JPH0576352A - 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 プレフェン酸デヒドラターゼ中の少なくとも
１アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する、あるい
は欠失することにより得られたフィードバック阻害が解
除された酵素をコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡで
形質転換された微生物、および該微生物を培養すること
により培地中に生産されたＬ−フェニルアラニンを取得
する 【効果】 Ｌ−フェニルアラニンの発酵生産において、
効率のよい製造法を提供する。
１アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する、あるい
は欠失することにより得られたフィードバック阻害が解
除された酵素をコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡで
形質転換された微生物、および該微生物を培養すること
により培地中に生産されたＬ−フェニルアラニンを取得
する 【効果】 Ｌ−フェニルアラニンの発酵生産において、
効率のよい製造法を提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】プレフェン酸デヒドラターゼ（Ｐ
Ｄ）及びコリスミン酸ムターゼ（ＣＭ）は、Ｌ−フェニ
ルアラニン（Ｐｈｅ）の生合成系上にある。従って、本
発明は甘味料アスパルテームの原料等に利用され、需要
が急増している有用アミノ酸であるＬ−フェニルアラニ
ンの生産に関するものである。
Ｄ）及びコリスミン酸ムターゼ（ＣＭ）は、Ｌ−フェニ
ルアラニン（Ｐｈｅ）の生合成系上にある。従って、本
発明は甘味料アスパルテームの原料等に利用され、需要
が急増している有用アミノ酸であるＬ−フェニルアラニ
ンの生産に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】微生物を用いてＬ−フェニルアラニンを
製造する方法は多数知られている。たとえば、組換え体
エシェリヒア・コリを用いるものに、特開昭５６−１８
９０、特開昭５８−１０３３９８、特開昭６１−９２５
６５、特開平１−１０４１６０、国際公開ＷＯ８７／０
０２０２がある。またＬ−フェニルアラニンまたはＬ−
チロシンの製造法としては、コリネバクテリウム属の変
異株を用いるものに、特開昭６１−１２８８９７があ
り、組換え体コリネバクテリウムを用いるものに、特開
昭６０−３４１９７、特開昭６０−２４１９２、特開昭
６１−２６０８９２、特開昭６１−１２４３７５が知ら
れている。
製造する方法は多数知られている。たとえば、組換え体
エシェリヒア・コリを用いるものに、特開昭５６−１８
９０、特開昭５８−１０３３９８、特開昭６１−９２５
６５、特開平１−１０４１６０、国際公開ＷＯ８７／０
０２０２がある。またＬ−フェニルアラニンまたはＬ−
チロシンの製造法としては、コリネバクテリウム属の変
異株を用いるものに、特開昭６１−１２８８９７があ
り、組換え体コリネバクテリウムを用いるものに、特開
昭６０−３４１９７、特開昭６０−２４１９２、特開昭
６１−２６０８９２、特開昭６１−１２４３７５が知ら
れている。
【０００３】Ｌ−フェニルアラニンを含む芳香族アミノ
酸生合成経路においては、その中心的役割を果たすキー
エンザイムが最終産物により、フィードバック阻害を受
ける。上記従来技術では、このフィドバック阻害の解除
がなされたキーエンザイムを有する微生物を用いること
により、目的アミノ酸の生産を行うことを原理としてい
る。
酸生合成経路においては、その中心的役割を果たすキー
エンザイムが最終産物により、フィードバック阻害を受
ける。上記従来技術では、このフィドバック阻害の解除
がなされたキーエンザイムを有する微生物を用いること
により、目的アミノ酸の生産を行うことを原理としてい
る。
【０００４】従来技術において、フィドバック阻害解除
の対象となるキーエンザイムとしては、プレフェン酸デ
ヒドラターゼ（以下、「ＰＤ」と略する）などがある。
上記従来技術で用いられる微生物の中で、エシェリヒア
・コリにおいては、コリスミン酸ムターゼ（以下、「Ｃ
Ｍ」と略する）およびＰＤ活性を有する２機能酵素（Ｃ
Ｍ−ＰＤ）の存在が知られ、該酵素活性はＬ−フェニル
アラニンによりフィードバック阻害を受ける。尚、該酵
素はｐｈｅＡと呼ばれる遺伝子にコードされており、ハ
ドソンとデビッドソンにより、該遺伝子の塩基配列およ
び該酵素のアミノ酸配列が報告されている[Hudson, G.
S. and Davidson, B.E., J. Mol. Biol.,180, 1023 (19
84)]。Ｌ−フェニルアラニンを効率的に生産するために
は、このＣＭ−ＰＤのＬ−フェニルアラニンによるフィ
ードバック阻害を解除することが肝要であり、その方法
において、アミノ酸レベルで解析されたものはいくつか
知られている。例えば、ゲッシングとデビットソンは、
ＣＭ−ＰＤの２個(Ｎ末端より２２６番目と３３８番
目）のトリプトファン残基をジメチル［２ーヒドロキシ
−５−ニトロベンジルスルフォニウムブロマイド］で修
飾すると、フィードバック阻害に耐性の酵素ができるこ
とを報告している [ Gething, M.J.H. and Davidson,
B.E., Eur. J. Biochem., 78, 111 (1977)]。また、バ
ックマンらは、ＣＭ−ＰＤのＮ末端側より３３８番目の
トリプトファン残基以降を欠失させるか、あるいはこの
残基をアルギニン−グリシン残基に置換することにより
フィードバック阻害の解除された酵素ができることを見
いだしている（特開平１−２３５５９７）。さらに、エ
ドワーズらは、やはり３３８番目のトリプトファン残基
の位置にトリプトファン−アルギニン−セリン−プロリ
ンのアミノ酸配列を挿入することにより、同様にフィー
ドバック阻害を解除した（国際特許ＷＯ８７／００２０
２）。これらはすべて、３３８番目のトリプトファン残
基について注目したものであり、その他の残基について
の知見はなかった。
の対象となるキーエンザイムとしては、プレフェン酸デ
ヒドラターゼ（以下、「ＰＤ」と略する）などがある。
上記従来技術で用いられる微生物の中で、エシェリヒア
・コリにおいては、コリスミン酸ムターゼ（以下、「Ｃ
Ｍ」と略する）およびＰＤ活性を有する２機能酵素（Ｃ
Ｍ−ＰＤ）の存在が知られ、該酵素活性はＬ−フェニル
アラニンによりフィードバック阻害を受ける。尚、該酵
素はｐｈｅＡと呼ばれる遺伝子にコードされており、ハ
ドソンとデビッドソンにより、該遺伝子の塩基配列およ
び該酵素のアミノ酸配列が報告されている[Hudson, G.
