JPH0576383A - 抗体製造方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 モノクローナル抗体の新規な製造方法を提供
する。 【構成】 この方法は、Ｂリンパ球のクローナル増加
と、それに先立つか又はその後に行なわれる、所望の特
異性を有する抗体を産生するＢリンパ球の選択との組合
せから成るものである。選択されたリンパ球は不死化さ
れる。この方法によって、Ｂリンパ球源が如何に小規模
なものであってもそれを利用することが可能になる。
する。 【構成】 この方法は、Ｂリンパ球のクローナル増加
と、それに先立つか又はその後に行なわれる、所望の特
異性を有する抗体を産生するＢリンパ球の選択との組合
せから成るものである。選択されたリンパ球は不死化さ
れる。この方法によって、Ｂリンパ球源が如何に小規模
なものであってもそれを利用することが可能になる。
Description
【発明の詳細な説明】本発明はモノクローナル抗体の製
造方法に係わる。１９７５年に（１）Ｋｏｈｌｅｒ及び
Ｍｉｌｓｔｅｉｎによって初めて開示されたモノクロー
ナル抗体の標準的製造方法は、感作したマウス（ｍｕｒ
ｉｎｅ）脾細胞をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の
存在下でマウス骨髄腫細胞と融合する操作を含む。しか
しながら、この方法は余り効率的ではない。通常は、骨
髄腫細胞とうまく融合して安定増殖ハイブリドーマを形
成するＢ細胞の数が、２ｘ１０５個の脾細胞で、せいぜ
い１つにすぎない。これは、細胞の９９．９９９５％が
損失されることを意味する。１９８２年に（２）、Ｚｉ
ｍｍｅｒｍａｎｎ及びその共同研究者らは、ＰＥＧ誘導
型細胞融合の効果的な代替方法として電気融合（ｅｌｅ
ｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ）を導入した。この方法はその
後、マウス及びヒトの両方に由来する抗体産生ハイブリ
ドーマの製造に関して更に研究されてきた。この方法
は、２つの細胞の膜同士の密着を交流電界（誘電泳動
（ｄｉｅｌｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ））で樹立させる
ことができるという観察に基づいている。次いで、強さ
が大きく期間が短い電界パルスに暴露すると、細胞膜は
一時的に透過性になる。この短いパルスの後で交流電界
におくと細胞は再びシールされる。密着し合った細胞は
再シールの間に細胞質ブリッジを形成し得、その結果細
胞融合が起こる。電気融合頻度は１：２０００に及ぶと
報告されている（３）。しかしながら、Ｂ細胞源として
は脾細胞しか使用できない。リンパ節細胞又は末梢血液
細胞との融合では、得られるハイブリドーマの数が余り
にも少ないか又は皆無だからである。ｉｎ ｖｉｔｒｏ
免疫又は選択実験の結果得られる限定された量の細胞に
ついても同じことが言える。モノクローナル抗体を産生
するための別の試みでは、Ｉｇ遺伝子用ＰＣＲ技術が使
用されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術
（４）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの限定されたＤＮＡフラ
グメントの特異的増幅に使用されてきた。この技術は、
増幅すべき遺伝子の各末端の領域について特異的な２つ
のプライマーからのエクステンションを何回も繰り返す
操作を含む。近年、この技術は、ハイブリドーマ細胞か
らのｍＲＮＡを出発材料として使用する再構成イムノグ
ロブリン可変遺伝子フラグメント（ｒｅａｒｒａｎｇｅ
ｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ
ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）の増幅に使用できる
ように改変されてきた（５）。Ｉｇ分子は種類が多様で
あるため、普遍的な特異的プライマーを形成することは
できない。そこでＬａｒｒｉｃｋら（６、７、８）は、
ヒトＨ鎖及びＬ鎖の既知のリーダー配列に由来するオリ
ゴヌクレオチドプライマーとヒトイムノグロブリン不変
部のＮ末端部分に対応する配列に由来するオリゴヌクレ
オチドプライマーとの縮重混合物を考案した。マウスイ
ムノグロブリンについても同じことがＢｏｅｕｆらによ
って行われた（９）。このようにすれば、任意のヒト又
はマウスイムノクロブリンに由来するＨ鎖及びＬ鎖の可
変部配列を増幅し、配列決定し且つ発現させることが可
能になる。しかしながら、哺乳動物細胞の完全Ｉｇ遺伝
子をクローニングするためのＰＣＲ技術は、多数の抗体
産生細胞系を形成するのには適していない。なぜなら、
ハイブリドーマの形成と異なり、哺乳動物細胞系におけ
るＩｇの発現は極めて複雑だからである。従って、哺乳
動物細胞系に発現する僅か数個の抗体を選択するのに、
より多くの情報が製造すべき抗体に関して必要とされ
る。Ｉｇは比較的簡単な大腸菌発現システムで発現させ
ることもできる。Ｗａｒｄら（１０）は、大腸菌中での
大きな抗原結合親和性を有するＶＨドメイン（単一ドメ
イン抗体、ｄＡｂ）の発現及び分泌について記述してい
る。より有望と思われるのは、大腸菌中でのＦｖフラグ
メントの発現である（１１、１２）。Ｓｋｅｒｒａら
（１１）は、大腸菌中に発現されたＶＨ及びＶＬが、も
との抗体と同じ親和性を有する完全機能二量体（ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｍｅｒ）Ｆｖ
にアッセンブルできると記述している。最後に述べた２
つの技術は多数の「抗体」を形成する可能性を有し、従
って選択は後の段階で、安定な「抗体」産生細菌クロー
ンについて実施し得る。興昧をひく抗体は更に操作し
て、完全抗体又は所望の性質を有する融合タンパク質、
例えば「抗体」−ＨＲＰ結合体にし得る。単細胞に由来
するＩｇコードｍＲＮＡの単離及び増幅も報告されてい
る（１３、１４）。しかしながら、ＰＣＲ技術の出発点
は通常ハイブリドーマであるためここでも融合技術と同
じ問題、特に脾細胞しか使用できないという問題が見ら
れる。抗体産生細胞を得るための更に別の試みはＢ細胞
のクローナル増加（ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏ
ｎ）である。従来のＢ細胞クローニングシステムは主と
してＬＰＳでのＢ細胞の刺激（マウスには効果があるが
ヒトＢ細胞には効かない）又は完全なクローン化された
同種反応性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ）ヘルパーＴ細
胞でのＢ細胞の刺激に基づくものであった。最近になっ
て、Ｚｕｂｌｅｒら（１５、１６、１７、１８）は、ヒ
ト及び／又はマウスＢ細胞をＴ細胞に依存せずにクロー
ン的に活性化できる培養システムを発表した。このシス
テムは、照射突然変異マウスＥＬ−４胸腺腫細胞である
ＥＬ−４／Ｂ５を、増殖源及び分化因子（ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）としてのヒトＴ細
胞／マクロファージ上清と組合わせて使用する。ＥＬ−
４／Ｂ５細胞はＭＨＣ非制限（ＭＨＣ−ｎｏｎｒｅｓｔ
ｒｉｃｔｅｄ）直接細胞−細胞相互作用を介してＢ細胞
を活性化する。活性化シグナル自体はマイトジェン性で
はないが、Ｂ細胞をヒトＴ細胞上清中に存在する１つ
（ＩＬ−２）又は複数のサイトカインに応答するように
感作する。ヒト末梢血液又は脾臓に由来するＢ細胞の９
０％が活性化され、１０日間の応答の間に抗体分泌細胞
平均数３８０の短期クローンを産生した（１５）。クロ
ーン当たりの平均Ｉｇ分泌量は４０ｎｇであり、個々の
クローンはＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ＋ＩｇＧ又
はＩｇＭ＋ＩｇＧ＋ＩｇＡ産生を示した。これは、１ｇ
クラススイッチが起きたことを意昧する。しかしなが
ら、前述の技術のいずれを使用しても、例えば動物のリ
ンパ節もしくは末梢血液のような任意の可能な源又はヒ
トに由来する源から、任意の所望の特異的モノクローナ
ル抗体を産生する安定な細胞系を得ることはできない。
リンパ節細胞又は末梢血液細胞の融合は脾臓細胞と比べ
て別の特異性、親和性又はイソタイプを有する抗体を形
成し得、従って先行技術で形成できる抗体に加えてまた
１つ有用な抗体が得られることになる。更に、末梢血液
細胞の融合は１種類の実験動物のより長い期間の免疫レ
パートリーを研究する機会も与えてくれる。動物由来の
モノクローナル抗体の他に、ヒト由来の抗体が関心を呼
んでいる。これには下記のような幾つかの理由がある： （ｉ）治療過程で、マウスモノクローナル抗体がヒト抗
マウス応答に起因して患者に有害なものとなった（１
９、２０）。ヒトモノクローナルはヒトにおいて免疫原
性を少ししか又は全く示さないと思われる。 （ｉｉ）ヒトゲノムは抗体の別のレパートリーであり
得、従って別の特異性をもつモノクローナルを形成し得
る。 （ｉｉｉ）免疫不妊（ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｅｒｔｉｌ
ｅ）ドナー、自己免疫疾患のあるドナー、又は抗腫瘍抗
体を有するドナーのような或る個体は興味深い特異性を
もつ抗体を産生する。 ヒトモノクローナル抗体の開発は近年多くの研究者によ
って報告されているが（２１、２２）、ヒトモノクロー
ナル抗体の産生における多くの間題は今日まで未解決の
ままである。ヒトモノクローナル抗体の開発における共
通の問題は、倫理的理由から免疫感作が許されていない
という点にある。そのため、単離ヒトリンパ球から製造
できるのは、天然抗原に対する抗体にほぼ限られてい
る。抗原特異的Ｂリンパ球の頻度は通常極めて低い。ヒ
トリンパ球を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫感作の実験の
結果は現在までのところ極めておそまつであり、再現性
がない（２３、２４）。これまで、ヒトモノクローナル
抗体の産生は主に下記の２つの方法にしぼられてきた： （ｉ）リンパ球と、マウス、ヒト及びマウスｘヒト由来
の骨髄腫細胞との融合、並びに （ｉｉ）エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）でのリ
ンパ球のウイルス性形質転換。 ＰＥＧ融合技術（既述）に固有の低融合頻度の他に、ヒ
トリンパ球との融合は理想的な融合相手がまだみつかっ
ていないという理由で実現が阻まれている。従って、こ
れまでに形成されたヒト抗体産生ハイブリドーマの大部
分は増殖及び抗体産生に関して不安定であることが判明
した。前述の低無限増殖性化頻度に対比して、ヒトＢリ
ンパ球はＥＢＶにより極めて効果的に無限増殖性化され
得る。しかしながら、このシステムでは、無限増殖性化
がサブセットのＢ細胞に限定され、その結果ＩｇＭクラ
スを主体とするモノクローナル抗体が形成される。更
に、ＥＢＶ形質転換細胞の一部は余り増殖せず、またＥ
ＢＶ形質転換細胞を骨髄腫細胞と融合させる試みは、得
られる細胞系の安定性に関する問題に起因してしばしば
失敗におわっている。本発明はモノクローナル抗体の製
造方法であって、ドナーからＢリンパ球を採取し、この
リンパ球をクローナル増加にかけ、得られたリンパ球を
無限増殖性にし（無眼増殖性化）、得られた細胞を培養
し、その培養培地からモノクローナル抗体を単離するこ
とからなる方法を提供する。（電気）融合又は無限増殖
性化の中間体として、細胞集団は特異的抗体産生細胞の
濃度を上げることができる。このようにすれば、１〜数
個の特異的抗体分泌Ｂ細胞からハイブリドーマを形成す
ることができる。本発明は、モノクローナル抗体の製造
方法であって、ドナーからＢリンパ球を採取し、このＢ
リンパ球をクローナル増加にかけ、増加した細胞からｍ
ＲＮＡを単離し、このｍＲＮＡを（ｃＤＮＡとして）増
幅し、このｃＤＮＡを適当な宿主中に発現させることか
らなる方法も提供する。個々のＢ細胞は、ＰＣＲ技術の
中間体として増加させ得る。この方法は、直接的ＰＣＲ
より有利である。なぜなら、（ｉ）培養上清の一部を、
操作すべき抗体に関してより多くの情報を得るために使
用し得、（ｉｉ）正確なＰＣＲプライマーセットを選択
すべくＩｇクラス（Ｈ＋Ｌ）を決定するのに上清を使用
