JPH0578320B2 - - Google Patents
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- JPH0578320B2 JPH0578320B2 JP60187555A JP18755585A JPH0578320B2 JP H0578320 B2 JPH0578320 B2 JP H0578320B2 JP 60187555 A JP60187555 A JP 60187555A JP 18755585 A JP18755585 A JP 18755585A JP H0578320 B2 JPH0578320 B2 JP H0578320B2
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- nucleic acid
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J43/00—Normal steroids having a nitrogen-containing hetero ring spiro-condensed or not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
- C07J43/003—Normal steroids having a nitrogen-containing hetero ring spiro-condensed or not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton not condensed
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Description
産業上の利用分野
本発明は、新規な誘導体化核酸配列、その製法
ならびに相補的核酸配列を用いる核酸の検出およ
び確認方法に関する。 従来の技術 核酸配列は通常、検出可能な基で標識された相
補的核酸配列を用いるハイブリツト形成により検
出される。これまで、この標識づけは放射性同位
元素を有する基の導入により行なわれる。放射性
物質を用いる作業および放射性同位元素の検出
は、著しい欠点（安全予防措置、装置費用）を伴
なうので、ハイブリツト形成試験のために他の標
識剤を使用することが何度か試みられた。 西ドイツ国特許出願公開第2915082号明細書か
ら、核酸配列の検出のため、この核酸配列を、相
補的核酸を含有しかつハイブリツド形成反応の前
または後に酵素に結合することにより化学的に変
性されている、指示薬を用いてハイブリツド形成
させる、核酸配列の検出法が公知である。この方
法は主に、以前から公知のアビジン−ビオチン相
互作用によるものである。このために、核酸配列
の検出のために使用される相補的核酸配列はアビ
ジンないしはビオチンを用いて標識される。次い
で、ハイブリツド形成工程後、標識剤としての酵
素で置換されているビオチンないしはアビジンと
反応させる。最後に、ハイブリツド形成生成物の
検出は、標識酵素の酵素活性の測定により行なわ
れる。この方法は、ビオチンがほぼ全ての生物学
的材料中に出現するので、これが非常に妨害され
やすいという欠点を有する。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、ハイブリツド形成試験のため
に抗原−抗体反応を利用することであつた。この
ためのこれまでの努力は、明らかに、核酸配列
を、確実にかつ、十分な収率で、適当な抗原ない
しは抗体で標識することが可能でなかつたために
失敗した。 問題点を解決するための手段 この課題は、、免疫反応のパートナーで標識さ
れている誘導体化された核酸配列を製造すること
により解決される。この免疫学的方法は、必要な
試薬が非常に安定であり、反応工程が定義された
方法で急速におよび十分完全に進行し、環境汚染
が公知の放射線方法におけるよりも著しくわずか
でありかつ本発明による試験のための費用が、公
知方法におけるよりも著しく低いという利点を有
する。 従つて、本発明の対象は、一般式： Ｘ−Ａ−Ｍ （） ［式中Ｘは基Ｎ−またはＮ−Ｒ−N′Hを
表わし、その際Ｎ原子は核塩基のアミン窒素原子
であり、Ｒはヘテロ原子がその基中に挿入されて
いてもよい直鎖または分枝低級アルキレン基を表
わし、 Ａは共有結合の形成下にアミノ官能基と反応し
うる二官能性架橋員を表わし、 Ｍは免疫反応のパートナーを表わす］で示され
る構成要素１つまたは若干を有する、誘導体化さ
れた核酸配列ならびにその製法である。 免疫反応のパートナーＭとしては、全ての可能
な抗原およびハプテンならびに相当する抗体が使
用できる。表現“抗体”は、完全な抗体も、その
断片も表わす。抗体は多クローン形でも、単クロ
ーン形でも使用できる。特別な実施例では、核酸
配列を抗原ないしはハプテンと結合させ、その際
ハプテンは殊にジゴキシン、T3およびT4が特に
有利である。ハプテンとしては、これが固相と非
特異性結合をする傾向が僅かであるので、特に親
水性ハプテン、たとえばジゴキシンが使用され
る。 架橋員Ａは、窒素原子を介して核酸塩基に結合
されている。後述するように、核酸塩基、たとえ
ばシトシンまたはグアノシンは、架橋員と直接反
応されうる(a)か、または先ず重亜硫酸塩の存在で
ポリアミンと反応して変性されてから架橋員と反
応される(b)。すなわち例えば原則としては次のよ
うな反応が起りうる：
ならびに相補的核酸配列を用いる核酸の検出およ
び確認方法に関する。 従来の技術 核酸配列は通常、検出可能な基で標識された相
補的核酸配列を用いるハイブリツト形成により検