S. and Davidson, B.E., J. Mol. Biol.,180, 1023 (19
84)]。Ｌ−フェニルアラニンを効率的に生産するために
は、このＣＭ−ＰＤのＬ−フェニルアラニンによるフィ
ードバック阻害を解除することが肝要であり、その方法
において、アミノ酸レベルで解析されたものはいくつか
知られている。例えば、ゲッシングとデビットソンは、
ＣＭ−ＰＤの２個(Ｎ末端より２２６番目と３３８番
目）のトリプトファン残基をジメチル［２ーヒドロキシ
−５−ニトロベンジルスルフォニウムブロマイド］で修
飾すると、フィードバック阻害に耐性の酵素ができるこ
とを報告している [ Gething, M.J.H. and Davidson,
B.E., Eur. J. Biochem., 78, 111 (1977)]。また、バ
ックマンらは、ＣＭ−ＰＤのＮ末端側より３３８番目の
トリプトファン残基以降を欠失させるか、あるいはこの
残基をアルギニン−グリシン残基に置換することにより
フィードバック阻害の解除された酵素ができることを見
いだしている（特開平１−２３５５９７）。さらに、エ
ドワーズらは、やはり３３８番目のトリプトファン残基
の位置にトリプトファン−アルギニン−セリン−プロリ
ンのアミノ酸配列を挿入することにより、同様にフィー
ドバック阻害を解除した（国際特許ＷＯ８７／００２０
２）。これらはすべて、３３８番目のトリプトファン残
基について注目したものであり、その他の残基について
の知見はなかった。
【０００５】一方、コリネ型細菌においては、ＰＤ単独
の活性を有する酵素（ＰＤ）があり、この反応もフェニ
ルアラニンによってフィードバック阻害を受けているこ
とが知られている。
の活性を有する酵素（ＰＤ）があり、この反応もフェニ
ルアラニンによってフィードバック阻害を受けているこ
とが知られている。
【０００６】該酵素をコードする遺伝子のうち、尾崎ら
[Ozaki, A.et al., Agric. biol.chem., 49, 2925 (198
6)]、及び伊藤ら[Ito, H. et al., Appl. Microbiol. B
iotechnol., 33, 190 (1989)]はフェニルアラニンによ
るフィードバック阻害が解除された遺伝子について報告
している。また、フォレッチーとシンスキーは、天然型
のＰＤ遺伝子の塩基配列を報告しており、エシェリヒア
・コリＫ−１２のｐｈｅＡ遺伝子との相同性を指摘して
いる[Follettie, M.T. and Sinsky, A.J., J. Bacterio
l., 167, 695 (1986)]。しかしながら、コリネ型細菌に
おいてフィードバック阻害が解除された酵素遺伝子の塩
基配列に関する知見はなかった。ましてや、塩基配列レ
ベルでの変換、それに伴うアミノ酸置換による阻害解除
の試みは実施されていなかった。
[Ozaki, A.et al., Agric. biol.chem., 49, 2925 (198
6)]、及び伊藤ら[Ito, H. et al., Appl. Microbiol. B
iotechnol., 33, 190 (1989)]はフェニルアラニンによ
るフィードバック阻害が解除された遺伝子について報告
している。また、フォレッチーとシンスキーは、天然型
のＰＤ遺伝子の塩基配列を報告しており、エシェリヒア
・コリＫ−１２のｐｈｅＡ遺伝子との相同性を指摘して
いる[Follettie, M.T. and Sinsky, A.J., J. Bacterio
l., 167, 695 (1986)]。しかしながら、コリネ型細菌に
おいてフィードバック阻害が解除された酵素遺伝子の塩
基配列に関する知見はなかった。ましてや、塩基配列レ
ベルでの変換、それに伴うアミノ酸置換による阻害解除
の試みは実施されていなかった。
【０００７】
【本発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｌ
−フェニルアラニンを、効率よく発酵生産する方法を提
供することである。
−フェニルアラニンを、効率よく発酵生産する方法を提
供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、効率よく
Ｌ−フェニルアラニンを発酵生産する方法を開発するこ
とを目的として研究を重ねた結果、本発明を完成するに
至った。
Ｌ−フェニルアラニンを発酵生産する方法を開発するこ
とを目的として研究を重ねた結果、本発明を完成するに
至った。
【０００９】本発明者らは、まず、Ｌ−フェニルアラニ
ンを良好に生産するブレビバクテリウム属に属する代表
的な菌株であるブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムの、Ｌ−フェニルアラニンによるフィードバック阻
害が解除されたＰＤに関する遺伝子の塩基配列を決定
し、天然型のものと比較解析することにより、両者の間
で１アミノ酸の置換が生じていることを見いだした。本
知見に基づき、エシェリヒア・コリＫ−１２におけるＣ
Ｍ−ＰＤの相同領域に同じアミノ酸置換、異なるアミノ
酸置換、あるいは以降のアミノ酸残基の欠失を実施した
ところ、フィードバック阻害の解除された酵素を保有す
る菌株を取得することができ、該菌株のＬ−フェニルア
ラニン生産性改良を確認することにより、本発明を完成
に至らしめたものである。
ンを良好に生産するブレビバクテリウム属に属する代表
的な菌株であるブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムの、Ｌ−フェニルアラニンによるフィードバック阻
害が解除されたＰＤに関する遺伝子の塩基配列を決定
し、天然型のものと比較解析することにより、両者の間
で１アミノ酸の置換が生じていることを見いだした。本
知見に基づき、エシェリヒア・コリＫ−１２におけるＣ
Ｍ−ＰＤの相同領域に同じアミノ酸置換、異なるアミノ
酸置換、あるいは以降のアミノ酸残基の欠失を実施した
ところ、フィードバック阻害の解除された酵素を保有す
る菌株を取得することができ、該菌株のＬ−フェニルア
ラニン生産性改良を確認することにより、本発明を完成
に至らしめたものである。
【００１０】すなわち本発明は、プレフェン酸デヒドラ
ターゼ中の少なくとも１アミノ酸残基を他のアミノ酸残
基に置換する、あるいは欠失することにより得られたフ
ィードバック阻害が解除された酵素をコードする遺伝子
を含む組換えＤＮＡで形質転換された微生物、および該
微生物を培養することにより培地中に生産されたＬ−フ
ェニルアラニンを取得することを特徴とするＬ−フェニ
ルアラニンの製造法である。以下、本発明を詳細に説明
する。
ターゼ中の少なくとも１アミノ酸残基を他のアミノ酸残
基に置換する、あるいは欠失することにより得られたフ
ィードバック阻害が解除された酵素をコードする遺伝子
を含む組換えＤＮＡで形質転換された微生物、および該
微生物を培養することにより培地中に生産されたＬ−フ
ェニルアラニンを取得することを特徴とするＬ−フェニ
ルアラニンの製造法である。以下、本発明を詳細に説明
する。
【００１１】まず、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムＡＪ１１９５７（ＦＥＲＭＰ−６６７３）から
クローニングしたＰＤ遺伝子を含むプラスミドｐＰＨ１
４（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１
２２５９（ＦＥＲＭ Ｐ−３５６５）に保有される）に
ついて塩基配列を決定したところ、フィードバック阻害
を解除する変異は、Ｎ末端より２３５番目のセリン残基
がプロリン残基にアミノ酸置換した、わずか１アミノ酸
置換であることを見いだした。次に、この２３５番目の
セリン残基近傍のアミノ酸配列は、エシェリヒア・コリ
Ｋ−１２のｐｈｅＡ遺伝子のＮ末端より３３０番目のセ
リン残基近傍と高い相同性を有していることを確認し、
エシェリヒア・コリＫ−１２の該３３０番目のセリン残
基をプロリン残基あるいはアスパラギン酸残基に置換し
たＰＤおよび該３３０番目のセリン残基以降が欠失した
ＰＤを造成したところ、該酵素がフィードバック阻害解
除されていることを見いだし、Ｌ−フェニルアラニン生
産に好適な酵素を取得することができた。
メンタムＡＪ１１９５７（ＦＥＲＭＰ−６６７３）から
クローニングしたＰＤ遺伝子を含むプラスミドｐＰＨ１
４（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１
２２５９（ＦＥＲＭ Ｐ−３５６５）に保有される）に
ついて塩基配列を決定したところ、フィードバック阻害
を解除する変異は、Ｎ末端より２３５番目のセリン残基
がプロリン残基にアミノ酸置換した、わずか１アミノ酸
置換であることを見いだした。次に、この２３５番目の
セリン残基近傍のアミノ酸配列は、エシェリヒア・コリ
Ｋ−１２のｐｈｅＡ遺伝子のＮ末端より３３０番目のセ
リン残基近傍と高い相同性を有していることを確認し、
エシェリヒア・コリＫ−１２の該３３０番目のセリン残
基をプロリン残基あるいはアスパラギン酸残基に置換し
たＰＤおよび該３３０番目のセリン残基以降が欠失した
ＰＤを造成したところ、該酵素がフィードバック阻害解
除されていることを見いだし、Ｌ−フェニルアラニン生
産に好適な酵素を取得することができた。
【００１２】本発明でいうＰＤ活性を有する酵素とは、
コリネ型細菌などの微生物由来で単独の該活性を有する
もの、さらにエシェリヒア・コリなどの微生物由来でＣ
Ｍ−ＰＤといった２機能の活性を有するものをいう。
コリネ型細菌などの微生物由来で単独の該活性を有する
もの、さらにエシェリヒア・コリなどの微生物由来でＣ
Ｍ−ＰＤといった２機能の活性を有するものをいう。
【００１３】ＰＤにおいて、他のアミノ酸に置換される
アミノ酸残基とは、Ｌ−フェニルアラニンによるフィー
ドバック阻害のメカニズムに関わるアミノ酸配列領域に
存在するアミノ酸残基をいう。例えば、ブレビバクテリ
ウム・ラクトフェルメンタムのＰＤにおいてはＮ末端側
より２３５番目、エシェリヒア・コリのＣＭ−ＰＤにお
いてはＮ末端側より３３０番目のセリン残基をいう。
アミノ酸残基とは、Ｌ−フェニルアラニンによるフィー
ドバック阻害のメカニズムに関わるアミノ酸配列領域に
存在するアミノ酸残基をいう。例えば、ブレビバクテリ
ウム・ラクトフェルメンタムのＰＤにおいてはＮ末端側
より２３５番目、エシェリヒア・コリのＣＭ−ＰＤにお
いてはＮ末端側より３３０番目のセリン残基をいう。
【００１４】ＰＤにおいて、他のアミノ酸残基への置換
とは、Ｌ−フェニルアラニンによるフィードバック阻害
が解除されるような他のアミノ酸への置換をいい、たと
えばプロリン残基、アスパラギン酸残基への置換をさ
す。
とは、Ｌ−フェニルアラニンによるフィードバック阻害
が解除されるような他のアミノ酸への置換をいい、たと
えばプロリン残基、アスパラギン酸残基への置換をさ
す。
【００１５】アミノ酸置換および欠失を実施する方法と
しては、リコンビナントＰＣＲ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎ
ｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ）法 [ R. Higuchi, 61, in PCR Technology ( Erl
ich H. A. Eds., Stockton press(1989))] 、部位特異
的変異法 [ Kramer W. and Frits H. J., Meth. in Enz
ymol., 154, 350 (1987); Kunkel T. A.et al., Meth.
