JPH0578355A

JPH0578355A - Ｂ−１０１５化合物

Info

Publication number: JPH0578355A
Application number: JP23913891A
Authority: JP
Inventors: Masatoshi Inukai; 正俊犬飼; Fujio Isono; 藤男磯野; Hideyuki Shiozawa; 秀幸塩澤; Hideji Takahashi; 秀次高橋; Hideyuki Haruyama; 英幸春山; Kentaro Kodama; 健太郎小玉; Yoshiaki Sakaida; 義陽境田
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1991-09-19
Filing date: 1991-09-19
Publication date: 1993-03-30

Abstract

(57)【要約】【構成】式（Ｉ）【化３】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗菌作用を有する B-101
5 化合物およびその製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、微生物からピラゾロピリジン骨格
を有する化合物は得られていない。わずかに、アルカリ
ジェネス属［Alcaligenes sp.（UC91252 ）］の細菌と
ストレプトミセスプリカタス［Streptomyces plicatu
s （UC8272）］の混合培養によって抗カビ作用を持つニ
トロソファンギン（Nitrosofungin ）が生産されること
が知られている［ジャーナルオブアンチビオチック
ス（J.Antibiotics）、36巻、1425-1430 頁、（1983
年）］が、アルカリジェネスフェカリス（Alcaligene
s faecalis ）が抗菌作用を有する化合物を生産する報
告はない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、スガイ
［Lunella coronata(GMELIN)］より分離したアルカリジ
ェネスフェカリス（Alcaligenes faecalis ）SANK 7
4291 株の培養物から、抗菌作用を有する新規化合物 B
-1015 化合物が生産されることを見出して本発明を完成
した。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明の B-1015 化合物
は下記の構造式（Ｉ）および理化学的性状を有する。１）構造式

【０００５】

【化２】

【０００６】２）物質の性状：酸性黄色粉末３）分子式：Ｃ₇ Ｈ₈ Ｎ₂ Ｏ₅ Ｓ（高分解能ネガティブ
FAB-MSにより測定）４）分子量： 232 （高分解能ネガティブFAB-MSにより
測定）５）元素分析値：（％）Ｃ₇ Ｈ₈ Ｎ₂ Ｏ₅ Ｓ・１水
和物・１アンモニウム塩として計算値Ｃ 31.46 、Ｈ 4.90、Ｎ 15.72 、Ｓ
11.99 実測値Ｃ 36.22 、Ｈ 5.01、Ｎ 16.73 、Ｓ
9.73 ６）赤外線吸収スペクトル：ν_max cm^-1 臭化カリウム（KBr)錠剤法で測定した赤外線吸収スペク
トルは、次に示す通りである。 3190、1656、1615、1589、1495、1401、1309、1214、11
15、1047、888、827 、 635 ７）紫外線吸収スペクトル：λ_max nm（ε）水溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、次に示す
通りである。中性水中： 245(4800)、345(13400) 酸性水中： 238(4800)、320(9300) 、345(Sh) アルカリ性水中： 260(400) 、350(10200)、390(9900)
、420(Sh) ８）比旋光度：［α］_D ²⁵ ＝−10.1°（Ｃ 0.93、水）９）高速液体クロマトグラフィー：分離カラム；センシュウパック ODS H-2151 （カラムサ
イズφ 6×150 mm、センシュウ科学（株）製）溶媒； 16 ％アセトニトリル−0.5 ％ Pic A （ウォー
ターズ社製）含有の水流速； 1.5ml／分波長； 220〜350 nm（フォトダイオードアレイによる検
出）保持時間； 8.1 分１０） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：（δ：ppm) 重水中、外部基準にテトラメチルシランを使用して測定
した核磁気共鳴スペクトル（270 MHz)は、次に示す通り
である。 7.49(H,d,J=8.8 Hz)、6.92(H,d,J=2.9Hz)、6.75(H,dd,J
₁=8.8 Hz,J₂=2.9Hz)、4.82(2H,s) １１）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：（δ：ｐｐｍ）重メタノール中、内部基準にテトラメチルシランを使用
して測定した核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨｚ）
は、次に示す通りである。 162.0(s)、144.0(s)、140.4(s)、119.4(d)、115.9(d)、
115.3(d)、59.5(t) １２）溶解性：水、メタノール、ジメチルスルホキシ
ド、ジメチルホルムアミドに可溶、酢酸エチル、アセト
ン、クロロホルム、ヘキサンに不溶。１３）呈色反応：ヨードに陽性。

