JPH0572205A

JPH0572205A - 免疫測定方法及び装置

Info

Publication number: JPH0572205A
Application number: JP3263094A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Ibaraki; 敏茨木; Hiroshi Nakayama; 博中山; Akio Kuzuhara; 亜起夫葛原; Satoru Nagura; 哲名倉
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1991-09-14
Filing date: 1991-09-14
Publication date: 1993-03-23

Abstract

(57)【要約】【構成】検体溶液中の被検体と免疫反応により結合す
る第１の抗体又は抗原を固定化した不溶性担体と、酵素
標識した第２の抗体又は抗原とで、担体に捕捉標識し、
次いでこの不溶性担体の酵素活性を測定することからな
る被検体の免疫測定方法において、免疫反応が終了した
後、不溶性担体を洗浄し、引き続いて酵素反応基質液を
導入して酵素反応を行うときに、該反応系に電極を挿入
し、基質量又は生成物量の変化を測定することを特徴と
する。【効果】本発明の免疫測定方法及び装置は、著しく簡
便な操作で、高感度、かつ高精度の免疫測定を可能にす
るものである。特に緊急診断、即時診断に利用できるこ
とから医療分野に於ける有用性は極めて高いものであ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、検体溶液中の被検体
を、電極を用いて簡便かつ高い精度、感度で測定する酵
素免疫測定方法及びその装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫測定は、ホルモン，ウイルス，酵素
や腫瘍マーカーとしての蛋白質，薬物，毒物などの体中
の濃度が微量で構造が類似しているため区別がつき難い
物質の高感度且つ選択的な定量法として、診断，血中濃
度モニタ，環境検査や農産物，水産物の検査などに有効
に用いられるに至っている。免疫測定の方法としては従
来より多くの方法が開発されているが、酵素で標識され
た抗体や抗原を用いるＥＩＡ（エンザイムイムノア
ッセイ）法は感度が高く、信頼性も高いことから最近多
く用いられるに至っている。しかし、このＥＩＡ法は一
般に測定時間が１〜２時間と長く、又操作が繁雑なこと
から自動化装置が各種開発されるに至ったが、効率化の
点や検出デバイスとして高価な分光光度計，蛍光光度計
を用いることから、大型の多検体処理装置として開発さ
れているのが実情である。これに対し、抗体などを固定
化した膜で被覆した電極（免疫センサー）を検出デバイ
スとすると、短時間に高感度な測定ができるばかりでな
く、検出デバイスが小さく且つ安価であるため、小型の
測定装置の開発が可能になる。

【０００３】本発明者らは、先に特開昭６３−１１７２
５３号公報において、抗体を包括固定化したフィブロイ
ン膜を酸素電極に装着したＥＩＡ用の免疫センサーを提
案している。かかる免疫センサーを使用すれば、一検体
測定後に結合した抗原又は抗体を解離させ、固定化抗体
又は抗原膜を再生使用することが可能であるため、固定
化膜を交換することなく数十回の繰り返し測定ができ、
操作的にも迅速，簡便な免疫測定装置を構成することが
できる。

【０００４】しかし、かかる免疫センサーの場合、電極
より得られる信号量の大きさは固定化膜の厚み、固定化
膜と電極との装着状態によって影響されるため、固定化
膜を交換する毎に測定物質の標準検体を用いて較正を行
うことが不可欠であり、較正を省略した場合の測定値の
信頼性は十分でない。また、酵素免疫測定に於いて、酵
素反応の生成物を選択性電極を用いて測定することも開
示されているが（特開昭５８−１０９８５１号公報）、
電極検出部が血清、血液等の検体中の諸成分によって汚
染するため測定値の再現性が損われる。このことは、特
に同一の固定化担体と電極とを繰り返し用いて測定を行
う場合にその簡便性を大きく損うことになる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは上述の問
題点に鑑み、鋭意研究を続けた結果本発明を完成したも
のであって、その目的は、被検体中の物質量を酵素免疫
測定法により測定するに際し、固定化担体と電極とを用
い、かつ電極表面の汚染を防止することにより、均一な
測定場を確保し、検体中の物質を測定対象に応じて簡
便、迅速に、高い信頼性で免疫測定する方法及びこれを
実現する免疫測定装置を提供するにある。他の目的は、
固定化担体を繰り返して使用することにより、検体中の
物質を著しく簡便、高精度に免疫測定する方法及びこれ
を実現する自動化免疫測定装置を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上述の目的は、検体溶液
中の被検体と免疫反応により結合する第１の抗体又は抗
原を固定化した不溶性担体と、酵素標識した第２の抗体
又は抗原とで、担体に捕捉標識し、次いでこの不溶性担
体の酵素活性を測定することからなる被検体の免疫測定
方法において、免疫反応が終了した後、不溶性担体を洗
浄し、引き続いて酵素反応基質液を導入して酵素反応を
行うときに、該反応系に電極を挿入し、基質量又は生成
物量の変化を測定することを特徴とする免疫測定方法。