出される。これまで、この標識づけは放射性同位
元素を有する基の導入により行なわれる。放射性
物質を用いる作業および放射性同位元素の検出
は、著しい欠点（安全予防措置、装置費用）を伴
なうので、ハイブリツト形成試験のために他の標
識剤を使用することが何度か試みられた。 西ドイツ国特許出願公開第2915082号明細書か
ら、核酸配列の検出のため、この核酸配列を、相
補的核酸を含有しかつハイブリツド形成反応の前
または後に酵素に結合することにより化学的に変
性されている、指示薬を用いてハイブリツド形成
させる、核酸配列の検出法が公知である。この方
法は主に、以前から公知のアビジン−ビオチン相
互作用によるものである。このために、核酸配列
の検出のために使用される相補的核酸配列はアビ
ジンないしはビオチンを用いて標識される。次い
で、ハイブリツド形成工程後、標識剤としての酵
素で置換されているビオチンないしはアビジンと
反応させる。最後に、ハイブリツド形成生成物の
検出は、標識酵素の酵素活性の測定により行なわ
れる。この方法は、ビオチンがほぼ全ての生物学
的材料中に出現するので、これが非常に妨害され
やすいという欠点を有する。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、ハイブリツド形成試験のため
に抗原−抗体反応を利用することであつた。この
ためのこれまでの努力は、明らかに、核酸配列
を、確実にかつ、十分な収率で、適当な抗原ない
しは抗体で標識することが可能でなかつたために
失敗した。 問題点を解決するための手段 この課題は、、免疫反応のパートナーで標識さ
れている誘導体化された核酸配列を製造すること
により解決される。この免疫学的方法は、必要な
試薬が非常に安定であり、反応工程が定義された
方法で急速におよび十分完全に進行し、環境汚染
が公知の放射線方法におけるよりも著しくわずか
でありかつ本発明による試験のための費用が、公
知方法におけるよりも著しく低いという利点を有
する。 従つて、本発明の対象は、一般式： Ｘ−Ａ−Ｍ （） ［式中Ｘは基Ｎ−またはＮ−Ｒ−N′Hを
表わし、その際Ｎ原子は核塩基のアミン窒素原子
であり、Ｒはヘテロ原子がその基中に挿入されて
いてもよい直鎖または分枝低級アルキレン基を表
わし、 Ａは共有結合の形成下にアミノ官能基と反応し
うる二官能性架橋員を表わし、 Ｍは免疫反応のパートナーを表わす］で示され
る構成要素１つまたは若干を有する、誘導体化さ
れた核酸配列ならびにその製法である。 免疫反応のパートナーＭとしては、全ての可能
な抗原およびハプテンならびに相当する抗体が使
用できる。表現“抗体”は、完全な抗体も、その
断片も表わす。抗体は多クローン形でも、単クロ
ーン形でも使用できる。特別な実施例では、核酸
配列を抗原ないしはハプテンと結合させ、その際
ハプテンは殊にジゴキシン、T3およびT4が特に
有利である。ハプテンとしては、これが固相と非
特異性結合をする傾向が僅かであるので、特に親
水性ハプテン、たとえばジゴキシンが使用され
る。 架橋員Ａは、窒素原子を介して核酸塩基に結合
されている。後述するように、核酸塩基、たとえ
ばシトシンまたはグアノシンは、架橋員と直接反
応されうる(a)か、または先ず重亜硫酸塩の存在で
ポリアミンと反応して変性されてから架橋員と反
応される(b)。すなわち例えば原則としては次のよ
うな反応が起りうる：
【化】
【式】
【化】
架橋員Ａとしては、免疫反応のパートナーと核
酸配列とを、パートナーの免疫活性に影響を与え
ないように結合するのに適している、全ての化学
的原子団が適している。この種の架橋員は疎水性
であつてはならず、むしろ親水性特性を有するべ
きである。本発明によれば、特にジアルデヒド、
たとえばグルタルジアルデヒド、ジカルボン酸な
らびにその誘導体、たとえばジアミド、ジエステ
ルおよび二無水物のような二官能性基またはこの
ような基の２つまたはそれより多くの組合せが適
している。さらに架橋員は、完全なペプチド、ペ
プチド断片からまたはペプチド結合を有する原子
団から構成されているペプチド鎖から成つていて
もよい。オリゴサツカリドも架橋員として好適で
ある。たとえばジゴキシンを免疫反応のパートナ
ーとして使用する場合には、既にジゴキシンのト
リサツカリド残基が適当な架橋を表わす。 置換基Ｒの定義における、直鎖または分枝の低
級アルキレン基は、特に１〜10、特に有利に３〜
５の炭素原子を有する。プロピレン鎖が、とくに
有利である。アルキレン基Ｒ中に挿入されうるヘ
テロ原子は、たとえば酸素原子、窒素原子および
硫黄原子である。 免疫反応のパートナーＭは、架橋員Ａを介し
て、核酸塩基のアミノ基と結合している。シトシ
ンおよびグアノシンは、たとえば容易に本発明に
よる方法で置換できる、アミノ基を有する核酸塩
基である。 一般式の本発明による核酸配列の製法は、１
つまたは若干の原子団Ｘ−Ｈを有する核酸を含有
する核酸配列を、一般式： Ｙ−Ａ−Ｍ （） ［式中Ｙは反応性の、アミノ基と反応する基を
表わし、 Ａは共有結合の形成下にアミノ官能基と反応し
うる二官能性架橋員を表わし、 Ｍは免疫反応のパートナーを表わす］の化合物
と、HYの脱離下に反応させることを特徴とす
る。 Ｘが基Ｎ−Ｒ−N′Hを表わす、一般式の
化合物は特に、アミノ基を有する１つまたは若干
の核酸塩基を含有する核酸配列を、最初に一般式
： H2Ｎ−Ｒ−N′H2 （） ［式中Ｒは上述のものを表わす］のポリアミン
と、重亜硫酸塩陰イオンの存在で反応させ、得ら
れる一般式： Ｎ−Ｒ−N′H2 （） ［式中Ｒは上述のものを表わす］の１つまたは
若干の構成成分を有する核酸を、一般式： Ｙ−Ａ−Ｍ ［式中Ｙは反応性の、アミノ基と反応する基を