することができ、且つ（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ単離のために
より多くの細胞を使用できるからである。この方法は、
好ましくは、クローナル増加及び無限増殖性化又は増幅
の前に抗体産生リンパ球を選択する（より好ましくは所
望の特異性を有する抗体を選択する）ステップを含む。
この選択ステップは、クローナル増加の後で行ってもよ
い。本発明の方法の重要な利点は、クローナル増加と無
限増殖性化技術との組合わせ、又は場合によっては増幅
技術及び組換ＤＮＡ法との組合わせにある。クローナル
増加技術を使用すれば、融合もしくは形質転換又はメッ
センジャーＲＮＡの単離を行うのに十分な数のＢリンパ
球を１〜数個のＢリンパ球から製造することができる。
１つのリンパ球から５００個に及ぶリンパ球を増殖させ
ることができる。従って、本発明を使用すれば、総ての
可能なリンパ球源から抗体産生細胞を製造することがで
きる。本発明の別の利点は抗体産生リンパ球を予め選択
することにある。応答の良い個体でも、所望の特異性を
有する抗体を産生できるのはリンパ球のほんの一部にす
ぎない。従って、無限増殖性化技術がより効果的になっ
たとしても、感作細胞を最適に使用するために、あるい
は電気融合、Ｂ細胞のクローナル増加又は単一のもしく
は増加したＢ細胞に関するＰＣＲ技術の結果得られる極
めて多数の上清の面倒なスクリーニングを回避するため
に、抗体産生Ｂ細胞の予選択が必要となる。パンニン
グ、ロゼッティング及び蛍光活性化細胞ソーティング
（ＦＡＣＳ）のような特異的選択技術は十分に記述され
ているが、選択した細胞を融合又は培養に使用できるか
否かについては殆ど知られていない。この点について
は、最近開発された非毒性常磁性免疫ビーズが極めて有
望と思われる。常磁性ビーズで選択した後は、ハイブリ
ドーマを首尾良くクローン化することがてき、ビーズと
細胞とを分離せずに継代培養できることが判明した（２
５）。この技術は本発明の予選択ステップとして使用す
るのに極めて適している。パンニングと称する予選択技
術も極めて有用である。 電気融合と組合わせたクロー
ナル増加は、予め選択された特異的Ｂ細胞を融合する可
能性を与える。即ち、陰性クローンを試験する労力なし
に、特異的ハイブリドーマの数を著しく増大することが
できる。その結果、所望の特性（エピトープ特異性、親
和性、クラス及びサブクラス）を有する抗体を多数の抗
体から選択することができるので、極めて特定のものを
見いだす機会が増大する。電気融合と組合わせたクロー
ナル増加を使用し、リンパ節、眼窩穿孔血液試料（ｏｒ
ｂｉｔａ ｐｕｎｃｔｉｏｎ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌ
ｅｓ）及びｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫実験から得られる少数
のリンパ球を融合することができる。Ｍｉｒｚａら（２
６）によって既に示されたように，リンパ節細胞の融合
によってより多数の感作特異的Ｂ細胞がもたらされ、従
ってより広い範囲の抗体特異性がもたらされ得る。末梢
血液リンパ球の融合は、同じ実験動物においてより長い
期間、免疫応答を追従し得るが故に更なる長所を有す
る。活性化された細胞は細胞容積が大きくなる。電気融
合においては、より大きな細胞は骨髄腫細胞と比較して
膜の破壊の電圧の差がより小さいが故に、より大きな細
胞を融合するのが好ましい。即ち、抗原刺激された親和
性成熟Ｂ細胞／血漿細胞を融合するのが好ましい。この
ことで抗体はより高い親和性となり得る。Ｂ細胞のクロ
ーナル増加及び電気融合の組合せは、単一のＢ細胞から
ハイブリドーマ細胞系を生産することのできるモノクロ
ーナル抗体産生の新規の方法を提供する。この点におい
て該方法は少なくともＩｇ遺伝子におけるＰＣＲ法に匹
敵し得る。更にこの方法は、親和性成熟抗体をもたらす
という長所を有する。ＥＬ−４／Ｂ細胞培養系は種特異
的ではないと考えられるので（マウス及びヒトＢ細胞が
増加し得る）、他の種由来のリンパ球も培養し得ること
が期待される。電気融合、Ｉｇ遺伝子におけるＰＣＲ法
及びこれらの技術とＢ細胞クローナル増加との組合せ
は、ヒトモノクローナル抗体の産生におけるＥＢＶ形質
転換の選択性の問題（主にＩｇＭ抗体）を回避する。以
下の実験のセクションにおいて本発明をより詳細に説明
する。実験 材料と方法 試薬 − 等量のダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇ
ｉｂｃｏ ０７４−２１００）及び栄養分混合物Ｆ１２
（ＨＡＭのＦ１２，Ｇｉｂｃｏ ０７４−１７００）を
混合し、この混合物に２５００ｍｇ／ｌの重炭酸ナトリ
ウム（Ｂａｋｅｒ）、５５ｍｇ／ｌのピルビン酸ナトリ
ウム（Ｆｌｕｋａ）、２．３ｍｇ／ｌの２−メルカプト
エタノール（Ｂａｋｅｒ）、１．２２ｍｇ／ｌのエタノ
ールアミン（Ｂａｋｅｒ）、３６０ｍｇ／ｌのＬ−グル
タミン（Ｍｅｒｃｋ）、４．５・１０−４ｍｇ／ｌの亜
セレン酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ）、６２．５ｍｇ／ｌ
のナトリウムペニシリン（Ｍｙｃｏｐｈａｒｍ）及び６
２．５ｍｇ／ｌのストレプトマイシン硫酸塩（Ｓｅｒｖ
ａ）を補充することにより、培養培地ＤＭＥＭ／ＨＡＭ
のＦ１２を調製した。融合実験においては、培地に更
に、１３．６１ｍｇ／ｌのヒポキサンチン（Ｆｌｕｋ
ａ）及び３．８３ｍｇ／ｌのチミジン（Ｆｌｕｋａ）を
補充した。この培地をＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２／ＨＴ
と称する。ハイブリドーマの選択は、１％のヒト膀胱癌
細胞系Ｔ２４（Ｔ２４ＣＭ）のＩｌ−６含有上清及び
０．４μＭのアミノプテリン（Ｆｌｏｗ）を補充したＤ
ＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２／ＨＴ中で行なった。 − 融合培地：２８０ｍＭ イノシトール（ＩＣＮ）、
０．１ｍＭ 酢酸カルシウム（Ｂａｋｅｒ）、０．５ｍ
Ｍ 酢酸マグネシウム（Ｂａｋｅｒ）及び１ｍＭヒスチ
ジン（Ｆｌｕｋａ）；比抵抗：１．１１・１０４Ω・ｃ
ｍ。材料をＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に溶解し、次いで伝導度
をＭｉｌｌｉ−Ｑ水または１ｍＭ酢酸カルシウム及び５
ｍＭ酢酸マグネシウムを含む溶液を用いて９０μＳ／ｃ
ｍに調整した。 − ０．５ｍｇ／ｍｌのプロナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈ
ｅｍ）をＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２中に溶解することに
よりプロナーゼ液を調製した。 − １部の１．５Ｍ ＮａＣｌを９部のパーコール（Ｐ
ｅｒｃｏｌｌ）（１００％ＳＩＰ）に加えることによ
り、パーコール密度勾配培地（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を
等浸透圧（ｉｓｏ−ｏｓｍｏｔｉｃ）にした。この等浸
透圧パーコール保存液を培養培地で希釈することによ
り、より低い密度に調整した。細胞培養 突然変異ＥＬ−４胸腺腫細胞ＥＬ−４／Ｂ５（Ｄｒ．
Ｒ．Ｚｕｂｌｅｒ，ジュネーブ，スイスからの寄贈）
を、１０％ＦＣＳ（Ｂｏｃｋｎｅｋ）を補充したＤＭＥ
Ｍ／ＨＡＭのＦ１２中で細胞濃度１・１０４〜１・１０
６細胞／ｍｌで常習的に培養した。細胞が１・１０６細
胞／ｍｌを越えて増殖すると、細胞はＢ細胞刺激活性を
失い得る。マウス骨髄腫細胞ＮＳ−１、またはキセノハ
イブリッド（ｘｅｎｏｈｙｂｒｉｄｓ）Ｋ６Ｈ６Ｂ５及
びＰＡＩ−１をそれぞれマウス及びヒトＢ細胞の融合相
手として使用した。細胞を、１０％ＦＣＳを補充したＤ
ＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２／ＨＴ中で細胞濃度５・１０４
〜１５・１０５細胞／ｍｌで常習的に培養した。融合の
１日前に培地を１：３に分割し、融合日には対数増殖相
培地を形成した。マウス脾細胞の調製 最後の免疫の後、マウスを殺し、それらの脾臓を取り出
した。細胞をＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２中に細片化し、
１６ゲージニードルによって穏やかに吸引することによ
り凝集塊を破壊した。細胞懸濁液を２０００Ｎ／ｋｇで
１０分間遠心分離し、ペレットを、０．１６Ｍ ＮＨ４
Ｃｌ及び０．０１Ｍ ＫＨＣＯ３を含む溶液中に再懸濁
し、赤血球を溶解した。細胞懸濁液を再度遠心分離し、
最終的に培地中に再懸濁した。末梢血液細胞の単離 Ｖａｎ Ｍｅｅｌ（１９８５）によって記載されたよう
に赤血球を等張デキストラン溶液中で膨潤させることに
より、ヒト白血球を単離した。次いで白血球を、１０％
ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２中に懸濁
し、ポリスチレン培養フラスコ内３７℃で１時間インキ
ュベートして単球を除去した。次いで、抗ＣＤ２モノク
ローナル抗体（Ｄｙｎａｌ １１１．０１）で被覆した
常磁性ポリスチレンビーズと一緒に２回続けてインキュ
ベートすることによりＴ細胞を除去した。ＣＤ２陽性細
胞を完全に除去するために、洗浄したイムノビーズと単
球を除去したＰＢＬとを比４０：１で混合した。ビーズ
及び細胞の混合物を、１０分ごとに穏やかに混合しなが
ら２〜４℃で３０分間インキュベートした。次いで、磁
気装置を試験管の壁に当てて保持し上清を除去すること
により、ロゼット形となった細胞を単離した。マウスＰ
ＢＬを単離するために、眼窩穿孔により１００μｌの血
液を採取し、直ぐに３０ＩＵ／ｍｌのリチウムヘパリン
を含むリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）１００μｌで希釈し
た。次いで希釈した血液を、毛細管中の７００μｌのＬ
ｙｍｐｈｏｐａｑｕｅ（Ｎｙｅｇａａｒｄ＆Ｃｏ．）上
に慎重に層状に置いた。次いで毛細管を４０００Ｎ／ｋ
ｇで３０分間遠心分離し、相間層を回収した。最後に細
胞を培養培地で２回洗浄することによる血小板を除去し
た。ヒトＴ細胞／マクロファージ上清（ＴＳＮ）の調製 新たに単離した単核細胞を２０００Ｎ／ｋｇで１０分間
遠心分離した。次いでＧｕｔｉｅｒｒｅｚら（１９７
９）によって記載された方法の改良法に従ってＢ細胞と
Ｔ細胞とを分離した。ペレットを５ｍｌの１００％ＳＩ
Ｐ中に再懸濁した。次いで１００％ＳＩＰ上に、まず１
０ｍｌの７０％ＳＩＰの層を、次いで２５ｍｌの５０％
ＳＩＰの層を置いた。勾配体を２５，０００Ｎ／ｋｇで
１０分間遠心分離した。７０％及び５０％ＳＩＰの界面
に残留したＴ細胞に富むフラクションを回収し、１０％
ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２で２回洗浄
した。洗浄した細胞を、１０％ＦＣＳ、５μｇ／ｍｌの
ＰＨＡ（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＭ
Ａ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２
中で４０〜４５時間刺激した。最後に上清を回収し、
０．２μｍ膜フィルターによって▲ろ▼過し、アリコー
トにして−７０℃で保存した。ＥＬ−４／Ｂ細胞培養液 Ｚｕｂｌｅｒら（１２〜１５）によって記載されたよう
にＥＬ−４／Ｂ細胞培養液を調製した。簡単に述べる
と、粗または精製Ｂ細胞をＴＳＮ及び５０，０００個の
放射線照射（２５００ＲＡＤ）ＥＬ−４／Ｂ５細胞と、
９６ウェルの平底組織培養プレートの最終容積２００μ
ｌの１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２
中で混合した。ＴＳＮの最適量は、各バッチに対して滴
定によって確定した。一般にヒトＢ細胞を最適に刺激す
るには１０％ＴＳＮで十分であったが、マウスＢ細胞に
は２０％ＴＳＮが必要であった。培養液が、５％ＣＯ２
及び湿度１００％として３７℃でインキュベートした。
８日目〜１２日目の間に上清の免疫グロブリン産生を試
験した。ミニ電気融合 個々のＥＬ−４／Ｂ細胞培養液の内容物を１０６個の骨
髄腫細胞と２ｍｌ遠心分離管内で混合した。ＤＭＥＭ／
