JPH0570494A - 一本鎖化モネリンの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 天然型モネリンの強い甘味活性を保存しなが
ら低ｐＨ域での耐熱性を向上させたモネリン蛋白質およ
びこの蛋白質を用いた低カロリ−甘味剤を提供する。 【構成】 天然型モネリンのＡ鎖とＢ鎖を特定のリンカ
−で結合して一本鎖化したアミノ酸配列と実質的に同じ
アミノ酸配列を有する蛋白質。上記の蛋白質をコ−ドす
るＤＮＡ配列。このＤＮＡ配列を適当な宿主に組み込ん
でこれを発現させることにより、上記の蛋白質を遺伝子
工学的に生産することが可能となる。上記の蛋白質を甘
味成分の少なくとも一部として含んでなる甘味剤。

Description

【発明の詳細な説明】

〔発明の背景〕

【産業上の利用分野】本発明は、甘味を有する蛋白質に
関する。さらに具体的には、本発明は、モネリン由来の
高度の甘味を保持させつつその耐熱性およびプロテアー
ゼ耐性を向上させた蛋白質に関する。蛋白工学的にいえ
ば、本発明は、天然型モネリンの２本のサブユニット
を、その個有の立体構造を実質的に保持するように設計
したアミノ酸配列を持ったリンカーによって一本鎖にす
ることによって、天然型モネリンが特に低ｐＨ域におい
て生じ易い耐熱性およびプロテアーゼ耐性の低下を防止
したものである。

【従来の技術】砂糖に代る低カロリー甘味剤に対する希
求に応えるものとして、各種の化合物ないし物質が提案
されてきている。そのような低カロリー甘味物質の一つ
として、モネリンが知られている。モネリンは熱帯植物
Dioscoreophyllum cumminsiiの実に存在する蛋白質であ
って、重量比で砂糖の約１０００倍の甘味を有するとさ
れていてる。このような植物由来のモネリンの構造は、
既に明らかにされている。すなわち、天然型モネリン
は、アミノ酸配列研究により（文献１、２）、非等価な
二つのサブユニット（Ａ、Ｂ）から構成され、その１０
％はサブユニットＡのＮ末端にＰｈｅが一つ多く付加さ
れたアミノ酸配列を有していることが明らかにされてい
る。また、Ｘ線結晶構造解析により（文献３）三次元立
体構造も判明し、二本のサブユニットの非共有結合によ
る会合の様子も明らかにされている。天然型モネリン
は、このような強い甘味活性を持っているところより、
また現在のところでは重大な毒性も認められていないの
で、低カロリー甘味剤として有望なものといえよう。し
かしながら、天然型モネリンには、低ｐＨ域において熱
によって容易にその甘味活性を失なってしまうという問
題があって、産業上の利用の障害となっていた。甘味剤
の大きな用途の一つは清涼飲料ないし果汁飲料での使用
であるが、これらの飲料は酸性であることが多く、また
加熱殺菌を受けることがふつうであるので、このような
条件を経て得られる製品は甘味の劣ったものとなってし
まうからである。

【０００１】＜考えられる解決策＞天然型モネリン蛋白
質のこのような問題点を解決するものとして、サブユニ
ットＡおよびサブユニットＢを適当な手段で連結した一
本鎖の蛋白質が知られている（文献４および５）。これ
らは、モネリンのサブユニットＡのＮ末端とサブユニッ
トＢのＣ末端を、直接に、あるいは欠失させることによ
り、あるいはモネリンの同様な立体構造を持った他の部
分の一次配列で置き換えることにより、一本のポリペプ
チド鎖になるように連結したアミノ酸配列を有する改変
型蛋白質である。その中で、最も甘味を保持しかつ耐熱
性を向上したものは、サブユニットＢとサブユニットＡ
を直接結合したアミノ酸配列を有する蛋白質である（文
献４参照）。このように、これらの従来の一本鎖化モネ
リンは、サブユニットＢのＣ末端とサブユニットＡのＮ
末端を、(i）直接結合した、あるいは(ii)数残基ずつ削
除して結合した、あるいは(iii) 天然体のアミノ酸残基
数を上回らない長さのアミノ酸配列をモネリンの配列の
なかから選択して、置換して結合した、構成となってい
る。これらの改変モネリンは低ｐＨ域での活性低下の点
で改善されていて、それなりの貢献をなしたものという
ことができようが、天然型モネリンの立体構造が有意に
保存されていないからであろうか、天然型に比べて甘味
活性が数分の一に低下している。この事実は、該先行技
術の発表者および発明者が当該刊行物中で述べているば
かりでなく、本発明者らの実験的に確認したところでも
ある（実施例５−（１）、（２）参照）。従って、モネ
リンの低カロリー甘味剤としての利用に関しては、解決
すべき問題が依然として存在しているというべきであ
る。

【０００２】 〔発明の概要〕

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の点に解
決を与えて天然型モネリンの強い甘味活性を保存しなが
ら低ｐＨ域での耐熱性を向上させることを目的とするも
のである。

【課題を解決するための手段】本発明は、天然型モネリ
ンのＡ鎖とＢ鎖を特定のリンカーで結合して一本鎖化す
ることによって上記目的を達成した。すなわち、本発明
による甘味を有する蛋白質は、下記配列式１′で示され
るアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するも
のであること、を特徴とするものである。

【化２】 （ここで、Ｘａａは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＴ
ｈｒを表わす） また、本発明によるＤＮＡ配列は、上記の蛋白質をコー
ドするものであること、を特徴とするものである。さら
にまた、本発明による甘味剤は、上記の甘味を有する蛋
白質を甘味成分の少なくとも一部として含んでなるも
の、である。

【０００３】〔発明の具体的説明〕 ＜一本鎖化モネリン＞ ＜蛋白質の構造解析＞本発明による甘味蛋白質は、天然
型モネリンのＡ鎖およびＢ鎖を特定のリンカーで結合し
て一本鎖化した構造を有することは前記したところであ
る。天然型モネリンのＡ鎖およびＢ鎖は、下記の配列式
で示されるアミノ酸配列を持つといわれている（ここ
で、配列式２と２′とはサブユニットＢの４９−５０番
目のアミノ酸配列が異なっている）。

【化３】

【化４】 配列式２（配列番号：３（または４）、５）は文献１お
よび２に基づいており、また配列式２′（配列番号：３
（または４）、６）はその後香村らによって報告され
（後記文献９）本発明者らも天然標品のアミノ酸配列の
分析によって確認している配列に基づくものである。天
然型モネリンのＡ鎖のＮ末端にＰｈｅが結合しているも
のが少数存在することは前記したところであって、Ａ鎖
Ｎ末端の（Ｐｈｅ）はこれを示すものである。本発明に
よる一本鎖化モネリンは基本的には、上記の配列式２を
基にすれば下記配列式１（配列番号：１）で示され、ま
た上記の配列式２′を基にすれば配列式１′（配列番
号：２）で示されることになる。本発明においては、上
記配列式２および２′で示されるものを含めて天然型モ
ネリンとよぶものとする。