表わし、 Ａは共有結合の形成下にアミノ官能基と反応し
うる二官能性架橋員を表わし、 Ｍは免疫反応のパートナーを表わす］の化合物
と反応させることを特徴とする方法により製造さ
れる。 反応性基Ｙとしては、特に一般的に、アミノ基
と、共有結合の形成下に反応しうる反応性基が適
している。ｏ−スクシンイミド基が特に適してい
る。 ポリマーの核酸の誘導体化を達成するために
は、核酸塩基、特にシトシンおよびグアノシンの
アミノ基の求核試薬が使用される。反応は、この
種の求核置換反応に常用の条件下に行なわれる。
置換は、統計的に、使用される核酸のシトシン−
およびグアノシン基で行なわれる。 この反応の際、シトシン環における末端位アミ
ノ基は部分的芳香族基よりも高い収率で反応す
る。この反応は、文献に多数記載されている、モ
ノ−ヌクレオチドの相当する反応と比較しうる。
反応条件も、記載された反応と同様に選択され
る。 アミノ基を有する１つまたは若干の核酸塩基を
含有する核酸配列、ならびに１つまたは若干の一
般式の構成要素を有する変性核酸は、免疫反応
の化学的に活性化されたパートナーと反応させ
る。このためには、免疫反応のパートナーを架橋
員Ａと結合し、基Ｙを導入することにより化学的
に活性化する。 このように製造された核酸誘導体は、相補的核
酸配列を有する核酸の検出のために特に好適であ
る。この種の試験は、ウイルスおよび細菌の検出
のために、または遺伝素質の研究の際にも重要で
ある。このために、検出すべき、相補的核酸ない
し核酸配列を含有する試料を、本発明による相応
する核酸誘導体と接触させ、その際生じるハイブ
リツド形成生成物を免疫反応の、標識されたパー
トナーと反応させ、標識を自体公知の方法で測定
する。 従つて、相補的核酸配列を有する核酸を検出す
るために、本発明による誘導体化された核酸配列
を使用し、検出すべき核酸ないしは核酸配列を有
する溶液を、本発明による誘導体化された相補的
核酸誘導体を含有する溶液と接触させ、非ハイブ
リツド形成成分を核酸ハイブリツドから分離し、
免疫反応の他の標識されたパートナーの免疫反応
を実施し、得られるハイブリツド形成生成物中に
存在する標識を測定することも本発明の範囲内で
ある。 試料中での本発明により誘導体化された核酸配
列および相補的核酸の間の本来のハイブリツド形
成工程は公知方法により行なわれる。固相ハイブ
リツド形成が特に有利である。このために、検出
すべき核酸を、固相に固着させる。場合により二
重鎖として存在する核酸は、自体公知の方法で、
個々の鎖に分割しなければならない。固相として
は、原則的に全ての核酸結合材料が適している。
通常ニトロセルロース膜が使用される。 固着工程のために、公知方法が使用される。固
相の特別な選択、非免疫血清および精製された画
分による凝集阻止、清浄剤を用いる洗浄工程およ
び類似のそれ自体常用の工程を特別に選択するこ
とにより、固相に対する免疫反応の他の標識され
たパートナーの非特異結合を阻止するか、ないし
は十分に制限することが試みられる。 抗原および抗体の複合体形成も、自体公知の方
法により行なわれる。原則的に、このために、全
ての可能な公知方法を適用することが可能であ
る。 標識剤として、原則的に全ての常用の標識剤、
たとえば放射性同位元素、発光性基ならびに酵素
を使用することができる。標識として、酵素の使
用が特に有利である。このような指示酵素は、既
に免疫学的測定方法から公知である。ペルオキシ
ダーゼ、アルカリ性ホスフアターゼおよびβ−ガ
ラクトシダーゼが特に有利である。 標識の測定は、ハイブリツド形成を行なつた後
に実施することができる。標識剤の選択に応じ
て、当業者には多数の方法が利用できる。酵素を
指示薬として使用する場合には、その検出のため
に、常用の基質が使用される。 本発明により誘導体化された核酸配列を使用し
非常に鋭敏な方法で核酸を検出することができ
る。検出反応を公知の斑点ハイブリツド形成
（Tuepfel−Hybridisierung）の形で実施する場
合、検出限界はDNAに対しほぼ5Pｇ／斑点
（Fleck）ないしはRNAに対しほぼ200Pｇ／斑点
である。これは、たとえば感染されたトマト葉を
試験する場合、細胞あたりバイロイド分子20個の
敏感性に相当する。 本発明を次の実施例により詳述する。 実施例 例 １ 単一鎖DNAと活性化エステルとの直接反応 標識すべきDNA、たとえばプラスミドDNA5
mgを、制限酵素を用いて切断することにより、線
形化し、95℃に10分間加熱し、引続きエタノー
ル／ドライアイス中で急冷することにより変性す
る。DNAを、エタノールで沈殿させ、次いで
0.1M炭酸水素ナトリウムに採取する。その際濃
度は約１mg／mlであるべきである。 このようなDNA溶液50μに、ジメチルホル
ムアミド74μ、ジゴキシン−グルタリル−Ｏ−
スクシンイミド−エステル10μ（ジメチルホル
ムアミド中μあたり20μｇ）を加える。この反
応混合物を、４℃で２時間、時々振とうしながら
保温する。その後、1/10量の20％酢酸カリウム溶
液を添加し、エタノールで沈殿させる。未反応の
スクシンイミドエステルを、第二のエタノール沈
殿により分離する。標識されたDNAを緩衝溶液
（トリス10mモル、EDTA1mモル、PH8.0）にと
り、2μｇ／μの濃度にする。軽く混濁した懸
濁液が生じる。収率は、使用されたDNAに対し、
約85％である。 例 ２ 変性DNAと活性化エステルとの反応 DNAにより大きな標準密度を得るために、シ
トシンのアミノ基を、シヤピロ（Shapiro）およ
びバイスグラス（Weisgras）の方法［“バイオケ
ミカル アンド バイオフイジカル リサーチ
コミユニケーシヨンズ（Biochem.and Biophys.
