JPH0574574B2

JPH0574574B2 -

Info

Publication number: JPH0574574B2
Application number: JP59162073A
Authority: JP
Inventors: Toshiichi Nakamura; Akira Ichihara; Katsuyuki Nakajima; Hideo Teramoto
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1984-07-31
Filing date: 1984-07-31
Publication date: 1993-10-18
Also published as: JPS6137733A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は、肝疾患用医薬製剤に関する。即ち肝
障害、より詳細には肝細胞（実質細胞）の変性及
び壊死に起因する各種の肝疾患の予防及び治療に
奏功する医薬製剤に関する。背景技術肝臓は、生体中で最も高度に分化の進んだ最大
の腺性器官である。これは主に各種栄養素（糖
質、蛋白質、脂質、ビタミン、ホルモン等）の処
理（代謝）、貯蔵、解毒、分解、排泄等の重要な
多種の機能を兼ね備えており、中でも生体内中間
代謝の中心的役割を果たすことが知られている。肝炎とは種々の原因によつて上記機能を担う肝
細胞が障害をきたした疾患であり、その慢性化、
それらの終末像としての肝硬変及び肝細胞癌等と
併せ、之等肝細胞障害に基づく疾患は、極めて深
刻なものとして捉えられている。しかして、上記
肝疾患の治療に際しては、障害された肝細胞・組
織の修復及び低下した肝機能の改善、即ち肝庇護
を計ることが最も重要視されているが、斯かる肝
庇護を行なつて上記肝疾患の有効、適切な予防及
び治療を計り得る医薬製剤は未だ開発されていな
い。僅かに糖液、ビタミン類等の投与や高カロリ
ー、高蛋白食による食事療法が行なわれているに
過ぎず、一般には肝血流量を増加させ、生体によ
る修復機能を促す効果を期待した横臥安静処置が
とられる程度にとどまつている。発明の目的本発明者らは、上記肝庇護を効果的且つ的確に
行ない、これに基づいて肝疾患の有効適切な予防
及び治療を行ない得る医薬製剤を提供することを
その目的として鋭意研究を重ねた結果、特定の二
種の化合物の併用が上記目的を達成する医薬製剤
として有用であることを見出し、ここに本発明を
完成するに至つた。発明の構成即ち、本発明は、Ｌ−プロリン（以下、「Pro」
と略記する）及び表皮成長因子（Epidermal
Growth Factor、以下「EGF」と略記する）を
有効成分として含有する肝疾患用医薬製剤に係わ
る。本発明の上記製剤は、Pro及びEGFの併用を必
須の要件とすることに基づいて、肝細胞を極めて
良好に増殖させ、障害された肝組織の再生乃至は
新生を促進し、本来の肝機能を根本的に正常に回
復させることができる。また本発明の医薬製剤は、肝細胞に対する上記
特有の作用の他に、肝の非実質細胞に対しては、
逆にその増殖を抑制する特徴をも有しており、慢
性肝炎、肝硬変、肝癌等における過度の結合繊維
増生、肝内繊維化の問題の点からも肝疾患用医薬
製剤として極めて好ましいものである。本発明医薬製剤において有効成分とするPro及
びEGFは、いずれも公知であり、容易に入手す
ることができる。即ちProとしては通常市販され
ているものを使用できる。またEGFは、上皮組
織に作用して、その成長を特異的に促進する因子
