JPH057438A - シクラメンのカルス誘導方法およびシクラメンの増殖方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 シクラメンのカルス誘導とシクラメンの植物
体の再生方法を提供する。 【構成】 シクラメンの外植片をピクロラム含有培地で
培養するシクラメンのカルス培養方法、または、オーキ
シンとしてのピクロラムとサイトカイニンを含むを培地
で培養するシクラメンのカルス培養方法。パーシカム系
固定種で大輪系普通品種のシクラメンの植物体を２，４
−ジクロロフェノキシ酢酸とカイネチンを含む培地で培
養してカルスを誘導し、ホルモンを含まない培地で不定
胚を誘導した後、二次胚を誘導しながら増殖させるシク
ラメンの増殖方法。また、前記と同様の手順で不定胚を
誘導し、該不定胚を液体培地で振とう培養することによ
り不定胚を分離するシクラメンの増殖する方法とその分
離不定胚を包埋材料とするシクラメンの人工種子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、シクラメンのカルス誘
導とシクラメンの植物体の再生方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】シクラメンの優良園芸品種の大量増殖に
関する研究は現在までのところ、ほとんど報告されてい
ないが、大谷らは品種「テーブル ミニ ライラック
ローズ」の播種後一年目の植物体の展開葉からカルスを
誘導して、そのカルスから不定胚を得る方法について報
告している（園芸学会雑誌、第５８巻別冊１ １９８９
年５７４頁）。これによれば、大谷らの不定胚誘導手順
は次の通りである。

【０００３】まず、展開葉を滅菌後、２，４−ジクロロ
フェノキシ酢酸（以下、２，４−Ｄと言う。）、カイネ
チン、ジェランガム、５％ショ糖を加え、ｐＨを５．０
にしたＬＳ培地で暗黒下に培養して二種類のカルスを得
る。一つはフライアブルなカルスで、他方は緻密で硬い
カルスである。フライアブルカルスをＬＳ培地にα−ナ
フタレン酢酸（以下、ＮＡＡと言う。）、カイネチン等
を添加して、カルス増殖と不定胚形成を同時に続けて、
４０〜５０日間隔で継代培養する。

【０００４】継代培養培地で形成された不定胚をＮＡ
Ａ、カイネチン、ジェランガム、５％ショ糖等を加えた
１／２濃度のＬＳ培地で照明下に培養すると塊茎様体を
経て幼植物体が得られる。この幼植物体を１／２濃度の
ＬＳホルモンフリー培地（１．５％ショ糖、０．２％ジ
ェランガム含有）で照明下に培養して植物体を得る。展
開葉が５〜１０枚になった植物体を鉢上げすると開花す
る。なお、不定胚から幼植物体誘導時に上記ホルモンの
他にインドール酢酸（ＩＡＡ）を添加する報告（Ｇ．Ｗ
ＩＣＡＲＴら、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ １１９巻 １
５９−１６７頁、１９８４年）もある。

【０００５】また、石坂らは組織培養学会第１１回組織
培養シンポジウム（１９８９年７月）において、胚珠培
養により得られたＣｙｃｌａｍｅｎ ｐｅｒｓｉｃｕｍ
とＣ．ｈｅｄｅｒｉｆｏｌｉｕｍ種間雑種約２００個の
個体の中の一個体だけの塊茎表面に形成されていた不定
胚を見いだし、この不定胚を植物生長ホルモンを含まな
い培地で培養すると二次不定胚が誘導されること、及び
ＮＡＡ、６−ベンジルアミノプリン（以下ＢＡとい
う。）を添加すると二次不定胚の誘導に効果があること
を報告している。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記、大谷らのシクラ
メンのカルスおよび不定胚誘導法によると、１ｍｇ／リ
ットルの２，４−Ｄ（オーキシン）と０．５ｍｇ／リッ
トルのカイネチン（サイトカイニン）からは１００％カ
ルスが誘導されるが、このカルスからは不定胚を形成す
るフライアブルカルスは全く得られていない。フライア
ブルカルスはホルモンとして１ｍｇ／リットルの２，４
−Ｄを単独で添加した培地と１ｍｇ／リットルの２，４
−Ｄと０．１ｍｇ／リットルのカイネチンを含む培地か
らそれぞれ１４．３％（緻密で硬いカルスを含めると３
５．７％）、４６．７％得られるのみである。

【０００７】このようにフライアブルカルスの形成率が
低いと、カルスからの不定胚大量培養に有利な液体培養
に適さない。また、大谷らの上記不定胚誘導法はミニ系
の品種（２ｎ＝４８）であり、大輪系品種についての不
定胚誘導法の報告はない。例えば、大輪系品種は複２倍
体（２ｎ＝９６）であるため、交雑によって得られる優
良個体は品質がばらつくため自殖により維持・増殖する
ことはできない。大谷らの方法を大輪系品種６種でテス
トしたが、実際に可能であったのは「ラージホワイト」
のみであった。