【化５】

【化６】 本発明の蛋白質は、天然型モネリンのＡ鎖のＮ末端とＢ
鎖のＣ末端を特定のリンカーで結合して一本鎖化した構
造であって、Ａ鎖のＮ末端が（Ｐｈｅ）で示されること
に相当して、本発明におけるリンカー部分はＸａａ（Ｐ
ｈｅ）で示される。すなわち、天然型モネリンと本発明
の蛋白質の構造を比較した場合、Ａ鎖のＮ末端がＰｈｅ
であるときはリンカーはＸａａであり、Ａ鎖Ｎ末端がＰ
ｈｅでないときはリンカーはＸａａＰｈｅであると考え
ることができる。ここでＸａａはＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌ
ｕおよびＴｈｒからなる群から選ばれたアミノ酸を表わ
す（詳細後記）。いずれの考え方に立っても、本発明の
一本鎖化モネリンは前記の配列式１′（あるいは配列式
１）で示されるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配
列を有する蛋白質である。

【０００４】＜一本鎖化モネリンの定義＞本発明による
甘味を有する蛋白質は、前記の配列式１′（あるいは配
列式１）で示されるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ
酸配列を有するものである（配列式１′と１とは４９−
５０番目のアミノ酸配列が異なっている）。ここで、Ｘ
ａａは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＧｌｕおよびＴｈｒからなる
群から選ばれたアミノ酸を表わす。後記の実施例で実際
に使用したのはＧｌｙであって、これは一本鎖化モネリ
ンの生産が大腸菌、酵母などの微生物、植物などにおけ
る発現生産が期待されるところより、選ばれたものであ
る。すなわち、一本鎖化モネリンを対応ＤＮＡ鎖の遺伝
情報の発現によって宿主細胞に産生させるときは、Ｘａ
ａがＧｌｕのときは蛋白質の等電点が天然型モネリンと
異なるところから、これはリンカーとして特に好ましい
というものではなく、またＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒ
のときには、宿主細胞によって、たとえば酵母では、糖
鎖が付着した発現物を産生する可能性があるが、Ｘａａ
がＧｌｙであればそのようなことがないからである。従
って、リンカーの如何にかゝわらず糖鎖付着のおそれの
ない宿主細胞、たとえば大腸菌の場合は、Ｘａａは必ず
しもＧｌｙでなくてもよい。なお、本発明の効果が過度
に損なわれない限り、多少の糖鎖の付着は許容されるも
のとする。いずれにしても、Ｘａａとしての４種のアミ
ノ酸は、天然型モネリンのＡ鎖Ｎ末端とＢ鎖Ｃ末端が形
成する逆平行β‐シート構造において、いずれもその立
体構造を実質的に保持するリンカーＸａａ（Ｐｈｅ）を
与えるものであり、本発明において等価なものである。
また、一般に、蛋白質の特性がその構成アミノ酸の一部
の欠失または置換あるいは別種アミノ酸の付加があって
も実質的に保存されることはよく知られたところであ
り、事実本発明蛋白質の場合にもそのような事実が確認
されている（後記実験例参照）。従って、本発明による
甘味を有する蛋白質も、このようなアミノ酸についての
改変（以後、改変された蛋白質を改変蛋白質ともいう）
を許容するものとして解すべきものとする。本発明によ
る蛋白質を、「配列式１′（あるいは配列式１）で示さ
れるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する
ものであること」と定義する所以である（配列式１′を
基準にすれば配列式１は配列式１′に対する（もしくは
配列式１′で示されるアミノ酸配列と実質的に同じアミ
ノ酸配列を有する）改変蛋白質（アミノ酸置換による）
の一例であるということもできる）。なお、この蛋白質
が多少の糖鎖を有していてもよいことは、前記したとこ
ろである。実際に甘味および熱安定性について評価した
ところ、配列式１、１′で示される蛋白質および改変蛋
白質（前述のように、配列式１′を基準にすれば、配列
式１はその改変蛋白質（アミノ酸置換による）の一つに
含めることもできる）は、相互間の比較および天然型モ
ネリンとの比較において同等であることが確認されてい
ることは前記したところである（後記実験例参照）。な
お、実験例において「天然体」あるいは「天然モネリン
標品」と記載されているモネリンは、前記の配列式２′
のアミノ酸配列を有する天然蛋白質である。

【０００５】＜一本鎖化モネリンの製造＞本発明による
甘味を有する蛋白質は、そのアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ配列に着目した遺伝子工学的方法によって製造す
ることが好ましい。 ＜ＤＮＡ配列＞本発明が上記の蛋白質をコードするＤＮ
Ａ配列にも関するものであることは前記したところであ
る。具体的なＤＮＡ配列は、配列式１′あるいは配列式
１のアミノ酸をコ−ドするコドンを「遺伝暗号表」から
選べば得られることも前記したところである。宿主細胞
によってそれが好むコドンが異なることはよく知られて
いるところであって、たとえば大腸菌を宿主細胞とする
ときに好ましいコドンは、たとえばT.Maruyama et al:
Nucleic Acids Research 14 、151-189(1986) に示さ
れている。本発明者らが、大腸菌宿主ならびに酵母宿主
において実施したＤＮＡ配列の具体的な例は、下記の配
列式３（配列番号：７）および３′（配列番号：８）の
通りである（配列式３と３′は配列式１と１′における
４９−５０番目に対応するアミノ酸位置において同様の
アミノ酸配列の相異がある）。

【化７】

【化８】 本発明によるＤＮＡ配列はそれがコードするアミノ酸配
列によって特定されているところ、アミノ酸をコードす
るコドンには縮重があるから、本発明によるＤＮＡ配列
にも使用コドンの幅に従って幅があることはいうまでも
ない。また、基礎となるアミノ酸配列には前記のような
欠失、置換あるいは付加があってもよいから、それに対
応して本発明ＤＮＡ配列もそのようなコドンの変化を当
然に包含するものである。本発明によるＤＮＡ配列を
「上記の蛋白質をコードするものであること」と定義す
る所以である。

