JPH0572173A

JPH0572173A - 免疫測定装置

Info

Publication number: JPH0572173A
Application number: JP3263095A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Nakayama; 博中山; Satoshi Ibaraki; 敏茨木; Akio Kuzuhara; 亜起夫葛原; Satoru Nagura; 哲名倉
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1991-09-14
Filing date: 1991-09-14
Publication date: 1993-03-23

Abstract

(57)【要約】【構成】検体溶液中の被検体と免疫反応により結合す
る第１の抗体又は抗原を固定化した不溶性担体と、酵素
標識した第２の抗体又は抗原とで、担体に捕捉標識し、
次いでこの不溶性担体の酵素活性を、酵素反応量を電極
を用いて検知し、検体溶液中の被検体量を測定する酵素
免疫測定装置において、各種溶液を導入及び排出するた
めの流路と、液体を攪拌する手段と、検出用電極とを設
けた測定用容器を備え、且つ該容器壁には空孔部が設け
られ空孔部には不溶性担体が外部より圧接され容器壁面
を構成することを特徴とする。【効果】本発明の免疫測定装置により、著しく簡便な
操作で高感度かつ高精度な免疫測定を行うことができ
る。測定の所要時間も短く、特に緊急診断、即時診断に
利用できることから、医療分野に於ける有用性は極めて
高いものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、検体溶液中の被検体量
を、電極を用いて簡便かつ高精度、高感度で測定し得る
酵素免疫測定装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫測定は、ホルモン，ウイルス，酵素
や腫瘍マーカーとしての蛋白質，薬物，毒物などの体中
の濃度が微量で構造が類似しているため区別がつき難い
物質の高感度且つ選択的な定量法として、診断，血中濃
度モニタ，環境検査や農産物，水産物の検査などに有効
に用いられるに至っている。免疫測定の方法としては従
来より多くの方法が開発されているが、酵素で標識され
た抗体や抗原を用いるＥＩＡ（エンザイムイムノア
ッセイ）法は感度が高く、信頼性も高いことから最近多
く用いられるに至っている。しかし、このＥＩＡ法は一
般に測定時間が１〜２時間と長く、又操作が繁雑なこと
から自動化装置が各種開発されるに至ったが、効率化の
点や検出デバイスとして高価な分光光度計，蛍光光度計
を用いることから、大型の多検体処理装置として開発さ
れているのが実情である。これに対し、抗体などを固定
化した膜で被覆した電極（免疫センサー）を検出デバイ
スとすると、短時間に高感度な測定ができるばかりでな
く、検出デバイスが小さく且つ安価であるため、小型の
測定装置の開発が可能になる。

【０００３】本発明者らは、先に特開昭６３−１１７２
５３号公報において、抗体を包括固定化したフィブロイ
ン膜を酸素電極に装着したＥＩＡ用の免疫センサーを提
案している。かかる免疫センサーを使用すれば、一検体
測定後に結合した抗原又は抗体を解離させ、固定化抗体
又は抗原膜を再生使用することが可能であるため、固定
化膜を交換することなく数十回の繰り返し測定ができ、
操作的にも迅速，簡便な免疫測定装置を構成することが
できる。

【０００４】しかし、こうした免疫センサーの場合、電
極より得られる信号量の大きさは固定化膜の厚み、固定
化膜と電極との装着状態のバラツキによって影響される
ため、固定化膜を交換する毎に、測定物質の標準検体を
用いて較正を行うことが不可欠であり、較正を省略した
場合の測定値の信頼性は十分でない。そこで緊急に測定
を行い度い場合の対応に関し、この較正操作が不可欠で
あることが課題となっていた。また、酵素免疫測定に於
いて酵素反応の生成物を選択性電極を用いて測定するこ
とも開示されているが、実用に際し高い簡便性をもつも
のは報告されていない。特開昭５８−１０９８５１号公
報に開示された例でも、測定の感度、精度を高めるた
め、固相担体を複雑な形状としており、コスト、調製面
での課題が大きいものである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は既存の装置が
有する上述の問題点に鑑み、鋭意研究を続けた結果完成
したものであってその目的とするところは、被検量を電
極を用いて酵素免疫測定法により測定するに際し、均一
な測定場を非常に簡便な方法で確保することにより、検
体中の物質を測定対象に応じて簡便、迅速に高い信頼性
で免疫測定するための装置を提供するにある。他の目的
は、固定化担体を繰り返して使用することにより、検体
中の物質を著しく簡便、迅速に、高い精度をもって免疫
酵素する自動化装置を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上述の目的は、検体溶液
中の被検体と免疫反応により結合する第１の抗体又は抗
原を固定化した不溶性担体と、酵素標識した第２の抗体
又は抗原とで、担体に捕捉標識し、次いでこの不溶性担
体の酵素活性を、酵素反応量を電極を用いて検知し、検
体溶液中の被検体量を測定する酵素免疫測定装置におい
て、各種溶液を導入及び排出するための流路と、液体を
攪拌する手段と、検出用電極とを設けた測定用容器を備
え、且つ該容器壁には空孔部が設けられ空孔部には不溶
性担体が外部より圧接され容器壁面を構成することを特
徴とする免疫測定装置により達成される。