【０００７】本発明の B-1015 化合物は、常法に従って
塩とすることができる。そのような塩としては例えばリ
チウム、ナトリウム、カリウムのようなアルカリ金属の
塩；カルシウム、バリウムのようなアルカリ土類金属の
塩；アルミニウム塩；リジン、アルギニンのような塩基
性アミノ酸の塩；アンモニア、メチルアミン、ジメチル
アミンのようなアミン塩等をあげることができる。好適
には薬理上許容される塩である。

【０００８】なお、本発明の B-1015 化合物は、種々の
異性体を有する。式（Ｉ）においては、これらの異性体
およびこれらの異性体の混合物がすべて単一の式で示さ
れている。従って、本発明においてはこれらの異性体お
よびこれらの異性体の混合物をもすべて含むものであ
る。

【０００９】本発明の B-1015 化合物を生産する上記 S
ANK74291 株は静岡県伊東市八幡野の海岸で採集したス
ガイ［Lunella coronata (GMELIN) ］からアンダーソン
（Anderson) 培地（バクトペプトン（Difco) 2.5 g、酵
母エキス（Difco) 2.5 g、リン酸鉄（III) 0.1 g、寒天
15 g 、人工海水 1000 ml(pH 7.4)を用い分離した細菌
である。

【００１０】B-1015化合物の生産菌である SANK 74291
株の菌学的性状は次の通りである。１．形態学的性状普通寒天培地（栄研化学（株）社製）上で 26 ℃、24
時間培養後の観察では、細胞は直径 0.8 μm 、長さ
1.0-2.0 μm の桿菌であり、周毛を有し、運動する。
胞子を形成せず、グラム染色は陰性である。

【００１１】２．普通寒天培地上での生育状態 26 ℃で 24 時間培養したコロニーは、薄黄茶色を帯び
た白色、円形、扁平状、全縁であり、水溶性の色素の生
成により培地はいくぶん薄オリーブ色を呈する。培養を
継続すると培地表面上での運動によるコロニーの拡大が
見られる。

【００１２】３．生理学的性状（１）海水の要求性：生育に海水を要求しない。（２）NaClの要求性：生育にNaClを要求しない。（３）O −F （オキシダティブ−ファーメンタティブ）
テスト［ヒュー・レイフソン（Hugh・Leifson) 法］： D
−グルコースと D−キシロースを分解しない。（４）カタラーゼ：＋（５）オキシダーゼ：＋（６）酸素に対する挙動：好気的（７）硝酸塩の還元：− （８）亜硝酸塩の還元：＋（９）デンプンの加水分解：− （１０）ウレアーゼの加水分解：− （１１）Tween 80 の分解：− （１２）ゼラチンの液化：− （１３）生育温度： 5 ℃では微弱に生育し、23−37
℃では良好な生育を示す。 42 ℃では微弱に生育し、50
℃では生育しない。（１４）炭素化合物の利用性：飯塚と駒形の培地（長谷
川武治編、「微生物の分類と同定（下）」、133 −134
頁）に酵母エキスを 0.2g 加え、行った場合は以下の
通りであった。Ｌ−アラビノース：− Ｄ−キシロース：− Ｄ−グルコース：− Ｄ−フラクトース：− Ｄ−マンノース：− Ｄ−マンニトール：− 酢酸ソーダ：＋グルコン酸カルシウム：
− グリシン：＋（１５）化学分類学的性状１）DNA の G＋C （グアニン＋シトシン）含量：56.2モ
ル％（HPLC法）。２）キノン系：ユビキノン Q−8 。

【００１３】以上の菌学的性状を有する SANK 74291 株
をバージーズ・マニュアル・オブ・システマテック・バ
クテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bact
eriology) 、1 巻（1984年）およびアカガワ（Akagawa)
とヤマサト（Yamasato) の報告（インターナショナル・
ジャーナル・オブ・システマテック・バクテリオロジー
（International Journal of Systematic Bacteriolog
y) 、39 巻、462 −466 頁（1989年））に基づき同定
を行った。その結果、周毛を有するグラム陰性の好気性
桿菌で、DNA の G＋C が 56.2 モル％、キノン系がユビ
キノン Q−8 であり、生理学的性状などから、本菌をア
ルカリジェネスフェカリス SANK 74291（Alcaligenes
faecalis SANK 74291 ）株（寄託機関、工業技術院微
生物工業技術研究所：寄託番号、微工研条寄 3551
号、FERM BP-3551：原寄託日、1991年9 月 6 日）と命
名した。