Research Commun.）”、第40巻、（1970年）、第
839〜843ページ］により、重亜硫酸塩触媒反応下
に脂肪族アミノ基に変換する。 線状にされたプラスミド−DNA5mgを、95℃に
10分間加熱し、エタノール／ドライアイス中で急
冷することにより変性し、直ちに、新たに製造さ
れた亜硫酸塩反応溶液に対し、室温で２×３時間
透析する（４−モルホリン−エタンスルホン酸
（MES）19.5ｇ、37％亜硫酸水素ナトリウム溶液
214.6ml、ジアミノプロパン249.9mlを発煙塩酸で
PH6.2に調節し、１にし；引続きヒドロキノン
0.55ｇを添加する）。透析物を60℃で90時間保温
する。引続き、トリス10ミリモルに対し、PH8.0
でEDTA／ミリモルを透析し、DANを溶液から
エタノールにより沈殿させる。 このようにして変性されたDNAを、例１に記
載されたように、活性化されたジゴキシン−グル
タリル−Ｏ−スクシンイミド−エステルと反応さ
せる。最終生成物は、軽度に混濁した懸濁液であ
る。収率は、使用されたDNAに対し、約80％で
ある。 例 ３ 制限酵素を用いるプラスミド切断後の断片混合物
中のプラスミドDNAの検出 方法ａ： プラスミドpBR322の、種々の大きい割合を有
する、種々のプラスミドの制限断片を、電気泳動
により分離し、ニトロセルロースフイルター上に
公知方法［“ジヤーナル オブ モレキユラー
バイオロジー（J.Mol.Biol）”、第94巻（1975年）
第51〜69ページ］で捕集する。このようにして得
られた調製物を、例２によりジゴキシンで標識さ
れているpBR322DNAでハイブリツド形成する。
10％−標識ヒツジ血清を加え、引続きペルオキシ
ダーゼ10mU／mlと複合された抗ジゴキシン−抗
体を保温する。最後に、ペルオキシダーゼ活性
は、テトラメチルベンチジンで可視化する。 pBR322と相補的配列を有する、ような制限断
片だけが陽に反応する。500〜4000塩基対の範囲
内の断片を検出することができた。 方法ｂ： 方法ａにより得られた制限断片を、直接ゲルで
［T.M.シニツク（Shinnick）その他、“ヌクレイ
ツク アシツド リサーチ（Nucleic Acid
Research）”、第２巻（1975年）第1911ページ］、
例２によりジゴキシンで標識されている
pBR322DNAでハイブリツド形成する。10％標
準−ヒツジ血清の添加後、100mU／mlペルオキ
シダーゼ複合抗ジゴキシン抗体を保温する。ペル
オキシダーゼ活性を、テトラメチルベンチジンで
可視化する。 こうして、同時に、特異的にpBR322に対し相
補的帯を確認することができた。検出感度は、約
200Pｇ／帯である。検出は、塩基対100〜8000の
範囲内で可能であつた。 結果の記録は、乾燥されたゲルを、ペルオキシ
ダーゼ検出系のゼラチン層上に保存することによ
り達成することができる。 例 ４ 細菌コロニー中の特異的DNAの検出 種々のエシエリキア コリ（Escherichia
Coli）菌株をタウブ（Taub）およびトンプソン
（Thompson）の方法［“アナリテイカル バイオ
ケミストリー（Analyt.Biochem）”第126巻
（1982年）、第222〜230ページ］により濾紙上に準
備し、例２によりジゴキシンで標識されている、
pBR322DNAでハイブリツド形成する。ハイブ
リツド形成条件および洗浄工程は、抗体検出に最
適であつた。抗ジゴキシン−抗体−ペルオキシダ
ーゼ−複合体（10mU／ml）を保温し、およびテ
トラメチルベンチジンゼラチン上に可視化した
後、pBR322を含有する細菌は、青着色により、
プラスミドを含有しないものと区別することがで
きた。ここでも、結果は、着色された濾紙の写真
撮影ないしは保存により記録することができる。 例 ５ トマト／じやがいもにおけるPSTV（ポテト−ス
ピンドル−チユーバー−バイロイド）−感染の検
出 トマト−ないしはじやがいも葉またはじやがい
も根瘤ないしは−皮を緩衝液中で均質化する（ウ
ルトラテユラツクス（Ultraturrax）、塩化ナト
リウム３モル、クエン酸ナトリウム300ミリモル、
ジエチルジチオカルバメート30ミリモル、０。１
％トライトン；濃度0.1ｇ／ml）。遠心分離および
濾過後、デオキシリボヌクレアーゼおよび引続き
プロテイナーゼＫと共に保温し、希釈後、エタノ
ールで沈殿させる。エタノール沈殿物を、2M塩
化リチウムで採取し、新たにエタノールで沈殿さ