【０００７】

【作用】本発明の免疫測定装置を、検体中の特定の抗原
を測定する場合により説明する。本発明に於いて、被検
体は予め酵素標識抗体試薬と混合され、測定用容器に注
入されるものであってもよいし、被検体が先ず測定用容
器に注入され、被検体中の対象物質と不溶性担体に固定
化された抗体との第１段目の免疫反応を行ってから、酵
素標識抗体試薬が導入され、第２段目の免疫反応を行う
ものであってもよい。また血液、血清等の検体の定量希
釈、或いは酵素標識抗体試薬との定量混合を自動的に行
った後、これら溶液を測定用セルに導入するようにする
こともできる。

【０００８】抗体を固定化した不溶性担体は板状、膜状
のものが好適に用いられ、容器壁の空孔部に容器壁面を
構成するように圧接、装着される。溶液類の洩れを防止
するため容器と担体との間にパッキングを設けてもよ
い。膜状の担体も同様に支持板により容器壁の空孔部に
圧接、装着することができるが、こうした方法によれば
不溶性担体を容易に交換することが可能である。更に、
抗体固定化担体を繰り返して使用できるように、抗体は
共有結合により不溶性担体に固定化されていることが好
ましい。こうした担体としては、アミノ化ポリスチレ
ン、クロルメチルスチレン共重合ポリマー、スチレン−
無水マレイン酸共重合ポリマーや、キュプロファン、ブ
ロモアセチルセルロースなどが好適に用いられる。ま
た、同様な目的に対し、抗体を包括固定化した絹フィブ
ロイン膜も好適に用いられる。

【０００９】免疫反応終了後、セル室内及び抗体固定化
担体面は十分に洗浄され、次いで酵素反応ステップに進
む。酵素反応系は選択性電極を用いた各種反応系を利用
することができるが、酵素の触媒効率が大きいことによ
る感度の高さ、検出の容易さ、繰り返し測定性能等の点
から、酵素をカタラーゼ、反応基質を過酸化水素とし、
発生酸素の溶液中濃度を酸素電極により検出する系が好
適である。電極測定は、攪拌下に溶液中の酸素濃度の増
大速度を計測する方法が適している。電極測定後、洗浄
液が導入され洗浄ステップが進められる。抗体固定化担
体を繰り返して使用する場合は、次いで解離液が導入さ
れ、固定化抗体からの抗原の解離処理を行った後、不溶
性担体は十分に洗浄され、再度次の測定に備える状態と
なる。

【００１０】抗体固定化担体を繰り返して使用するため
には、抗体自体の安定性に加え、測定条件の中で抗体を
安定に固定化する方法を選択することが必要である。ま
た、該不溶性担体により、較正を行わずに高い精度の測
定結果を得るためには、抗体の固定化量が均一なものを
使用する必要のあることは言う迄もない。勿論、固定化
担体を繰り返して使用する場合、標準検体による較正を
実施することにより、更に精密な結果を得ることができ
る。