【０００７】並びに、免疫反応終了後、不溶性担体と解
離液とを接触せしめ、結合した被検体及び酵素標識抗体
又は抗原を担体から解離し、抗体又は抗原を固定化した
不溶性担体を再生し、繰り返し使用する請求項１記載の
免疫測定方法。

【０００８】更には、各種溶液を導入及び排出する流路
と、容器内の液体を攪拌する手段と、出入自在の電極と
を設けた測定容器を備え、検体溶液中の被検体と免疫反
応により結合する第１の抗体又は抗原を固定化した不溶
性担体と、酵素標識した第２の抗体又は抗原とで、担体
に捕捉標識し、次いでこの不溶性担体の酵素活性を測定
する免疫測定装置であって、免疫反応が終了した後不溶
性担体を洗浄する工程、容器に電極を装着する工程、酵
素反応基質液を導入し攪拌下で基質量又は生成物量の変
化を電極により測定する工程、電極測定部を洗浄する工
程を順次自動的に制御遂行せしめることを特徴とする自
動免疫測定装置により達成される。

【０００９】

【作用】本発明の免疫測定方法、及び装置による測定操
作手順を、検体中の或る特定の抗原を測定する場合によ
り説明する。本発明に於いて、検体は予め酵素標識抗体
試薬と混合された後、測定用容器に注入されるものであ
ってもよいし、検体が先ず測定用容器に注入され、検体
中の対象物質と不溶性担体の抗体との第１段目の結合反
応が終了した後、酵素標識抗体試薬が導入され、第２段
目の免疫反応を行うものであってもよい。また、血液、
血清等の検体の定量希釈、或いは酵素標識抗体試薬との
定量混合を自動的に行った後、これら溶液を測定用容器
に導入するようにすることもできる。抗体を固定化した
不溶性担体は、ビーズ状、板状、膜状などの各種形状の
ものを用いることができる。又、それ自体を攪拌要素と
することもできる。同様な目的から磁性体を包含するビ
ーズも用いられる。これら不溶性担体は測定容器内に入
れられるものであってもよいが、また板状の担体は、容
器壁の空孔部に容器壁面を構成するように圧接、装着す
ることもできる。この場合、溶液類の洩れを防止するた
め容器と担体との間にパッキングを設けることが望まし
い。こうした方法によれば、不溶性担体を容易に交換す
ることができる。又、膜状担体は同様な方法により、支
持板と共に容器空孔部に圧接、装着することができる。

【００１０】抗体固定化担体を繰り返して使用するた
め、抗体は不溶性担体に共有結合により固定化されてい
ることが好ましい。この場合、担体としては、アミノ化
ポリスチレン、クロルメチルスチレン共重合ポリマー、
スチレン−無水マレイン酸共重合ポリマーなどが好適に
用いられる。また同様な目的に対し、抗体を包括固定化
した絹フィブロイン膜も好適に用いられる。免疫反応終
了後、抗原、酵素標識抗体を結合した抗体固定化不溶性
担体は十分に洗浄される。この洗浄により、血清、血液
等の検体に由来する成分を除去した後、電極が測定容器
に挿入される。電極は容器上方向より容易に挿入セット
されるが、容器側面の空孔部の押え板と交換する方式で
検出部を圧接、装着することも可能である。