ＨＡＭのＦ１２／ＨＴで１回洗浄することにより細胞か
ら血清を除いた。次いで細胞懸濁液を遠心分離し、ペレ
ットを３７℃のＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２／ＨＴ １ｍ
ｌ中に再懸濁し、１３０μｌのプロナーゼ溶液を加え
た。細胞懸濁液をプロナーゼと一緒に３分間インキュベ
ートし、次いで２００μｌのＦＣＳを加えることにより
酵素反応を停止させた。次いで細胞を融合培地で１回洗
浄し、最終容積５０μｌの融合培地中に室温で再懸濁し
た。全細胞懸濁液を融合チャンバの内部スペース内にピ
ペットで注入した。このチャンバは、パースペックス
（ｐｅｒｓｐｅｘ）ボックス内に埋め込まれた２つのス
テンレススチール製のディスク形電極からなる。電極は
厚さ０．０５ｍｍで異なる直径のテフロンスペーサによ
って分離されている。融合チャンバ内の細胞の整列は、
２ＭＨｚ及び４００Ｖ／ｃｍの交流電場を３０秒間印加
することによって誘起した。次いで直ちに、３ｋＶ／ｃ
ｍ及び継続時間１０μｓの角形高電場パルス（ｓｑｕａ
ｒｅ，ｈｉｇｈ ｆｉｅｌｄ ｐｕｌｓｅ）を与えて細
胞膜を破壊した。細胞を相互に混合し且つ膜を再封止さ
せるために交流電場を再度３０秒間印加した。最後に、
融合チャンバの内容物を２０ｍｌの選択培地に移し、９
６ウェルの微小培養プレート内で平板培養した。１４日
目に、培養液のハイブリドーマ増殖を調査し、上清の免
疫グロブリン産生を試験した。酵素イムノアッセイ ヒトＩｇの測定を、ヤギ抗ヒトＩｇ被覆プレート及びＨ
ＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇ第２抗体を使用する標準的なサ
ンドイッチＥＬＩＳＡによって行なった。マウスＩｇ
は、ヒツジ抗マウス抗体を使用する同様のＥＬＩＳＡに
よって測定した。マウス抗ＨＩＶ抗体を検出するため
に、ＨＲＰ標識ヒツジ抗マウスＩｇと組み合わせてＨＩ
Ｖウイルス溶解物で被覆したプレートを使用した。捕捉
抗体としてのヤギ抗ヒトＩｇ及びマウスモノクローナル
抗風疹ＨＲＰに結合した風疹抗原とを用いたダブルサン
ドイッチＥＬＩＳＡにおいてヒト抗風疹抗体を検出し
た。パンニング手順 ０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ＝９．６中に１〜
１０μｇの抗原を含む溶液を１ウェル当たり４ｍｌ含む
６ウェルの培養プレートを一晩インキュベートした。次
いでウェルをＰＢＳで洗浄し、パンニング実験に直接使
用するか、または−２０℃で保存した。パンニングは、
単球を除去したマウス脾細胞またはヒト単核細胞を抗原
被覆ウェルにおいて３７℃、５％ＣＯ２及び湿度１００
％で１〜２時間インキュベートすることにより行なっ
た。このインキュベーションの後、未付着の細胞をＰＢ
Ｓで３回続けて洗浄することにより穏やかに除去した。
次いで、各ウェルを、１．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ及び
０．０５％トリプシン（Ｆｌｏｗ，カタログ番号１６−
８９３−４９）を含むＰＢＳ２５０μｌ，ｐＨ７．５と
一緒に２分間インキュベートすることにより、抗原に結
合した特異的Ｂ細胞を回収した。１０％ＦＣＳを補充し
たＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２ ５ｍｌを加えることによ
りトリプシン処理を停止した。最後に、残存する付着Ｂ
細胞を機械的に除去するために、ウェルの表面全体をパ
スツールピペットを使用し培地で洗い流した。結果 ──マウスＢ細胞の不死化 独立した２つの実験において、ＥＬ−４／Ｂ細胞培養物
に、マウス脾細胞または抹消血単核細胞をウェルあたり
５０，１０もしくは２細胞の播種密度で接種した。この
培養物の上清を、マウスＢ細胞の外殖（ｏｕｔｇｒｏｗ
ｔｈ）およびマウスＩｇの存在に関して（８〜１１日目
に）テストした。表Ｉから、２脾細胞を接種した培養物
ではその約５０％で、また、２抹消血単核細胞を接種し
た培養物ではその約２０％でＢ細胞の外殖が達成された
ことが分かる。Ｂ細胞培養物中に存在するほんの少数の
Ｂ細胞から抗体産生ハイブリドーマを作ることが可能か
どうかを調べるために、１２個の各培養物をＮＳ−１ミ
エローマ細胞との電気的微量融合（ｍｉｎｉ−ｅｌｅｃ
ｔｒｏｆｕｓｉｏｎｓ）に掛けた。表ＩＩから、多数の
抗体産生ハイブリドーマが、１２のうち１１の融合実験
で生成したことが分かる。本発明者らは更に、抗原特異
的ハイブリドーマを開発することができるかどうかを調
べた。そのために、脾細胞と末梢血単核細胞を、ＨＩＶ
ウイルス溶解物を免疫したマウスから単離した。９日目
に、その培養物を細胞増殖について調べ、また、その上
清をマウス免疫グロブリンおよびマウス抗ＨＩＶについ
てＥＬＩＳＡでアッセイした。表ＩＩＩから、２脾細胞
を接種した培養物ではその５２％で、また、４末梢血細
胞を接種した培養物ではその３５％でＩｇ産生Ｂ細胞の
外殖が起ったことが分かる。これらの培養物では、抗Ｈ
ＩＶを産生するウェルは１つも見出せなかったが、より
高い播種密度で接種した培養物では、３および４個の抗
ＨＩＶ産生Ｂ細胞クローンが、それぞれ脾細胞およびＰ
ＢＬ培養物中に見出された。抗ＨＩＶ Ｂ細胞クローン
を連続増殖性ハイブリドーマ細胞系に変えるために、全
ての抗ＨＩＶ産生培養物を個々にＮＳ−１ミエローマ細
胞との電気的微量融合に掛けた。７のうち５の電気的微
量融合において、少なくとも１つの抗原特異的ハイブリ
ドーマが生成した（表ＩＶ）。２脾細胞または４ＰＢＬ
を接種した培養物中のＢ細胞クローンは、単一のＢ細胞
から派生することが予期された。従って、これらの培養
物を用いてさらに２つの電気的微量融合を行い、単一の
Ｂ細胞を接種したＢ細胞培養物から抗体産生ハイブリド
ーマを開発できるかどうかを調べた。これらの融合の結
果、それぞれ４５および７５個のＩｇ産生ハイブリドー
マが生じた（結果を示さず）。表Ｉ マウスＢ細胞の外殖 ９６穴培養プレート中、５０，０００個の被照射ＥＬ−
４／Ｂ５ヘルパー細胞および２０％ヒトＴ細胞上清の存
在中に、マウス脾細胞または末梢血リンパ球を接種し
た。８〜１１日目に、培養上清をマウスＩｇについてテ
ストした。 表ＩＩ Ｂ細胞培養物の電気的微量融合 表Ｉに記載の実験から得たマウスＢ細胞培養物を、１０
６ＮＳ−１ミエローマ細胞と混合した。細胞をプロナー
ゼ処理し、最終的に融合用培地中に懸濁した。融合後、
９６穴培養プレート中、選択用培地中に細胞を播種し
た。融合して９日後に、培養物をハイブリドーマの増殖
について調べ、また、上清をマウスＩｇについてテスト
した。 表ＩＩＩ ＥＬ−４／Ｂ細胞培養物中での抗ＨＩＶ特異
的マウスＢ細胞の外殖 ９６穴培養プレート中、５０，０００個の被照射（２５
００ラド）ＥＬ−４／Ｂ５ヘルパー細胞および２０％ヒ
トＴ細胞上清の存在中にマウス脾細胞または末梢血リン
パ球を接種した。９日目に、培養上清をマウスＩｇまた
はマウス抗ＨＩＶ抗体についてテストした。 表ＩＶ 個々の抗ＨＩＶ陽性Ｂ細胞培養物の電気的微量
融合 表ＩＩＩに記載の実験から得たマウスＢ細胞培養物を、
１０６ＮＳ−１ミエローマ細胞と混合した。細胞をプロ
ナーゼ処理し、最終的に融合用培地中に再懸濁した。融
合後、９６穴培養プレート中、選択用培地中に細胞を播
種した。融合して１３日後に、培養物をハイブリドーマ
増殖について調べ、また、上清をマウスＩｇおよびマウ
ス抗ＨＩＶについてテストした。 ──ヒトＢ細胞の不死化 過去に風疹に感染したことのある供給者から、「材料お
よび方法」の項目に記載したとおりにヒト白血球を単離
した。ＦＡＣＳ分析の結果、最終調製物はＢ細胞約１１
％、単球４％およびＴ細胞１％を含有していることが分
かった。この細胞集団を用いてＥＬ−４／Ｂ細胞培養物
に接種した。ウェルあたり８５０，２５０，２５，５０
および１０細胞（これらは、それぞれ、ウェルあたり平
均９０，２５，５，２．５および１Ｂ細胞を示す）を培
養物に播種した。接種して８日後に、１Ｂ細胞を接種し
た培養物の４３％でヒトＩｇが測定された。これらの培
養物中では抗風疹陽性クローンは１つも検出されなかっ
たが、より多い数のＢ細胞を接種した培養物中では１８
個の抗風疹陽性クローンが認められた（表Ｖ）。これら
の培養物を別々に、Ｋ６Ｈ６Ｂ５またはＰＡＩ−１ミエ
ローマ細胞との電気的微量融合に掛けた（表ＶＩ）。融
合実験の全てにおいて、多数のハイブリドーマが生成し
たが、これらのハイブリドーマのうち僅かに小数のもの
が免疫グロブリンを産生したにすぎなかった。最初に、
３つの融合において、抗風疹陽性ハイブリドーマを検出
することができた。その１つの融合からのハイブリドー
マをスケールアップし、安定な抗風疹ＩｇＧ産生細胞系
にクローニングした。もう１つの融合から、２つの抗風
疹ＩｇＭハイブリドーマが生成したが、これらもまた首
尾よくスケールアップおよびクローニングが行なわれ
た。残りの第３の融合からの抗風疹陽性クローンは見つ
け出せなかった。これらのクローンでは、おそらく、比
較的多数の非産生ハイブリドーマが過剰増殖したためで
あろう。表Ｖ ＥＬ−４／Ｂ細胞培養物中でのヒト抗風疹Ｂ細胞
の外殖 ９６穴培養プレート中、５０，０００個の被照射（２５
００ラド）ＥＬ−４／Ｂ５ヘルパー細胞および２０％ヒ
トＴ細胞上清の存在中に、単球とＴ細胞を除去したヒト
白血球を接種した。８日目に、培養上清をヒトＩｇおよ
びヒト抗風疹抗体についてテストした。 表ＶＩ 個々のヒトＢ細胞培養物の電気的微量融合 表Ｖに記載の実験から得たヒトＢ細胞培養物を、１０６
Ｋ６Ｈ６Ｂ５または１０６ＰＡＩ−１ミエローマ細胞と
混合した。細胞をプロナーゼ処理し、最終的に融合培地
中に再懸濁した。融合後、９６穴培養プレート中、選択
用培地中に細胞を播種した。融合して１５日後に、培養
物をハイブリドーマ増殖について調べ、また、上清をヒ
トＩｇおよび抗風疹についてテストした。 選択実験１ ２つの別個の実験において、既に風疹に感染したヒトド
ナーの白血球を、等張性デキストラン溶液中に赤血球を
バルジさせて（ｂｕｌｇｉｎｇ ｏｕｔ）単離した。続
いて、白血球をポリスチレン培養フラスコにおいて２時
間インキュベートして、単球を除去した。更に、非付着
細胞集団３ｍｌを風疹被覆ウェルを用いてパンニングし
た（ｐａｎｎｉｎｇ）。この方法において、選択細胞
（細胞集団Ｂ）を異なる細胞濃度でＥＬ−４／Ｂ−細胞
培養物を接種するために使用した。コントロールとし
て、非付着細胞集団０．７ｍｌを、それぞれ抗−ＣＤ２
および抗−ＣＤ１６常磁性イムノビーズで処理してＴ−
およびＫ−細胞から減少させた（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）。
これらの細胞（細胞集団Ａ）をＥＬ−４／Ｂ−細胞培養
物を接種するために使用した。１１日目に、ヒト抗−風
疹抗体および総ヒトＩｇの存在についてＢ−細胞培養物
をテストした。表ＶＩＩから明らかな通り、両方の実験
においてパンニングにより抗原特異性Ｂ細胞の実質的な
濃厚化が生じた。実験Ｉにおいては５個の抗体産生Ｂ−
細胞クローンのうちの１つまでが、実験ＩＩにおいては
３つのうちの１つが抗−風疹特異性であった。さらに、
抗原特異性Ｂ−細胞の大部分はＩｇＧ産生者であること
が確認された。
造方法に係わる。１９７５年に（１）Ｋｏｈｌｅｒ及び
Ｍｉｌｓｔｅｉｎによって初めて開示されたモノクロー
ナル抗体の標準的製造方法は、感作したマウス（ｍｕｒ
ｉｎｅ）脾細胞をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の
存在下でマウス骨髄腫細胞と融合する操作を含む。しか
しながら、この方法は余り効率的ではない。通常は、骨
髄腫細胞とうまく融合して安定増殖ハイブリドーマを形
成するＢ細胞の数が、２ｘ１０５個の脾細胞で、せいぜ
い１つにすぎない。これは、細胞の９９．９９９５％が
損失されることを意味する。１９８２年に（２）、Ｚｉ
ｍｍｅｒｍａｎｎ及びその共同研究者らは、ＰＥＧ誘導
型細胞融合の効果的な代替方法として電気融合（ｅｌｅ
ｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ）を導入した。この方法はその
後、マウス及びヒトの両方に由来する抗体産生ハイブリ
ドーマの製造に関して更に研究されてきた。この方法
は、２つの細胞の膜同士の密着を交流電界（誘電泳動
（ｄｉｅｌｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ））で樹立させる
ことができるという観察に基づいている。次いで、強さ
が大きく期間が短い電界パルスに暴露すると、細胞膜は
一時的に透過性になる。この短いパルスの後で交流電界
におくと細胞は再びシールされる。密着し合った細胞は
再シールの間に細胞質ブリッジを形成し得、その結果細
胞融合が起こる。電気融合頻度は１：２０００に及ぶと
報告されている（３）。しかしながら、Ｂ細胞源として
は脾細胞しか使用できない。リンパ節細胞又は末梢血液
細胞との融合では、得られるハイブリドーマの数が余り
にも少ないか又は皆無だからである。ｉｎ ｖｉｔｒｏ
免疫又は選択実験の結果得られる限定された量の細胞に
ついても同じことが言える。モノクローナル抗体を産生
するための別の試みでは、Ｉｇ遺伝子用ＰＣＲ技術が使
用されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術
（４）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの限定されたＤＮＡフラ
グメントの特異的増幅に使用されてきた。この技術は、
増幅すべき遺伝子の各末端の領域について特異的な２つ
のプライマーからのエクステンションを何回も繰り返す
操作を含む。近年、この技術は、ハイブリドーマ細胞か
らのｍＲＮＡを出発材料として使用する再構成イムノグ
ロブリン可変遺伝子フラグメント（ｒｅａｒｒａｎｇｅ
ｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ
ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）の増幅に使用できる
ように改変されてきた（５）。Ｉｇ分子は種類が多様で
あるため、普遍的な特異的プライマーを形成することは
できない。そこでＬａｒｒｉｃｋら（６、７、８）は、
ヒトＨ鎖及びＬ鎖の既知のリーダー配列に由来するオリ
ゴヌクレオチドプライマーとヒトイムノグロブリン不変
部のＮ末端部分に対応する配列に由来するオリゴヌクレ
オチドプライマーとの縮重混合物を考案した。マウスイ
ムノグロブリンについても同じことがＢｏｅｕｆらによ
って行われた（９）。このようにすれば、任意のヒト又
はマウスイムノクロブリンに由来するＨ鎖及びＬ鎖の可
変部配列を増幅し、配列決定し且つ発現させることが可
能になる。しかしながら、哺乳動物細胞の完全Ｉｇ遺伝
子をクローニングするためのＰＣＲ技術は、多数の抗体
産生細胞系を形成するのには適していない。なぜなら、
ハイブリドーマの形成と異なり、哺乳動物細胞系におけ
るＩｇの発現は極めて複雑だからである。従って、哺乳
動物細胞系に発現する僅か数個の抗体を選択するのに、
より多くの情報が製造すべき抗体に関して必要とされ
る。Ｉｇは比較的簡単な大腸菌発現システムで発現させ
ることもできる。Ｗａｒｄら（１０）は、大腸菌中での
大きな抗原結合親和性を有するＶＨドメイン（単一ドメ
イン抗体、ｄＡｂ）の発現及び分泌について記述してい
る。より有望と思われるのは、大腸菌中でのＦｖフラグ
メントの発現である（１１、１２）。Ｓｋｅｒｒａら
（１１）は、大腸菌中に発現されたＶＨ及びＶＬが、も
との抗体と同じ親和性を有する完全機能二量体（ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｍｅｒ）Ｆｖ
にアッセンブルできると記述している。最後に述べた２
つの技術は多数の「抗体」を形成する可能性を有し、従
って選択は後の段階で、安定な「抗体」産生細菌クロー
ンについて実施し得る。興昧をひく抗体は更に操作し
て、完全抗体又は所望の性質を有する融合タンパク質、
例えば「抗体」−ＨＲＰ結合体にし得る。単細胞に由来
するＩｇコードｍＲＮＡの単離及び増幅も報告されてい
る（１３、１４）。しかしながら、ＰＣＲ技術の出発点
は通常ハイブリドーマであるためここでも融合技術と同
じ問題、特に脾細胞しか使用できないという問題が見ら
れる。抗体産生細胞を得るための更に別の試みはＢ細胞
のクローナル増加（ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏ
ｎ）である。従来のＢ細胞クローニングシステムは主と
してＬＰＳでのＢ細胞の刺激（マウスには効果があるが
ヒトＢ細胞には効かない）又は完全なクローン化された
同種反応性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ）ヘルパーＴ細
胞でのＢ細胞の刺激に基づくものであった。最近になっ
て、Ｚｕｂｌｅｒら（１５、１６、１７、１８）は、ヒ
ト及び／又はマウスＢ細胞をＴ細胞に依存せずにクロー
ン的に活性化できる培養システムを発表した。このシス
テムは、照射突然変異マウスＥＬ−４胸腺腫細胞である
ＥＬ−４／Ｂ５を、増殖源及び分化因子（ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）としてのヒトＴ細
胞／マクロファージ上清と組合わせて使用する。ＥＬ−
４／Ｂ５細胞はＭＨＣ非制限（ＭＨＣ−ｎｏｎｒｅｓｔ
ｒｉｃｔｅｄ）直接細胞−細胞相互作用を介してＢ細胞
を活性化する。活性化シグナル自体はマイトジェン性で
はないが、Ｂ細胞をヒトＴ細胞上清中に存在する１つ
（ＩＬ−２）又は複数のサイトカインに応答するように
感作する。ヒト末梢血液又は脾臓に由来するＢ細胞の９
０％が活性化され、１０日間の応答の間に抗体分泌細胞
平均数３８０の短期クローンを産生した（１５）。クロ
ーン当たりの平均Ｉｇ分泌量は４０ｎｇであり、個々の
クローンはＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ＋ＩｇＧ又
はＩｇＭ＋ＩｇＧ＋ＩｇＡ産生を示した。これは、１ｇ
クラススイッチが起きたことを意昧する。しかしなが
ら、前述の技術のいずれを使用しても、例えば動物のリ
ンパ節もしくは末梢血液のような任意の可能な源又はヒ
トに由来する源から、任意の所望の特異的モノクローナ
ル抗体を産生する安定な細胞系を得ることはできない。
リンパ節細胞又は末梢血液細胞の融合は脾臓細胞と比べ
て別の特異性、親和性又はイソタイプを有する抗体を形
成し得、従って先行技術で形成できる抗体に加えてまた
１つ有用な抗体が得られることになる。更に、末梢血液
細胞の融合は１種類の実験動物のより長い期間の免疫レ
パートリーを研究する機会も与えてくれる。動物由来の
モノクローナル抗体の他に、ヒト由来の抗体が関心を呼
んでいる。これには下記のような幾つかの理由がある： （ｉ）治療過程で、マウスモノクローナル抗体がヒト抗
マウス応答に起因して患者に有害なものとなった（１
９、２０）。ヒトモノクローナルはヒトにおいて免疫原
性を少ししか又は全く示さないと思われる。 （ｉｉ）ヒトゲノムは抗体の別のレパートリーであり
得、従って別の特異性をもつモノクローナルを形成し得
る。 （ｉｉｉ）免疫不妊（ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｅｒｔｉｌ
ｅ）ドナー、自己免疫疾患のあるドナー、又は抗腫瘍抗
体を有するドナーのような或る個体は興味深い特異性を
もつ抗体を産生する。 ヒトモノクローナル抗体の開発は近年多くの研究者によ
って報告されているが（２１、２２）、ヒトモノクロー
ナル抗体の産生における多くの間題は今日まで未解決の
ままである。ヒトモノクローナル抗体の開発における共
通の問題は、倫理的理由から免疫感作が許されていない
という点にある。そのため、単離ヒトリンパ球から製造
できるのは、天然抗原に対する抗体にほぼ限られてい
る。抗原特異的Ｂリンパ球の頻度は通常極めて低い。ヒ
トリンパ球を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫感作の実験の
結果は現在までのところ極めておそまつであり、再現性
がない（２３、２４）。これまで、ヒトモノクローナル
抗体の産生は主に下記の２つの方法にしぼられてきた： （ｉ）リンパ球と、マウス、ヒト及びマウスｘヒト由来
の骨髄腫細胞との融合、並びに （ｉｉ）エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）でのリ
ンパ球のウイルス性形質転換。 ＰＥＧ融合技術（既述）に固有の低融合頻度の他に、ヒ
トリンパ球との融合は理想的な融合相手がまだみつかっ
ていないという理由で実現が阻まれている。従って、こ
れまでに形成されたヒト抗体産生ハイブリドーマの大部
分は増殖及び抗体産生に関して不安定であることが判明
した。前述の低無限増殖性化頻度に対比して、ヒトＢリ
ンパ球はＥＢＶにより極めて効果的に無限増殖性化され
得る。しかしながら、このシステムでは、無限増殖性化
がサブセットのＢ細胞に限定され、その結果ＩｇＭクラ
スを主体とするモノクローナル抗体が形成される。更
に、ＥＢＶ形質転換細胞の一部は余り増殖せず、またＥ
ＢＶ形質転換細胞を骨髄腫細胞と融合させる試みは、得
られる細胞系の安定性に関する問題に起因してしばしば
失敗におわっている。本発明はモノクローナル抗体の製
造方法であって、ドナーからＢリンパ球を採取し、この
リンパ球をクローナル増加にかけ、得られたリンパ球を
無限増殖性にし（無眼増殖性化）、得られた細胞を培養
し、その培養培地からモノクローナル抗体を単離するこ
とからなる方法を提供する。（電気）融合又は無限増殖
性化の中間体として、細胞集団は特異的抗体産生細胞の
濃度を上げることができる。このようにすれば、１〜数
個の特異的抗体分泌Ｂ細胞からハイブリドーマを形成す
ることができる。本発明は、モノクローナル抗体の製造
方法であって、ドナーからＢリンパ球を採取し、このＢ
リンパ球をクローナル増加にかけ、増加した細胞からｍ
ＲＮＡを単離し、このｍＲＮＡを（ｃＤＮＡとして）増
幅し、このｃＤＮＡを適当な宿主中に発現させることか
らなる方法も提供する。個々のＢ細胞は、ＰＣＲ技術の
中間体として増加させ得る。この方法は、直接的ＰＣＲ
より有利である。なぜなら、（ｉ）培養上清の一部を、
操作すべき抗体に関してより多くの情報を得るために使
用し得、（ｉｉ）正確なＰＣＲプライマーセットを選択
すべくＩｇクラス（Ｈ＋Ｌ）を決定するのに上清を使用
することができ、且つ（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ単離のために
より多くの細胞を使用できるからである。この方法は、
好ましくは、クローナル増加及び無限増殖性化又は増幅
の前に抗体産生リンパ球を選択する（より好ましくは所
望の特異性を有する抗体を選択する）ステップを含む。
この選択ステップは、クローナル増加の後で行ってもよ
い。本発明の方法の重要な利点は、クローナル増加と無
限増殖性化技術との組合わせ、又は場合によっては増幅
技術及び組換ＤＮＡ法との組合わせにある。クローナル
増加技術を使用すれば、融合もしくは形質転換又はメッ
センジャーＲＮＡの単離を行うのに十分な数のＢリンパ
球を１〜数個のＢリンパ球から製造することができる。
１つのリンパ球から５００個に及ぶリンパ球を増殖させ
ることができる。従って、本発明を使用すれば、総ての
可能なリンパ球源から抗体産生細胞を製造することがで
きる。本発明の別の利点は抗体産生リンパ球を予め選択
することにある。応答の良い個体でも、所望の特異性を
有する抗体を産生できるのはリンパ球のほんの一部にす
ぎない。従って、無限増殖性化技術がより効果的になっ
たとしても、感作細胞を最適に使用するために、あるい
は電気融合、Ｂ細胞のクローナル増加又は単一のもしく
は増加したＢ細胞に関するＰＣＲ技術の結果得られる極
めて多数の上清の面倒なスクリーニングを回避するため
に、抗体産生Ｂ細胞の予選択が必要となる。パンニン
グ、ロゼッティング及び蛍光活性化細胞ソーティング
（ＦＡＣＳ）のような特異的選択技術は十分に記述され
ているが、選択した細胞を融合又は培養に使用できるか
否かについては殆ど知られていない。この点について
は、最近開発された非毒性常磁性免疫ビーズが極めて有
望と思われる。常磁性ビーズで選択した後は、ハイブリ
ドーマを首尾良くクローン化することがてき、ビーズと
細胞とを分離せずに継代培養できることが判明した（２
５）。この技術は本発明の予選択ステップとして使用す
るのに極めて適している。パンニングと称する予選択技
術も極めて有用である。 電気融合と組合わせたクロー
ナル増加は、予め選択された特異的Ｂ細胞を融合する可