【０００６】＜一本鎖化モネリンの製造＞本発明による
ＤＮＡ配列を利用する一本鎖化モネリンの製造は、遺伝
子工学に慣用されているところに従って行なうことがで
きる。すなわち、たとえば、このＤＮＡ配列を所与の宿
主細胞に対する発現ベクターに組込み、この組込みＤＮ
Ａ配列によって宿主細胞を形質転換させ、この形質転換
体を培養して、菌体内あるいは菌体外に発現産物である
蛋白質を得ることができる。具体的には、たとえば、宿
主細胞が大腸菌である場合、ラクトースプロモーター(l
ac) ，ラムダＰL プロモーター、トリプトファンプロモ
ーター(trp) などを含む適当な発現プラスミドを利用し
て、蛋白質を生産させることができる。実施例で使用し
た発現ベクターｐＳＴ６３１１は、ｐＢＲ３２２由来の
ｐＡＴ１５３（アムシャム・ジャパン）を基にして構築
されたプラスミドであり、ＥｃｏＲＩサイトとＡｆｌII
サイトとの間に化学合成した大腸菌のトリプトファンオ
ペロンのプロモーター、オペレーターおよび転写開始点
からＳＤ配列直前までのＤＮＡ配列を含み、ＡｆｌIIサ
イトとＢａｍＨＩサイトとの間に化学合成したＳＤ配
列、そしてＢａｍＨＩサイトとＳｐｈＩサイトとの間に
化学合成したｔｒｐＡのターミネーターを含んでいる。
このプラスミドの構築方法は、特開昭６３−２６９９８
３号公報に記載されている。一方、宿主細胞が酵母であ
る場合は、ＧＰＤ（グリセルアルデヒド ３‐リン酸還
元酵素）、ＡＤＨ（アルコール還元酵素）、ＰＨＯ（酸
性ホスファターゼ）、ＧＡＬ（ガラクトシダーゼ）など
のプロモーターを含む適当な発現プラスミドを利用して
発現を行うことができる。菌体外またはペリプラズムへ
の産生蛋白質の分泌を希望する場合には、必要に応じて
発現ベクターにシグナル配列を持たせることができるこ
とはいうまでもなく、その他必要に応じて各種の遺伝子
工学的手法を応用することができることはいうまでもな
い。そのための一般的指針として、各種の参考文献、た
とえば、Maniatis et al : MOLECULAR CLONING - A LAB
ORATORY MANUAL, Cold SpringHarbor Laboratory (198
2)、を挙げることができる。

【０００７】＜一本鎖化モネリンの有用性＞本発明によ
る蛋白性甘味物質は、低カロリーで安定性が高い、甘味
剤あるいは香味剤（天然型モネリンがチューインガムの
香味を増強することが知られている）として食品添加
物、あるいは甘味料として食品、医薬品などに用いるこ
とができる。甘味が極めて高いので、賦形剤等を加えて
顆粒状、粉状等で供することが可能であって、必要に応
じて他の甘味成分と併用して甘味剤として有利に使用す
ることができる。また、本発明による蛋白性甘味物質
は、水溶性が高いので、高濃度溶液として、工業用その
他に利用することもできる。なお、本物質はマウスに
０．５ｇ／kgの投与を行なっても問題がない（実施例
７）。なお、本蛋白質をコードする遺伝子により形質転
換された微生物、植物、またはその果実なども風味を持
つことが期待でき、有用であろうことは前記したところ
である。

【０００８】＜実験例＞

【実施例】実施例１ ：一本鎖化モネリン分子の設計 ＸａａとしてＧｌｙを選定して、前記配列式１に示した
アミノ酸配列を有するペプチドを決定した。

【０００９】実施例２：大腸菌宿主による一本鎖化モネ
リンの製造 （１）大腸菌宿主モネリン発現プラスミド ｐＭＮＥＩの構築 実施例１で決定したアミノ酸配列のＮ末端に Ｍｅｔを
付加したアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列（前記の配
列式３）の５′末端側にＳＤ配列、３′末端側に終止コ
ドンを付加してなるＤＮＡ断片（下記の配列式４（配列
番号：９、１０））を化学合成した。この断片がｐＵＣ
１８（ファルマシア）のＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄII
I サイトとの間に挿入されているプラスミドを構築し
て、これをｐＭＮ４Ｅと命名した（図１）。このプラス
ミドをＡｆｌIIとＢｇｌIIで切断して得られた０．３ｋ
ｂＤＮＡ断片を、発現用プラスミドｐＳＴ６３１１（特
開昭６３−２６９９８３号公報参照）のＡｆｌIIサイト
とＢａｍＨＩサイトとの間に挿入して、モネリン発現プ
ラスミドｐＭＮＥＩを構築した（図１）。モネリン発現
プラスミドｐＭＮＥＩで形質転換した大腸菌Ｗ３１１０
（ＡＴＣＣ２７３２５）を、ｐＭＮＥＩ／Ｗ３１１０と
命名した。

【化９】

【化１０】 （２）プラスミドｐＭＮＥＩの発現 上記の実施例２−（１）で得られたｐＭＮＥＩ／Ｗ３１
１０を、アンピシリン（５０μｇ／ml）を含むＬ培地１
５０mlにて３７℃で一晩振盪培養した。この培養液を３
０００mlのＭ９培地（０．８％グルコース、０．４％カ
ザミノ酸、１０μｇ／mlチアミン、５０μｇ／mlアンピ
シリンを含む：文献６）に加え、３７℃で３時間培養し
たのち、インドールアクリル酸を最終濃度２０μｇ／ml
になるように添加し、さらに４時間振盪培養した。上記
操作によって得た培養液から、遠心分離（１００００
ｇ，２０分）により菌体を集め、リン酸緩衝液（１０ｍ
Ｍリン酸カリウムｐＨ７．０：以下ＰＢＳと略称する）
３０mlに再懸濁した。この懸濁液に対して１Ｍジチオス
レイトールを１７５μｌ添加した後、菌体懸濁液をフレ
ンチプレスにて処理（８００psi 、３回）して菌体を破
砕した。以降の操作は４℃にて行なう。遠心分離（１０
０００ｇ、２０分）を２回繰り返して得た上清画分をＰ
ＢＳに対して透析した後、析出する不溶性物質を遠心分
離（１００００ｇ、２０分）にて除去した後、ＰＢＳに
て平衡化したＣＭ‐Sepharose （ファルマシア）を充填
したカラム（直径１．６cm、高さ６．９cm）に吸着させ
た。非吸着画分をＰＢＳにて溶出させた後、ＮａＣｌの
線形勾配（０−０．４Ｍ ＮａＣｌ／８０ml）をかける
ことにより目的蛋白質を溶出させた。活性フラクション
（１１．８ml）を、ＰＢＳに対して透析し、次いでミリ
ポアフィルター（０．２２μｍ）にて槇過した後、ＰＢ
Ｓで平衡化したSephacryl Ｓ‐１００（ファルマシア）
を充填したカラム（直径２．６cm、高さ３３cm）による
ゲル槇過クロマトグラフィで精製した。活性フラクショ
ンを蒸留水に対して充分に透析（２０時間ごとに蒸留水
２Ｌを５回交換）した後、ミリポアフィルター（０．２
２μｍ）にて槇過して得た精製蛋白溶液（２６．６ml）
を凍結乾燥して、５０mgの一本鎖化モネリン蛋白粉末を
得た。この蛋白質をＭＮＥＩと名付けた。精製品の純度
はＣＭ‐Sepharose 精製後の段階で電気泳動的に均一で
あり、凍結乾燥品は緩衝液や純水に溶解しても失活せ
ず、逆相高速液体クロマトグラフィによる分析において
も蛋白質として均一であった。