【０００８】また、石坂らの二次不定胚も特定の交配種
から、たまたま得られた不定胚を培養したものでしかな
い。

【０００９】そこで、本発明の目的はカルスの誘導率を
高め、しかも大輪系品種のシクラメンのカルスおよび不
定胚の誘導方法と当該不定胚からの植物体増殖方法を確
立することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は次の
各構成により達成される。

【００１１】すなわち、請求項１記載の発明はシクラメ
ンの植物体の一部をピクロラム含有培地で培養するシク
ラメンのカルス培養方法である。

【００１２】ピクロラムの添加量は０．０１〜１０ｐｐ
ｍで用いる。ピクロラムの添加量が０．０１ｐｐｍ未満
だとカルス生成量が少なくて、１０ｐｐｍを超えると組
織が枯死し、ピクロラムが有害物質として作用する。好
ましくは０．５〜２ｐｐｍで用いる。ここで、葉柄を用
いた例を示したが、葉柄以外の植物体の一部、例えば花
茎でもほぼ同様の誘導率でカルスが得られた。

【００１３】また、請求項２記載の発明はオーキシンと
してのピクロラムとサイトカイニンを含む培地で培養
し、不定胚を誘導しながら増殖させるシクラメンのカル
ス培養方法である。

【００１４】サイトカイニンとしてゼアチンを、オーキ
シンとしてピクロラムを用いるが、培地中のゼアチンの
濃度、ピクロラムの濃度はそれぞれ０．０１〜１０ｐｐ
ｍであり、０．０１ｐｐｍ未満だとカルス生成量が少な
く、１０ｐｐｍを超えると組織が枯死する。好ましくは
いずれも０．２〜２ｐｐｍの濃度で用いる。ここで、葉
柄を用いた例を示したが、葉柄以外の植物体の一部、例
えば花茎でもほぼ同様の誘導率でカルスが得られた。こ
のカルスの増殖速度は２，４−Ｄとカイネチンを用いて
同一培地で、同一条件下で培養した場合の増殖速度が３
〜４倍である。

【００１５】本方法で得られたカルスは柔らかいので液
体培養に適する。

【００１６】また、請求項３記載の発明は、パーシカム
系シクラメンの外植片を２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸とカイネチンを含む培地で培養してカルスを誘導し、
該カルスをホルモンを含まない培地で不定胚を誘導した
後、二次胚を誘導しながら増殖させるシクラメンの増殖
方法である。

【００１７】ここで、パーシカム（percicum）系の固定
種で大輪系普通品種としては「ラージホワイト」、「バ
ーバーク」、「ハーレカイン」等があるが、すべてにつ
いて１００％の誘導率でカルスが得られた。またその外
植片としては葉柄、花茎等が適しており、葉片由来のカ
ルスは誘導できるが、それから不定胚は形成できなかっ
た。

【００１８】また、オーキシンとして２，４−Ｄを０．
１〜１０ｐｐｍ、好ましく０．５〜５ｐｐｍの濃度で用
いる。０．１ｐｐｍ未満だとカルス生成量が少なく、１
０ｐｐｍを超えると組織が枯死する。また、サイトカイ
ニンとしてカイネチンを０．００５〜５ｐｐｍ、好まし
くは０．０１〜１ｐｐｍの濃度で用いる。０．００５ｐ
ｐｍ未満だとカルス生成量が少なく、５ｐｐｍを超える
と組織が枯死する。

【００１９】ホルモンを含まない培地としては一般的に
用いられる植物体培養用培地でよい。また、培養条件の
限定は特にないが暗黒下でしかも約２５℃付近で行うこ
とが好ましい。ホルモンを含まない培地でパーシカム系
大輪系品種のカルス誘導不定胚は二次胚を生成しながら
増殖する。

【００２０】また、請求項４記載の発明は、パーシカム
系シクラメンの外植片を２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸とカイネチンを含む培地で培養してカルスを誘導し、
該カルスをホルモンを含まない培地で培養して不定胚を
誘導し、該不定胚を液体培地で振とう培養することによ
り不定胚を分離するシクラメンの増殖方法である。

【００２１】ここでカルスはパーシカム系品種の葉柄も
しくは花茎から誘導したものが最も不定胚誘導率が高か
った。また、カルス誘導用、不定胚誘導用培地は一般的
に用いられる植物体培養用培地が用い得る。得られた不
定胚は約１００〜２００ｒｐｍで振とう培養することで
分離が可能となるが、一個ずつ分離された不定胚を自動
的に選別してゲルカプセルに包埋する装置を接続するこ
とで人工種子製造装置ができる。

