JPH0573394B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は7α−ヒドロキシアンドロスタ−４−
エン−３，17−ジオンの製造方法に関し、詳しく
は3α，7α−ジヒドロキシ−5β−コラン酸（以下、
CDCAと称す）及び／又はその塩に微生物を作用
させることによつて7α−ヒドロキシアンドロス
タ−４−エン−３，17−ジオン（以下、7α−ヒ
ドロキシ4ADと称す）を製造する方法に関する。 本発明の方法により製造される7α−ヒドロキ
シ4ADは、抗アルドステロン性利尿剤として知
られている17β−ヒドロキシ−7α−メルカプト−
３−オキソ−17α−プレグナ−４−エン−21−カ
ルボン酸＝γ−ラクトン＝7α−アセテート（以
下、スピロノラクトンと称す）の合成中間体であ
る17β−ヒドロキシ−17α−（３−ヒドロキシプロ
ピル）アンドロスタ−４，６−ジエン−３−オン
を製造するための原料化合物として有用である。 〔従来の技術〕 従来、CDCAに微生物を作用させて7α−ヒド
ロキシ4ADが得られた例がいつくか報告されて
いる。例えば、テネソン（M.E.Tenneson）ら
は、CDCAを含む無機塩培地でシユードモナス・
エスピーNCIB10590（Pseudomonas sp.
NCIB10590）菌株を好気的に培養して7α−ヒド
ロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３，17−
ジオン（以下、7α−ヒドロキシADDと称す）、
7α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３
−オン−20−カルボン酸、7α−ヒドロキシプレ
グナ−４−エン−３−オン−20−カルボン酸、ア
ンドロスタ−１，４，６−トリエン−３，17−ジ
オンなどを得たこと、またその生成物のうちの
7α−ヒドロキシADD及びアンドロスタ−１，４，
６−トリエン−３，17−ジオンは代謝中間体とし
て7α−ヒドロキシ4ADを経由して生成されたと
予想されることを報告している〔ジヤーナル・オ
ブ・ステロイド・バイオケミストリー（Journal
of Steroid Biochemistry）、第10巻、第311〜
316頁（1979年）参照〕。オーウエン（R.W.
Owen）らは、上記のシユードモナス・エスピー
NCIB10590菌株をCDCAを含む無機塩培地で嫌
気的に培養し、コラ−４，６−ジエン−３−オン
−24−酸とアンドロスタ−４，６−ジエン−３，
17−ジオンとを主生成物として得、他に7α−ヒ
ドロキシ4ADなどの種々の副生物を得たことを
報告している〔ジヤーナル・オブ・リピド・リサ
ーチ（Journal of Lipid Research）、第24巻、
第1109〜1118頁（1983年）参照〕。なお、テネソ
ンらの方法及びオーウエンらの方法で使用されて
いるシユードモナス・エスピーNCIB10590菌株
については、この菌株が動物糞便から採取された
シユードモナス（Pseudomonas）属に属する細
菌であること以外には全く報告されていない〔ジ
ヤーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサエテイー、
ケミカル・コミユニケーシヨンズ（Journal of
the Chemical Society、Chemical
Communications）、1974年、第115〜116頁参
照〕。 また特表昭57−500226号公報には、シユードモ
ナス・エスピーATCC31752（Pseudomonas sp.
ATCC31752）菌株を胆汁濃縮物を含む培地で好
気的に培養し、この培養液から7α−ヒドロキシ
4ADなどの数多くのステロイド生成物が得られ
たことが記載されている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 上記の従来法はいずれも7α−ヒドロキシ4AD
を工業的に有利に製造するに適した方法とは言い
難い。 しかして、本発明の目的は、CDCAに微生物を
作用させることによつて7α−ヒドロキシ4ADを
高選択率でかつ収率よく製造する工業的に有利な
方法を提供することにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明によれば、上記の目的は、CDCA及び／
又はその塩を基質として7α−ヒドロキシ4ADを
生産する能力を有するシユードモナス属プチダ種
又はシユードモナス属スツチエリ種に属する細菌
をCDCA及び／又はその塩を含む培地に培養して
7α−ヒドロキシ4ADを生成せしめ、これを採取
することを特徴とする7α−ヒドロキシ4ADの製
造方法を提供することによつて達成される。 本発明の方法において使用するCDCA及び／又
はその塩を基質として7α−ヒドロキシ4ADを生
産する能力を有するシユードモナス属プチダ種に
属する細菌としては、例えばシユードモナス・プ
チダD4014−A1615（Pseudomonas putida
D4014−A1615）菌株（微工研菌寄第6572号）が
あり、またCDCA及び／又はその塩を基質として
7α−ヒドロキシ4ADを生産する能力を有するシ
ユードモナス属スツチエリ種に属する細菌として
は、例えばシユードモナス・スツチエリＭ−1492
（Pseudomonas stutzeri Ｍ−1492）菌株（微工
研菌寄第8771号）がある。シユードモナス・プチ
ダD4014−A1615菌株は土壌中より採取したシユ
ードモナス・プチダD4014（Pseudomonas putida
D4014）菌株（微工研条寄第205号）に突然変異
処理を施して得られた変異株であり、これらの菌
株の菌学的性質は特開昭58−149698号公報又は特
開昭59−39298号公報に記載されているとおりで
ある。また、シユードモナス・スツチエリＭ−
1492菌株は土壌中より採取したシユードモナス・
スツチエリＣ−37−２（Pseudomonas stutzeri
Ｃ−37−２）菌株（微工研菌寄第8770号）に突然
変異処理を施して得られた変異株であり、これら
の菌株の菌学的性質を次表に示す。