として知られており、常法に従い調整される〔例
えばJ.Biol.Chem.，247，7609−7611（1972），
Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，72，1317（1975）等
参照〕。該EGFとしてはまた一部市販されてお
り、本発明では該市販品をも利用することができ
る。本発明において用いられる上記EGFはその由
来等にも特に限定はないが、本発明医薬製剤をヒ
トに適用することを考慮すれば、該EGFは抗原
性等の面よりヒト由来のものであるのが好まし
い。ヒト由来のEGFは、また現在ウロガストロ
ン（urogastoron）としても知られている〔Ann.
Rev.Biochem.，48，193（1979）〕。これは例えば
ヒトの尿、母乳、唾液等より、常法に従いEGF
の物理化学的性質等を利用する各種の処理手段、
例えば抽出、分子ふるいクロマトグラフイ（ゲル
過）、イオン交換クロマトグラフイ、遠心分離、
電気泳動、透析法等の単独又は組合せにより容易
に調整される〔Nature，257，325（1975）〕本発明製剤における上記Pro及びEGFの配合割
合は、特に限定はないが、通常EGFに対してPro
を過剰量、例えばEGF1重量部に対してProを約
750〜120000重量部程度、好ましくは約1500〜
12000重量部程度とするのがよい。本発明医薬製剤は、上記Pro及びEGFを必須成
分として、通常之等と共に適当な医薬製剤担体を
配合して製剤組成物の形態に調製される。該製剤
担体としては使用形態に応じた製剤を調製するの
に通常慣用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿
剤、崩壊剤、表面活性剤等の賦形剤乃至は希釈剤
をいずれも使用できる。製剤組成物の形態は、之
が上記２種の有効成分を効果的に含有する状態で
あれば、特に限定はないが、通常液剤、懸濁剤、
乳剤等の注射剤形態とするのが好適である。また
之は使用前に適当な担体の添加によつて液状とな
し得る乾燥品とすることもできる。上記製剤組成
物には、また必要に応じて通常の各種の添加剤、
例えば溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、
着色剤等を添加配合でき、更に他の医薬品を添加
配合することもできる。殊に、本発明者らの研究
によれば、本発明医薬製剤有効成分の肝細胞に対
する作用は、その内因性コラーゲン合成に極めて
密接に関与することが確認されており、従つてコ
ラーゲン合成促進剤、例えばＬ−アスコルビン酸
（ビタミンＣ）、乳酸ナトリウム等の本発明製剤中
への配合が特に好ましい。該コラーゲン合成促進
剤の配合割合としては、特に限定はないが、通常
有効成分合計１重量部に対してＬ−アスコルビン
酸は約10〜40重量部程度、乳酸ナトリウムは約
100〜200重量部程度とするのが好ましい。本発明医薬製剤は、該製剤組成物の形態に応じ
た適当な投与経路で投与され、その投与方法も特
に限定はない。例えば注射剤の形態に調製された
本発明医薬製剤は、これを単独で又はリンゲル
液、ブドウ糖液等の一般的補液と併用して静脈内
投与され得る。また上記製剤は必要に応じて単独
で筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等を行なうこ
ともできる。本発明製剤中に配合される有効成分の量及び該
製剤の投与量は、該製剤の投与方法、投与形態、
使用目的、之を適用される患者の症状等に応じて