せる。このペレツトを、ジエチルチオカルバメー
トおよびトライドンなしの抽出緩衝液に採取し、
濾過によりニトロセルロース上に設ける。このよ
うにして得られた調製物を、PSTVの完全な配列
を含有し、例２によりジゴキシンで標識されてい
るプラスミドDNA pAV 401でハイブリツト形
成する。10％標準ヒツジ血清を添加し、引続き抗
ジゴキシン−抗体−β−ガラクトシダーゼ複合体
と共に保温する。PSTV感染試料の可視化は、β
−ガラクトシダーゼ基質（クロルフエノールロー
ト−ガラクトシド）と共に保温により行なう。結
果は、カラー写真を用いて記録することができ
る。 記載された方法で、トマトおよびじやがいもに
おけるPSTV感染を、32P標識されたプラスミド
−DNAを用いるオウエンス（Owens）の方法
［サイエンス（Science）213（1981年）、第670〜
672ページ］に相当する感度で検出することがで
きる。
酸配列とを、パートナーの免疫活性に影響を与え
ないように結合するのに適している、全ての化学
的原子団が適している。この種の架橋員は疎水性
であつてはならず、むしろ親水性特性を有するべ
きである。本発明によれば、特にジアルデヒド、
たとえばグルタルジアルデヒド、ジカルボン酸な
らびにその誘導体、たとえばジアミド、ジエステ
ルおよび二無水物のような二官能性基またはこの
ような基の２つまたはそれより多くの組合せが適
している。さらに架橋員は、完全なペプチド、ペ
プチド断片からまたはペプチド結合を有する原子
団から構成されているペプチド鎖から成つていて
もよい。オリゴサツカリドも架橋員として好適で
ある。たとえばジゴキシンを免疫反応のパートナ
ーとして使用する場合には、既にジゴキシンのト
リサツカリド残基が適当な架橋を表わす。 置換基Ｒの定義における、直鎖または分枝の低
級アルキレン基は、特に１〜10、特に有利に３〜
５の炭素原子を有する。プロピレン鎖が、とくに
有利である。アルキレン基Ｒ中に挿入されうるヘ
テロ原子は、たとえば酸素原子、窒素原子および
硫黄原子である。 免疫反応のパートナーＭは、架橋員Ａを介し
て、核酸塩基のアミノ基と結合している。シトシ
ンおよびグアノシンは、たとえば容易に本発明に
よる方法で置換できる、アミノ基を有する核酸塩
基である。 一般式の本発明による核酸配列の製法は、１
つまたは若干の原子団Ｘ−Ｈを有する核酸を含有
する核酸配列を、一般式： Ｙ−Ａ−Ｍ （） ［式中Ｙは反応性の、アミノ基と反応する基を
表わし、 Ａは共有結合の形成下にアミノ官能基と反応し
うる二官能性架橋員を表わし、 Ｍは免疫反応のパートナーを表わす］の化合物
と、HYの脱離下に反応させることを特徴とす
る。 Ｘが基Ｎ−Ｒ−N′Hを表わす、一般式の
化合物は特に、アミノ基を有する１つまたは若干
の核酸塩基を含有する核酸配列を、最初に一般式
： H2Ｎ−Ｒ−N′H2 （） ［式中Ｒは上述のものを表わす］のポリアミン
と、重亜硫酸塩陰イオンの存在で反応させ、得ら
れる一般式： Ｎ−Ｒ−N′H2 （） ［式中Ｒは上述のものを表わす］の１つまたは
若干の構成成分を有する核酸を、一般式： Ｙ−Ａ−Ｍ ［式中Ｙは反応性の、アミノ基と反応する基を
表わし、 Ａは共有結合の形成下にアミノ官能基と反応し
うる二官能性架橋員を表わし、 Ｍは免疫反応のパートナーを表わす］の化合物
と反応させることを特徴とする方法により製造さ
れる。 反応性基Ｙとしては、特に一般的に、アミノ基
と、共有結合の形成下に反応しうる反応性基が適
している。ｏ−スクシンイミド基が特に適してい
る。 ポリマーの核酸の誘導体化を達成するために
は、核酸塩基、特にシトシンおよびグアノシンの
アミノ基の求核試薬が使用される。反応は、この
種の求核置換反応に常用の条件下に行なわれる。
置換は、統計的に、使用される核酸のシトシン−
およびグアノシン基で行なわれる。 この反応の際、シトシン環における末端位アミ
ノ基は部分的芳香族基よりも高い収率で反応す
る。この反応は、文献に多数記載されている、モ
ノ−ヌクレオチドの相当する反応と比較しうる。
反応条件も、記載された反応と同様に選択され
る。 アミノ基を有する１つまたは若干の核酸塩基を
含有する核酸配列、ならびに１つまたは若干の一
般式の構成要素を有する変性核酸は、免疫反応
の化学的に活性化されたパートナーと反応させ
る。このためには、免疫反応のパートナーを架橋
員Ａと結合し、基Ｙを導入することにより化学的
に活性化する。 このように製造された核酸誘導体は、相補的核