【００１０】実施例３：酵母宿主による一本鎖化モネリ
ンの製造 （１）酵母宿主モネリン発現プラスミドｐＣＴＭＮＹＩ
の構築 (i) ＧＰＤプロモーターの取得 Saccharomyces cerevisiae S288C(ATCC26108) より、常
法に従って染色体ＤＮＡを調製した。このＤＮＡをSau
３ＡＩを用いて約１０ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を多く
生じるような条件で部分分解した後、プラスミドｐＢＲ
３２２（宝酒造）のＢａｍＨＩサイトに挿入して、ライ
ブラリーを作成した。ＧＰＤ遺伝子（文献７）のコーデ
ィング領域の７番目から３６番目の塩基に対応する化学
合成ＤＮＡをプローブとして、上記ライブラリーよりＧ
ＰＤ遺伝子を含むクローンを得た。このクローンから得
たプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄIII で切断し、約２．１
ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１８
（ファルマシア）のＨｉｎｄIII サイトに挿入して、プ
ラスミドｐＧＰＤ１８１を得た（図２）。このプラスミ
ドをＸｂａｌて切断し、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼで処理
してコーディング領域を完全に欠失させた後、クレノウ
フラグメントでフィルインし、ＨｉｎｄIII リンカー
（宝酒造）を付加した後、ＨｉｎｄIII で切断した。プ
ロモーターを含む約１ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片を
ｐＣＵ１８のＨｉｎｄIII サイトに挿入して、ｐＳＴ１
８を得た。ｐＳＴ１８をＨｉｎｄIII で部分分解し、ク
レノウフラグメントでフィルインした後に再連結して、
ＧＰＤプロモーターを持つプラスミドｐＳＴ１８Ｈを得
た。 （ii）ＰＧＫターミネータの取得 ＰＧＫ遺伝子（文献８）のコーディング領域の１番目か
ら２８番目の塩基に対応する化学合成ＤＮＡをプローブ
として、上記ライブラリーよりＰＧＫ遺伝子を含むクロ
ーンを得た。このクローンから得たプラスミドＤＮＡを
ＨｉｎｄIIIで切断して、約２．９ｋｂのＨｉｎｄIII
ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＢｇｌIIで切断し
て、ＰＧＫ遺伝子のターミネーター部分とコーディング
領域の一部を含む３７５ｂｐのＢｇｌII−ＨｉｎｄIII
ＤＮＡ断片を得た（図３）。ｐＵＣ１２（ファルマシ
ア）をＳｍａＩで切断後、ＢｇｌIIリンカーを付加して
再結合して得たプラスミドｐＵＣ１２ＢのＢｇｌIIサイ
トとＨｉｎｄIII サイトとの間に、ＰＧＫ遺伝子のター
ミネーター部分を含むＢｇｌII−ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断
片を挿入して、ｐＰＧＴ１を得た。ｐＰＧＴ１をＨｉｎ
ｄIII で切断後、クレノウフラグメントでフィルイン
し、ＳａｌＩリンカー（宝酒造）を付加して、ｐＰＧＴ
２を得た。 (iii) 発現プラスミドの構築 大腸菌‐酵母シャトルベクターｐＪＤＢ２０７（アマシ
ャム・ジャパン）の二つのＨｉｎｄIII サイトの間を、
配列式５（配列番号：１１、１２）に示される化学合成
ＤＮＡで置換して、ｐＪＤＢ２０７Ｋを得た（図４）。
このプラスミドのＳａｌＩサイトとＨｉｎｄIII サイト
との間に、(i) で得た酵母ＧＰＤ遺伝子のプロモーター
領域をもつプラスミドｐＳＴ１８ＨのＳａｌＩ‐Ｈｉｎ
ｄIIIＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＪＤＢＧを
得た。さらに、(ii)で得た酵母ＰＧＫ遺伝子ターミネー
ター領域をもつプラスミドｐＰＧＴ２のＳａｌＩサイト
をＸｈｏＩサイトに変更したプラスミドｐＰＧＴ２Ｘの
ＢｇｌII−ＸｈｏＩ断片を、ｐＪＤＢＧのＢｇｌIIサイ
トとＸｈｏＩサイトとの間に挿入して、ＧＰＤプロモー
ターとＰＧＫターミネーターとをもつプラスミドｐＪＤ
ＢＧＰを構築した。一方、化学合成モネリン遺伝子をも
つプラスミドｐＭＮ４Ｅ（実施例２）のＥｃｏＲＩサイ
トとＣｌａＩサイトとの間を配列式６（配列番号：１
３、１４）で示される化学合成ＤＮＡで置換して、ｐＭ
ＮＹ１を得た（ｐＭＮＹ１は前記の配列式３のモネリン
遺伝子を含む）。また、ｐＪＤＢＧＰのＨｉｎｄIII サ
イトをクレノウフラグメントでフィルインした後、Ｂｇ
ｌIIで切断した。得られたＤＮＡ断片と、ｐＭＮＹ１の
ＤｒａＩ−ＢｇｌII ＤＮＡ断片を連結することによ
り、「ＧＰＤプロモーター＋モネリン遺伝子＋ＰＧＫタ
ーミネーター」という構成の発現カセットをもつプラス
ミドｐＭＮＧＰを得た。

