連続的活性エステル結
    合及び塩基触媒された遊離解除を用いて、Ｃ−末端アミ
    ノ酸誘導体から開始して、配列番号１及び２のペプチド
    の保護された中間体を段階的に鎖延長し；次に軽いアシ
    ドリシスによりそれらの保護された中間体をブロック解
    除し；そして 所望により配列番号１及び２の遊離オリゴペプチドをそ
    れらの酸付加塩に転換することを含んで成る方法。
  6. 【請求項６】 前記活性エステル結合段階において保護
    されたアミノ酸のペンタフルオロフェニルエステルを用
    いることを含んで成る請求項７記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記非反応性カルボキシル基上にｔｅｒ
    ｔ・ブチル基を含む保護されたアミノ酸誘導体を用いる
    ことを含んで成る請求項７又は８記載の方法。
  8. 【請求項８】 造血細胞の増殖を選択的に阻害する医薬
    組成物の調製方法であって、１又は複数の医薬的に許容
    できる希釈剤、充填剤、安定剤、pH及び浸透圧影響剤、
    賦形剤及び配合を可能にし又は促進する添加剤と共に、
    請求項７〜９のいづれか１項に従って調製された、遊離
    形又はそれらの酸付加塩の形での配列番号１及び２の１
    又は複数のペプチドを混合し、そして医薬組成物を形成
    することを含んで成る方法。
JP3223023A 1990-09-03 1991-09-03 造血細胞の増殖に対する選択的阻害効果を示す新規のオリゴペプチド、それを含んで成る医薬組成物及び新規オリゴペプチド及び組成物の調製方法 Pending JPH0570480A (ja)

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