【００２２】また、請求項５記載の発明は請求項４記載
のシクラメン増殖法で得られた分離不定胚を包埋材料と
するシクラメンの人工種子である。

【００２３】カプセル剤としては公知のものが用いられ
る。例えばアルギン酸カルシウムからなるゲルカプセル
である本発明の人工種子は大きさが一定しているため人
工種子播種装置を用いて能率的播種を行うこともでき
る。

【００２４】

【作用】請求項１記載の発明によりピクロラム単独で１
００％のカルスが誘導できる。また、請求項２記載の発
明により１００％の誘導率で柔らかい（フライアブル）
カルスが得られる。

【００２５】請求項３記載の発明によりパーシカム系で
固定種の大輪系普通品種の植物体の一部から誘導して１
００％の誘導率でカルスを得、このカルスから不定胚を
経て、二次胚を生成しながら、１ケ月あたり個体（不定
胚は個体とみなす。）増殖率１０倍で増殖させることが
できる。

【００２６】請求項４記載の発明によりパーシカム系の
固定種、大輪系普通品種の不定胚を液体培地でストレス
を与えながら培養すると不定胚は一個ずつ分離できる。

【００２７】請求項５記載の発明によりパーシカム系の
品種の不定胚を人工種子にすることが可能となった。

【実施例】本発明の実施例を説明する。

【００２８】実施例１ ＭＳ培地、ＳＨ培地およびＲ−２培地の各培地にオーキ
シンとしてピクロラム（４−アミノ−３，５，６−トリ
クロロピコリン酸）の添加濃度を以下のように変えて加
え、５〜１０ｍｍのシクラメンの葉柄の培養を行った。
培養条件は２５℃、暗黒下に一ケ月置くことである。表
１に直径５ｍｍ以上のカルスの誘導率を示し、図１
（ａ）、（ｂ）にカルスの写真を示す。

【００２９】 表１ 培地 ピクロラム濃度（ｐｐｍ） カルス誘導率（％） ＭＳ ０．２ ０ 〃 １．０ １００ 〃 ２．０ １００ ＳＨ ０．２ ０ 〃 １．０ １００ 〃 ２．０ １００ Ｒ−２ ０．２ ０ 〃 １．０ １００ 〃 ２．０ １００

【００３０】ここでシクラメンの品種はパーシカム系の
「ピュアホワイト」、「ラージホワイト」、「加茂」、
「大文字」を用いたが、これら四品種との間にはカルス
誘導率の有意差はなかった。

【００３１】実施例２ 「加茂」の外植片をピクロラムとゼアチンをそれぞれ２
ｐｐｍ含有するＳＨ培地で２５℃、暗黒下に１ケ月間培
養して誘導率１００％でフライアブルなカルスを得た
（図２（ａ））。このようなカルスを同一培地で同一条
件下で５回継代増殖させた（図２（ｂ））。

【００３２】このカルスの増殖速度は容積で１０〜２０
倍／月である。２，４−Ｄを１ｐｐｍとカイネチンを
０．５ｐｐｍを用いて同一培地で、同一条件下で培養し
た場合の増殖速度が約５であるので、本実施例のカルス
の増殖速度は２〜４倍となる。

【００３３】図２（ｂ）で示す継代増殖したカルスから
２５℃、暗黒下で誘導した不定胚を図３（ａ）に示す。
また、図３（ｂ）に図２（ｂ）の固体培地と同一組成の
液体培地でカルスを培養して得た液体培養細胞を示す。
この図３（ｂ）に示すように、本実施例により大量培養
に適した液体培養細胞でも、不定胚を誘導しながら増殖
が可能となった。

【００３４】実施例３ パーシカム系の品種「ラージホワイト」の葉柄を２，４
−Ｄ１ｐｐｍ、カイネチン０．５ｐｐｍを含むＬＳ培地
で２５℃、暗黒下３０日間培養して１００％の誘導率で
カルスを誘導した（図４（ａ）)。 このカルスを同一培
養条件下で３０日間培養して胚様体カルスが得られた
（図４（ｂ））。この胚様体カルスをホルモンを添加し
ていないＭＳ培地で２５℃、暗黒下３０日間培養すると
植物体の再分化が行われた（図５）。

【００３５】実施例４ パーシカム系品種「ラージホワイト」の葉柄の切片を
２，４−Ｄ１ｍｇ／リットル、カイネチン１ｍｇ／リッ
トルおよびショ糖５０ｇ／リットルを含むＬＳ培地で２
５℃、暗黒下、３０日間培養しカルスを誘導する。カル
ス誘導率は１００％であった。