能性を与える。即ち、陰性クローンを試験する労力なし
に、特異的ハイブリドーマの数を著しく増大することが
できる。その結果、所望の特性（エピトープ特異性、親
和性、クラス及びサブクラス）を有する抗体を多数の抗
体から選択することができるので、極めて特定のものを
見いだす機会が増大する。電気融合と組合わせたクロー
ナル増加を使用し、リンパ節、眼窩穿孔血液試料（ｏｒ
ｂｉｔａ ｐｕｎｃｔｉｏｎ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌ
ｅｓ）及びｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫実験から得られる少数
のリンパ球を融合することができる。Ｍｉｒｚａら（２
６）によって既に示されたように，リンパ節細胞の融合
によってより多数の感作特異的Ｂ細胞がもたらされ、従
ってより広い範囲の抗体特異性がもたらされ得る。末梢
血液リンパ球の融合は、同じ実験動物においてより長い
期間、免疫応答を追従し得るが故に更なる長所を有す
る。活性化された細胞は細胞容積が大きくなる。電気融
合においては、より大きな細胞は骨髄腫細胞と比較して
膜の破壊の電圧の差がより小さいが故に、より大きな細
胞を融合するのが好ましい。即ち、抗原刺激された親和
性成熟Ｂ細胞／血漿細胞を融合するのが好ましい。この
ことで抗体はより高い親和性となり得る。Ｂ細胞のクロ
ーナル増加及び電気融合の組合せは、単一のＢ細胞から
ハイブリドーマ細胞系を生産することのできるモノクロ
ーナル抗体産生の新規の方法を提供する。この点におい
て該方法は少なくともＩｇ遺伝子におけるＰＣＲ法に匹
敵し得る。更にこの方法は、親和性成熟抗体をもたらす
という長所を有する。ＥＬ−４／Ｂ細胞培養系は種特異
的ではないと考えられるので（マウス及びヒトＢ細胞が
増加し得る）、他の種由来のリンパ球も培養し得ること
が期待される。電気融合、Ｉｇ遺伝子におけるＰＣＲ法
及びこれらの技術とＢ細胞クローナル増加との組合せ
は、ヒトモノクローナル抗体の産生におけるＥＢＶ形質
転換の選択性の問題（主にＩｇＭ抗体）を回避する。以
下の実験のセクションにおいて本発明をより詳細に説明
する。実験 材料と方法 試薬 − 等量のダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇ
ｉｂｃｏ ０７４−２１００）及び栄養分混合物Ｆ１２
（ＨＡＭのＦ１２，Ｇｉｂｃｏ ０７４−１７００）を
混合し、この混合物に２５００ｍｇ／ｌの重炭酸ナトリ
ウム（Ｂａｋｅｒ）、５５ｍｇ／ｌのピルビン酸ナトリ
ウム（Ｆｌｕｋａ）、２．３ｍｇ／ｌの２−メルカプト
エタノール（Ｂａｋｅｒ）、１．２２ｍｇ／ｌのエタノ
ールアミン（Ｂａｋｅｒ）、３６０ｍｇ／ｌのＬ−グル
タミン（Ｍｅｒｃｋ）、４．５・１０−４ｍｇ／ｌの亜
セレン酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ）、６２．５ｍｇ／ｌ
のナトリウムペニシリン（Ｍｙｃｏｐｈａｒｍ）及び６
２．５ｍｇ／ｌのストレプトマイシン硫酸塩（Ｓｅｒｖ
ａ）を補充することにより、培養培地ＤＭＥＭ／ＨＡＭ
のＦ１２を調製した。融合実験においては、培地に更
に、１３．６１ｍｇ／ｌのヒポキサンチン（Ｆｌｕｋ
ａ）及び３．８３ｍｇ／ｌのチミジン（Ｆｌｕｋａ）を
補充した。この培地をＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２／ＨＴ
と称する。ハイブリドーマの選択は、１％のヒト膀胱癌
細胞系Ｔ２４（Ｔ２４ＣＭ）のＩｌ−６含有上清及び
０．４μＭのアミノプテリン（Ｆｌｏｗ）を補充したＤ
ＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２／ＨＴ中で行なった。 − 融合培地：２８０ｍＭ イノシトール（ＩＣＮ）、
０．１ｍＭ 酢酸カルシウム（Ｂａｋｅｒ）、０．５ｍ
Ｍ 酢酸マグネシウム（Ｂａｋｅｒ）及び１ｍＭヒスチ
ジン（Ｆｌｕｋａ）；比抵抗：１．１１・１０４Ω・ｃ
ｍ。材料をＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に溶解し、次いで伝導度
をＭｉｌｌｉ−Ｑ水または１ｍＭ酢酸カルシウム及び５
ｍＭ酢酸マグネシウムを含む溶液を用いて９０μＳ／ｃ
ｍに調整した。 − ０．５ｍｇ／ｍｌのプロナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈ
ｅｍ）をＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２中に溶解することに
よりプロナーゼ液を調製した。 − １部の１．５Ｍ ＮａＣｌを９部のパーコール（Ｐ
ｅｒｃｏｌｌ）（１００％ＳＩＰ）に加えることによ
り、パーコール密度勾配培地（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を
等浸透圧（ｉｓｏ−ｏｓｍｏｔｉｃ）にした。この等浸
透圧パーコール保存液を培養培地で希釈することによ
り、より低い密度に調整した。細胞培養 突然変異ＥＬ−４胸腺腫細胞ＥＬ−４／Ｂ５（Ｄｒ．
Ｒ．Ｚｕｂｌｅｒ，ジュネーブ，スイスからの寄贈）
を、１０％ＦＣＳ（Ｂｏｃｋｎｅｋ）を補充したＤＭＥ
Ｍ／ＨＡＭのＦ１２中で細胞濃度１・１０４〜１・１０
６細胞／ｍｌで常習的に培養した。細胞が１・１０６細
胞／ｍｌを越えて増殖すると、細胞はＢ細胞刺激活性を
失い得る。マウス骨髄腫細胞ＮＳ−１、またはキセノハ
イブリッド（ｘｅｎｏｈｙｂｒｉｄｓ）Ｋ６Ｈ６Ｂ５及
びＰＡＩ−１をそれぞれマウス及びヒトＢ細胞の融合相
手として使用した。細胞を、１０％ＦＣＳを補充したＤ
ＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２／ＨＴ中で細胞濃度５・１０４
〜１５・１０５細胞／ｍｌで常習的に培養した。融合の
１日前に培地を１：３に分割し、融合日には対数増殖相
培地を形成した。マウス脾細胞の調製 最後の免疫の後、マウスを殺し、それらの脾臓を取り出
した。細胞をＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２中に細片化し、
１６ゲージニードルによって穏やかに吸引することによ
り凝集塊を破壊した。細胞懸濁液を２０００Ｎ／ｋｇで
１０分間遠心分離し、ペレットを、０．１６Ｍ ＮＨ４
Ｃｌ及び０．０１Ｍ ＫＨＣＯ３を含む溶液中に再懸濁
し、赤血球を溶解した。細胞懸濁液を再度遠心分離し、
最終的に培地中に再懸濁した。末梢血液細胞の単離 Ｖａｎ Ｍｅｅｌ（１９８５）によって記載されたよう
に赤血球を等張デキストラン溶液中で膨潤させることに
より、ヒト白血球を単離した。次いで白血球を、１０％
ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２中に懸濁
し、ポリスチレン培養フラスコ内３７℃で１時間インキ
ュベートして単球を除去した。次いで、抗ＣＤ２モノク
ローナル抗体（Ｄｙｎａｌ １１１．０１）で被覆した
常磁性ポリスチレンビーズと一緒に２回続けてインキュ
ベートすることによりＴ細胞を除去した。ＣＤ２陽性細
胞を完全に除去するために、洗浄したイムノビーズと単
球を除去したＰＢＬとを比４０：１で混合した。ビーズ
及び細胞の混合物を、１０分ごとに穏やかに混合しなが
ら２〜４℃で３０分間インキュベートした。次いで、磁
気装置を試験管の壁に当てて保持し上清を除去すること
により、ロゼット形となった細胞を単離した。マウスＰ
ＢＬを単離するために、眼窩穿孔により１００μｌの血
液を採取し、直ぐに３０ＩＵ／ｍｌのリチウムヘパリン
を含むリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）１００μｌで希釈し
た。次いで希釈した血液を、毛細管中の７００μｌのＬ
ｙｍｐｈｏｐａｑｕｅ（Ｎｙｅｇａａｒｄ＆Ｃｏ．）上
に慎重に層状に置いた。次いで毛細管を４０００Ｎ／ｋ
ｇで３０分間遠心分離し、相間層を回収した。最後に細
胞を培養培地で２回洗浄することによる血小板を除去し
た。ヒトＴ細胞／マクロファージ上清（ＴＳＮ）の調製 新たに単離した単核細胞を２０００Ｎ／ｋｇで１０分間
遠心分離した。次いでＧｕｔｉｅｒｒｅｚら（１９７
９）によって記載された方法の改良法に従ってＢ細胞と
Ｔ細胞とを分離した。ペレットを５ｍｌの１００％ＳＩ
Ｐ中に再懸濁した。次いで１００％ＳＩＰ上に、まず１
０ｍｌの７０％ＳＩＰの層を、次いで２５ｍｌの５０％
ＳＩＰの層を置いた。勾配体を２５，０００Ｎ／ｋｇで
１０分間遠心分離した。７０％及び５０％ＳＩＰの界面
に残留したＴ細胞に富むフラクションを回収し、１０％
ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２で２回洗浄
した。洗浄した細胞を、１０％ＦＣＳ、５μｇ／ｍｌの
ＰＨＡ（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＭ
Ａ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２
中で４０〜４５時間刺激した。最後に上清を回収し、
０．２μｍ膜フィルターによって▲ろ▼過し、アリコー
トにして−７０℃で保存した。ＥＬ−４／Ｂ細胞培養液 Ｚｕｂｌｅｒら（１２〜１５）によって記載されたよう
にＥＬ−４／Ｂ細胞培養液を調製した。簡単に述べる
と、粗または精製Ｂ細胞をＴＳＮ及び５０，０００個の
放射線照射（２５００ＲＡＤ）ＥＬ−４／Ｂ５細胞と、
９６ウェルの平底組織培養プレートの最終容積２００μ
ｌの１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２
中で混合した。ＴＳＮの最適量は、各バッチに対して滴
定によって確定した。一般にヒトＢ細胞を最適に刺激す
るには１０％ＴＳＮで十分であったが、マウスＢ細胞に
は２０％ＴＳＮが必要であった。培養液が、５％ＣＯ２
及び湿度１００％として３７℃でインキュベートした。
８日目〜１２日目の間に上清の免疫グロブリン産生を試
験した。ミニ電気融合 個々のＥＬ−４／Ｂ細胞培養液の内容物を１０６個の骨
髄腫細胞と２ｍｌ遠心分離管内で混合した。ＤＭＥＭ／
ＨＡＭのＦ１２／ＨＴで１回洗浄することにより細胞か
ら血清を除いた。次いで細胞懸濁液を遠心分離し、ペレ
ットを３７℃のＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２／ＨＴ １ｍ
ｌ中に再懸濁し、１３０μｌのプロナーゼ溶液を加え
た。細胞懸濁液をプロナーゼと一緒に３分間インキュベ
ートし、次いで２００μｌのＦＣＳを加えることにより
酵素反応を停止させた。次いで細胞を融合培地で１回洗
浄し、最終容積５０μｌの融合培地中に室温で再懸濁し
た。全細胞懸濁液を融合チャンバの内部スペース内にピ
ペットで注入した。このチャンバは、パースペックス
（ｐｅｒｓｐｅｘ）ボックス内に埋め込まれた２つのス
テンレススチール製のディスク形電極からなる。電極は
厚さ０．０５ｍｍで異なる直径のテフロンスペーサによ
って分離されている。融合チャンバ内の細胞の整列は、
２ＭＨｚ及び４００Ｖ／ｃｍの交流電場を３０秒間印加
することによって誘起した。次いで直ちに、３ｋＶ／ｃ
ｍ及び継続時間１０μｓの角形高電場パルス（ｓｑｕａ
ｒｅ，ｈｉｇｈ ｆｉｅｌｄ ｐｕｌｓｅ）を与えて細
胞膜を破壊した。細胞を相互に混合し且つ膜を再封止さ
せるために交流電場を再度３０秒間印加した。最後に、
融合チャンバの内容物を２０ｍｌの選択培地に移し、９
６ウェルの微小培養プレート内で平板培養した。１４日
目に、培養液のハイブリドーマ増殖を調査し、上清の免
疫グロブリン産生を試験した。酵素イムノアッセイ ヒトＩｇの測定を、ヤギ抗ヒトＩｇ被覆プレート及びＨ
ＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇ第２抗体を使用する標準的なサ
ンドイッチＥＬＩＳＡによって行なった。マウスＩｇ
は、ヒツジ抗マウス抗体を使用する同様のＥＬＩＳＡに
よって測定した。マウス抗ＨＩＶ抗体を検出するため
に、ＨＲＰ標識ヒツジ抗マウスＩｇと組み合わせてＨＩ
Ｖウイルス溶解物で被覆したプレートを使用した。捕捉
抗体としてのヤギ抗ヒトＩｇ及びマウスモノクローナル
抗風疹ＨＲＰに結合した風疹抗原とを用いたダブルサン