in Enzymol., 154, 367 (1987)]、染色体もしくはプラ
スミド上の目的遺伝子を直接ヒドロキシルアミン処理す
る方法 [ Hashimoto T. and Sekiguchi M., J. Bacteri
ol., 159, 1039(1984)]または該ＤＮＡを保有する菌体
を紫外線照射法もしくはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソグ
アニジン、亜硝酸などの化学薬剤処理による常法、目的
遺伝子を化学合成する方法等をいう。
しては、リコンビナントＰＣＲ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎ
ｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ）法 [ R. Higuchi, 61, in PCR Technology ( Erl
ich H. A. Eds., Stockton press(1989))] 、部位特異
的変異法 [ Kramer W. and Frits H. J., Meth. in Enz
ymol., 154, 350 (1987); Kunkel T. A.et al., Meth.
in Enzymol., 154, 367 (1987)]、染色体もしくはプラ
スミド上の目的遺伝子を直接ヒドロキシルアミン処理す
る方法 [ Hashimoto T. and Sekiguchi M., J. Bacteri
ol., 159, 1039(1984)]または該ＤＮＡを保有する菌体
を紫外線照射法もしくはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソグ
アニジン、亜硝酸などの化学薬剤処理による常法、目的
遺伝子を化学合成する方法等をいう。
【００１６】こうして得られた該変異型遺伝子を、組換
えＤＮＡとして適当な微生物に導入し、発現させること
により、フィードバック阻害が実質的に解除されたＰＤ
を保有する微生物を取得した。
えＤＮＡとして適当な微生物に導入し、発現させること
により、フィードバック阻害が実質的に解除されたＰＤ
を保有する微生物を取得した。
【００１７】以上の方法で取得される組換えＤＮＡと
は、フィードバック阻害が解除されたＰＤをコードする
有用遺伝子をパッセンジャーとして、プラスミドやファ
ージＤＮＡのベクターに組み込んだものをいう。その
際、該有用遺伝子の発現を効率的に実施するために、ｌ
ａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働くプロモーターを
用いてもよい。尚、ここでいう組換えＤＮＡには、該有
用遺伝子をトランスポゾン［Berg, D.E. and Berg, C.
M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)］、Ｍｕファージ
［特開平２−１０９９８５］または相同性組換え［Expe
riments inMolecular Genetics, Cold Spring Habor La
b. (1972)］を用いた方法で染色体に組み込んだものも
含まれる。
は、フィードバック阻害が解除されたＰＤをコードする
有用遺伝子をパッセンジャーとして、プラスミドやファ
ージＤＮＡのベクターに組み込んだものをいう。その
際、該有用遺伝子の発現を効率的に実施するために、ｌ
ａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働くプロモーターを
用いてもよい。尚、ここでいう組換えＤＮＡには、該有
用遺伝子をトランスポゾン［Berg, D.E. and Berg, C.
M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)］、Ｍｕファージ
［特開平２−１０９９８５］または相同性組換え［Expe
riments inMolecular Genetics, Cold Spring Habor La
b. (1972)］を用いた方法で染色体に組み込んだものも
含まれる。
【００１８】組換えＤＮＡを有する微生物としては、該
ＰＤといった目的の酵素をコードする遺伝子が発現する
もので、かつＬ−フェニルアラニンアナログ耐性等の付
与によりＬ−フェニルアラニン生産性を獲得したもので
あれば、エシェリヒア属、ブレビバクテリウム属、コリ
ネバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、シュード
モナス属等に属する微生物の種、菌株を問わずどのよう
なものでもよい。具体的には以下に示すものがある。 エシェリヒア・コリＫ−１２ ＡＴＣＣ１０７９８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１３８２６ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０６０
ＰＤといった目的の酵素をコードする遺伝子が発現する
もので、かつＬ−フェニルアラニンアナログ耐性等の付
与によりＬ−フェニルアラニン生産性を獲得したもので
あれば、エシェリヒア属、ブレビバクテリウム属、コリ
ネバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、シュード
モナス属等に属する微生物の種、菌株を問わずどのよう
なものでもよい。具体的には以下に示すものがある。 エシェリヒア・コリＫ−１２ ＡＴＣＣ１０７９８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１３８２６ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０６０
【００１９】上記微生物を形質転換する方法として
は、エシェリヒア、セラチア等に属する微生物では、塩
化カルシウムを用いる方法 [ Mandel M. and Higa A.,
J. Mol.Biol., 53, 154 (1970)]や電気パルスを用いる
方法 [ Taketo A., Biochem. Biophys. Acta, 949, 318
(1988)]が可能である。またブレビバクテリウム、コリ
ネバクテリウム等に属する微生物では、プロトプラスト
を用いる方法[ Miwa K. etal., Gene, 39, 281 (1985)]
や電気パルスを用いる方法（特開平２−２０７７９１）
等がある。バチルス属の場合はコンピテント法、電気パ
ルス、プロトプラストを用いる方法等がある。
は、エシェリヒア、セラチア等に属する微生物では、塩
化カルシウムを用いる方法 [ Mandel M. and Higa A.,
J. Mol.Biol., 53, 154 (1970)]や電気パルスを用いる
方法 [ Taketo A., Biochem. Biophys. Acta, 949, 318
(1988)]が可能である。またブレビバクテリウム、コリ
ネバクテリウム等に属する微生物では、プロトプラスト
を用いる方法[ Miwa K. etal., Gene, 39, 281 (1985)]
や電気パルスを用いる方法（特開平２−２０７７９１）
等がある。バチルス属の場合はコンピテント法、電気パ
ルス、プロトプラストを用いる方法等がある。
【００２０】以上の方法で取得した、フィードバック阻
害が解除されたＰＤをコードする遺伝子を含む組換えＤ
ＮＡで形質転換された微生物を培養し、培養液に目的の
芳香族アミノ酸を生成蓄積せしめ、これを採取した。
害が解除されたＰＤをコードする遺伝子を含む組換えＤ
ＮＡで形質転換された微生物を培養し、培養液に目的の
芳香族アミノ酸を生成蓄積せしめ、これを採取した。
【００２１】使用するＬ−フェニルアラニン生産用の培
地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその
他の有機成分を含有する通常の培地である。
地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその
他の有機成分を含有する通常の培地である。
【００２２】炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解
物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアル
コール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸
類を用いることができる。
ス、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解
物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアル
コール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸
類を用いることができる。
【００２３】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。
【００２４】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、
Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵母エキス等を適量
含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じ
て、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マ
ンガンイオン等が少量添加される。
Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵母エキス等を適量
含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じ
て、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マ
ンガンイオン等が少量添加される。
【００２５】培養は好気的条件下で１６〜７２時間実施
するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐ
Ｈは５〜７に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは
有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガ
ス等を使用することができる。発酵液からの芳香族アミ
ノ酸の採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公
知の方法を組み合わせることにより実施できる。
するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐ
Ｈは５〜７に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは
有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガ
ス等を使用することができる。発酵液からの芳香族アミ