【化１１】

【化１２】 酵母２μｍＤＮＡ全長をもつベクターの構築は、以下の
ように行なった（図５）。大腸菌‐酵母シャトルベクタ
ーＹＲｐ７（ＡＴＣＣ３７０６０）のＴＲＰ１遺伝子を
含むＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を Mungbean ヌクレアーゼ
処理後、クレノウフラグメントでフィルインしておき、
ｐＵＣ１２（ファルマシア）をＸｂａＩで切断して Mun
gbean ヌクレアーゼ処理後、クレノウフラグメントでフ
ィルインしたＤＮＡと、連結した（ｐＴＲＰ１１２）。
酵母２μｍＤＮＡを常法により調製した後、ＥｃｏＲＩ
で部分分解し、ｐＴＲＰ１１２のＥｃｏＲＩサイトに挿
入して、２μｍ ＤＮＡ全長を含む酵母ベクターｐＣＴ
５を得た。ｐＣＴ５のＳａｌＩサイトにｐＭＮＧＰのモ
ネリン発現カセット（ＳａｌＩ‐ＸｈｏＩ ＤＮＡ断
片）を挿入して、酵母宿主モネリン発現プラスミドｐＣ
ＴＭＮＹＩを構築した。このプラスミドにより形質転換
された酵母ＴＤ４を、ｐＣＴＭＮＹＩ／ＴＤ４と命名し
た。酵母ＴＤ４はSaccharomyces cerevisiaeＳ２８８Ｃ
（ＡＴＣＣ２６１０８）の変異株（ａ，ｈｉｓ，ｕｒ
ａ， ｌｅｕ，ｔｒｐ）である。 （２）プラスミドｐＣＴＭＮＹＩの発現 実施例３−（１）にて得たｐＣＴＭＮＹＩ／ＴＤ４を、
ヒスチジン、ウラシル、ロイシンをそれぞれ２０μｇ／
ml含んでいるＳＤ培地（０．６７％酵母ナイトロジェン
ベース（除アミノ酸）、２％ブドウ糖）３ml中、３０℃
で一晩振盪培養し、２００mlの同培地に添加して３０℃
で一晩振盪培養した。遠心分離（１００００ｇ、２０
分）による集菌後、２×１０⁸ cells／mlになるよう
に、ＰＢＳに懸濁させた（２３．５ml）。これに１Ｍジ
チオスレイトール２５μｌを加えた後、菌体懸濁液をフ
レンチプレスにて処理（８００psi 、３回）して菌体を
破砕した。以降の操作は４℃にて行なう。遠心分離（１
００００ｇ、２０分）上清画分をＰＢＳに対して透析し
た後、析出する不溶性物質を遠心分離（１００００ｇ，
２０分）にて除去してから、ＰＢＳにて平衡化したＣＭ
‐Sepharose （ファルマシア）を充填したカラム（直径
１．６cm、高さ６cm）に吸着させた。非吸着画分をＰＢ
Ｓにて溶出させた後、ＮａＣｌの線形勾配（０−０．４
ＭＮａＣｌ／８０ml）をかけることにより活性画分（蛋
白として３．７mg）を得た。この画分は、電気泳動的に
は均一でなかった（推定純度約４０％）。

【００１１】実施例４：製造した一本鎖化モネリンのＮ
末端配列分析とアミノ酸分析 ｐＭＮＥＩ／Ｗ３１１０株から得た可溶性蛋白質画分を
ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に付し、エレクトロ
ブロッティングにより（Ｔｒｉｓ‐ε‐アミノカプロン
酸‐メタノール系でのセミドライブロッティング法）Ｐ
ＶＤＦ膜(Immobilon‐Ｐ^TM、ミリポア）へ蛋白質を転写
し、Poncean Ｓ（シグマ）で染色して、組換えモネリン
（ＭＮＥＩ）に対応するバンドを切りだした。０．２ｍ
Ｍ ＮａＯＨで脱色後、膜片を気相シークエンサー（ア
プライドバイオシステム、８７０Ａ）で分析して、Ｎ末
端アミノ酸配列を決定した（１２残基）。大腸菌組換え
モネリン（ＭＮＥＩ）はＮ末端にＭｅｔを有し、それに
引き続くアミノ酸配列は設計どおりであった。また、ア
ミノ酸組成分析により、組換えモネリンが設計どおりの
アミノ酸組成を有していることを確認した。

【００１２】実施例５：製造した一本鎖化モネリンの評
価 （１）甘味検定 精製一本鎖化モネリン（ＭＮＥＩ、実施例２）ならびに
天然モネリン標品を、純水に０．３μｇ／μｌ、０．２
μｇ／μｌ、０．１μｇ／μｌ、０．０５μｇ／μｌ、
０．０２μｇ／μｌの各濃度になるように溶解し、それ
ぞれ１０μｌを舌にのせて味わうことにより、甘味活性
を評価した。試験は盲験法で３名のパネルメンバーに対
して行なった。天然体、ＭＮＥＩともに、甘味閾値濃度
は０．０５−０．１μｇ／μｌであり（即ち０．５−１
μｇ蛋白）、ＭＮＥＩは天然体と同等の比活性を有して
いた。従来もっとも甘味活性が高いとされていた改変蛋
白質（文献５におけるＳＰ１）を製造し、本法により甘
味検定を行なったところ、その甘味閾値濃度は０．１−
０．２μｇ／μｌ（即ち１−２μｇ蛋白）であった。 （２）熱安定性 精製一本鎖化モネリン（ＭＮＥＩ）ならびに天然モネリ
ン標品を、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．
３）あるいは２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
３．３）中で０．２μｇ／μｌの濃度になるように調製
し、４０℃、５０℃、８０℃、１００℃、１２０℃（オ
ートクレーブ）の各温度で２０分間処理した後、１０μ
ｌを舌にのせて評価した（第１表）。ｐＨ２．３におい
ては天然体は５０℃の処理で失活したが、ＭＮＥＩは１
００℃の処理においても甘味を保持した。ＭＮＥＩは、
ｐＨ３．０でも天然体を上回る耐熱性を示した。従来も
っとも甘味活性が高いとされていた改変蛋白質（文献５
におけるＳＰＩ）についても検定を行なったところ、Ｍ
ＮＥＩと同様の熱安定性の向上を観測したが、甘味非活
性は常にＭＮＥＩがこれを上回っていた。また、ｐＨ
２．３において、未変性の天然型モネリンの円二色性ス
ペクトル（波長領域２００ ｎｍから３２０ｎｍ）は、
２１２ｎｍ付近に強い負のスペクトル、２３６ｎｍ付近
に正のスペクトルを示すが、熱処理（５０℃）によりそ
れぞれ強度が弱くなる。ＭＮＥＩは、未変性、変性状態
のどちらの場合においても、対応する天然体の円二色性
スペクトルとよく一致したスペクトルを示した。すなわ
ち、５０℃、８０℃、１００℃で２０分処理した後のＭ
ＮＥＩの円二色性スペクトルは未変性の天然体のスペク
トルによく一致し、オートクレーブ（１２０℃）処理し
たＭＮＥＩのスペクトルは熱変性した天然体のスペクト
ルとよく一致した。 第１表 ｐＨ２．３ ｐＨ３．０ 温 度 天然体 ＭＮＥＩ 天然体 ＭＮＥＩ ４０℃ 甘 甘 甘 甘 ５０℃ ×^* 甘 甘 甘 ８０℃ × 甘 やや甘 甘 １００℃ × 甘 やや甘 甘 １２０℃(オ -トクレ -フ゛) × × × × * ×は「甘味なし」を示す。 （３）プロテアーゼ耐性 精製１本鎖化モネリン（ＭＮＥＩ）を８Ｍ尿素溶液に溶
かした後、尿素最終温度が２Ｍとなるように消化用緩衝
液を加え、次いでプロテアーゼを加え（基質／酵素＝２
００）、３０℃で１２時間加水分解を行なった。消化物
を逆相ＨＰＬＣにより分析して、未消化モネリンの量を
検定した。蛋白加水分解酵素としては、Achromobacter
protease Ｉ、endoproteinase Ａｓｐ‐Ｎ（ベーリン
ガー）を用い、消化用緩衝液は、それぞれ、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ９．０）と１００ｍＭリン酸ナ
トリウム（ｐＨ７．８）を用いた。いずれの場合も、天
然モネリンが完全に消化されたのに対し、ＭＮＥＩは９
０％以上が分解を受けなかった。