ドイッチＥＬＩＳＡにおいてヒト抗風疹抗体を検出し
た。パンニング手順 ０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ＝９．６中に１〜
１０μｇの抗原を含む溶液を１ウェル当たり４ｍｌ含む
６ウェルの培養プレートを一晩インキュベートした。次
いでウェルをＰＢＳで洗浄し、パンニング実験に直接使
用するか、または−２０℃で保存した。パンニングは、
単球を除去したマウス脾細胞またはヒト単核細胞を抗原
被覆ウェルにおいて３７℃、５％ＣＯ２及び湿度１００
％で１〜２時間インキュベートすることにより行なっ
た。このインキュベーションの後、未付着の細胞をＰＢ
Ｓで３回続けて洗浄することにより穏やかに除去した。
次いで、各ウェルを、１．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ及び
０．０５％トリプシン（Ｆｌｏｗ，カタログ番号１６−
８９３−４９）を含むＰＢＳ２５０μｌ，ｐＨ７．５と
一緒に２分間インキュベートすることにより、抗原に結
合した特異的Ｂ細胞を回収した。１０％ＦＣＳを補充し
たＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２ ５ｍｌを加えることによ
りトリプシン処理を停止した。最後に、残存する付着Ｂ
細胞を機械的に除去するために、ウェルの表面全体をパ
スツールピペットを使用し培地で洗い流した。結果 ──マウスＢ細胞の不死化 独立した２つの実験において、ＥＬ−４／Ｂ細胞培養物
に、マウス脾細胞または抹消血単核細胞をウェルあたり
５０，１０もしくは２細胞の播種密度で接種した。この
培養物の上清を、マウスＢ細胞の外殖（ｏｕｔｇｒｏｗ
ｔｈ）およびマウスＩｇの存在に関して（８〜１１日目
に）テストした。表Ｉから、２脾細胞を接種した培養物
ではその約５０％で、また、２抹消血単核細胞を接種し
た培養物ではその約２０％でＢ細胞の外殖が達成された
ことが分かる。Ｂ細胞培養物中に存在するほんの少数の
Ｂ細胞から抗体産生ハイブリドーマを作ることが可能か
どうかを調べるために、１２個の各培養物をＮＳ−１ミ
エローマ細胞との電気的微量融合（ｍｉｎｉ−ｅｌｅｃ
ｔｒｏｆｕｓｉｏｎｓ）に掛けた。表ＩＩから、多数の
抗体産生ハイブリドーマが、１２のうち１１の融合実験
で生成したことが分かる。本発明者らは更に、抗原特異
的ハイブリドーマを開発することができるかどうかを調
べた。そのために、脾細胞と末梢血単核細胞を、ＨＩＶ
ウイルス溶解物を免疫したマウスから単離した。９日目
に、その培養物を細胞増殖について調べ、また、その上
清をマウス免疫グロブリンおよびマウス抗ＨＩＶについ
てＥＬＩＳＡでアッセイした。表ＩＩＩから、２脾細胞
を接種した培養物ではその５２％で、また、４末梢血細
胞を接種した培養物ではその３５％でＩｇ産生Ｂ細胞の
外殖が起ったことが分かる。これらの培養物では、抗Ｈ
ＩＶを産生するウェルは１つも見出せなかったが、より
高い播種密度で接種した培養物では、３および４個の抗
ＨＩＶ産生Ｂ細胞クローンが、それぞれ脾細胞およびＰ
ＢＬ培養物中に見出された。抗ＨＩＶ Ｂ細胞クローン
を連続増殖性ハイブリドーマ細胞系に変えるために、全
ての抗ＨＩＶ産生培養物を個々にＮＳ−１ミエローマ細
胞との電気的微量融合に掛けた。７のうち５の電気的微
量融合において、少なくとも１つの抗原特異的ハイブリ
ドーマが生成した（表ＩＶ）。２脾細胞または４ＰＢＬ
を接種した培養物中のＢ細胞クローンは、単一のＢ細胞
から派生することが予期された。従って、これらの培養
物を用いてさらに２つの電気的微量融合を行い、単一の
Ｂ細胞を接種したＢ細胞培養物から抗体産生ハイブリド
ーマを開発できるかどうかを調べた。これらの融合の結
果、それぞれ４５および７５個のＩｇ産生ハイブリドー
マが生じた（結果を示さず）。表Ｉ マウスＢ細胞の外殖 ９６穴培養プレート中、５０，０００個の被照射ＥＬ−
４／Ｂ５ヘルパー細胞および２０％ヒトＴ細胞上清の存
在中に、マウス脾細胞または末梢血リンパ球を接種し
た。８〜１１日目に、培養上清をマウスＩｇについてテ
ストした。 表ＩＩ Ｂ細胞培養物の電気的微量融合 表Ｉに記載の実験から得たマウスＢ細胞培養物を、１０
６ＮＳ−１ミエローマ細胞と混合した。細胞をプロナー
ゼ処理し、最終的に融合用培地中に懸濁した。融合後、
９６穴培養プレート中、選択用培地中に細胞を播種し
た。融合して９日後に、培養物をハイブリドーマの増殖
について調べ、また、上清をマウスＩｇについてテスト
した。 表ＩＩＩ ＥＬ−４／Ｂ細胞培養物中での抗ＨＩＶ特異
的マウスＢ細胞の外殖 ９６穴培養プレート中、５０，０００個の被照射（２５
００ラド）ＥＬ−４／Ｂ５ヘルパー細胞および２０％ヒ
トＴ細胞上清の存在中にマウス脾細胞または末梢血リン
パ球を接種した。９日目に、培養上清をマウスＩｇまた
はマウス抗ＨＩＶ抗体についてテストした。 表ＩＶ 個々の抗ＨＩＶ陽性Ｂ細胞培養物の電気的微量
融合 表ＩＩＩに記載の実験から得たマウスＢ細胞培養物を、
１０６ＮＳ−１ミエローマ細胞と混合した。細胞をプロ
ナーゼ処理し、最終的に融合用培地中に再懸濁した。融
合後、９６穴培養プレート中、選択用培地中に細胞を播
種した。融合して１３日後に、培養物をハイブリドーマ
増殖について調べ、また、上清をマウスＩｇおよびマウ
ス抗ＨＩＶについてテストした。 ──ヒトＢ細胞の不死化 過去に風疹に感染したことのある供給者から、「材料お
よび方法」の項目に記載したとおりにヒト白血球を単離
した。ＦＡＣＳ分析の結果、最終調製物はＢ細胞約１１
％、単球４％およびＴ細胞１％を含有していることが分
かった。この細胞集団を用いてＥＬ−４／Ｂ細胞培養物
に接種した。ウェルあたり８５０，２５０，２５，５０
および１０細胞（これらは、それぞれ、ウェルあたり平
均９０，２５，５，２．５および１Ｂ細胞を示す）を培
養物に播種した。接種して８日後に、１Ｂ細胞を接種し
た培養物の４３％でヒトＩｇが測定された。これらの培
養物中では抗風疹陽性クローンは１つも検出されなかっ
たが、より多い数のＢ細胞を接種した培養物中では１８
個の抗風疹陽性クローンが認められた（表Ｖ）。これら
の培養物を別々に、Ｋ６Ｈ６Ｂ５またはＰＡＩ−１ミエ
ローマ細胞との電気的微量融合に掛けた（表ＶＩ）。融
合実験の全てにおいて、多数のハイブリドーマが生成し
たが、これらのハイブリドーマのうち僅かに小数のもの
が免疫グロブリンを産生したにすぎなかった。最初に、
３つの融合において、抗風疹陽性ハイブリドーマを検出
することができた。その１つの融合からのハイブリドー
マをスケールアップし、安定な抗風疹ＩｇＧ産生細胞系
にクローニングした。もう１つの融合から、２つの抗風
疹ＩｇＭハイブリドーマが生成したが、これらもまた首
尾よくスケールアップおよびクローニングが行なわれ
た。残りの第３の融合からの抗風疹陽性クローンは見つ
け出せなかった。これらのクローンでは、おそらく、比
較的多数の非産生ハイブリドーマが過剰増殖したためで
あろう。表Ｖ ＥＬ−４／Ｂ細胞培養物中でのヒト抗風疹Ｂ細胞
の外殖 ９６穴培養プレート中、５０，０００個の被照射（２５
００ラド）ＥＬ−４／Ｂ５ヘルパー細胞および２０％ヒ
トＴ細胞上清の存在中に、単球とＴ細胞を除去したヒト
白血球を接種した。８日目に、培養上清をヒトＩｇおよ
びヒト抗風疹抗体についてテストした。 表ＶＩ 個々のヒトＢ細胞培養物の電気的微量融合 表Ｖに記載の実験から得たヒトＢ細胞培養物を、１０６
Ｋ６Ｈ６Ｂ５または１０６ＰＡＩ−１ミエローマ細胞と
混合した。細胞をプロナーゼ処理し、最終的に融合培地
中に再懸濁した。融合後、９６穴培養プレート中、選択
用培地中に細胞を播種した。融合して１５日後に、培養
物をハイブリドーマ増殖について調べ、また、上清をヒ
トＩｇおよび抗風疹についてテストした。 選択実験１ ２つの別個の実験において、既に風疹に感染したヒトド
ナーの白血球を、等張性デキストラン溶液中に赤血球を
バルジさせて（ｂｕｌｇｉｎｇ ｏｕｔ）単離した。続
いて、白血球をポリスチレン培養フラスコにおいて２時
間インキュベートして、単球を除去した。更に、非付着
細胞集団３ｍｌを風疹被覆ウェルを用いてパンニングし
た（ｐａｎｎｉｎｇ）。この方法において、選択細胞
（細胞集団Ｂ）を異なる細胞濃度でＥＬ−４／Ｂ−細胞
培養物を接種するために使用した。コントロールとし
て、非付着細胞集団０．７ｍｌを、それぞれ抗−ＣＤ２
および抗−ＣＤ１６常磁性イムノビーズで処理してＴ−
およびＫ−細胞から減少させた（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）。
これらの細胞（細胞集団Ａ）をＥＬ−４／Ｂ−細胞培養
物を接種するために使用した。１１日目に、ヒト抗−風
疹抗体および総ヒトＩｇの存在についてＢ−細胞培養物
をテストした。表ＶＩＩから明らかな通り、両方の実験
においてパンニングにより抗原特異性Ｂ細胞の実質的な
濃厚化が生じた。実験Ｉにおいては５個の抗体産生Ｂ−
細胞クローンのうちの１つまでが、実験ＩＩにおいては
３つのうちの１つが抗−風疹特異性であった。さらに、
抗原特異性Ｂ−細胞の大部分はＩｇＧ産生者であること
が確認された。
【表１】 選択実験２ サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）に対して免疫をもつチ
ンパンジーの末梢血リンパ球を、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑ
ｕｅを用いて単離した。続いて、これらのリンパ球をポ
リスチレン培養フラスコにおいて２時間インキュベート
して、単球を除去した。更に、非付着細胞集団の１２×
１０５細胞をＣＭＶ被覆ウェルを用いてパンニングし
た。この方法において、選択細胞（細胞集団Ｂ）を異な
る細胞濃度でＥＬ−４／Ｂ−細胞培養物を接種するため
に使用した。コントロールとして、非付着細胞集団の
２．４×１０５細胞を、それぞれ抗−ＣＤ２および抗−
ＣＤ１６常磁性イムノビーズで処理してＴ−およびＫ−
細胞から減少させた。これらの細胞（細胞集団Ａ）をＥ
Ｌ−４／Ｂ−細胞培養物を接種するために使用した。９
日目に、抗−ＣＭＶ抗体および総チンパンジーＩｇの存
在についてＢ−細胞培養物をテストした。表ＶＩＩＩか
ら明らかな通り、多数のＢ−細胞を接種したが、非選択
細胞（細胞集団Ａ）と共に接種したＢ−細胞培養物では
抗−ＣＭＶ陽性ウェルが認められなかった。一方、比較
的少量の選択細胞と共に接種したＢ−細胞培養物では２
つの抗−ＣＭＶ陽性ウェルが認められた。この実施例か
ら、パンニングが、少量の抗原特異性Ｂ−細胞を含む大
きな細胞集団から抗原特異性Ｂ−細胞を選択するための
非常に有用な手段であることが確認される。パンニング
を用いなければ非常に多くのサンプルをスクリーニング
しなければならない。
ンパンジーの末梢血リンパ球を、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑ
ｕｅを用いて単離した。続いて、これらのリンパ球をポ
リスチレン培養フラスコにおいて２時間インキュベート
して、単球を除去した。更に、非付着細胞集団の１２×
１０５細胞をＣＭＶ被覆ウェルを用いてパンニングし
た。この方法において、選択細胞（細胞集団Ｂ）を異な
る細胞濃度でＥＬ−４／Ｂ−細胞培養物を接種するため
に使用した。コントロールとして、非付着細胞集団の
２．４×１０５細胞を、それぞれ抗−ＣＤ２および抗−
ＣＤ１６常磁性イムノビーズで処理してＴ−およびＫ−
細胞から減少させた。これらの細胞（細胞集団Ａ）をＥ
Ｌ−４／Ｂ−細胞培養物を接種するために使用した。９
日目に、抗−ＣＭＶ抗体および総チンパンジーＩｇの存
在についてＢ−細胞培養物をテストした。表ＶＩＩＩか
ら明らかな通り、多数のＢ−細胞を接種したが、非選択
細胞（細胞集団Ａ）と共に接種したＢ−細胞培養物では
抗−ＣＭＶ陽性ウェルが認められなかった。一方、比較
的少量の選択細胞と共に接種したＢ−細胞培養物では２
つの抗−ＣＭＶ陽性ウェルが認められた。この実施例か
ら、パンニングが、少量の抗原特異性Ｂ−細胞を含む大
きな細胞集団から抗原特異性Ｂ−細胞を選択するための
非常に有用な手段であることが確認される。パンニング
を用いなければ非常に多くのサンプルをスクリーニング
しなければならない。
【表２】 選択実験３ １１週前に一次ＣＭＶ感染したヒトドナーの末梢血リン
パ球を、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅを用いて単離した。