ノ酸の採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公
知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００２６】
【発明の効果】少なくとも１つのアミノ酸残基を置換す
る、あるいは欠失することによってフィードバック阻害
が解除されたＰＤをコードする変異型遺伝子を組換えＤ
ＮＡとして導入した形質転換株を培養すると、Ｌ−フェ
ニルアラニンの生産性について大幅な向上がみられた。
る、あるいは欠失することによってフィードバック阻害
が解除されたＰＤをコードする変異型遺伝子を組換えＤ
ＮＡとして導入した形質転換株を培養すると、Ｌ−フェ
ニルアラニンの生産性について大幅な向上がみられた。
【００２７】以下、実施例に基づき更に具体的に説明す
る。
る。
【００２８】
実施例１ フィードバック阻害が解除されたＰＤをコー
ドする新規遺伝子の取得 （１）ブレビバクテリウム変異型ＰＤの変異点の決定 まず、既知のコリネバクテリウムのＰＤ遺伝子[Follett
ie, M.T. and Sinsky,A.J., J. Bacteriol., 167, 695
(1986)]との相同性を指標として、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム野生株のＰＤ遺伝子を含むプラ
スミドｐＡＪ１６中のＮｃｏＩ断片の塩基配列をダイデ
オキシ法により決定した。尚、該プラスミドは、ブレリ
バクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２１２５
（ＦＥＲＭ−Ｐ７５４６）に保持される。得られた塩基
配列とコードするアミノ酸配列を配列番号１に示す。
尚、該アミノ酸配列はコリネバクテリウムのものと比べ
て、わずか１アミノ酸残基異なっていた。
ドする新規遺伝子の取得 （１）ブレビバクテリウム変異型ＰＤの変異点の決定 まず、既知のコリネバクテリウムのＰＤ遺伝子[Follett
ie, M.T. and Sinsky,A.J., J. Bacteriol., 167, 695
(1986)]との相同性を指標として、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム野生株のＰＤ遺伝子を含むプラ
スミドｐＡＪ１６中のＮｃｏＩ断片の塩基配列をダイデ
オキシ法により決定した。尚、該プラスミドは、ブレリ
バクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２１２５
（ＦＥＲＭ−Ｐ７５４６）に保持される。得られた塩基
配列とコードするアミノ酸配列を配列番号１に示す。
尚、該アミノ酸配列はコリネバクテリウムのものと比べ
て、わずか１アミノ酸残基異なっていた。
【００２９】次に、同じくプラスミドｐＰＨ１４上にあ
るブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのフェニ
ルアラニン生産株のＰＤをコードする遺伝子の塩基配列
を決定したところ、配列番号２に示すような配列が得ら
れた。尚、該プラスミドはブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムＡＪ１２２５９（ＦＥＲＭＢＰ−３５６
５）株に保有されるものを使用した。野生株とフィード
バック阻害解除がなされた株で比較したところ２３５番
目のセリン残基がプロリン残基に変異していた。
るブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのフェニ
ルアラニン生産株のＰＤをコードする遺伝子の塩基配列
を決定したところ、配列番号２に示すような配列が得ら
れた。尚、該プラスミドはブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムＡＪ１２２５９（ＦＥＲＭＢＰ−３５６
５）株に保有されるものを使用した。野生株とフィード
バック阻害解除がなされた株で比較したところ２３５番
目のセリン残基がプロリン残基に変異していた。
【００３０】（２）エシェリヒア・コリの変異型ＣＭ−
ＰＤをコードする新規遺伝子の構築 まず、エシェリヒア・コリＫ−１２のＲＲ１株から、通
常の方法に従って、染色体ＤＮＡを抽出した。一方、公
知の文献[Hudson, G.S. andDavidson, B.E.,J. Mol. Bi
ol., 180, 1023 (1984)]に記載されているｐｈｅＡ遺伝
子の塩基配列に基づいて、以下に示すような合成ＤＮＡ
プライマー４本（配列番号３−６）を通常の方法で化学
合成した。 配列番号３ TCAACAAGCT GGAACGGACG 配列番号４ CGCCGATTTA CCGCCTTGAG 配列番号５ CCGTCTGGAA CCACGCCCGA T 配列番号６ ATCGGGCGTG ATTCCAGACG G ５と６はそれぞれｐｈｅＡ遺伝子の上流および下流に相
同な配列を持つ。７と８はたがいに相補的であり、Ｔ
（チミン塩基）がＣ（シトシン塩基）に置換した１塩基
のみ異なる以外、３３０番目のセリン残基近傍の配列と
相同性を持つ。エシェリヒア・コリＫ−１２のＣＭ−Ｐ
Ｄとブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのＰＤ
とは高い相同性を有し、特にエシェリヒア・コリＫ−１
２のＣＭ−ＰＤのＮ末端より３３０番目のセリン残基
は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＰＤの
Ｎ末端より２３５番目のセリン残基に相当するものであ
る。該配列番号７、８は、３３０番目のセリン残基がプ
ロリン残基となるよう合成されている。
ＰＤをコードする新規遺伝子の構築 まず、エシェリヒア・コリＫ−１２のＲＲ１株から、通
常の方法に従って、染色体ＤＮＡを抽出した。一方、公
知の文献[Hudson, G.S. andDavidson, B.E.,J. Mol. Bi
ol., 180, 1023 (1984)]に記載されているｐｈｅＡ遺伝
子の塩基配列に基づいて、以下に示すような合成ＤＮＡ
プライマー４本（配列番号３−６）を通常の方法で化学
合成した。 配列番号３ TCAACAAGCT GGAACGGACG 配列番号４ CGCCGATTTA CCGCCTTGAG 配列番号５ CCGTCTGGAA CCACGCCCGA T 配列番号６ ATCGGGCGTG ATTCCAGACG G ５と６はそれぞれｐｈｅＡ遺伝子の上流および下流に相
同な配列を持つ。７と８はたがいに相補的であり、Ｔ
（チミン塩基）がＣ（シトシン塩基）に置換した１塩基
のみ異なる以外、３３０番目のセリン残基近傍の配列と
相同性を持つ。エシェリヒア・コリＫ−１２のＣＭ−Ｐ
Ｄとブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのＰＤ
とは高い相同性を有し、特にエシェリヒア・コリＫ−１
２のＣＭ−ＰＤのＮ末端より３３０番目のセリン残基
は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＰＤの
Ｎ末端より２３５番目のセリン残基に相当するものであ
る。該配列番号７、８は、３３０番目のセリン残基がプ
ロリン残基となるよう合成されている。
【００３１】次に、染色体ＤＮＡ１μｇと、配列番号５
および８のプライマーおのおの３００ｎｇ、または配列
番号６および７のプライマーおのおの３００ｎｇを用い
て、ＰＣＲ反応を行い、それぞれ１．３Ｋｂｐと０．５
ＫｂｐのＤＮＡ断片を得た。該ＰＣＲの方法は、エルリ
ッチらの方法[Erlich, H.A., ed., PCR Technology,Sto
ckton press (1989)]にしたがって、連続複製反応装置
（Thermalcycler, Perkin Elmer Cetus社製）を用いて
９４℃１分間、５０℃２分間、７２℃３分間の反応を１
サイクルとして２０サイクル行なった。これらのＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ回収キット
（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ，フナコシ社製）をもちいて回
収し、更にこれらの断片と配列番号５と６のプライマー
を用いてＰＣＲ反応を行い、１．８ＫｂｐのＤＮＡ断片
を得た。この断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切
断した後、１．７ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル
電気泳動により回収し、更にこの断片とプラスミドｐＨ
ＳＧ３９８（宝酒造社製）のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ切断
物をＴ４リガーゼを用いて連結した。これをエシェリヒ
ア・コリＫ−１２のＫＡ１９７株（ｐｈｅＡ）に形質転
換し、クロラムフェニコール耐性株の中で、フェニルア
ラニン要求性が消失している株からプラスミドを回収
し、ｐＰＨＡＢと命名した。塩基配列を決定することに
より該プラスミドが、３３０番目のセリン残基がプロリ
ン残基に置換した変異型ＣＭ−ＰＤ酵素遺伝子を保有す
ることを確認した。
および８のプライマーおのおの３００ｎｇ、または配列
番号６および７のプライマーおのおの３００ｎｇを用い
て、ＰＣＲ反応を行い、それぞれ１．３Ｋｂｐと０．５
ＫｂｐのＤＮＡ断片を得た。該ＰＣＲの方法は、エルリ
ッチらの方法[Erlich, H.A., ed., PCR Technology,Sto
ckton press (1989)]にしたがって、連続複製反応装置
（Thermalcycler, Perkin Elmer Cetus社製）を用いて
９４℃１分間、５０℃２分間、７２℃３分間の反応を１
サイクルとして２０サイクル行なった。これらのＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ回収キット
（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ，フナコシ社製）をもちいて回
収し、更にこれらの断片と配列番号５と６のプライマー
を用いてＰＣＲ反応を行い、１．８ＫｂｐのＤＮＡ断片
を得た。この断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切
断した後、１．７ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル
電気泳動により回収し、更にこの断片とプラスミドｐＨ
ＳＧ３９８（宝酒造社製）のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ切断
物をＴ４リガーゼを用いて連結した。これをエシェリヒ
ア・コリＫ−１２のＫＡ１９７株（ｐｈｅＡ）に形質転
換し、クロラムフェニコール耐性株の中で、フェニルア
ラニン要求性が消失している株からプラスミドを回収
し、ｐＰＨＡＢと命名した。塩基配列を決定することに
より該プラスミドが、３３０番目のセリン残基がプロリ
ン残基に置換した変異型ＣＭ−ＰＤ酵素遺伝子を保有す
ることを確認した。
【００３２】（３）エシェリヒア・コリＫ−１２のｔｙ