【００１３】実施例６：一本鎖化モネリン誘導体の製
造、評価 （１）ＭＮＥＩ／Ｖ１２ＡＡ体の製造と評価 モネリンの分子構造モデルをコンピューターグラフィッ
クを利用して検討すると、サブユニットＡの第十二番目
のアミノ酸残基であるＶａｌ（Ｖａｌ１２Ａ）はモネリ
ン分子の内部に位置していることがわかる。この残基を
Ａｌａに置換した分子模型について構造最適化計算を行
なったところ、このアミノ酸変異によっては立体構造は
大きく変わらないと推定された。したがって、この改変
蛋白（ＭＮＥＩ／Ｖ１２ＡＡ）は一本鎖化モネリン（Ｍ
ＮＥＩ）と実質的に同等であると考えられる。図６は、
実施例２に示した一本鎖化モネリン遺伝子のＶａｌｌ２
Ａに対応するコドンＧＴＡ（配列式４、２１５−２１
７）をＡｌａに対応するコドンに変更する方法を示して
いる。まず、配列式７（配列番号：１５、１６）に示し
た化学合成ＤＮＡを、ｐＭＮ４Ｅ（実施例２、第１図）
のＳｎａＢＩサイトとＰｍａＣＩサイトとの間に挿入し
た。このプラスミドをＡｆｌIIとＢｇｌIIで切断して得
られた０．３Ｋｂ ＤＮＡ断片を、発現用プラスミドｐ
ＳＴ６３１１（実施例２、図１）のＡｆｌIIサイトとＢ
ａｍＨＩサイトとの間に挿入して、一本鎖化モネリン誘
導体発現プラスミドｐＭＮＥＩ／Ｖ１２ＡＡを構築し
た。このプラスミドで形質転換した大腸菌Ｗ３１１０
（ＡＴＣＣ２７３２５）をｐＭＮＥＩ（Ｖ１２ＡＡ）／
Ｗ３１１０と命名した。この菌による誘導体蛋白質の発
現及び精製は、実施例２−（２）と同様に行なった。精
製された誘導体蛋白質（ＭＮＥＩ／Ｖ１２ＡＡ）の評価
を実施例５にならって行なったところ、甘味閾値濃度は
０．１−０．２μｇ／μｌであり、熱安定性ならびにプ
ロテアーゼ耐性において、ＭＮＥＩと同等であった。

【化１３】 （２）ＭＮＥＩ／Ｖ３７ＢＡ体の製造と評価 実施例６−（１）にならい、分子構造を検討すると、サ
ブユニットＢの第３７番目のアミノ酸残基である Val
(Val37B) をAla に置き換えることができ、この改変蛋
白（ＭＮＥＩ／Ｖ３７ＢＡ）も一本鎖化モネリン（ＭＮ
ＥＩ）と実質的に同等であると考えられた。配列式８
（配列番号：１７、１８）に示した化学合成ＤＮＡを調
製し、ｐＭＮ４Ｅ（実施例２、図１）のBalＩサイトＥ
ｃｏＴ２２Ｉサイトの間に挿入した。このプラスミドを
ＡｆｌIIとＢｇｌIIで切断して得られた０．３ｋｂ Ｄ
ＮＡ断片を、発現用プラスミドｐＳＴ６３１１（実施例
２、図１）のＡｆｌIIサイトとＢａｍＨＩサイトの間に
挿入して、一本鎖化モネリン誘導体発現プラスミドｐＭ
ＮＥＩ／Ｖ３７ＢＡを構築した（図７）。このプラスミ
ドで形質転換した大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２
５）をｐＭＮＥＩ（Ｖ３７ＢＡ）／Ｗ３１１０と命名し
た。この菌による誘導体蛋白質の発現および精製は、実
施例２−（２）と同様に行なった。精製された誘導体蛋
白質（ＭＮＥＩ／Ｖ３７ＢＡ）の評価を実施例５になら
って行なったところ、甘味活性において閾値が０．３−
０．４μｇ／μｌ（蛋白量として３−４μｇ）になった
が、熱安定性においてＭＮＥＩと同等であった。 （３）ＭＮＥＩ／Ｎ４９ＢＥ・Ｅ５０ＢＮ体の製造と評
価 第８図は配列式１′で示されるアミノ酸配列を有するペ
プチド（実施例１におけるペプチドとは配列式２あるい
は２′のサブユニットＢの４９−５０番目に対応するア
ミノ酸位置において同様のアミノ酸配列の相異がある
（Asn-Glu→Glu-Asn)（ＭＮＥＩ／Ｎ４９ＢＥ・Ｅ５０
ＢＮ））を製造するための発現プラスミドｐＭＮＥＩ／
Ｎ４９ＢＥ・Ｅ５０ＢＮの構築を示している。配列式９
（配列番号：１９、２０）に示した化学合成ＤＮＡを、
ｐＭＮＥＩ（実施例２、図１および配列式４）のＥｃｏ
Ｔ２２１サイトとＳｎａＢＩサイトの間に挿入して、一
本鎖化モネリン発現プラスミドｐＭＮＥＩ／Ｎ４９ＢＥ
・Ｅ５０ＢＮを構築した。このプラスミドで形質転換し
た大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）をｐＭＮＥ
Ｉ（Ｎ４９ＢＥ・Ｅ５０ＢＮ）／Ｗ３１１０と命名し
た。この菌による蛋白質の発現および精製は、実施例２
−(2) と同様に行った。精製された蛋白質（ＭＮＥＩ／
Ｎ４９ＢＥ・Ｅ５０ＢＮ）の評価を実施例５にならって
おこなったところ、甘味活性において域値は０．０５〜
０．１μｇ／μｌ（蛋白量として０．５〜１．０μｇ）
でありＭＮＥＩおよび天然型モネリンと同等であり、熱
安定性についてもＭＮＥＩおよび天然型モネリンと同等
であった。

【化１４】

【化１５】

【００１４】実施例７：急性毒性試験 ５週齢の雄性Ｓｌｃ：ＩＣＲマウス５匹（投与時体重１
９．４〜２０．５ｇ）に、注射用蒸留水に溶解した一本
鎖化モネリン（ＭＮＥＩ）をゾンデを用いて胃内に強制
投与した（１０．３mg／固体、すなわち０．５ｇ／k
g）。投与後１週間の観察期間中、ＭＮＥＩの投与によ
ると考えられる毒性所見は認められなかった。また、観
察終了時に測定した体重は正常で（３０．６〜３２．７
ｇ）、観察期間中の発育も順調であったことが示され
た。 ＜文献＞ (1) H. Van der Wel: FEBS Letters 21, 88-90(1972) J. A. Morris et al: Biochim. Biophys. Acta. 261, 1
14-122 (1972) (2) Z. Bohak et al: Biochim. Biophys. Acta. 427, 1
53-170 (1976) G. Hudson et al: Biochem. Biophys.Res. Comm. 71, 2
12-220 (1976) G. Frank: Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem. 357. 585
-592 (1976) (3) G. Tomlinson et al: Biochemistry22,5772-5774
(1983) A. Wlodawer et al: Proc. Natl. Acad. Sci．USA 72,
398-399 (1975) C. Ogata et al: Nature 328, 739-742 (1987) (4) S-H. Kim et al: Protein Engineering 2,571-575
(1989) (5) 特表平２−５００７１７号公報 特表平２−５００６４１号公報 特許ＷＯ８８／１０２６５ (6) Maniatis et al: Molecular Cloning -A Laborator
y Manual、 Cold SpringHarbor Laboratory (1982) (7) J.P.Holland et al: J.Biol. Chem.254,9839-9845
(1979) (8) R.A.Hitzeman et al: Nucleic Acids Res.10, 7791
-7808(1982) (9) M.Kohmura et al:Agric.Biol.Chem.54,2219-2224(1
990).