酸配列を有する核酸の検出のために特に好適であ
る。この種の試験は、ウイルスおよび細菌の検出
のために、または遺伝素質の研究の際にも重要で
ある。このために、検出すべき、相補的核酸ない
し核酸配列を含有する試料を、本発明による相応
する核酸誘導体と接触させ、その際生じるハイブ
リツド形成生成物を免疫反応の、標識されたパー
トナーと反応させ、標識を自体公知の方法で測定
する。 従つて、相補的核酸配列を有する核酸を検出す
るために、本発明による誘導体化された核酸配列
を使用し、検出すべき核酸ないしは核酸配列を有
する溶液を、本発明による誘導体化された相補的
核酸誘導体を含有する溶液と接触させ、非ハイブ
リツド形成成分を核酸ハイブリツドから分離し、
免疫反応の他の標識されたパートナーの免疫反応
を実施し、得られるハイブリツド形成生成物中に
存在する標識を測定することも本発明の範囲内で
ある。 試料中での本発明により誘導体化された核酸配
列および相補的核酸の間の本来のハイブリツド形
成工程は公知方法により行なわれる。固相ハイブ
リツド形成が特に有利である。このために、検出
すべき核酸を、固相に固着させる。場合により二
重鎖として存在する核酸は、自体公知の方法で、
個々の鎖に分割しなければならない。固相として
は、原則的に全ての核酸結合材料が適している。
通常ニトロセルロース膜が使用される。 固着工程のために、公知方法が使用される。固
相の特別な選択、非免疫血清および精製された画
分による凝集阻止、清浄剤を用いる洗浄工程およ
び類似のそれ自体常用の工程を特別に選択するこ
とにより、固相に対する免疫反応の他の標識され
たパートナーの非特異結合を阻止するか、ないし
は十分に制限することが試みられる。 抗原および抗体の複合体形成も、自体公知の方
法により行なわれる。原則的に、このために、全
ての可能な公知方法を適用することが可能であ
る。 標識剤として、原則的に全ての常用の標識剤、
たとえば放射性同位元素、発光性基ならびに酵素
を使用することができる。標識として、酵素の使
用が特に有利である。このような指示酵素は、既
に免疫学的測定方法から公知である。ペルオキシ
ダーゼ、アルカリ性ホスフアターゼおよびβ−ガ
ラクトシダーゼが特に有利である。 標識の測定は、ハイブリツド形成を行なつた後
に実施することができる。標識剤の選択に応じ
て、当業者には多数の方法が利用できる。酵素を
指示薬として使用する場合には、その検出のため
に、常用の基質が使用される。 本発明により誘導体化された核酸配列を使用し
非常に鋭敏な方法で核酸を検出することができ
る。検出反応を公知の斑点ハイブリツド形成
（Tuepfel−Hybridisierung）の形で実施する場
合、検出限界はDNAに対しほぼ5Pｇ／斑点
（Fleck）ないしはRNAに対しほぼ200Pｇ／斑点
である。これは、たとえば感染されたトマト葉を
試験する場合、細胞あたりバイロイド分子20個の
敏感性に相当する。 本発明を次の実施例により詳述する。 実施例 例 １ 単一鎖DNAと活性化エステルとの直接反応 標識すべきDNA、たとえばプラスミドDNA5
mgを、制限酵素を用いて切断することにより、線
形化し、95℃に10分間加熱し、引続きエタノー
ル／ドライアイス中で急冷することにより変性す
る。DNAを、エタノールで沈殿させ、次いで
0.1M炭酸水素ナトリウムに採取する。その際濃
度は約１mg／mlであるべきである。 このようなDNA溶液50μに、ジメチルホル
ムアミド74μ、ジゴキシン−グルタリル−Ｏ−
スクシンイミド−エステル10μ（ジメチルホル
ムアミド中μあたり20μｇ）を加える。この反
応混合物を、４℃で２時間、時々振とうしながら
保温する。その後、1/10量の20％酢酸カリウム溶
液を添加し、エタノールで沈殿させる。未反応の
スクシンイミドエステルを、第二のエタノール沈
殿により分離する。標識されたDNAを緩衝溶液
（トリス10mモル、EDTA1mモル、PH8.0）にと
り、2μｇ／μの濃度にする。軽く混濁した懸
濁液が生じる。収率は、使用されたDNAに対し、
約85％である。 例 ２ 変性DNAと活性化エステルとの反応 DNAにより大きな標準密度を得るために、シ
トシンのアミノ基を、シヤピロ（Shapiro）およ
びバイスグラス（Weisgras）の方法［“バイオケ
ミカル アンド バイオフイジカル リサーチ
コミユニケーシヨンズ（Biochem.and Biophys.