ｒＡ遺伝子欠損性Ｗ３１１０株の造成 まず、エシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１０株（国
立遺伝研究所より入手）をストレプトマイシンを含む平
板培地に塗布することにより、ストレプトマイシン耐性
株を取得した。次に、この株とエシェリヒア・コリＫ−
１２のＭＥ８４２４株（ＨｆｒＰＯ４５、ｔｈｉ、ｒｅ
ｌＡ１、ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０、ｕｎｇ−１、ｎａｄ
Ｂ）（国立遺伝研究所より入手）の培養液を混合し、３
７℃で１５分間放置して接合伝達を行わせた後、ストレ
プトマイシン、テトラサイクリン、Ｌ−チロシンを含む
平板培地に塗布し、生じたコロニー即ちエシェリヒア・
コリＫ−１２のＷ３１１０（ｔｙｒＡ）株を取得した。
この株に、（２）で得たプラスミドｐＰＨＡＢを形質転
換により導入した。尚、エシェリヒア・コリＫ−１２の
該形質転換株［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＢ］
は微工研に寄託されており、寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰ
−３５６６である。
ｒＡ遺伝子欠損性Ｗ３１１０株の造成 まず、エシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１０株（国
立遺伝研究所より入手）をストレプトマイシンを含む平
板培地に塗布することにより、ストレプトマイシン耐性
株を取得した。次に、この株とエシェリヒア・コリＫ−
１２のＭＥ８４２４株（ＨｆｒＰＯ４５、ｔｈｉ、ｒｅ
ｌＡ１、ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０、ｕｎｇ−１、ｎａｄ
Ｂ）（国立遺伝研究所より入手）の培養液を混合し、３
７℃で１５分間放置して接合伝達を行わせた後、ストレ
プトマイシン、テトラサイクリン、Ｌ−チロシンを含む
平板培地に塗布し、生じたコロニー即ちエシェリヒア・
コリＫ−１２のＷ３１１０（ｔｙｒＡ）株を取得した。
この株に、（２）で得たプラスミドｐＰＨＡＢを形質転
換により導入した。尚、エシェリヒア・コリＫ−１２の
該形質転換株［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＢ］
は微工研に寄託されており、寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰ
−３５６６である。
【００３３】（４）ＰＤ酵素活性の測定 エシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１０（ｔｙｒＡ）
／（ｐＰＨＡＢ）株の菌体を、Ｌ培地を用いて３７℃、
１５時間培養した培養液を遠心分離することにより集菌
した。次いで、該菌体を生理食塩水にて２回洗浄し、氷
冷下０．５ｍＭジチオスレイトールを含む２５０ｍＭの
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、３０秒
間、４回の超音波（２０ｋＨｚ）破砕することにより粗
酵素液を調製した。
／（ｐＰＨＡＢ）株の菌体を、Ｌ培地を用いて３７℃、
１５時間培養した培養液を遠心分離することにより集菌
した。次いで、該菌体を生理食塩水にて２回洗浄し、氷
冷下０．５ｍＭジチオスレイトールを含む２５０ｍＭの
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、３０秒
間、４回の超音波（２０ｋＨｚ）破砕することにより粗
酵素液を調製した。
【００３４】ＰＤ酵素活性測定は、常法[Cotton, R.G.
H. and Gibson, F., Meth. in Enzymol., 17, 564 (197
0)]に従った。すなわち、粗酵素液を用いて、１ｍＭプ
レフェン酸バリウムおよび０．５ｍＭチロシンを含む５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）存在下、３７℃
１０分反応させ、１Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応を
停止後、生成したフェニルピリビン酸を３２０ｎｍの吸
光波長にて測定した。蛋白定量法はプロテイン アッセ
イキット（Bio Rad社製）を用い、そのプロトコールに
従った。結果は第４図に示すように、野生型ＣＭ−ＰＤ
では０．５ｍＭＬ−フェニルアラニン存在下で強く酵素
反応が阻害されるのに対し、変異型ＣＭ−ＰＤは５ｍＭ
Ｌ−フェニルアラニンでもほとんど阻害を受けなかっ
た。
H. and Gibson, F., Meth. in Enzymol., 17, 564 (197
0)]に従った。すなわち、粗酵素液を用いて、１ｍＭプ
レフェン酸バリウムおよび０．５ｍＭチロシンを含む５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）存在下、３７℃
１０分反応させ、１Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応を
停止後、生成したフェニルピリビン酸を３２０ｎｍの吸
光波長にて測定した。蛋白定量法はプロテイン アッセ
イキット（Bio Rad社製）を用い、そのプロトコールに
従った。結果は第４図に示すように、野生型ＣＭ−ＰＤ
では０．５ｍＭＬ−フェニルアラニン存在下で強く酵素
反応が阻害されるのに対し、変異型ＣＭ−ＰＤは５ｍＭ
Ｌ−フェニルアラニンでもほとんど阻害を受けなかっ
た。
【００３５】さらにＬ−フェニルアラニンの非存在下で
の野生型酵素遺伝子を保有するプラスミドの場合は、
３．５×１０2Ｕ／ｍｇ蛋白で、変異型の場合は１．５
×１０4Ｕ／ｍｇ蛋白と、より高い酵素活性を示した。
このことにより、当該変異を導入することにより、Ｌ−
フェニルアラニンによるフィードバック阻害解除のみな
らず、酵素量または酵素活性が４０倍増大させることが
できた。
の野生型酵素遺伝子を保有するプラスミドの場合は、
３．５×１０2Ｕ／ｍｇ蛋白で、変異型の場合は１．５
×１０4Ｕ／ｍｇ蛋白と、より高い酵素活性を示した。
このことにより、当該変異を導入することにより、Ｌ−
フェニルアラニンによるフィードバック阻害解除のみな
らず、酵素量または酵素活性が４０倍増大させることが
できた。
【００３６】実施例２ Ｌ−フェニルアラニンの発酵生
産 （１）フィードバック阻害が解除されたＣＭ−ＰＤを保
有するエシェリヒア・コリＫ−１２の造成 実施例１で得られた、フィードバック阻害が解除された
ＣＭ−ＰＤ遺伝子を含有するｐＰＨＡＢを保持するエシ
ェリヒア・コリＫ−１２の該形質転換株［Ｗ３１１０
（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＢ］をＬ−フェニルアラニン生
産用培地（グルコース２０ｇ、リン酸水素２ナトリウム
２９．４ｇ、リン酸２水素カリウム６ｇ、塩化ナトリウ
ム１ｇ、塩化アンモニウム２ｇ、クエン酸ナトリウム１
０ｇ、グルタミン酸ナトリウム０．４ｇ、硫酸マグネシ
ウム７水和物３ｇ、塩化カルシウム０．２３ｇ、サイア
ミン塩酸塩２ｍｇを水１Ｌに含む）を用いて、３７℃で
２４時間培養した。その結果を表１に示す。尚、定量は
高速液体クロマトグラフィーで実施した。
産 （１）フィードバック阻害が解除されたＣＭ−ＰＤを保
有するエシェリヒア・コリＫ−１２の造成 実施例１で得られた、フィードバック阻害が解除された
ＣＭ−ＰＤ遺伝子を含有するｐＰＨＡＢを保持するエシ
ェリヒア・コリＫ−１２の該形質転換株［Ｗ３１１０
（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＢ］をＬ−フェニルアラニン生
産用培地（グルコース２０ｇ、リン酸水素２ナトリウム
２９．４ｇ、リン酸２水素カリウム６ｇ、塩化ナトリウ
ム１ｇ、塩化アンモニウム２ｇ、クエン酸ナトリウム１
０ｇ、グルタミン酸ナトリウム０．４ｇ、硫酸マグネシ
ウム７水和物３ｇ、塩化カルシウム０．２３ｇ、サイア
ミン塩酸塩２ｍｇを水１Ｌに含む）を用いて、３７℃で
２４時間培養した。その結果を表１に示す。尚、定量は
高速液体クロマトグラフィーで実施した。
【００３７】
【表１】
【００３８】実施例３ ３３０番目のセリン残基がアス
パラギン酸残基に置換したＣＭ−ＰＤおよび３３０番目
のセリン残基以降が欠失したＣＭ−ＰＤをコードする遺
伝子の構築 実施例１と同様に、配列番号７−１０の合成ＤＮＡを作
製し、これを用いて３３０番目のセリン残基がアスパラ
ギン酸残基に置換したＣＭ−ＰＤおよび３３０番目のセ
リン残基以降が欠失したＣＭ−ＰＤをコードする遺伝子
を構築した。これらの遺伝子を含有するプラスミドはそ
れぞれｐＰＨＡＤ，ｐＰＨＡＴｅｒｍと命名した。
パラギン酸残基に置換したＣＭ−ＰＤおよび３３０番目
のセリン残基以降が欠失したＣＭ−ＰＤをコードする遺
伝子の構築 実施例１と同様に、配列番号７−１０の合成ＤＮＡを作
製し、これを用いて３３０番目のセリン残基がアスパラ
ギン酸残基に置換したＣＭ−ＰＤおよび３３０番目のセ
リン残基以降が欠失したＣＭ−ＰＤをコードする遺伝子
を構築した。これらの遺伝子を含有するプラスミドはそ
れぞれｐＰＨＡＤ，ｐＰＨＡＴｅｒｍと命名した。
【００３９】更に、このプラスミドをＷ３１１０（ｔｙ
ｒＡ）株に通常の形質転換法を用いて導入した。なお、
Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＤ，Ｗ３１１０（ｔ
ｙｒＡ）／ｐＰＨＡＴｅｒｍはそれぞれ微工研に寄託さ
れており、寄託番号はそれぞれＦＥＲＭ ＢＰ−３６５
２とＦＥＲＭ ＢＰ−３６５３である。
ｒＡ）株に通常の形質転換法を用いて導入した。なお、
Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＤ，Ｗ３１１０（ｔ
ｙｒＡ）／ｐＰＨＡＴｅｒｍはそれぞれ微工研に寄託さ
れており、寄託番号はそれぞれＦＥＲＭ ＢＰ−３６５
２とＦＥＲＭ ＢＰ−３６５３である。
【００４０】これらの株を培養し、ＰＤ酵素活性を測定
したところ、どの変異株もｐＰＨＡＢを保有する株同
様、５ｍＭ Ｌ−フェニルアラニン存在下でも酵素反応
は阻害を受けなかった。更にこれらの株を用い、Ｌ−フ
ェニルアラニンの発酵生産を行ったところ、培地中に
０．５ｇ／ｌのＬ−フェニルアラニンを蓄積した。
したところ、どの変異株もｐＰＨＡＢを保有する株同
様、５ｍＭ Ｌ−フェニルアラニン存在下でも酵素反応
は阻害を受けなかった。更にこれらの株を用い、Ｌ−フ
ェニルアラニンの発酵生産を行ったところ、培地中に
０．５ｇ／ｌのＬ−フェニルアラニンを蓄積した。
【図１】図１は、野生型および変異型（プロリン残基へ
の置換を行ったもの）のコリスミン酸ムターゼープレフ
ェン酸デヒドラターゼの、Ｌ−フェニルアラニンによる
プレフェン酸デヒドラターゼ活性の阻害を表したもので
ある。
の置換を行ったもの）のコリスミン酸ムターゼープレフ
ェン酸デヒドラターゼの、Ｌ−フェニルアラニンによる
プレフェン酸デヒドラターゼ活性の阻害を表したもので
ある。
【配列表】配列番号：1 配列の長さ：948 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(B