【００１１】電極は、酸素電極、過酸化水素電極、及び
その他の選択性イオン電極等が用いられるが、測定感度
の点から、酸素電極を用い、標識酵素をカタラーゼ、酵
素反応基質を過酸化水素水溶液とする系が好適である。
この検出系に於いては、特に測定精度の面から、酸素電
極を予め容器中にセットされた状態で一定量の酵素反応
基質液を導入し、攪拌下溶液中の酸素濃度の増大速度を
計測する方法が好ましいが、酵素反応基質液を導入した
後、速やかに電極を挿入することによっても同様の効果
を得ることができる。酵素反応時の攪拌は測定精度上非
常に重要な要素であるが、電極の上下運動、回転運動に
よって容易に行うこともできる。また容器内の磁気回転
子によって攪拌することもできる。電極計測後、洗浄液
が導入され、電極検出部周辺が十分に洗浄された後、電
極は容器より元の場所に戻される。

【００１２】固定化抗体の繰り返し使用に対しては、上
述のステップの後、解離液が導入される。一定時間、固
定化抗体からの抗原の解離処理を行った後、不溶性担体
は十分に洗浄され、再度、次の測定に備える。抗体固定
化担体を繰り返して使用するためには、抗体自体の安定
性に加え、測定条件の中で安定に抗体を固定化する方法
を選択することが必要である。また、該不溶性担体によ
り、較正を行わずに高い精度の測定結果を得るために
は、抗体の固定化量が均一なものを使用する必要のある
ことは言う迄もない。勿論、繰り返して使用する場合、
標準検体による較正を実施することにより、更に、精密
な高い結果を得ることができる。本発明の方法によれ
ば、いつも均一な測定場を得ることができるため、検体
中の対象とする物質を簡便、迅速に高い信頼性を以って
測定することが可能である。

【００１３】以下本発明を図面に示す実施例に基づいて
説明する。

【実施例】図１は本発明に係る測定セルの一実施態様を
示す説明図である。測定容器（１）には２本の配管Ａ
（６），Ｂ（７）が配設されている。配管Ａは各種溶液
の導入管であり、配管Ｂは排出用である。溶液導入量を
一定化するため、液面センサーＡ（４）が設けられてい
る。抗体固定化絹フィブロイン膜（９）は支持板（８）
によりＯ−リング（１０）を介して容器壁に設けられた
空孔部に圧接されている。酸素電極（２）は測定容器
（１）の上部より自動的に挿入及び抜き出される構造に
なっており、電極が降下された時、電極先端の検出部は
液中に浸漬するように位置決めされている。電極先端部
はテフロン膜（３）によって被覆されている。洗浄プロ
セスでは、電極を確実に洗浄するため、液面センサーＢ
（５）により液量が制御される。攪拌はマグネチックス
ターラー（１２）により、回転子（１１）を回転させる
ことによって行われる。

【００１４】図２は各種溶液類を測定セル（１１４）に
通液及び排液するための流路図を示す。洗浄液（１０１
ａ），解離液（１０２ａ），基質溶液（１０３ａ）は各
々の容器（１０１），（１０２），（１０３）中に貯え
られ、この順に設置されている。これらの各種溶液を送
液するためのチューブポンプ（１０５），（１０６），
（１０７）及び、測定セル（１１４）から排液するため
のチューブポンプ（１０８）が設けられている。測定セ
ル（１１４）までの流路系は全てエアポンプ（１０４）
により排液できる構造になっている。各種溶液流路と主
流路とは電磁弁（１０９），（１１０），（１１１）に
より連接されている。測定セル（１１４）の前後には電
磁弁（１１２），（１１３）が配設されている。電磁弁
（１１２）は測定容器を介さずに配管中の溶液を排出す
るためのものである。酵素反応で電極から得られる電流
信号は、演算部（１１５）で処理され、電流の増大速度
が求められ、内蔵された（溶液中物質濃度）−（電流増
大速度）の関係式により検体中濃度として表示部に表示
される。