Research Commun.）”、第40巻、（1970年）、第
839〜843ページ］により、重亜硫酸塩触媒反応下
に脂肪族アミノ基に変換する。 線状にされたプラスミド−DNA5mgを、95℃に
10分間加熱し、エタノール／ドライアイス中で急
冷することにより変性し、直ちに、新たに製造さ
れた亜硫酸塩反応溶液に対し、室温で２×３時間
透析する（４−モルホリン−エタンスルホン酸
（MES）19.5ｇ、37％亜硫酸水素ナトリウム溶液
214.6ml、ジアミノプロパン249.9mlを発煙塩酸で
PH6.2に調節し、１にし；引続きヒドロキノン
0.55ｇを添加する）。透析物を60℃で90時間保温
する。引続き、トリス10ミリモルに対し、PH8.0
でEDTA／ミリモルを透析し、DANを溶液から
エタノールにより沈殿させる。 このようにして変性されたDNAを、例１に記
載されたように、活性化されたジゴキシン−グル
タリル−Ｏ−スクシンイミド−エステルと反応さ
せる。最終生成物は、軽度に混濁した懸濁液であ
る。収率は、使用されたDNAに対し、約80％で
ある。 例 ３ 制限酵素を用いるプラスミド切断後の断片混合物
中のプラスミドDNAの検出 方法ａ： プラスミドpBR322の、種々の大きい割合を有
する、種々のプラスミドの制限断片を、電気泳動
により分離し、ニトロセルロースフイルター上に
公知方法［“ジヤーナル オブ モレキユラー
バイオロジー（J.Mol.Biol）”、第94巻（1975年）
第51〜69ページ］で捕集する。このようにして得
られた調製物を、例２によりジゴキシンで標識さ
れているpBR322DNAでハイブリツド形成する。
10％−標識ヒツジ血清を加え、引続きペルオキシ
ダーゼ10mU／mlと複合された抗ジゴキシン−抗
体を保温する。最後に、ペルオキシダーゼ活性
は、テトラメチルベンチジンで可視化する。 pBR322と相補的配列を有する、ような制限断
片だけが陽に反応する。500〜4000塩基対の範囲
内の断片を検出することができた。 方法ｂ： 方法ａにより得られた制限断片を、直接ゲルで
［T.M.シニツク（Shinnick）その他、“ヌクレイ
ツク アシツド リサーチ（Nucleic Acid
Research）”、第２巻（1975年）第1911ページ］、
例２によりジゴキシンで標識されている
pBR322DNAでハイブリツド形成する。10％標
準−ヒツジ血清の添加後、100mU／mlペルオキ
シダーゼ複合抗ジゴキシン抗体を保温する。ペル
オキシダーゼ活性を、テトラメチルベンチジンで
可視化する。 こうして、同時に、特異的にpBR322に対し相
補的帯を確認することができた。検出感度は、約
200Pｇ／帯である。検出は、塩基対100〜8000の
範囲内で可能であつた。 結果の記録は、乾燥されたゲルを、ペルオキシ
ダーゼ検出系のゼラチン層上に保存することによ
り達成することができる。 例 ４ 細菌コロニー中の特異的DNAの検出 種々のエシエリキア コリ（Escherichia
Coli）菌株をタウブ（Taub）およびトンプソン
（Thompson）の方法［“アナリテイカル バイオ
ケミストリー（Analyt.Biochem）”第126巻
（1982年）、第222〜230ページ］により濾紙上に準
備し、例２によりジゴキシンで標識されている、
pBR322DNAでハイブリツド形成する。ハイブ
リツド形成条件および洗浄工程は、抗体検出に最
適であつた。抗ジゴキシン−抗体−ペルオキシダ
ーゼ−複合体（10mU／ml）を保温し、およびテ
トラメチルベンチジンゼラチン上に可視化した
後、pBR322を含有する細菌は、青着色により、
プラスミドを含有しないものと区別することがで
きた。ここでも、結果は、着色された濾紙の写真
撮影ないしは保存により記録することができる。 例 ５ トマト／じやがいもにおけるPSTV（ポテト−ス
ピンドル−チユーバー−バイロイド）−感染の検
出 トマト−ないしはじやがいも葉またはじやがい
も根瘤ないしは−皮を緩衝液中で均質化する（ウ
ルトラテユラツクス（Ultraturrax）、塩化ナト
リウム３モル、クエン酸ナトリウム300ミリモル、
ジエチルジチオカルバメート30ミリモル、０。１
％トライトン；濃度0.1ｇ／ml）。遠心分離および
濾過後、デオキシリボヌクレアーゼおよび引続き
プロテイナーゼＫと共に保温し、希釈後、エタノ
ールで沈殿させる。エタノール沈殿物を、2M塩
化リチウムで採取し、新たにエタノールで沈殿さ
せる。このペレツトを、ジエチルチオカルバメー
トおよびトライドンなしの抽出緩衝液に採取し、
濾過によりニトロセルロース上に設ける。このよ
うにして得られた調製物を、PSTVの完全な配列
を含有し、例２によりジゴキシンで標識されてい
るプラスミドDNA pAV 401でハイブリツト形