【００１４】本発明の B-1015 化合物を得るため、これ
らの微生物の培養は他の醗酵生成物を生産するために用
いられるような培地中で行なわれる。このような培地中
には、微生物が資化出来る炭素源、窒素源および無機塩
を含有する。

【００１５】一般に、炭素源としてグルコース、フラク
トース、マルトース、シュークロース、マンニトール、
グリセロール、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウ
モロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆
粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸などを単一に、あ
るいは併用して用いる事が出来る。一般には、培地量の
1−10 重量％で変量する。

【００１６】窒素源としては、一般に蛋白質を含有する
物質を醗酵工程に用いる。適当な窒素源としては、大豆
粉、フスマ、落花生粉、綿実油、綿実粉、カゼイン加水
分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、
ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マル
トエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム等である。窒素源は、単一または併用して培
地量の 0.2−6 重量％の範囲で用いる。

【００１７】培地中に取り入れる栄養無機塩は、ナトリ
ウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サ
ルフェート、クロライド、カーボネート等のイオンを得
ることの出来る通常の塩類である。また、カリウム、カ
ルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の
微量の金属も含む。

【００１８】液体培養に際しては、消泡剤としてシリコ
ン油、植物油、界面活性剤等が使用される。

【００１９】アルカリジェネスフェカリス（Alcalige
nes faecalis）SANK 74291 株を培養し B-1015 化合物
を生産する培地の pH は、5.0-7.4 に変化させることが
出来る。

【００２０】菌の生育温度は 4 ℃から 42 ℃までであ
るが23 ℃から 37 ℃の範囲が生育良好であり、更に B-
1015化合物の生産には、20 ℃から 28 ℃が好適であ
る。

【００２１】B-1015化合物は、好気的に培養して得られ
るが通常用いられる好気的培養法、例えば固体培養法、
振とう培養法、通気撹拌培養法等が用いられる。

【００２２】小規模な培養においては、22 ℃から 26
℃で数日間振とう培養を行うのが良好である。培養は三
角フラスコ中で、1 −2 段階の種の発育工程により開始
する。種発育段階の培地は、炭素源および窒素源を併用
出来る。種フラスコは定温インキュベーター中で 23
℃、1 乃至 3 日間振とうするか、または充分に成長す
るまで振とうする。成長した種は第二の種培地、または
生産培地に接種するのに用いる。中間の発育工程を用い
る場合には、本質的に同様の方法で成長させ、生産培地
に接種するためにそれを部分的に用いる。接種したフラ
スコを一定温度で 1乃至2 日間振とうし、インキュベ
ーションが終わったらフラスコの含有物を遠心分離また
はろ過する。

【００２３】大量培養の場合には、撹拌機、通気装置を
付けた適当なタンクで培養するのが好ましい。この方法
によれば、栄養培地をタンクの中で作成出来る。栄養培
地を125 ℃まで加熱して滅菌し、冷却後、滅菌培地にあ
らかじめ成長させてあった種を接種する。培養は 22 ℃
乃至 26 ℃で通気撹拌して行う。この方法は、多量の化
合物を得るのに適している。

【００２４】培養の経過に伴って生産される B-1015 化
合物の量の経時変化は、高速液体クロマトグラフィーを
用いて測定することが出来る。通常は、19 時間から 4
8 時間の培養で B-1015 化合物の生産量は最高値に達す
る。

【００２５】培養終了後、培養液中の液体部分に存在す
る B-1015 化合物は、菌体、その他の固形部分を珪藻土
をろ過助剤とする、ろ過操作または遠心分離によって分
別し、そのろ液または上清中に存在する B-1015 化合物
を、その物理化学的性状を利用し抽出精製することによ
り得られる。例えば、ろ液または、上清中に存在するB-
1015 化合物は、吸着剤として、例えば活性炭または吸
着用樹脂であるアンバーライトXAD-2 、XAD-4 （ローム
・アンド・ハース社製）等や、ダイアイオンHP-10 、HP
-20 、CHP-20、HP-50 （三菱化成（株）製）等が使用さ
れる。 B-1015化合物を含む液を上記のごとき吸着剤の
層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、または
B-1015化合物を吸着させた後、メタノール水、アセト
ン水、ｎ−ブタノール水あるいはアンモニアを加えたメ
タノール、アセトン水、ｎ−ブタノール水などを用いて
溶出させることにより得られる。