【００１５】

【発明の効果】本発明による蛋白質は天然型モネリンの
Ａ鎖およびＢ鎖を特定のかつ比較的短少なリンカーで連
結して一本鎖化したからであろうか、天然型モネリンの
強い甘味活性を保持したまゝ思いがけずにも低ｐＨ域で
の耐熱性が向上している。また、この蛋白質は、プロテ
アーゼ耐性も向上している。この特性は、この蛋白質を
遺伝子工学的に微生物の細胞内で産生させる場合に有利
である。すなわち、細胞内で異種蛋白質として産生させ
た本発明蛋白質は、細胞の自衛手段である細胞内プロテ
アーゼによる消化に、よりよく耐えることができるから
である。プロテアーゼ耐性が大きいということは、この
蛋白質を甘味剤として食品に使用した場合にも有益であ
ろう。食品をプロテアーゼ処理することが必要であった
ときに、甘味剤入りの状態でこの処理を行なうことがで
きるからである。蛋白質のアミノ酸配列が判明していれ
ば、それをコードするＤＮＡ配列は所謂「遺伝暗号
表」、たとえば、J.D. Watson : MOLECULAR BIOLOGY OF
THE GENE（3rd Ed）、第１３−７表）から知ることが
でき、そのＤＮＡ配列を所与の宿主細胞に対する発現ベ
クターに組込んで該宿主細胞内で当該ＤＮＡ配列による
遺伝情報を発現させれば、本発明蛋白質を大量に生産す
ることができる。本発明による甘味蛋白質が遺伝子工学
的手法で生産できるということは、熱帯植物D. cummins
iiが特殊な栽培し難いものであることを考えれば、極め
て有利なことである。また、本発明によるＤＮＡ配列を
植物ＤＮＡ内に組込んで植物内で発現させることによっ
て、あるいは酵母等の細胞内で非分泌型で発現させるこ
とによって、甘味を有する植物あるいは甘味を有する酵
母等を育種することも考えられよう。

【００１６】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：９６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Glu Trp Glu Ile Ile Asp Ile Gly Pro Phe Thr Gln Asn Leu Gly 1 5 10 15 Lys Phe Ala Val Asp Glu Glu Asn Lys Ile Gly Gln Tyr Gly Arg Leu 20 25 30 Thr Phe Asn Lys Val Ile Arg Pro Cys Met Lys Lys Thr Ile Tyr Glu 35 40 45 Asn Glu Xaa Phe Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu Tyr Val 50 55 60 Tyr Ala Ser Asp Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu Asp Tyr Lys 65 70 75 80 Thr Arg Gly Arg Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro Val Pro Pro Pro 85 90 95

【００１７】配列番号：２ 配列の長さ：９６ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Glu Trp Glu Ile Ile Asp Ile Gly Pro Phe Thr Gln Asn Leu Gly 1 5 10 15 Lys Phe Ala Val Asp Glu Glu Asn Lys Ile Gly Gln Tyr Gly Arg Leu 20 25 30 Thr Phe Asn Lys Val Ile Arg Pro Cys Met Lys Lys Thr Ile Tyr Glu 35 40 45 Glu Asn Xaa Phe Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu Tyr Val 50 55 60 Tyr Ala Ser Asp Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu Asp Tyr Lys 65 70 75 80 Thr Arg Gly Arg Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro Val Pro Pro Pro 85 90 95

【００１８】配列番号：３ 配列の長さ：４５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu Tyr Val Tyr Ala Ser 1 5 10 15 Asp Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu Asp Tyr Lys Thr Arg Gly 20 25 30 Arg Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro Val Pro Pro Pro 35 40 45

【００１９】配列番号：４ 配列の長さ：４４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu Tyr Val Tyr Ala Ser Asp 1 5 10 15 Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu Asp Tyr Lys Thr Arg Gly Arg 20 25 30 Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro Val Pro Pro Pro 35 40

【００２０】配列番号：５ 配列の長さ：５０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Glu Trp Glu Ile Ile Asp Ile Gly Pro Phe Thr Gln Asn Leu Gly 1 5 10 15 Lys Phe Ala Val Asp Glu Glu Asn Lys Ile Gly Gln Tyr Gly Arg Leu 20 25 30 Thr Phe Asn Lys Val Ile Arg Pro Cys Met Lys Lys Thr Ile Tyr Glu 35 40 45 Asn Glu

【００２１】配列番号：６ 配列の長さ：５０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Glu Trp Glu Ile Ile Asp Ile Gly Pro Phe Thr Gln Asn Leu Gly 1 5 10 15 Lys Phe Ala Val Asp Glu Glu Asn Lys Ile Gly Gln Tyr Gly Arg Leu 20 25 30 Thr Phe Asn Lys Val Ile Arg Pro Cys Met Lys Lys Thr Ile Tyr Glu 35 40 45 Glu Asn

【００２２】配列番号：７ 配列の長さ：２９１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．２９１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG GGC GAG TGG GAA ATC ATC GAT ATC GGT CCA TTC ACT CAA AAC TTG 48 Met Gly Glu Trp Glu Ile Ile Asp Ile Gly Pro Phe Thr Gln Asn Leu 1 5 10 15 GGT AAA TTC GCT GTT GAT GAA GAA AAC AAG ATT GGC CAA TAC GGT AGA 96 Gly Lys Phe Ala Val Asp Glu Glu Asn Lys Ile Gly Gln Tyr Gly Arg 20 25 30 TTG ACC TTT AAC AAG GTT ATC AGA CCA TGC ATG AAG AAG ACT ATT TAC 144 Leu Thr Phe Asn Lys Val Ile Arg Pro Cys Met Lys Lys Thr Ile Tyr 35 40 45 GAA AAC GAA GGT TTT AGA GAA ATT AAG GGT TAC GAA TAC CAA TTG TAC 192 Glu Asn Glu Gly Phe Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu Tyr 50 55 60 GTA TAC GCT TCT GAC AAG TTG TTC CGT GCT GAC ATT TCC GAA GAC TAC 240 Val Tyr Ala Ser Asp Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu Asp Tyr 65 70 75 AAG ACA CGT GGT CGT AAG TTG TTG AGA TTC AAC GGT CCA GTC CCA CCA 288 Lys Thr Arg Gly Arg Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro Val Pro Pro 80 85 90 95 CCA Pro 291