【００１１】以下、本発明の装置を図面に示す実施例に
基づいて説明する。

【実施例】図１，図２，図３は測定セルの構造例を示す
説明図である。図１は測定セルを上から見た図である。
測定容器（１）にはポーラロ型酸素電極（２）がＯ−リ
ング（３）を介して装着されている。対向面の円形の空
孔部には抗体固定化絹フィブロイン膜（４）が支持板
（５）によりＯ−リング（６）を介して圧接されてお
り、固定化膜（４）は支持板（５）を後方に引くことで
容易に交換できる。又測定容器には３本の配管Ａ
（９），Ｂ（１０），Ｃ（１１）が配設されている。配
管Ａは各種溶液の導入管であり、配管Ｂ，Ｃは排出用で
ある。

【００１２】図２は、図１に示した測定セルをａ−ａ′
で示した垂直面で切断した断面図である。測定容器中の
液体は回転子（７）をマグネチックスターラー（８）に
より回転させ、攪拌する構造となっている。図３は、図
１に示した測定セルをｂ−ｂ′で示した垂直面で切断し
た断面図である。各種溶液は配管Ａ（９）より導入され
るが、セル内の気泡を除き、溶液を充填するため余剰溶
液は配管Ｂ（１０）より排出される。また、セル内を除
液する際は配管Ｃ（１１）より行われる。

【００１３】図４は各種溶液類を測定セル（１０７）に
通液及び排液するための流路図を示す。洗浄液（１０１
ａ），解離液（１０２ａ），基質溶液（１０３ａ）は各
々の容器（１０１），（１０２），（１０３）中に貯留
され、この順に設置されている。これらの溶液類の送液
はチューブポンプ（１０４）により行われる。被検体溶
液は注入部（１０６）より装置に注入される。注入され
た検体溶液は注入部の液保持用ループ部分（１０６ａ）
を充満し、ノブ回転による流路切換えによりセル室内に
導入される構造になっている。

【００１４】次に、本発明注入部の構造及び動作の説明
図、図６（Ａ），（Ｂ）及び図７に基づいて被検体注入
部（２０）について説明すると、被検体注入部（２０）
はオペレータがロータ（２４）を回動するためのノブ
（２２）を有しており、被検体溶液を装置表面側より注
入するための注入口（２３）が設けられている。ロータ
（２４）には注入口（２３）に連接された注入管（２
７）が配設されており、ステータ（２５）にはループ
（２１）が接続されると共に、ステータ（２５）及びロ
ータ（２６）の対向面にはそれぞれシール（２６）され
た６個ずつの弁口が設けられ、ロータ（２４）側の弁口
には図６（Ａ）で示すように弁口（１）及び（６），弁
口（２）及び（３）を連結する連結管（２４Ａ），（２
４Ｂ）が設けられている。したがって、図６（Ａ）の状
態で注入口（２３）から被検体溶液を注入してループ
（２１）に一定量保持した後、ノブ（２２）を回動する
ことによって同図（Ｂ）のように弁口（１）−（２），
（３）−（４）が連結管（２４Ａ），（２４Ｂ）によっ
て連結されると同時にチューブポンプ（１０４）を一定
時間作動させ、ループ（２１）内の被検体溶液を標識抗
体溶液と共にセル室（１０７）に送液することができ
る。

【００１５】セル室内及び注入部（流路）はエアポンプ
（１０５）により除液できるようになっている。流路切
り換えは電磁弁（１０８），（１０９），（１１０）に
より行われる。又、測定セルからの排液流路は電磁弁
（１１１），（１１２）により選択される。酵素反応で
電極から得られる電流信号は演算部（１１３）で処理さ
れ、電流の増大速度が求められ、内蔵された（溶液中物
質濃度）−（電流増大速度）の関係式により変換され、
検体中濃度として表示部に表示される。

【００１６】図８は測定プロセスのフロー図である。抗
体固定化絹フィブロイン膜を支持板により測定容器に設
けられた空孔部に圧接、装着する。被検体溶液と標識抗
体溶液を一定容量比で混合し、注入部に注入する。次い
で、直ちに注入部のノブを回転すると同時に、チューブ
ポンプ（１０４）が一定時間作動し、注入部ループ部分
に保持された混合溶液はセル室内を充満する。検体混合
溶液を注入するに先立ち、注入部流路とセル室内はエア
ポンプによる通気によって除液されている。又、チュー
ブポンプ作動時は流路は洗浄液槽に通じており、検体混
合溶液は洗浄液に押されてセル室内へ移動するが、電磁
弁（１１０）と注入部（１０６）の間は空気層となって
いるため、検体混合溶液が洗浄液による希釈を受けない
仕組みになっている。注入部ノブ回転と同時にシーケン
サーが起動し、以下の操作は自動的に進められる。