続いて、リンパ球をポリスチレン培養フラスコにおいて
１晩インキュベートして、単球を除去した。更に、非付
着細胞集団の１８×１０５細胞をＣＭＶ被覆ウェルを用
いてパンニングした。この方法において、選択細胞（細
胞集団Ｂ）を異なる細胞濃度でＥＬ−４／Ｂ−細胞培養
物を接種するために使用した。コントロールとして、４
×１０５個の単球減少細胞を、それぞれ抗−ＣＤ２およ
び抗−ＣＤ１６常磁性イムノビーズで処理してＴ−およ
びＫ−細胞から減少させた。これらの細胞（細胞集団
Ａ）をＥＬ−４／Ｂ−細胞培養物を接種するために使用
した。９日目に、抗−ＣＭＶ抗体および総ヒトＩｇの存
在についてＢ−細胞培養物をテストした。表ＩＸから明
らかな通り、パンニングにより抗原特異性Ｂ−細胞の実
質的な濃厚化が生じた。バンニング後、２つの抗体産生
Ｂ−細胞クローンのうちの１つまでが抗−ＣＭＶ特異性
であった。また、表ＩＸから明らかな通り、抗原特異性
Ｂ−細胞の大部分はＩｇＧ産生者であった。
パ球を、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅを用いて単離した。
続いて、リンパ球をポリスチレン培養フラスコにおいて
１晩インキュベートして、単球を除去した。更に、非付
着細胞集団の１８×１０５細胞をＣＭＶ被覆ウェルを用
いてパンニングした。この方法において、選択細胞（細
胞集団Ｂ）を異なる細胞濃度でＥＬ−４／Ｂ−細胞培養
物を接種するために使用した。コントロールとして、４
×１０５個の単球減少細胞を、それぞれ抗−ＣＤ２およ
び抗−ＣＤ１６常磁性イムノビーズで処理してＴ−およ
びＫ−細胞から減少させた。これらの細胞（細胞集団
Ａ）をＥＬ−４／Ｂ−細胞培養物を接種するために使用
した。９日目に、抗−ＣＭＶ抗体および総ヒトＩｇの存
在についてＢ−細胞培養物をテストした。表ＩＸから明
らかな通り、パンニングにより抗原特異性Ｂ−細胞の実
質的な濃厚化が生じた。バンニング後、２つの抗体産生
Ｂ−細胞クローンのうちの１つまでが抗−ＣＭＶ特異性
であった。また、表ＩＸから明らかな通り、抗原特異性
Ｂ−細胞の大部分はＩｇＧ産生者であった。
【表３】 選択実施例４ ＨＩＶウィルス溶解物で免疫したマウスから脾臓細胞を
前記のように単離した。次いで、単球を除去する目的
で、これらりの脾臓細胞をポリスチレン培養フラスコ内
で１．５時間インキュベートした。次に、１７５×１０
５の非付着細胞を５つのＨＩＶウィルス溶解物被覆ウェ
ル上のパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）へかけた。この方法
において、選択細胞（細胞集団Ｂ）をＥＬ−４／Ｂ細胞
培養物を接種する為に用いた。対照ＥＬ−４／Ｂ細胞培
養物は非選択で単球が減らされている脾臓細胞（細胞集
団Ａ）と共に接種した。９日目に、抗ＨＩＶ抗体及び全
マウスＩｇの存在につきＢ細胞培養物をテストした。表
Ｘによると、非選択細胞と共に接種されたＢ細胞培養物
には抗原特異的Ｂ細胞クローンは見出せなかったのに対
し、選択細胞と共に接種した培養物には６つの抗原特異
的Ｂ細胞クローンが見出された。
前記のように単離した。次いで、単球を除去する目的
で、これらりの脾臓細胞をポリスチレン培養フラスコ内
で１．５時間インキュベートした。次に、１７５×１０
５の非付着細胞を５つのＨＩＶウィルス溶解物被覆ウェ
ル上のパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）へかけた。この方法
において、選択細胞（細胞集団Ｂ）をＥＬ−４／Ｂ細胞
培養物を接種する為に用いた。対照ＥＬ−４／Ｂ細胞培
養物は非選択で単球が減らされている脾臓細胞（細胞集
団Ａ）と共に接種した。９日目に、抗ＨＩＶ抗体及び全
マウスＩｇの存在につきＢ細胞培養物をテストした。表
Ｘによると、非選択細胞と共に接種されたＢ細胞培養物
には抗原特異的Ｂ細胞クローンは見出せなかったのに対
し、選択細胞と共に接種した培養物には６つの抗原特異
的Ｂ細胞クローンが見出された。
【表４】 選択実施例５ ヒトＺＰ３に対するモノクローナル抗体を生起させる為
に、組換え融合タンパクβＧＡＬ−ＺＰ３でマウスを免
疫した。βＧＡＬの有する強い免疫原性故に、βＧＡＬ
に対する応答は大きく、ＺＰ３に対する応答は非常に弱
かった。この為、非常に多数の非選択脾臓細胞との電気
融合からたった１つの抗ＺＰ３モノクローナル抗体しか
得ることができなかった。この実施例においては、抗β
ＧＡＬ産生Ｂ細胞の大多数はまずβＧＡＬ被覆ウェル上
への吸収によって除去された。次いで、βＧＡＬ−ＺＰ
３被覆ウェル上でのパニングを行ない、抗ＺＰ３産生Ｂ
細胞を選択した。最後に、選択した細胞をＥＬ−４／Ｂ
細胞培養物中で増加させ、ＮＳ−１ミエローマ細胞との
ミニ電気融合によって不死化した。組換えβＧＡＬ−Ｚ
Ｐ３で免疫したマウスから脾臓細胞を前記のように単離
した。次いで、単球を除去する目的で、これらの脾臓細
胞をポリスチレン培養フラスコ内で１．５時間インキュ
ベートした。次に１７×１０６の非付着細胞を４つのβ
ＧＡＬ被覆ウェル上で３７℃、５％ＣＯ２及び１００％
湿度下で１．５時間インキュベートした。その後、非接
着細胞を４つのβＧＡＬ−ＺＰ３被覆ウェル上のパニン
グ（ｐａｎｎｉｎｇ）へかけた。この方法において、選
択細胞（細胞集団Ｂ）をＥＬ−４／Ｂ細胞培養物を接種
する他に用いた。対照ＥＬ−４／Ｂ細胞培養物は非選択
で単球が減らされている脾臓細胞（細胞集団Ａ）と共に
接種した。８日目に、抗βＧＡＬ抗体、抗βＧＡＬ−Ｚ
Ｐ３抗体及び全マウスＩｇの存在につきＢ細胞培養物を
テストした。表ＸＩによると、抗βＧＡＬ産生Ｂ細胞の
吸収にも拘わらず、選択細胞中にまだ多数の抗βＧＡＬ
陽性Ｂ細胞クローンが見出された。しかしながら、βＧ
ＡＬとβＧＡＬ−ＺＰ３を識別する抗体を産生する２つ
のＢ細胞培養物も存在した。
に、組換え融合タンパクβＧＡＬ−ＺＰ３でマウスを免
疫した。βＧＡＬの有する強い免疫原性故に、βＧＡＬ
に対する応答は大きく、ＺＰ３に対する応答は非常に弱
かった。この為、非常に多数の非選択脾臓細胞との電気
融合からたった１つの抗ＺＰ３モノクローナル抗体しか
得ることができなかった。この実施例においては、抗β
ＧＡＬ産生Ｂ細胞の大多数はまずβＧＡＬ被覆ウェル上
への吸収によって除去された。次いで、βＧＡＬ−ＺＰ
３被覆ウェル上でのパニングを行ない、抗ＺＰ３産生Ｂ
細胞を選択した。最後に、選択した細胞をＥＬ−４／Ｂ
細胞培養物中で増加させ、ＮＳ−１ミエローマ細胞との
ミニ電気融合によって不死化した。組換えβＧＡＬ−Ｚ
Ｐ３で免疫したマウスから脾臓細胞を前記のように単離
した。次いで、単球を除去する目的で、これらの脾臓細
胞をポリスチレン培養フラスコ内で１．５時間インキュ
ベートした。次に１７×１０６の非付着細胞を４つのβ
ＧＡＬ被覆ウェル上で３７℃、５％ＣＯ２及び１００％
湿度下で１．５時間インキュベートした。その後、非接
着細胞を４つのβＧＡＬ−ＺＰ３被覆ウェル上のパニン
グ（ｐａｎｎｉｎｇ）へかけた。この方法において、選
択細胞（細胞集団Ｂ）をＥＬ−４／Ｂ細胞培養物を接種
する他に用いた。対照ＥＬ−４／Ｂ細胞培養物は非選択
で単球が減らされている脾臓細胞（細胞集団Ａ）と共に
接種した。８日目に、抗βＧＡＬ抗体、抗βＧＡＬ−Ｚ
Ｐ３抗体及び全マウスＩｇの存在につきＢ細胞培養物を
テストした。表ＸＩによると、抗βＧＡＬ産生Ｂ細胞の
吸収にも拘わらず、選択細胞中にまだ多数の抗βＧＡＬ
陽性Ｂ細胞クローンが見出された。しかしながら、βＧ
ＡＬとβＧＡＬ−ＺＰ３を識別する抗体を産生する２つ
のＢ細胞培養物も存在した。
【表５】 ６つの抗βＧＡＬ陽性Ｂ細胞クローンとβＧＡＬ−ＺＰ
３及びβＧＡＬを識別する２つのクローンを１０６個の
ＮＳ−１細胞とのミニ電気融合に供した。この融合８日
後に、抗βＧＡＬ抗体及び抗βＧＡＬ−ＺＰ３抗体の産
生につきハイブリドーマ培養物をテストした。表ＸＩＩ
が示すように、Ｂ細胞のすべてを特異抗体産生ハイブリ
ドーマに転換させることに成功した。更に、１つの融合
では、βＧＡＬ−ＺＰ３を認識するが、βＧＡＬは認識
しない２つのハイブリドーマが更に得られた。
３及びβＧＡＬを識別する２つのクローンを１０６個の
ＮＳ−１細胞とのミニ電気融合に供した。この融合８日
後に、抗βＧＡＬ抗体及び抗βＧＡＬ−ＺＰ３抗体の産
生につきハイブリドーマ培養物をテストした。表ＸＩＩ
が示すように、Ｂ細胞のすべてを特異抗体産生ハイブリ
ドーマに転換させることに成功した。更に、１つの融合
では、βＧＡＬ−ＺＰ３を認識するが、βＧＡＬは認識
しない２つのハイブリドーマが更に得られた。
【表６】 検討 限界希釈試験によって、脾臓及び末梢血由来のマウスＢ
細胞がＥＬ−４／Ｂ５ヘルパー細胞及びヒトＴ細胞上清
と共に培養すると非常に効率の良い外殖（ｏｕｔｇｒｏ
ｗｔｈ）をすることが示された。粗脾臓細胞集団からの
２つの程の少ない細胞で接種された培養物の４０〜６０
％でマウスＩｇ産生が見出された。マウスＰＢＬで接種
された培養物に於いては、約半分の量のＩｇ産生が見ら
れ、このことは末梢血中のＢ細胞の割合が低いことと一
致する。１つのＢ細胞から由来したと考えられるこのよ
うなＢ細胞培養物をミニ電気融合することによって、常
に多数の抗体産生ハイブリドーマが得られた。この方法
は、マウス抗ＨＩＶ産生ハイブリドーマの生成について
首尾良く応用できた。１０個の脾臓細胞又は２０個のＰ
ＢＬで接種した培養において、マウス抗ＨＩＶ産生Ｂ細
胞を増加させた。７つの抗ＨＩＶ産生培養物のうちの５
つが抗ＨＩＶ産生ハイブリドーマに転換された。２つの
ものについてそれが失敗した原因は、多分、オリゴクロ
ーン状に増殖したＢ細胞培養物に於いて非特異的Ｂ細胞
が大多数存在したことによるものと思われる。不幸なこ
とに、２個の脾臓細胞又は４個のＰＢＬで接種したクロ
ーナル増加のＢ細胞培養物からは抗ＨＩＶ産生クローン
は得ることができなかった。４個のＰＢＬの場合には、
培養に用いたウェルの数に比較して、使用した粗細胞集
団中の抗原特異的Ｂ細胞の数が少ないことによるかも知
れない。効率の高さだけでなく、特にマウスＰＢＬ又は
リンパ節からの少数のリンパ球を使用することができる
という可能性によって、この方法はマウスＭＡｂの開発
にとって新たな次元を切り開くものである。リンパ節細
胞の融合によって、より多数の感作特異Ｂ細胞と抗体特
異性のより広いスペクトラムが得られることは、すでに
Ｍｉｒｚａ等（１９８７）が以前に示した通りである。
眼嵩小腔から得られたＰＢＬの融合によって、非常に長
期間に亘って同じ動物について、モノクローナルレベル
での免疫応答のモーターリングが可能になる。Ｂ細胞培
養系はヒトＢ細胞の増加についても使用することができ
るので（Ｗｅｎ等，１９８７；Ｚｕｂｌｅｒ等，１９８
７；Ｓｔｒａｕｂ及びＺｕｂｌｅｒ，１９８９；Ｚｈａ
ｎｇ等，１９９０）、本発明の新規な方法がヒトＭＡｂ
の開発に応用出来るか否か調べた。Ｂ細胞の外殖がまた
もや非常に効率の良いものであることが判明した。個々
のＢ細胞培養物のミニ電気融合の結果、多数のハイブリ
ドーマが得られたが、そのうちの僅かなものしかＩｇ産
生ではなかった。このことは、ヒトＢ細胞と異種ハイブ
リッド融合パートナー（Ｋ６Ｈ６Ｂ５及びＰＡＩ−１）
とから形成されたハイブリドーマの安定性が悪いことに
依るかも知れない。しかしながら、この原因に依るので
はないことを示す幾つかの徴候がある。我々の実験室に
於ける他の実験によれば、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞及び異
種ハイブリッドからのハイブリドーマの多数は３ケ月以
上に亘って安定な抗体産生細胞であることが明らかとな
った。更に、約１１％のＢ細胞を含む細胞集団をウェル
当り１０個で接種したＢ細胞培養物の顕微鏡検査によれ
ば、これらウェルに於ける細胞増殖はＩｇ産生と非常に
相関が良いという訳ではないことが判明した。幾つかの
培養物については多数の細胞増加が見られたがＩｇ産生
は観察されなかったのに対し、他の培養物においてはＥ
Ｌ−４／Ｂ５ヘルパー細胞間に認められる細胞は殆んど
ないもにも拘わらず有意な量のＩｇが測定された。明ら
かに、Ｂ細胞クローンのサイズは小さく、他の細胞、例
えばＮＫ細胞及び科存するＴ細胞がＢ細胞培養系の中で
増殖した。このことが、多数の非産生ハイブリドーマ
（Ｂ細胞以外の細胞からのハイブリドーマ）の出現の原
因かも知れない。この新規な方法に於いて、マウスＢ細