【００２３】配列番号：８ 配列の長さ：２９１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．２９１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG GGC GAG TGG GAA ATC ATC GAT ATC GGT CCA TTC ACT CAA AAC TTG 48 Met Gly Glu Trp Glu Ile Ile Asp Ile Gly Pro Phe Thr Gln Asn Leu 1 5 10 15 GGT AAA TTC GCT GTT GAT GAA GAA AAC AAG ATT GGC CAA TAC GGT AGA 96 Gly Lys Phe Ala Val Asp Glu Glu Asn Lys Ile Gly Gln Tyr Gly Arg 20 25 30 TTG ACC TTT AAC AAG GTT ATC AGA CCA TGC ATG AAG AAG ACT ATT TAC 144 Leu Thr Phe Asn Lys Val Ile Arg Pro Cys Met Lys Lys Thr Ile Tyr 35 40 45 GAA GAA AAC GGT TTT AGA GAA ATT AAG GGT TAC GAA TAC CAA TTG TAC 192 Glu Glu Asn Gly Phe Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu Tyr 50 55 60 GTA TAC GCT TCT GAC AAG TTG TTC CGT GCT GAC ATT TCC GAA GAC TAC 240 Val Tyr Ala Ser Asp Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu Asp Tyr 65 70 75 AAG ACA CGT GGT CGT AAG TTG TTG AGA TTC AAC GGT CCA GTC CCA CCA 288 Lys Thr Arg Gly Arg Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro Val Pro Pro 80 85 90 95 CCA Pro 291

【００２４】配列番号：９ 配列の長さ：３２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AATTCCTTAA GGAGGTATAT TATGGGCGAG TGGGAAATCA TCGATATCGG TCCATTCACT 60 CAAAACTTGG GTAAATTCGC TGTTGATGAA GAAAACAAGA TTGGCCAATA CGGTAGATTG 120 ACCTTTAACA AGGTTATCAG ACCATGCATG AAGAAGACTA TTTACGAAAA CGAAGGTTTT 180 AGAGAAATTA AGGGTTACGA ATACCAATTG TACGTATACG CTTCTGACAA GTTGTTCCGT 240 GCTGACATTT CCGAAGACTA CAAGACACGT GGTCGTAAGT TGTTGAGATT CAACGGTCCA 300 GTCCCACCAC CATAATGAGA TCT 323

【００２５】配列番号：１０ 配列の長さ：３２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AGCTAGATCT CATTATGGTG GTGGGACTGG ACCGTTGAAT CTCAACAACT TACGACCACG 60 TGTCTTGTAG TCTTCGGAAA TGTCAGCACG GAACAACTTG TCAGAAGCGT ATACGTACAA 120 TTGGTATTCG TAACCCTTAA TTTCTCTAAA ACCTTCGTTT TCGTAAATAG TCTTCTTCAT 180 GCATGGTCTG ATAACCTTGT TAAAGGTCAA TCTACCGTAT TGGCCAATCT TGTTTTCTTC 240 ATCAACAGCG AATTTACCCA AGTTTTGAGT GAATGGACCG ATATCGATGA TTTCCCACTC 300 GCCCATAATA TACCTCCTTA AGG 323

【００２６】配列番号：１１ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AGCTTATGAT TACGAGCTCC CGGGCAGATC TCGGCCTCGA G 41

【００２７】配列番号：１２ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AGCTCTCGAG GCCGAGATCT GCCCGGGAGC TCGTAATCAT A 41

【００２８】配列番号：１３ 配列の長さ：５５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AATTCGAGCT CGGTACCCGG GGGATCCTTT AAAAAATGGG CGAGTGGGAA ATCAT 55

【００２９】配列番号：１４ 配列の長さ：５３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CGATGATTTC CCACTCGCCC ATTTTTTAAA GGATCCCCCG GGTACCGAGC TCG 53

【００３０】配列番号：１５ 配列の長さ：８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GCTTACGCTT CTGACAAGTT GTTCCGTGCT GACATTTCCG AAGACTACAA GACACAGTCC 60 CACCACCATA ATGAGATCTA GCTT 84

【００３１】配列番号１６ 配列の長さ：８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AAGCTAGATC TCATTATGGT GGTGGGACTG TGTCTTGTAG TCTTCGGAAA TGTCAGCACG 60 GAACAACTTG TCAGAAGCGT AAGC 84

【００３２】配列番号１７ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCAATACGGT AGATTGACCT TTAACAAGGC TATCAGACCA TGCA 44

【００３３】配列番号：１８ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TGGTCTGATA GCCTTGTTAA AGGTCAATCT ACCGTATTGG 40

【００３４】配列番号：１９ 配列の長さ：６５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TGAAGAAGAC TATTTACGAA GAAAACGGTT TTAGAGAAAT TAAGGGTTAC GAATACCAAT 60 TGTAC 65

【００３５】配列番号：２０ 配列の長さ：６９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GTACAATTGG TATTCGTAAC CCTTAATTTC TCTAAAACCG TTTTCTTCGT AAATAGTCTT 60 CTTCATGCA 69

【図面の簡単な説明】

【図１】大腸菌宿主モネリン発現プラスミドｐＭＮＥ１
構築のフローシートである。

【図２】酵母宿主モネリン発現プラスミドｐＣＴＭＮＹ
Ｉ構築のフローシートの一部である。

【図３】酵母宿主モネリン発現プラスミドｐＣＴＭＮＹ
Ｉ構築のフローシートの一部である。

【図４】酵母宿主モネリン発現プラスミドｐＣＴＭＮＹ
Ｉ構築のフローシートの一部である。

【図５】酵母宿主モネリン発現プラスミドｐＣＴＭＮＹ
Ｉ構築のフローシートの一部である。

【図６】プラスミドｐＭＮＥＩ／Ｖ１２ＡＡ構築のフロ
ーシートである。

【図７】プラスミドｐＭＮＥＩ／Ｖ３７ＢＡ構築のフロ
ーシートである。

【図８】プラスミドｐＭＮＥＩ／Ｎ４９ＢＥ・Ｅ５０Ｂ
Ｅ構築のフロ−シ−トである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記配列式１′で示されるアミノ酸配列と
   実質的に同じアミノ酸配列を有するものであることを特
   徴とする、甘味を有する蛋白質。 【化１】 （ここで、Ｘａａは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＴ
   ｈｒを表わす）
2. 【請求項２】請求項１に記載の蛋白質をコードするもの
   であることを特徴とする、ＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】請求項１に記載の甘味を有する蛋白質を甘
   味成分の少なくとも一部として含んでなる、甘味剤。