適宜選択され、一定ではないが、通常有効成分を
合計約１〜80重量％程度含有する製剤形態に調製
して、この製剤をこれに含有される有効成分総量
が一日成人一人当り約0.1〜10ｇ程度となる範囲
で投与するのが望ましい。該投与は、一日１回で
ある必要はなく一日３〜４回に分けることもでき
る。発明の効果本発明の肝疾患用医薬製剤は、障害された肝細
胞、組織の再生乃至新生を促進し、之等を生理的
に回復させ、その肝機能を根本的に正常回復化さ
せ得る。従つて本発明製剤は、各種肝疾患例えば
急性及び慢性肝炎、肝硬変等の予防及び治療剤と
して、また肝硬変及び肝癌等の手術後の予後改善
剤として非常に有用である。以下、本発明製剤及びその効果を明らかにする
実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明するが、
本発明は、之に限定されるものではない。実施例１ウイスター系雄ラツト（体重約200ｇ）を用い、
コラーゲナーゼ還流法〔J.Biochem.（Tokyo），
84，937〜946（1978）〕に従い、肝細胞（実質細
胞）を分離調製した。ラツトの尾の腱コラーゲンを３％酢酸水溶液に
溶解し、これを内径24mmの12ウエルプラスチツク
デイツシユ（リンブロ社）に注ぎ、５分間放置
後、リン酸塩緩衝液（PBS）で２回洗浄してコ
ラーゲンをコートしたデイツシユを調製した。上記で調製した肝細胞を５％牛血清、10^-8Ｍデ
キサメサゾン及び10^-9Ｍインスリンを含む下記
〜の各培地に懸濁させ、上記デイツシユに１ウ
エル当り１ml（細胞濃度2.0×10⁵細胞／ml）で撒
き込み、５％CO₂及び30％O₂の存在下、37℃にて
培養した。〈培地〉Ｌ−15培地：Ｌ−15（成分として、Proを含
まない；フローラポラトリー社） 30mg／のProを添加したＬ−15培地最小必須培地；MEM（成分としてProを含ま
ない；日水産業社） 30mg／のProを添加したMEM培地ダルベツコ改質MEM；DME（成分として
Proを含まない；日水産業社） 30mg／のProを添加したDME培地上記培養20時間後に、インスリン10^-7Ｍ及び
EGF20nｇ／mlを更に添加した同培地（EGF添加
群）又は非添加の同培地（対照群）に変換した。尚、この試験においてEGFとしては、マウス
顎下腺よりサベージ及びコーエンの方法〔J.Biol.
Chem.，247，7609〜7611，1972年〕により調製
したものを用いた。上記培地変換の14時間後に³H−チミジン（0.3
ｍ Ci／μmol；アマシヤム社）の1.25μCi／ウエ
ルを添加し、34時間培養した。尚、上記³H−チ
ミジンによるラベル時に、アフイデイコリン
（10μｇ／ml）を添加して、DNA合成を止めたも
のをコントロール群とした。上記34時間の培養によるラベル後、細胞を冷
PBSで２回洗浄し、冷10％トリクロル酢酸
（TCA）水溶液１mlに浸した。細胞を１ウエル当
り0.5mlの0.5N水酸化ナトリウム水溶液によつて
可溶化し、一部を取つて蛋白量をローリー法に従
つて測定した。残液を冷５％TCA水溶液で処理
し、不溶性画分を遠心沈澱により集め、５％
TCA水溶液で洗浄後、10％TCA水溶液0.5mlを加
え、90℃、15分間加熱し、上清画分の放射活性を
トルエン−エタノール系シンチレーターにより測
定した。肝細胞DNAに取り込まれた³H−チミジン量を
コントロールとのカウントの差として求め、これ
を肝細胞１mg蛋白量当りに換算してDNA合成活
性（dpm／mg蛋白）とし、細胞増殖の指標とし
た。結果を下記第１表に示す。