【表】

【表】 上記の表に示した菌学的性質に基づき、シユー
ドモナス・スツチエリＣ−37−２菌株及びシユー
ドモナス・スツチエリＭ−1492菌株の同定を行な
つた。シユードモナス・スツチエリＣ−37−２菌
株は桿菌であること、極単鞭毛を有しているこ
と、グラム染色が陰性であることなどの顕微鏡的
所見、並びにオキシダーゼ反応及びカタラーゼ反
応がともに陽性であること、好気性であること、
Ｏ−Ｆテストの結果が酸化的（oxidative）であ
ることなどの生理学的性質からバージエイズ・マ
ニユアル・オブ・デイターミネイテイブ・バクテ
リオロジー（Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology）第８版に基づき、
シユードモナス属に属する細菌であると同定し
た。さらにシユードモナス・スツチエリＣ−37−
２菌株は可溶性色素を生産しない点、脱窒反応を
行なう点、ゼラチンを分解しない点、デンプンを
分解する点などからシユードモナス属のスツチエ
リ種に属する細菌であると同定した。また、一般
に突然変異株はその親株と同じ種に属するものと
考えられており、シユードモナス・スツチエリＭ
−1492菌株はシユードモナス属のスツチエリ種に
属する細菌であると判定した。 本発明の方法による7α−ヒドロキシ4ADの生
産は、CDCA及び／又はその塩を基質として7α
−ヒドロキシ4ADを生産する能力を有するシユ
ードモナス属プチダ種又はシユードモナス属スツ
チエリ種に属する細菌を、CDCA及び／又はその
塩を含む培地で培養することにより行なわれる。
CDCAの塩としては具体的にはCDCAのナトリウ
ム、カリウムなどのアルカリ金属の塩又はカルシ
ウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属の塩
が挙げられる。CDCA及び／又はその塩の培地中
の濃度は通常約１〜100ｇ／の範囲でよいが、
7α−ヒドロキシ4ADを穏和な条件下で容易にか
つ高収量で得る観点からは約10〜50ｇ／の範囲
が好ましい。培養方法は原則的には一般微生物の
好気培養で採用される方法と同じであるが、通常
は液体培地による振とう培養法又は通気撹拌培養
法が用いられる。培地としては上記のCDCA及
び／又はその塩を基質として7α−ヒドロキシ
4ADを生産する能力を有するシユードモナス属
プチダ種又はシユードモナス属スツチエリ種に属
する細菌が資化利用できる栄養源を含有するもの
であればよい。炭素源としてはCDCA及び／又は
その塩を単一炭素源としてもよく、或いはCDCA
及び／又はその塩にアラビノースなどのペントー
ス類；グルコース、マンノース、フラクトース、
ガラクトースなどのヘキソース類；シユークロー
ス、マルトースなどの二糖類；デンプン分解物；
糖アルコール類、グリセリンなどの多価アルコー
ル類；又はポリペプトン、ペプトン、肉エキス、
麦芽エキス、コーンステイープリカー、酵母エキ
ス、各種アミノ酸、有機酸などを併用してもよ
い。また窒素源としては、例えば硝酸アンモニウ
ム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの、無機
窒素源、又はボリペプトン、ペプトン、肉エキス
などの有機窒素源が用いられる。また、この他に
燐酸水素２カリウム、燐酸２水素カリウム、硫酸
マグネシウムなどの無機塩類が添加される。培養
条件に特徴はないが、通常25〜35℃で10時間〜７
日間振とう培養又は通気撹拌培養を行なう。 このようにして培養液中に蓄積された7α−ヒ
ドロキシ4ADは通常その大部分が沈殿物として
得られる。蓄積された7α−ヒドロキシ4ADを分
離、採取するには、7α−ヒドロキシ4ADを溶解
しかつ水と相分離する有機溶媒、例えば酢酸エチ
ル、クロロホルム、クロロホルムとメタノールの
混合液などを用いて抽出する方法が採られる。有
機溶媒による抽出は、沈殿物及び菌体を含んだ状
態の培養物について行なつてもよいし、培養物か
ら濾過又は遠心分離により分離された不溶成分に
ついて行なつてもよい。前者の抽出方法を採る場
合には、培養液をこれに水酸化ナトリウムの水溶
液などのアルカリ水溶液を加えてアルカリ性にし
たのち上記の有機溶媒による抽出操作を行なうの
が好ましい。後者の抽出方法を採る場合には、必
要に応じて濾過又は遠心分離などによつて分離除
去される培養濾液又は上澄みに、好ましくは水酸
化ナトリウムの水溶液などのアルカリ水溶液を加
えて該培養濾液又は上澄みをアルカリ性にしたの
ち、上記の有機溶媒による抽出操作を施すことに
より、培養液中に溶解している7α−ヒドロキシ
4ADを回収することができる。このようにして
得られた抽出液を集め、これより溶媒を留去する
ことにより目的とする7α−ヒドロキシ4ADをほ
ぼ全量回収することができる。回収された7α−
ヒドロキシ4ADの精製は例えばメタノール、メ
タノール水溶液などから再結晶することにより行
なわれる。 本発明の方法によつて製造される7α−ヒドロ
キシ4ADは、例えば次の方法により17β−ヒドロ
キシ−17α−（３−ヒドロキシプロピル）アンド
ロスタ−４，６−ジエン−３−オンを経由してス
ピロノラクトンに誘導される。