revibacteriumlactofermentum) 株名：AJ12125(FERM P-7546) 配列 ATG AGC GAC GCA CCA ATT GTT GTG GCC TAT TTG GGG CCT GCC GGA ACC 48 Met Ser Asp Ala Pro Ile Val Val Ala Tyr Leu Gly Pro Ala Gly Thr 1 5 10 15 TTC ACC GAA GAA GCC CTC TAC AAA TTT GCC GAC GCC GGC GTA TTC GGC 96 Phe Thr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys Phe Ala Asp Ala Gly Val Phe Gly 20 25 30 GAC GGT GAG ATC GAG CAG CTA CCA GCC AAA TCG CCA CAA GAA GCT GTC 144 Asp Gly Glu Ile Glu Gln Leu Pro Ala Lys Ser Pro Gln Glu Ala Val 35 40 45 GAC GCG GTC CGC CAC GGC ACC GCC CAG TTC GCG GTG GTC GCC ATC GAA 192 Asp Ala Val Arg His Gly Thr Ala Gln Phe Ala Val Val Ala Ile Glu 50 55 60 AAC TTC GTC GAC GGC CCC GTC ACC CCC ACC TTC GAC GCC CTT GAC CAG 240 Asn Phe Val Asp Gly Pro Val Thr Pro Thr Phe Asp Ala Leu Asp Gln 65 70 75 80 GGC TCC AAC GTG CAA ATC ATC GCC GAA GAA GAA CTC GAT ATT GCC TTT 288 Gly Ser Asn Val Gln Ile Ile Ala Glu Glu Glu Leu Asp Ile Ala Phe 85 90 95 TCC ATC ATG GTC CGG CCA GGG ACT TCG CTT GCC GAC GTC AAA ACC CTC 336 Ser Ile Met Val Arg Pro Gly Thr Ser Leu Ala Asp Val Lys Thr Leu 100 105 110 GCC ACC CAC CCG GTT GGG TAC CAA CAA GTG AAA AAC TGG ATG GCA ACC 384 Ala Thr His Pro Val Gly Tyr Gln Gln Val Lys Asn Trp Met Ala Thr 115 120 125 ACC ATT CCG GAC GCC ATG TAT CTT TCA GCA AGC TCC AAC GGC GCC GGC 432 Thr Ile Pro Asp Ala Met Tyr Leu Ser Ala Ser Ser Asn Gly Ala Gly 130 135 140 GCA CAA ATG GTT GCC GAA GGA ACC GCC GAC GCA GCC GCA GCG CCC TCC 480 Ala Gln Met Val Ala Glu Gly Thr Ala Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser 145 150 155 160 CGC GCA GCC GAA CTC TTC GGA CTG GAA CGC CTT GTT GAT GAT GTC GCC 528 Arg Ala Ala Glu Leu Phe Gly Leu Glu Arg Leu Val Asp Asp Val Ala 165 170 175 GAC GTC CGC GGC GCC CGC ACC CGC TTC GTT GCA GTC CAA GCC CAA GCA 576 Asp Val Arg Gly Ala Arg Thr Arg Phe Val Ala Val Gln Ala Gln Ala 180 185 190 GCC GTT TCC GAA CCG ACC GGC CAC GAC CGC ACC TCC GTC ATT TTC TCC 624 Ala Val Ser Glu Pro Thr Gly His Asp Arg Thr Ser Val Ile Phe Ser 195 200 205 CTA CCG AAT GTG CCA GGC AGC CTC GTG CGC GCC CTC AAC GAA TTC GCC 672 Leu Pro Asn Val Pro Gly Ser Leu Val Arg Ala Leu Asn Glu Phe Ala 210 215 220 ATC CGT GGC GTC GAC CTC ACC CGC ATC GAA TCC CGC CCC ACC CGC AAA 720 Ile Arg Gly Val Asp Leu Thr Arg Ile Glu Ser Arg Pro Thr Arg Lys 225 230 235 240 GTC TTC GGA ACC TAC CGC TTC CAC CTG GAC ATA TCC GGA CAT ATC CGC 768 Val Phe Gly Thr Tyr Arg Phe His Leu Asp Ile Ser Gly His Ile Arg 245 250 255 GAC ATC CCC GTC GCC GAA GCC CTC CGC GCA CTC CAC CTC CAA GCC GAA 816 Asp Ile Pro Val Ala Glu Ala Leu Arg Ala Leu His Leu Gln Ala Glu 260 265 270 GAA CTC GTA TTC GTC GGT TCC TGG CCC TCC AAC CGT GCA GAA GAC AGC 864 Glu Leu Val Phe Val Gly Ser Trp Pro Ser Asn Arg Ala Glu Asp Ser 275 280 285 ACG CCC CAA ACC GAC CAA CTA GCT AAC GTA CAC AAG GCG GAC GAA TGG 912 Thr Pro Gln Thr Asp Gln Leu Ala Asn Val His Lys Ala Asp Glu Trp 290 295 300 GTT CGC GCA GCA AGC GAA GGA AGG AAA CTT AAC TAG 948 Val Arg Ala Ala Ser Glu Gly Arg Lys Leu Asn 305 310 315 配列番号：2 配列の長さ：948 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(B
revibacteriumlactofermentum) 株名：AJ12259(FERM P-3565) 配列 ATG AGC GAC GCA CCA ATT GTT GTG GCC TAT TTG GGG CCT GCC GGA ACC 48 Met Ser Asp Ala Pro Ile Val Val Ala Tyr Leu Gly Pro Ala Gly Thr 1 5 10 15 TTC ACC GAA GAA GCC CTC TAC AAA TTT GCC GAC GCC GGC GTA TTC GGC 96 Phe Thr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys Phe Ala Asp Ala Gly Val Phe Gly 20 25 30 GAC GGT GAG ATC GAG CAG CTA CCA GCC AAA TCG CCA CAA GAA GCT GTC 144 Asp Gly Glu Ile Glu Gln Leu Pro Ala Lys Ser Pro Gln Glu Ala Val 35 40 45 GAC GCG GTC CGC CAC GGC ACC GCC CAG TTC GCG GTG GTC GCC ATC GAA 192 Asp Ala Val Arg His Gly Thr Ala Gln Phe Ala Val Val Ala Ile Glu 50 55 60 AAC TTC GTC GAC GGC CCC GTC ACC CCC ACC TTC GAC GCC CTT GAC CAG 240 Asn Phe Val Asp Gly Pro Val Thr Pro Thr Phe Asp Ala Leu Asp Gln 65 70 75 80 GGC TCC AAC GTG CAA ATC ATC GCC GAA GAA GAA CTC GAT ATT GCC TTT 288 Gly Ser Asn Val Gln Ile Ile Ala Glu Glu Glu Leu Asp Ile Ala Phe 85 90 95 TCC ATC ATG GTC CGG CCA GGG ACT TCG CTT GCC GAC GTC AAA ACC CTC 336 Ser Ile Met Val Arg Pro Gly Thr Ser Leu Ala Asp Val Lys Thr Leu 100 105 110 GCC ACC CAC CCG GTT GGG TAC CAA CAA GTG AAA AAC TGG ATG GCA ACC 384 Ala Thr His Pro Val Gly Tyr Gln Gln Val Lys Asn Trp Met Ala Thr 115 120 125 ACC ATT CCG GAC GCC ATG TAT CTT TCA GCA AGC TCC AAC GGC GCC GGC 432 Thr Ile Pro Asp Ala Met Tyr Leu Ser Ala Ser Ser Asn Gly Ala Gly 130 135 140 GCA CAA ATG GTT GCC GAA GGA ACC GCC GAC GCA GCC GCA GCG CCC TCC 480 Ala Gln Met Val Ala Glu Gly Thr Ala Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser 145 150 155 160 CGC GCA GCC GAA CTC TTC GGA CTG GAA CGC CTT GTT GAT GAT GTC GCC 528 Arg Ala Ala Glu Leu Phe Gly Leu Glu Arg Leu Val Asp Asp Val Ala 165 170 175 GAC GTC CGC GGC GCC CGC ACC CGC TTC GTT GCA GTC CAA GCC CAA GCA 576 Asp Val Arg Gly Ala Arg Thr Arg Phe Val Ala Val Gln Ala Gln Ala 180 185 190 GCC GTT TCC GAA CCG ACC GGC CAC GAC CGC ACC TCC GTC ATT TTC TCC 624 Ala Val Ser Glu Pro Thr Gly His Asp Arg Thr Ser Val Ile Phe Ser 195 200 205 CTA CCG AAT GTG CCA GGC