【００３６】誘導したカルスをホルモンを含まず、か
つ、ショ糖３０ｇ／リットルおよびゲルライト２ｇ／リ
ットルを含むＭＳ培地で培養し、不定胚を誘導する。そ
して、誘導した不定胚をショ糖３０ｇ／リットルを含む
ＭＳ培地で培養する。このとき、培養容器は三角フラス
コまたはバッフル付きの三角フラスコを用いて１８０ｒ
ｐｍで振とうし、ストレスを与えながら培養することに
よって不定胚を一個ずつ分離することができる。図６に
振とう培養３日後の状態を示す。

【００３７】実施例５ 実施例４と同一手順でカルスおよび不定胚の誘導と、不
定胚の振とう培養を行い、一個ずつの不定胚を分離す
る。この分離した不定胚をアルギン酸ナトリウム３０ｇ
／リットル溶液に入れ、撹拌する。そして、不定胚一個
を含むアルギン酸ナトリウム溶液を塩化カルシウム５０
ｍＭ溶液に滴下し、シクラメンの人工種子を作製する。
アルギン酸ナトリウムと塩化カルシウムとの反応で分離
不定胚を包埋したアルギン酸カルシウムゲルカプセルが
できる。得られた人工種子を図７の写真に示す。

【００３８】

【発明の効果】請求項１記載の発明によりオーキシンと
してピクロラム単独で１００％のカルスの誘導率が得ら
れる。

【００３９】請求項２記載の発明によりカルス増殖速度
が大きく、液体培養での不定胚の大量増殖が可能な柔ら
かいカルスが得られる。

【００４０】請求項３記載の発明によりパーシカム系の
品種の不定胚利用により優良個体の大量増殖が可能とな
った。また、発明によりホルモンを含有していない培地
で継代増殖させるので、変異の危険が少ない。

【００４１】請求項４記載の発明により不定胚の分離と
いった手作業が不要となるため、苗生産コストが大幅に
削減される。また、手作業によるコンタミネーションの
危険がなくなる。

【００４２】請求項５記載の発明により従来不可能だっ
たパーシカム系の品種の不定胚を人工種子にして大量増
殖することが可能となった。また、不定胚を無菌条件下
で発芽させる必要がなくなり、試験管外でも発芽させる
ことができるため、育種において、種子で後代を維持す
る必要がなくなり効率化し、苗生産コストが大幅に削減
される。そして、小さなスペースでも人工種子の状態で
パーシカム系の品種を大量に保存し、需要に応じて供給
することができ、輸送性が向上する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１で得られたカルスの生物の形
態を示す写真である。

【図２】本発明の実施例２で得られたカルスの生物の形
態を示す写真である。

【図３】本発明の実施例２で得られた不定胚の生物の形
態を示す写真である。

【図４】本発明の実施例３で得られたカルスと不定胚の
生物の形態を示す写真である。

【図５】本発明の実施例３で得られたカルスのからの不
定胚の生物の形態を示す写真である。

【図６】本発明の実施例４で得られたカルスの分離不定
胚の生物の形態を示す写真である。

【図７】本発明の実施例５で得られた不定胚からの人工
種子の生物の形態を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 長尾 照義 茨城県稲敷郡阿見町大字阿見4818 井関農 機株式会社筑波研究所内 (72)発明者 井戸 洋一 茨城県稲敷郡阿見町大字阿見4818 井関農 機株式会社筑波研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シクラメンの植物体の一部をピクロラム
   含有培地で培養することを特徴とするシクラメンのカル
   ス培養方法。
2. 【請求項２】 オーキシンとしてのピクロラムとサイト
   カイニンを含む培地で培養し、不定胚を誘導しながら増
   殖させることを特徴とするシクラメンのカルス培養方
   法。
3. 【請求項３】 パーシカム系の固定種で大輪系普通品種
   のシクラメンの植物体の一部を２，４−ジクロロフェノ
   キシ酢酸とカイネチンを含む培地で培養してカルスを誘
   導し、ホルモンを含まない培地で不定胚を誘導した後、
   二次胚を誘導しながら増殖させることを特徴とするシク
   ラメンの増殖方法。
4. 【請求項４】 パーシカム系の固定種で大輪系普通品種
   のシクラメンの植物体の一部を２，４−ジクロロフェノ
   キシ酢酸とカイネチンを含む培地で培養してカルスを誘
   導し、該カルスをホルモンを含まない培地で培養して不
   定胚を誘導し、該不定胚を液体培地で振とう培養するこ
   とにより不定胚を分離することを特徴とするシクラメン
   の増殖方法。
5. 【請求項５】 請求項４記載のシクラメン増殖法で得ら
   れた分離不定胚を包埋材料とすることを特徴とするシク
   ラメンの人工種子。