胞と比較してヒトＢ細胞に対する不死化効率が低いのに
も拘わらず、１８個しかない抗原特異的細胞クローンか
らの２つの異なるヒト抗風疹抗体産生ハイブリドーマが
生成された。現在、ミニ電気泳動からの少なくとも少数
ではあるが抗原特異的ハイブリドーマを保証し得るレベ
ルまでクローンサイズを大きくすべく、Ｂ細胞培養系を
最適化している。ここに記載された方法は、ヒトＭＡｂ
の生成に対する魅力的な代替方法と考えられる。この方
法は効率が高い為に古典的なハイブリドーマ技術より優
れており、ヒト提供者から得られる数少ないリンパ球の
使用を可能にするものである。更に、陽性選択操作で残
った数少ない特異リンパ球を処理し、陰性ハイブリドー
マの煩雑なスクリーニングをしなくても済ませることが
できる。更にまた、この方法におけるＢ細胞の不死化
は、Ｂ細胞のサブセットに限定されるものではなく、そ
れ故に、ＥＢＶ形質転換技術に較べてより多数のＴｇＧ
産生細胞系を得ることができる。下記の文献は明細書中
に引用されたものである：
細胞がＥＬ−４／Ｂ５ヘルパー細胞及びヒトＴ細胞上清
と共に培養すると非常に効率の良い外殖（ｏｕｔｇｒｏ
ｗｔｈ）をすることが示された。粗脾臓細胞集団からの
２つの程の少ない細胞で接種された培養物の４０〜６０
％でマウスＩｇ産生が見出された。マウスＰＢＬで接種
された培養物に於いては、約半分の量のＩｇ産生が見ら
れ、このことは末梢血中のＢ細胞の割合が低いことと一
致する。１つのＢ細胞から由来したと考えられるこのよ
うなＢ細胞培養物をミニ電気融合することによって、常
に多数の抗体産生ハイブリドーマが得られた。この方法
は、マウス抗ＨＩＶ産生ハイブリドーマの生成について
首尾良く応用できた。１０個の脾臓細胞又は２０個のＰ
ＢＬで接種した培養において、マウス抗ＨＩＶ産生Ｂ細
胞を増加させた。７つの抗ＨＩＶ産生培養物のうちの５
つが抗ＨＩＶ産生ハイブリドーマに転換された。２つの
ものについてそれが失敗した原因は、多分、オリゴクロ
ーン状に増殖したＢ細胞培養物に於いて非特異的Ｂ細胞
が大多数存在したことによるものと思われる。不幸なこ
とに、２個の脾臓細胞又は４個のＰＢＬで接種したクロ
ーナル増加のＢ細胞培養物からは抗ＨＩＶ産生クローン
は得ることができなかった。４個のＰＢＬの場合には、
培養に用いたウェルの数に比較して、使用した粗細胞集
団中の抗原特異的Ｂ細胞の数が少ないことによるかも知
れない。効率の高さだけでなく、特にマウスＰＢＬ又は
リンパ節からの少数のリンパ球を使用することができる
という可能性によって、この方法はマウスＭＡｂの開発
にとって新たな次元を切り開くものである。リンパ節細
胞の融合によって、より多数の感作特異Ｂ細胞と抗体特
異性のより広いスペクトラムが得られることは、すでに
Ｍｉｒｚａ等（１９８７）が以前に示した通りである。
眼嵩小腔から得られたＰＢＬの融合によって、非常に長
期間に亘って同じ動物について、モノクローナルレベル
での免疫応答のモーターリングが可能になる。Ｂ細胞培
養系はヒトＢ細胞の増加についても使用することができ
るので（Ｗｅｎ等，１９８７；Ｚｕｂｌｅｒ等，１９８
７；Ｓｔｒａｕｂ及びＺｕｂｌｅｒ，１９８９；Ｚｈａ
ｎｇ等，１９９０）、本発明の新規な方法がヒトＭＡｂ
の開発に応用出来るか否か調べた。Ｂ細胞の外殖がまた
もや非常に効率の良いものであることが判明した。個々
のＢ細胞培養物のミニ電気融合の結果、多数のハイブリ
ドーマが得られたが、そのうちの僅かなものしかＩｇ産
生ではなかった。このことは、ヒトＢ細胞と異種ハイブ
リッド融合パートナー（Ｋ６Ｈ６Ｂ５及びＰＡＩ−１）
とから形成されたハイブリドーマの安定性が悪いことに
依るかも知れない。しかしながら、この原因に依るので
はないことを示す幾つかの徴候がある。我々の実験室に
於ける他の実験によれば、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞及び異
種ハイブリッドからのハイブリドーマの多数は３ケ月以
上に亘って安定な抗体産生細胞であることが明らかとな
った。更に、約１１％のＢ細胞を含む細胞集団をウェル
当り１０個で接種したＢ細胞培養物の顕微鏡検査によれ
ば、これらウェルに於ける細胞増殖はＩｇ産生と非常に
相関が良いという訳ではないことが判明した。幾つかの
培養物については多数の細胞増加が見られたがＩｇ産生
は観察されなかったのに対し、他の培養物においてはＥ
Ｌ−４／Ｂ５ヘルパー細胞間に認められる細胞は殆んど
ないもにも拘わらず有意な量のＩｇが測定された。明ら
かに、Ｂ細胞クローンのサイズは小さく、他の細胞、例
えばＮＫ細胞及び科存するＴ細胞がＢ細胞培養系の中で
増殖した。このことが、多数の非産生ハイブリドーマ
（Ｂ細胞以外の細胞からのハイブリドーマ）の出現の原
因かも知れない。この新規な方法に於いて、マウスＢ細
胞と比較してヒトＢ細胞に対する不死化効率が低いのに
も拘わらず、１８個しかない抗原特異的細胞クローンか
らの２つの異なるヒト抗風疹抗体産生ハイブリドーマが
生成された。現在、ミニ電気泳動からの少なくとも少数
ではあるが抗原特異的ハイブリドーマを保証し得るレベ
ルまでクローンサイズを大きくすべく、Ｂ細胞培養系を
最適化している。ここに記載された方法は、ヒトＭＡｂ
の生成に対する魅力的な代替方法と考えられる。この方
法は効率が高い為に古典的なハイブリドーマ技術より優
れており、ヒト提供者から得られる数少ないリンパ球の
使用を可能にするものである。更に、陽性選択操作で残
った数少ない特異リンパ球を処理し、陰性ハイブリドー
マの煩雑なスクリーニングをしなくても済ませることが
できる。更にまた、この方法におけるＢ細胞の不死化
は、Ｂ細胞のサブセットに限定されるものではなく、そ
れ故に、ＥＢＶ形質転換技術に較べてより多数のＴｇＧ
産生細胞系を得ることができる。下記の文献は明細書中
に引用されたものである：
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 15/07 15/13 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Claims (14)
- 【請求項１】ドナーからＢリンパ球を採取し、このＢリ
ンパ球をクローナル増加にかけ、増加したＢリンパ球を
無限増殖性にし、これらのＢリンパ球を培養し、その培
養培地から抗体を単離することからなるモノクローナル
抗体製造方法。 - 【請求項２】クローナル増加の前に、所望の特異性をも
つ抗体を産生するＢリンパ球を選択することを特徴とす
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】クローナル増加の後で、所望の特異性をも
つ抗体を産生するＢリンパ球を選択することを特徴とす
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】無限増殖性にする操作を、適当な融合相手
との電気融合によって行うことを特徴とする請求項１か
ら３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】クローナル増加を、ヘルパーＴ細胞でのＢ
リンパ球の刺激によって達成することを特徴とする請求
項１から４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】クローナル増加を、ＬＰＳでのＢリンパ球
の刺激によって達成することを特徴とする請求項１から
４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】クローナル増加を、照射胸腺腫細胞でのＢ
リンパ胸腺の刺激によって達成することを特徴とする請
求項１から４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項８】クローナル増加を、マウスＥＬ−４／Ｂ５
胸腺腫細胞でのＢリンパ球の刺激によって達成すること
を特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】クローナル増加を、ヒトＴ細胞／マクロフ
ァージ上清と組合わせたマウスＥＬ−４／Ｂ５胸腺腫細
胞でのＢリンパ球の刺激によって達成することを特徴と
する請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】１種類以上のインターロイキンを胸腺腫
細胞と組合わせて使用することを特徴とする請求項７又
は８に記載の方法。 - 【請求項１１】ドナーからＢリンパ球を採取し、所望の
特異性をもつ抗体を産生するＢリンパ球を選択し、その
Ｂリンパ球をクローナル増加にかけ、このＢリンパ球か
らｍＲＮＡを単離し、逆転写酵素を用いてこのｍＲＮＡ
からＤＮＡを転写し、そのＤＮＡを適当な増幅処理にか
け、得られたＤＮＡを適当なベクター中にクローニング
し、そのＤＮＡを適当な宿主中に発現させることからな
るモノクローナル抗体製造方法。 - 【請求項１２】ドナーからＢリンパ球を採取し、そのＢ
リンパ球をクローナル増加にかけ、所望の特異性を有す
る抗体を産生するＢリンパ球を選択し、このＢリンパ球
からｍＲＮＡを単離し、逆転写酵素を用いてこのｍＲＮ
ＡからＤＮＡを転写し、そのＤＮＡを適当な増幅処理に
かけ、得られたＤＮＡを適当なベクター中にクローニン
グし、そのＤＮＡを適当な宿主中に発現させることから
なるモノクローナル抗体製造方法。 - 【請求項１３】イムノグロブリンのＨ鎖及びＬ鎖のリー
ダー配列に由来するオリゴヌクレオチドプライマーとヒ
トイムノグロブリン不変部のＮ末端部分に対応する配列
に由来するオリゴヌクレオチドプライマーとの縮重混合
物を増幅で使用することを特徴とする請求項１１又は１
２に記載の方法。 - 【請求項１４】Ｂリンパ球がヒトＢリンパ球であること
を特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP90203124 | 1990-11-26 | ||
| NL90203124.4 | 1990-11-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0576383A true JPH0576383A (ja) | 1993-03-30 |
| JP3392883B2 JP3392883B2 (ja) | 2003-03-31 |
Family
ID=8205174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35543691A Expired - Lifetime JP3392883B2 (ja) | 1990-11-26 | 1991-11-26 | 抗体製造方法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0488470B1 (ja) |
| JP (1) | JP3392883B2 (ja) |
| KR (1) | KR100223381B1 (ja) |
| AT (1) | ATE153695T1 (ja) |
| AU (1) | AU646108B2 (ja) |
| CA (1) | CA2056102C (ja) |
| DE (1) | DE69126281T2 (ja) |
| DK (1) | DK0488470T3 (ja) |
| ES (1) | ES2103770T3 (ja) |
| GR (1) | GR3024487T3 (ja) |
| NZ (1) | NZ240748A (ja) |
| ZA (1) | ZA919299B (ja) |
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| JP2019513368A (ja) * | 2016-03-30 | 2019-05-30 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | Ｂ細胞培養法 |
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| EP1056858B1 (en) | 1998-02-19 | 2004-12-08 | Eastern Virginia Medical School | RECOMBINANT ACTIVE HUMAN ZONA PELLUCIDA PROTEIN 3 (hZP3) |
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