AGC CTC GTG CGC GCC CTC AAC GAA TTC GCC 672 Leu Pro Asn Val Pro Gly Ser Leu Val Arg Ala Leu Asn Glu Phe Ala 210 215 220 ATC CGT GGC GTC GAC CTC ACC CGC ATC GAA CCC CGC CCC ACC CGC AAA 720 Ile Arg Gly Val Asp Leu Thr Arg Ile Glu Pro Arg Pro Thr Arg Lys 225 230 235 240 GTC TTC GGA ACC TAC CGC TTC CAC CTG GAC ATA TCC GGA CAT ATC CGC 768 Val Phe Gly Thr Tyr Arg Phe His Leu Asp Ile Ser Gly His Ile Arg 245 250 255 GAC ATC CCC GTC GCC GAA GCC CTC CGC GCA CTC CAC CTC CAA GCC GAA 816 Asp Ile Pro Val Ala Glu Ala Leu Arg Ala Leu His Leu Gln Ala Glu 260 265 270 GAA CTC GTA TTC GTC GGT TCC TGG CCC TCC AAC CGT GCA GAA GAC AGC 864 Glu Leu Val Phe Val Gly Ser Trp Pro Ser Asn Arg Ala Glu Asp Ser 275 280 285 ACG CCC CAA ACC GAC CAA CTA GCT AAC GTA CAC AAG GCG GAC GAA TGG 912 Thr Pro Gln Thr Asp Gln Leu Ala Asn Val His Lys Ala Asp Glu Trp 290 295 300 GTT CGC GCA GCA AGC GAA GGA AGG AAA CTT AAC TAG 948 Val Arg Ala Ala Ser Glu Gly Arg Lys Leu Asn 305 310 315 配列番号：3 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TCAACAAGCT GGAACGGACG 20 配列番号：4 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CGCCGATTTA CCGCCTTGAG 20 配列番号：5 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCGTCTGGAA CCACGCCCGA T 21 配列番号：6 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATCGGGCGTG ATTCCAGACG G 21 配列番号：7 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＣＣＧＴＣＴＧＧＡＡ ＧＡＣＣＧＣＣＣＧＡ Ｔ
２１ 配列番号：８ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATCGGGCGGT CTTCCAGACG G 21 配列番号：9 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCGTCTGGAA TGACGCCCGA T 21 配列番号：10 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＡＴＣＧＧＧＣＧＴＣ ＡＴＴＣＣＡＧＡＣＧ Ｇ
２１
revibacteriumlactofermentum) 株名：AJ12125(FERM P-7546) 配列 ATG AGC GAC GCA CCA ATT GTT GTG GCC TAT TTG GGG CCT GCC GGA ACC 48 Met Ser Asp Ala Pro Ile Val Val Ala Tyr Leu Gly Pro Ala Gly Thr 1 5 10 15 TTC ACC GAA GAA GCC CTC TAC AAA TTT GCC GAC GCC GGC GTA TTC GGC 96 Phe Thr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys Phe Ala Asp Ala Gly Val Phe Gly 20 25 30 GAC GGT GAG ATC GAG CAG CTA CCA GCC AAA TCG CCA CAA GAA GCT GTC 144 Asp Gly Glu Ile Glu Gln Leu Pro Ala Lys Ser Pro Gln Glu Ala Val 35 40 45 GAC GCG GTC CGC CAC GGC ACC GCC CAG TTC GCG GTG GTC GCC ATC GAA 192 Asp Ala Val Arg His Gly Thr Ala Gln Phe Ala Val Val Ala Ile Glu 50 55 60 AAC TTC GTC GAC GGC CCC GTC ACC CCC ACC TTC GAC GCC CTT GAC CAG 240 Asn Phe Val Asp Gly Pro Val Thr Pro Thr Phe Asp Ala Leu Asp Gln 65 70 75 80 GGC TCC AAC GTG CAA ATC ATC GCC GAA GAA GAA CTC GAT ATT GCC TTT 288 Gly Ser Asn Val Gln Ile Ile Ala Glu Glu Glu Leu Asp Ile Ala Phe 85 90 95 TCC ATC ATG GTC CGG CCA GGG ACT TCG CTT GCC GAC GTC AAA ACC CTC 336 Ser Ile Met Val Arg Pro Gly Thr Ser Leu Ala Asp Val Lys Thr Leu 100 105 110 GCC ACC CAC CCG GTT GGG TAC CAA CAA GTG AAA AAC TGG ATG GCA ACC 384 Ala Thr His Pro Val Gly Tyr Gln Gln Val Lys Asn Trp Met Ala Thr 115 120 125 ACC ATT CCG GAC GCC ATG TAT CTT TCA GCA AGC TCC AAC GGC GCC GGC 432 Thr Ile Pro Asp Ala Met Tyr Leu Ser Ala Ser Ser Asn Gly Ala Gly 130 135 140 GCA CAA ATG GTT GCC GAA GGA ACC GCC GAC GCA GCC GCA GCG CCC TCC 480 Ala Gln Met Val Ala Glu Gly Thr Ala Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser 145 150 155 160 CGC GCA GCC GAA CTC TTC GGA CTG GAA CGC CTT GTT GAT GAT GTC GCC 528 Arg Ala Ala Glu Leu Phe Gly Leu Glu Arg Leu Val Asp Asp Val Ala 165 170 175 GAC GTC CGC GGC GCC CGC ACC CGC TTC GTT GCA GTC CAA GCC CAA GCA 576 Asp Val Arg Gly Ala Arg Thr Arg Phe Val Ala Val Gln Ala Gln Ala 180 185 190 GCC GTT TCC GAA CCG ACC GGC CAC GAC CGC ACC TCC GTC ATT TTC TCC 624 Ala Val Ser Glu Pro Thr Gly His Asp Arg Thr Ser Val Ile Phe Ser 195 200 205 CTA CCG AAT GTG CCA GGC AGC CTC GTG CGC GCC CTC AAC GAA TTC GCC 672 Leu Pro Asn Val Pro Gly Ser Leu Val Arg Ala Leu Asn Glu Phe Ala 210 215 220 ATC CGT GGC GTC GAC CTC ACC CGC ATC GAA TCC CGC CCC ACC CGC AAA 720 Ile Arg Gly Val Asp Leu Thr Arg Ile Glu Ser Arg Pro Thr Arg Lys 225 230 235 240 GTC TTC GGA ACC TAC CGC TTC CAC CTG GAC ATA TCC GGA CAT ATC CGC 768 Val Phe Gly Thr Tyr Arg Phe His Leu Asp Ile Ser Gly His Ile Arg 245 250 255 GAC ATC CCC GTC GCC GAA GCC CTC CGC GCA CTC CAC CTC CAA GCC GAA 816 Asp Ile Pro Val Ala Glu Ala Leu Arg Ala Leu His Leu Gln Ala Glu 260 265 270 GAA CTC GTA TTC GTC GGT TCC TGG CCC TCC AAC CGT GCA GAA GAC AGC 864 Glu Leu Val Phe Val Gly Ser Trp Pro Ser Asn Arg Ala Glu Asp Ser 275 280 285 ACG CCC CAA ACC GAC CAA CTA GCT AAC GTA CAC AAG GCG GAC GAA TGG 912 Thr Pro Gln Thr Asp Gln Leu Ala Asn Val His Lys Ala Asp Glu Trp 290 295 300 GTT CGC GCA GCA AGC GAA GGA AGG AAA CTT AAC TAG 948 Val Arg Ala Ala Ser Glu Gly Arg Lys Leu Asn 305 310 315 配列番号：2 配列の長さ：948 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(B