【化】

【化】

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を説明するが、本発
明はこれらの実施例により限定されるものではな
い。 参考例 １ シユードモナス・スツチエリＭ−1492菌株の取
得 培地１（組成：ペプトン0.5％、肉エキス0.5％、
食塩0.5％及び寒天1.5％；PH：7.8）のスラントに
生育させたシユードモナス・スツチエリＣ−37−
２菌株の一白金耳を、予め試験管（内径：21mm；
長さ：200mm）内に準備した培地２（組成：
CDCA3％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素
カリウム0.1％、燐酸水素２カリウム0.6％、硫酸
マグネシウム・７水和物0.02％、酵母エキス0.02
％、グルコース0.05％、ペプトン0.05％及び水酸
化ナトリウム0.3％；PH：7.5）の10mlに植菌し、
30℃で24時間振とう培養した。この培養液の0.4
mlを予め試験管（内径：21mm；長さ：200mm）内
に準備した培地３（組成：CDCA0.5％、硝酸アン
モニウム0.2％、燐酸２水素カリウム0.1％、燐酸
水素２カリウム0.6％、硫酸マグネシウム・７水
和物0.02％、酵母エキス0.02％及びグルコース0.1
％；PH：8.5）の10mlに加え、30℃で６時間振と
う培養した。次いで、この対数増殖期にある菌体
を孔径0.45μのメンプレンフイルターで無菌的に
濾過集菌し、0.1M燐酸塩緩衝液（PH：7.0）20ml
で洗滌後、同じ緩衝液25mlに懸濁させた。この菌
懸濁液４mlを試験管（内径：21mm：長さ：200mm
に入れ、これに終濃度が50μｇ／mlになるように
Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンを添加し、10分後にその0.1mlを培地４〔組
成：7α−ヒドロキシ4AD0.1％、硝酸アンモニウ
ム0.2％、燐酸２水素カリウム0.1％、燐酸水素２
カリウム0.6％、硫酸マグネシウム・７水和物
0.02％、酵母エキス0.05％及びポリオキシエチレ
ン（20）ソルビタンモノオレエート（ツイーン
80）0.05％；PH：7.5〕に加え、さらにペニシリ
ンＧを濃度が100U／mlになるように加えたのち、
30℃で18時間振とう培養した。得られた培養液
を、培地１のプレート上に約100〜500個のコロニ
ーが出現するように、稀釈して該プレートに塗布
したのち、30℃で一夜培養を行なつた。出現した
コロニーを培地１のスラントに単離したのち、各
分離株を培地２の10ml中で２日間振とう培養し
た。得られたそれぞれの培養液中の生産物を薄層
クロマトグラフイーで検定し、目的とする7α−
ヒドロキシ4ADを選択的に蓄積している１菌株
を見出し、これをシユードモナス・スツチエリＭ
−1492菌株と命名した。 実施例 １ シユードモナス・プチダD4014−A1615菌株を
次に示す方法で培養した。CDCA10ｇ、硝酸アン
モニウム2.0ｇ、燐酸２水素カリウム1.0ｇ、燐酸
水素２カリウム6.0ｇ、硫酸マグネシウム・７水
和物0.2ｇ、酵母エキス0.2ｇ、グルコース0.5ｇ、
ペプトン0.5ｇ及び水酸化ナトリウム1.0ｇの混合
物に水道水を加えて容量を１に調整し（PH：
8.5）これを培地とした。この培地を２容発酵
槽に入れ、120℃で15分間蒸気滅菌を行なつた。
予め上記の培地と同じ培地で試験管振とう機にて
20時間増殖させた種菌50mlを上記の培地に添加
し、撹拌速度300rpm、通気量0.5vvm及び30℃の
条件下で48時間通気撹拌培養を行なつた。培養