【００１７】攪拌下、免疫反応が２分間行われる。溶液
が排液された後、洗浄液が導入され、２０秒間攪拌下通
液洗浄される。排液は最初の１０秒間排管Ｂより排出さ
れ、次いで１０秒間排管Ｃより排出される。洗浄工程で
は、この操作が３回繰り返される。エアポンプが作動
し、セル室内及びその間の流路が除液された後、基質液
がセル室内に通液される。基質液がセル室内を満たした
状態で、送液が停止し、排出用配管の電磁弁が閉じる。
攪拌下、基質液導入終了５秒後から４０秒後迄の電流変
化が計測され、演算部で処理されて結果が表示される。
この酵素反応ステップの後、先と同様の洗浄ステップを
経て解離反応ステップに進む。解離液が導入され、１分
間攪拌の後排出される。この操作が２回繰り返された
後、１０秒間通液され、固定化抗体が再生される。通気
によるセル内の除液の後、再度洗浄工程が行われ、最終
的に洗浄液を測定セルに溜めた状態で次の測定に備え
る。新たに測定を行う場合は、測定スイッチを押すこと
により、測定セル内の溶液は排出され、測定の準備が完
了する。以上の一連の測定に要する時間は、検体注入か
ら約１１分間である。

【００１８】又、図５は他の構成の流路系を示す。要素
部品の動作は既に述べたものと変わるところはないが、
こうした流路系を用いた装置では、図９に示した２段階
で免疫反応を行う測定方式にも対応することができる。
この測定方式では、先ず、注入部に検体溶液が注入され
る。これは測定セルに送液されて、固定化抗体と１段目
の免疫反応を行った後、洗浄工程を経て、酵素標識抗体
試薬溶液が導入され、２段目の免疫反応を行うものであ
る。その他のステップは図８の測定フローと同様に進め
られる。

【００１９】

【発明の効果】以上に述べた本発明の免疫測定装置によ
り、著しく簡便な操作で高感度かつ高精度な免疫測定を
行うことができる。測定の所要時間も短く、特に緊急診
断、即時診断に利用できることから、医療分野に於ける
有用性は極めて高いものである。

【００２０】

【図面の簡単な説明】

【図１】測定セルの構造を示した説明図である。

【図２】測定セルの構造を示した説明図である。

【図３】測定セルの構造を示した説明図である。

【図４】流路系を含む装置構成を示した説明図である。

【図５】流路系を含む装置構成を示した説明図である。

【図６】注入部の構造及び動作の説明図である。

【図７】注入部の構造及び動作の説明図である。

【図８】測定プロセスのフロー図である。

【図９】測定プロセスのフロー図である。

【符号の説明】

１測定容器２酸素電極３，６Ｏ−リング４抗体固定化膜５支持板７磁気回転子８マグネチックスターラー９，１０，１１配管２０，１０６検体注入部２１，１０６ａ保持ループ２２ノブ１０１，１０２，１０３，１２１試薬用容器１０１ａ洗浄液１０２ａ解離液１０３ａ基質液１２１ａ酵素標識抗体液１０４，１２２チューブポンプ１０５エアポンプ１０７測定セル１１３演算部１０８，１０９，１１０，１１１，１１２，１２３
電磁弁

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/543 Ｚ 7906−2Ｊ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検体溶液中の被検体と免疫反応により結
合する第１の抗体又は抗原を固定化した不溶性担体と、
酵素標識した第２の抗体又は抗原とで、担体に捕捉標識
し、次いでこの不溶性担体の酵素活性を、酵素反応量を
電極を用いて検知し、検体溶液中の被検体量を測定する
酵素免疫測定装置において、各種溶液を導入及び排出す
るための流路と、液体を攪拌する手段と、検出用電極と
を設けた測定用容器を備え、且つ該容器壁には空孔部が
設けられ空孔部には不溶性担体が外部より圧接され容器
壁面を構成することを特徴とする免疫測定装置。