revibacteriumlactofermentum) 株名：AJ12259(FERM P-3565) 配列 ATG AGC GAC GCA CCA ATT GTT GTG GCC TAT TTG GGG CCT GCC GGA ACC 48 Met Ser Asp Ala Pro Ile Val Val Ala Tyr Leu Gly Pro Ala Gly Thr 1 5 10 15 TTC ACC GAA GAA GCC CTC TAC AAA TTT GCC GAC GCC GGC GTA TTC GGC 96 Phe Thr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys Phe Ala Asp Ala Gly Val Phe Gly 20 25 30 GAC GGT GAG ATC GAG CAG CTA CCA GCC AAA TCG CCA CAA GAA GCT GTC 144 Asp Gly Glu Ile Glu Gln Leu Pro Ala Lys Ser Pro Gln Glu Ala Val 35 40 45 GAC GCG GTC CGC CAC GGC ACC GCC CAG TTC GCG GTG GTC GCC ATC GAA 192 Asp Ala Val Arg His Gly Thr Ala Gln Phe Ala Val Val Ala Ile Glu 50 55 60 AAC TTC GTC GAC GGC CCC GTC ACC CCC ACC TTC GAC GCC CTT GAC CAG 240 Asn Phe Val Asp Gly Pro Val Thr Pro Thr Phe Asp Ala Leu Asp Gln 65 70 75 80 GGC TCC AAC GTG CAA ATC ATC GCC GAA GAA GAA CTC GAT ATT GCC TTT 288 Gly Ser Asn Val Gln Ile Ile Ala Glu Glu Glu Leu Asp Ile Ala Phe 85 90 95 TCC ATC ATG GTC CGG CCA GGG ACT TCG CTT GCC GAC GTC AAA ACC CTC 336 Ser Ile Met Val Arg Pro Gly Thr Ser Leu Ala Asp Val Lys Thr Leu 100 105 110 GCC ACC CAC CCG GTT GGG TAC CAA CAA GTG AAA AAC TGG ATG GCA ACC 384 Ala Thr His Pro Val Gly Tyr Gln Gln Val Lys Asn Trp Met Ala Thr 115 120 125 ACC ATT CCG GAC GCC ATG TAT CTT TCA GCA AGC TCC AAC GGC GCC GGC 432 Thr Ile Pro Asp Ala Met Tyr Leu Ser Ala Ser Ser Asn Gly Ala Gly 130 135 140 GCA CAA ATG GTT GCC GAA GGA ACC GCC GAC GCA GCC GCA GCG CCC TCC 480 Ala Gln Met Val Ala Glu Gly Thr Ala Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser 145 150 155 160 CGC GCA GCC GAA CTC TTC GGA CTG GAA CGC CTT GTT GAT GAT GTC GCC 528 Arg Ala Ala Glu Leu Phe Gly Leu Glu Arg Leu Val Asp Asp Val Ala 165 170 175 GAC GTC CGC GGC GCC CGC ACC CGC TTC GTT GCA GTC CAA GCC CAA GCA 576 Asp Val Arg Gly Ala Arg Thr Arg Phe Val Ala Val Gln Ala Gln Ala 180 185 190 GCC GTT TCC GAA CCG ACC GGC CAC GAC CGC ACC TCC GTC ATT TTC TCC 624 Ala Val Ser Glu Pro Thr Gly His Asp Arg Thr Ser Val Ile Phe Ser 195 200 205 CTA CCG AAT GTG CCA GGC AGC CTC GTG CGC GCC CTC AAC GAA TTC GCC 672 Leu Pro Asn Val Pro Gly Ser Leu Val Arg Ala Leu Asn Glu Phe Ala 210 215 220 ATC CGT GGC GTC GAC CTC ACC CGC ATC GAA CCC CGC CCC ACC CGC AAA 720 Ile Arg Gly Val Asp Leu Thr Arg Ile Glu Pro Arg Pro Thr Arg Lys 225 230 235 240 GTC TTC GGA ACC TAC CGC TTC CAC CTG GAC ATA TCC GGA CAT ATC CGC 768 Val Phe Gly Thr Tyr Arg Phe His Leu Asp Ile Ser Gly His Ile Arg 245 250 255 GAC ATC CCC GTC GCC GAA GCC CTC CGC GCA CTC CAC CTC CAA GCC GAA 816 Asp Ile Pro Val Ala Glu Ala Leu Arg Ala Leu His Leu Gln Ala Glu 260 265 270 GAA CTC GTA TTC GTC GGT TCC TGG CCC TCC AAC CGT GCA GAA GAC AGC 864 Glu Leu Val Phe Val Gly Ser Trp Pro Ser Asn Arg Ala Glu Asp Ser 275 280 285 ACG CCC CAA ACC GAC CAA CTA GCT AAC GTA CAC AAG GCG GAC GAA TGG 912 Thr Pro Gln Thr Asp Gln Leu Ala Asn Val His Lys Ala Asp Glu Trp 290 295 300 GTT CGC GCA GCA AGC GAA GGA AGG AAA CTT AAC TAG 948 Val Arg Ala Ala Ser Glu Gly Arg Lys Leu Asn 305 310 315 配列番号：3 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TCAACAAGCT GGAACGGACG 20 配列番号：4 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CGCCGATTTA CCGCCTTGAG 20 配列番号：5 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCGTCTGGAA CCACGCCCGA T 21 配列番号：6 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATCGGGCGTG ATTCCAGACG G 21 配列番号：7 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＣＣＧＴＣＴＧＧＡＡ ＧＡＣＣＧＣＣＣＧＡ Ｔ
２１ 配列番号：８ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATCGGGCGGT CTTCCAGACG G 21 配列番号：9 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCGTCTGGAA TGACGCCCGA T 21 配列番号：10 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＡＴＣＧＧＧＣＧＴＣ ＡＴＴＣＣＡＧＡＣＧ Ｇ
２１
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/60 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/60 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (6)
- 【請求項１】 プレフェン酸デヒドラターゼ中の少なく
とも１アミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換する、
あるいは欠失することにより得られたフィードバック阻
害が解除された酵素をコードする遺伝子を含む組換えＤ
ＮＡで形質転換された微生物 - 【請求項２】 プレフェン酸デヒドラターゼのＮ末端か
ら３３０番目のＬ−セリン残基が他のアミノ酸残基に置
換され、かつ微生物がエシェリヒア・コリである請求項
１記載の微生物 - 【請求項３】 他のアミノ酸がプロリン残基またはアス
パラギン酸残基である請求項２記載の微生物 - 【請求項４】 プレフェン酸デヒドラターゼのＮ末端か
ら２３５番目のＬ−セリン残基が置換され、かつ微生物
がブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムである請
求項１記載の微生物 - 【請求項５】 プレフェン酸デヒドラターゼのＮ末端か
ら３３０番目のＬ−セリン残基以降が欠失し、かつ微生
物がエシェリヒア・コリである請求項１記載の微生物 - 【請求項６】 請求項１乃至５記載の微生物を培養する
ことにより培地中に生産されたＬ−フェニルアラニンを
取得することを特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造
法
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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| JP33722190 | 1990-11-30 |
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|---|---|
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|---|---|
| JP (1) | JP3060668B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
1991
- 1991-11-22 JP JP30761491A patent/JP3060668B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
| US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| US7425435B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-09-16 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| JP2005333984A (ja) * | 2004-04-26 | 2005-12-08 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2007207805A (ja) * | 2006-01-31 | 2007-08-16 | Sony Corp | 半導体装置の製造方法及び半導体装置 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3060668B2 (ja) | 2000-07-10 |
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