後、培養液を充分に混和し、その一部を薄層クロ
マトグラフイーにより分析した結果、CDCAは残
存していないことが確認された。培養液に１規定
の水酸化ナトリウム水溶液を加えることによつて
PHを10に調整したのち、培養液をクロロホルム／
エタノール混合溶媒（容量比；４／１）の５で
抽出した。抽出液から菌体変性物などの不溶物を
濾別し、濾液から溶媒を減圧下に留去することに
より7.0ｇの乾固物を得た。この乾固物を高速液
体クロマトグラフイーによつて分析した結果、乾
固物は純度86％の7α−ヒドロキシ4ADであるこ
とが判明した。この7α−ヒドロキシ4ADを80容
量％のメタノール水溶液を使用して再結晶するこ
とにより、4.0ｇの精製物を得た。 7α−ヒドロキシ4ADの精製物の分析結果を以
下に示す。 融点：245〜247℃ マススペクトルｍ／ｅ：302〔Ｍ〕⁺ 284〔Ｍ−H₂O〕⁺ またｍ／ｅ＝124より３−ケト−４−エンの存
在が確認された。 NMR（CDCl₃、90MHz）δ： 0.92（ｓ、3H、18−CH₃）、1.22（ｓ、3H、19
−CH₃）、4.09（ｍ、1H、7β−Ｈ）、5.79（ｓ、
1H、４−Ｈ）ppm 実施例 ２ 実施例１におけると同様の方法により培養を行
ない、培養液を得た。培養液の一部を薄層クロマ
トグラフイーにより分析した結果、この培養液中
にはCDCAが残存していないことが確認された。
培養液を遠心分離し、取得された沈殿物及び菌体
をクロロホルム／エタノール混合溶媒（容量比：
４／１）1000mlと混合し、この混合物を濾過し
た。この濾液を減圧下に濃縮することにより5.0
ｇの乾固物を得た。この乾固物を高速液体クロマ
トグラフイーによつて分析した結果、乾固物は純
度92％の7α−ヒドロキシ4ADであることが判明
した。 実施例 ３ 実施例１においてシユードモナス・プチダ
D4014−A1615菌株に代えてシユードモナス・ス
ツチエリＭ−1492菌株を用い、かつ培地中の
CDCAの使用量を10ｇから30ｇに変更し、また培
地中の水酸化ナトリウムの使用量を1.0ｇから3.0
ｇに変更した以外は同様の操作を行なうことによ
り、乾固物を21.9ｇ得た。なお、得られた培養液
の一部を薄層クロマトグラフイーにより分析した
結果、培養液中にはCDCAが残存していないこと
が確認された。乾固物を高速液体クロマトグラフ
イーによつて分析した結果、該乾固物は純度85％
の7α−ヒドロキシ4ADであることが判明した。
この7α−ヒドロキシ4ADをメタノールを使用し
て再結晶することにより、10.5ｇの精製物を得
た。 参考例 ２

【化】

【化】

〔発明の効果〕

本発明によれば、上記の実施例から明らかなと
おり、7α−ヒドロキシ4ADを高選択率でかつ収
率よく製造することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 3α，7α−ジヒドロキシ−5β−コラン酸及
   び／又はその塩を基質として7α−ヒドロキシア
   ンドロスタ−４−エン−３，17−ジオンを生産す
   る能力を有するシユードモナス（Pseudomonas）
   属プチダ（putida）種又はシユードモナス
   （Pseudomonas）属スツチエリ（stutzeri）種に
   属する細菌を、3α，7α−ジヒドロキシ−5β−コ
   ラン酸及び／又はその塩を含む培地に培養して
   7α−ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−３，
   17−ジオンを生成せしめ、これを採取することを
   特徴とする7α−ヒドロキシアンドロスタ−４−
   エン−３，17−ジオンの製造方法。