【００１５】図３は測定プロセスのフロー図である。抗
体固定化絹フィブロイン膜を支持板により測定容器の空
孔部に圧接し、装着する。検体溶液と標識抗体溶液を一
定容量比で混合し、この一定量を速やかに測定セルに注
入すると同時に開始ボタンを押し、装置を起動する。攪
拌下免疫反応が２分間行われる。溶液が排液された後、
洗浄液が導入され、２０秒間攪拌洗浄の後排液される。
洗浄工程では、この洗浄操作が４回行われる。酸素電極
が挿入され、次いで酵素反応基質液が導入される。攪拌
下、基質液導入終了５秒後から４０秒後迄の電流変化が
計測され、演算部で処理されて結果が表示される。先と
同様の洗浄工程が行われた後電極が抜き出される。次い
で解離液が導入され、１分間攪拌の後排出される。解離
反応工程ではこの操作が３回繰り返して行われ、固定化
抗体が再生される。再度洗浄工程が行われた後、洗浄液
を測定容器に溜めた状態で次の測定に備える。

【００１６】次回の測定に際しては、測定スイッチを押
すことにより、測定容器中の溶液は排出され、測定の準
備が完了する。但し、上記操作に於いて酵素反応基質液
の導入に際しては、エアポンプによる通気によって流路
系に滞留する洗浄液が排出される。この操作はまず測定
セルの前に位置する電磁弁（１１２）より測定セルを通
らずに排液され、次いで測定セルと電磁弁（１１２）の
間が排液され、最後に測定セル中に滞留する残液を排出
するように行われる。これは、基質液の薄め効果を防
ぎ、高精度の測定値を得るためである。また、解離反応
前後の電磁弁（１０９）から電磁弁（１１２）の間に滞
留する洗浄液、解離液も電磁弁（１１２）を通り通気排
液され、次の工程の処理効率が確保される。これら一連
の測定プロセスはシーケンス制御され、自動化されてお
り、１回の測定に要する時間は、検体溶液注入から約１
１分間である。

【００１７】

【発明の効果】以上に述べた本発明の免疫測定方法及び
装置は、著しく簡便な操作で、高感度、かつ高精度の免
疫測定を可能にするものである。特に緊急診断、即時診
断に利用できることから医療分野に於ける有用性は極め
て高いものである。

【００１８】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る測定セルの一実施態様を示す図で
ある。

【図２】各種溶液を測定セルに導入、排出するための流
路系を主に示した図である。

【図３】測定プロセスのフローを説明するための図であ
る。

【符号の説明】

１測定容器２酸素電極３テフロン膜４液面センサー５液面センサー６配管７配管８支持板９抗体固定化膜１０Ｏ−リング１１回転子１２マグネチックスターラー１０１試薬用容器１０２試薬用容器１０３試薬用容器１０１ａ洗浄液１０２ａ解離液１０３ａ基質液１０４エアポンプ１０５チューブポンプ１０６チューブポンプ１０７チューブポンプ１０８チューブポンプ１０９電磁弁１１０電磁弁１１１電磁弁１１２電磁弁１１３電磁弁１１４測定セル１１５演算部

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検体溶液中の被検体と免疫反応により結
合する第１の抗体又は抗原を固定化した不溶性担体と、
酵素標識した第２の抗体又は抗原とで、担体に捕捉標識
し、次いでこの不溶性担体の酵素活性を測定することか
らなる被検体の免疫測定方法において、免疫反応が終了
した後、不溶性担体を洗浄し、引き続いて酵素反応基質
液を導入して酵素反応を行うときに、該反応系に電極を
挿入し、基質量又は生成物量の変化を測定することを特
徴とする免疫測定方法。
【請求項２】免疫反応終了後、不溶性担体と解離液と
を接触せしめ、結合した被検体及び酵素標識抗体又は抗
原を担体から解離し、抗体又は抗原を固定化した不溶性
担体を再生し、繰り返し使用する請求項１記載の免疫測
定方法。
【請求項３】各種溶液を導入及び排出する流路と、容
器内の液体を攪拌する手段と、出入自在の電極とを設け
た測定容器を備え、検体溶液中の被検体と免疫反応によ
り結合する第１の抗体又は抗原を固定化した不溶性担体
と、酵素標識した第２の抗体又は抗原とで、担体に捕捉
標識し、次いでこの不溶性担体の酵素活性を測定する免
疫測定装置であって、免疫反応が終了した後不溶性担体
を洗浄する工程、容器に電極を装着する工程、酵素反応
基質液を導入し攪拌下で基質量又は生成物量の変化を電
極により測定する工程、電極測定部を洗浄する工程を順
次自動的に制御遂行せしめることを特徴とする自動免疫
測定装置。