【表】上記第１表より、Pro及びEGFの併用は、強力
に肝細胞DNA合成を促進することが判る。尚、デイツシユにコートされたコラーゲン及び
10^-7Ｍのインスリンは、外因性に添加して試験に
より、いずれも上記DNA合成には、影響を与え
ないことを確認した。また、フイブロネクチンをコートしたデイツシ
ユを用い、牛血清の非存在下に同様の試験を行な
い、略々同様の結果を得た。実施例２ Pro及びEGFの肝細胞増殖作用をラベリングイ
ンデツクスにより評価した。即ち、上記実施例１
において、34時間の培養によるラベル後、細胞を
冷PBSで２回洗浄し、固定化（ジエンダー溶液、
５分）後、サクラNR−M2（小西六写真工業株式
会社製）でコートし、ラジオオートグムの調製
に、10日間感光させた。細胞をエオジン染色後、
50個の細胞を測定し、³H−チミジンでラベルされ
た核数（％ labelled unclei）を求め、これをラ
ベリングインデツクスとした。結果を下記第２表に示す。

【表】第２表より、Pro及びEGFの併用により、全肝
細胞数の約80％の細胞がDNA合成を開始するこ
とが判る。尚、該試験において、EGF添加時に200mg／
のアスコルビン酸を更に添加した結果、そのラベ
リングインデツクスは、85.5±6.1に上昇した。実施例３実施例１において、用いた培地のPro含有量
を３，７，15，30，60又は120mg／に変化させ
て、同様にして試験を行なつた。結果を第１図に示す。図において縦軸はDNA
合成活性を１時間当りに換算（dpm／mg蛋白／
hr）して表示する。横軸はPro添加量を示す。ま
た図中１はEGF添加群を、２は対照群を各々示
す。実施例４この例ではコラーゲン合成促進剤を更に添加併
用した場合の効果を調べた。即ち、上記実施例１
の培地を用いた試験において、EGFの添加と
同時に更に各種濃度のアスコルビン酸又は乳酸ナ
トリウムを添加し、同様の試験を繰返し、これら
コラーゲン合成促進剤の添加がDNA合成にいか
なる影響を与えるかを調べた。培地（Ｌ−15＋Pro）へのEGF単独添加群に
おけるDNA合成活性を対照（100％）として、上
記各種濃度のコラーゲン合成促進剤の併用による
DNA合成活性の百分率を求めた。結果を下記第３表に示す。

【表】第３表より、Pro及びEGFの併用による本発明
の効果は、コラーゲン合成促進剤の添加により、
更に促進されることが判る。実施例５ヒト肝臓のバイオプシー組織切片の血管の穴か
ら、注射針のかわりにカニユーレをつけた注射器
を用いて、前灌流液〔0.5mlＭ−EGTAを含む
Ca²⁺フリーのハンクス−10mM−Hepes緩衝液）
を注入し、脱血を充分に行なう。脱血の完了後、
コラーゲナーゼ−ジスパーゼ液〔0.05％−コラー
ゲナーゼ，1000単位／mlのジスパーゼ及び５ｍＭ
−CaCl₂を含むハンクス−10mM−Hepes緩衝液）
を同様に注入する。組織をシヤーレに移し、メス
で細分し、これをガーゼを２重にひいた細胞過
器で過し、液を細胞遠心管に移し、低速遠心
（50ｇ×１分）を行ない上清をすてる。沈澱した
細胞をMEMで懸濁し、同様に遠心し、沈澱した
細胞を回収する。この操作を３回繰り返し、線維
芽細胞を含むヒト肝細胞を得た。上記実施例１において、ラツト肝細胞のかわり
に上記ヒト肝細胞を使用し、Pro添加量を300
mg／とし、以下同様に試験した。肝細胞（実質
細胞）と線維芽細胞（非実質細胞）の増殖は、
EGF添加の34時間後に計測した細胞数及び上記
実施例２と同様にして測定したラベリングインデ
ツクスにより評価した。結果を下記第４表に示す。

【表】該表より、肝細胞と線維芽細胞は、Pro及び
EGFの併用により相反的変化を示すことが判る。即ち、肝細胞は、その数及びラベリングインデ
ツクスの増加を示すのに反し、線維芽細胞のそれ
らは、顕著に減少する。このことは、本発明製剤
が肝細胞を良好に増殖させると同時に、繊維化の
抑制に著しい効果を有することを示す。実施例６以下、本発明医薬製剤の各種形態の調製例を示
す。注射剤下記各成分を混合後、滅菌して注射剤を得る。Ｌ−プロリン 6000重量部 EGF（実施例１で調製したもの）１重量部生理食塩水 50000重量部注射剤下記成分を混合後、滅菌して注射剤を得る。Ｌ−プロリン 5000重量部 EGF（グリゴリー（Gregory，H.）の方法
〔Nature、257，325（1975）〕に従つて調製した
もの）１重量部注射用蒸留水 8000重量部急性毒性ヒトEGFの100μｇ／Kg投与（単回皮下投与：
マウス及びラツト各10匹（雄雌５匹づつ））にお
いて、死亡例がなく、LD₅₀はそれ以上である。また、Ｌ−プロリンは、各種輸液の組成成分と
して既に採用されており、低毒性であることが認
められている。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例３に示す試験における本発明医
薬製剤の肝細胞増殖作用（DNA合成活性）を示
すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

１Ｌ−プロリン及び表皮成長因子（EGF）を
有効成分として含有することを特徴とする肝疾患
用医薬製剤。