成する。10％標準ヒツジ血清を添加し、引続き抗
ジゴキシン−抗体−β−ガラクトシダーゼ複合体
と共に保温する。PSTV感染試料の可視化は、β
−ガラクトシダーゼ基質（クロルフエノールロー
ト−ガラクトシド）と共に保温により行なう。結
果は、カラー写真を用いて記録することができ
る。 記載された方法で、トマトおよびじやがいもに
おけるPSTV感染を、32P標識されたプラスミド
−DNAを用いるオウエンス（Owens）の方法
［サイエンス（Science）213（1981年）、第670〜
672ページ］に相当する感度で検出することがで
きる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式：Ｘ−Ａ−Ｍ ［式中Ｘは基Ｎ−またはＮ−Ｒ−N′Hを
表わし、その際Ｎ原子は核酸塩基のアミン窒素原
子を表わし、Ｒはヘテロ原子がその基中に挿入さ
れていてもよい直鎖または分枝低級アルキレン基
を表わし、 Ａは共有結合の形成下にアミノ官能基と反応し
うる二官能性架橋員を表わし、 Ｍは免疫反応のパートナーを表わす］で示され
る構成要素１つまたは若干を有することを特徴と
する、誘導体化された核酸配列。 ２ 免疫反応のパートナーとして、抗原、ハプテ
ンまたは抗体を使用する、特許請求の範囲第１項
記載の核酸配列。 ３ ハプテンとして、ジゴキシン、T3またはT4
を使用する、特許請求の範囲第２項記載の核酸配
列。 ４ 架橋員Ａとして、グルタリル基を使用する、
特許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか
１項記載の核酸配列。 ５ 一般式：Ｘ−Ａ−Ｍ ［式中Ｘは基Ｎ−またはＮ−Ｒ−N′Hを
表わし、その際Ｎ原子は核酸塩基のアミン窒素原
子を表わし、Ｒはヘテロ原子がその基中に挿入さ
れていてもよい、直鎖または分枝低級アルキレン
基を表わし、 Ａは共有結合の形成下にアミノ官能基と反応し
うる二官能性架橋員を表わし、 Ｍは免疫反応のパートナーを表わす］で示され
る構成成分１つまたは若干を有する核酸配列の製
法において、基Ｘ−Ｈを有する１つまたは若干核
酸塩基を有する核酸配列を、一般式： Ｙ−Ａ−Ｍ ［式中Ｙは反応性の、アミノ基と反応する基を
表わし、 Ａは共有結合の形成下にアミノ官能基と反応し
うる二官能性架橋員を表わし、 Ｍは免疫反応のパートナーを表わす］ の化合物と、HYの脱離下に反応させることを特
徴とする、核酸配列の製法。 ６ 一般式：Ｘ−Ａ−Ｍ ［式中Ｘは基Ｎ−またはＮ−Ｒ−N′Hを
表わし、その際Ｎ原子は核酸塩基のアミン窒素原
子を表わし、Ｒはヘテロ原子がその基中に挿入さ
れていてもよい直鎖または分枝低級アルキレン基
を表わし、 Ａは共有結合の形成下にアミノ官能基と反応し
うる二官能性架橋員を表わし、 Ｍは免疫反応のパートナーを表わす］で示され
る構成成分１つまたは若干を有する核酸配列の製
法において、アミノ基を有する１つまたは若干の
核酸塩基を有する核酸配列を、最初に一般式： H2Ｎ−Ｒ−N′H2 （） ［式中Ｒは上述のものを表わす］のポリアミン
と、重亜硫酸塩陰イオンの存在で反応させ、得ら
れる一般式： Ｎ−Ｒ−N′H2 （） ［式中Ｒは上述のものを表わす］の１つまたは
若干の構成成分を有する核酸を、一般式： Ｙ−Ａ−Ｍ （） ［式中Ｙは反応性の、アミノ基と反応する基を
表わし、 Ａは共有結合の形成下にアミノ官能基と反応し
うる二官能性架橋員を表わし、 Ｍは免疫反応のパートナーを表わす］の化合物
と反応させることを特徴とする、核酸配列の製
法。 ７ 標識を有する、探究される配列に対し相補的
核酸配列を用いるハイブリツト形成による核酸な
いし核酸配列の測定および標識の検出法におい
て、探される配列に対し相補的核酸配列として、
一般式： ： Ｘ−Ａ−Ｍ ［式中Ｘは基Ｎ−またはＮ−Ｒ−N′Hを
表わし、その際Ｎ原子は核酸塩基のアミン窒素原
子を表わし、Ｒはヘテロ原子がその基中に挿入さ
れていてもよい直鎖または分枝低級アルキレン基
を表わし、 Ａは共有結合の形成下にアミノ官能基と反応し
うる二官能性架橋員を表わし、 Ｍは免疫反応のパートナーを表わす］で示され
る構成要素１つまたは若干を有する、免疫反応の
パートナーで誘導体化された核酸配列を使用し、
ハイブリツト形成生成物を、検出可能な標識を有
する免疫反応の他のパートナーと反応させること
を特徴とする、核酸ないしは核酸配列の検出法。 ８ 検出可能な標識が酵素標識である、特許請求
の範囲第７項記載の方法。 ９ 標識酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリ
性ホスフアターゼまたはβ−ガラクトシダーゼを
使用する、特許請求の範囲第９項記載の方法。
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