【００２６】また、酸性物質として挙動することを利用
して陰または陽イオン交換体に吸脱着させて精製するこ
とができる。陰イオン交換体としては DEAE −セルロー
ス（ブラウン社製）、DEAE−セファデックス、 QAE−セ
ファデックス（ファルマシア社製）、デュオライト A−
2 （ダイアモンド・シャムロック・ケミカル社製）、ア
ンバーライトIRA-68（ローム・アンド・ハース社製）、
ダウエックス 1×4 、21Ｋ、SBR-P （ダウ・ケミカル社
製）等が利用できる。また、陽イオン交換体としてはア
ンバーライトIRC-50（ローム・アンド・ハース社製）、
ダウエックス 50 W （ダウ・ケミカル社製）等が利用で
きる。また、上記のごとき酸性物質の性質を利用して、
ジメチル・ベンジル・セチル・アンモニウムクロライド
の如き 4級アンモニウム塩を水と混合しない溶媒、例え
ばジクロルメタン等に溶解し、 B-1015 化合物を水溶液
から 4 級アンモニウム塩として抽出する方法も用いら
れる。

【００２７】このようにして得られた B-1015 化合物
は、更にシリカゲル、マグネシウム−シリカゲル系のフ
ロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマトグラ
フィー、セファデックス LH-20（ファルマシア社製）な
どを用いた分配カラムクロマトグラフィー、および順
相、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等
で精製することが出来る。

【００２８】以上の分離、精製の手段を単独または適宜
組み合わせ反復用いることにより B-1015 化合物を分離
精製することができる。

【００２９】

【作用】本発明の B-1015 化合物は、文献未載の新規化
合物であり、動物（例、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ等）
において、グラム陽性および陰性細菌に対し抗菌作用を
示すことから、各種細菌感染症を対照とする抗菌剤とし
て有用である。

【００３０】本発明の B-1015 化合物を医薬として用い
る場合、常法に従ってそれ自体または適宜の薬学的に許
容される担体、賦形剤、希釈剤と混合し、粉末、顆粒、
錠剤、カプセル剤、注射剤などの形態で経口的または非
経口的に安全に投与することが出来る。投与量は対象疾
患、投与経路および投与回数などにより異なるが、例え
ば成人に対しては 1 日 20 mg から 2000 mg を、症
状に応じて 1 回または数回に分けて投与するのが好ま
しい。

【００３１】

【実施例】次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００３２】実施例１． B-1015 化合物の培養Ａ）培養アルカリジェネスフェカリス SANK 74291 株を、マリ
ンアガースラント（Marine Agar Slant 、Difco 社製）
上で 22 ℃で 3 日間培養を行い、滅菌した後述の組成
の培地 100 ml を含む 500 ml の三角フラスコに一白
金耳を接種し、26 ℃で、200 rpm （7 cm の回転半
径）のロータリー振とう培養機で 24 時間培養した。そ
の 300 ml を無菌的に滅菌した同様の組成の培地 15
リットルを含む 30 リットルのジャーファーメンター
2 機に埴菌し、26 ℃で、通気（15リットル／分）、撹
拌（100 rpm）下に 23 時間培養した。

【００３３】培地組成ブレイン・ハート・インフュージョン（Difco 社製） 37 g 人工海水（ジャマリンＳ、ジャマリンラボラトリー社製） 800 ml 蒸留水 200 ml ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ pH 無調整。

【００３４】Ｂ）単離得られた培養液 32 リットルはシャープレス分離機で
固形物をのぞき、分離液（35 リットル）は活性炭（3
リットル）カラムに付した。水（6 リットル）および 2
0 ％アセトン水（9 リットル）で洗った後、50 ％アセ
トン水（12リットル）で溶出した。アセトンを減圧下、
ロータリーエバポレーターで留去した。濃縮液を凍結乾
燥に付すと黄色粉末 61.3 g が得られた。この粉末の一
部 56 gを 0.05 M リン酸緩衝液（pH 4.2）1.5 リット
ルに溶解し、同じ濃度のリン酸緩衝液（pH 4.2) で平衡
化したセファデックス DEAE A-25（300 ml）のカラムに
付した。同じ濃度のリン酸緩衝液（pH 4.2) を含む 0.1
M 食塩水（1.5 リットル）、0.2 M 食塩水（1.5 リッ
トル）、0.25 M 食塩水（1.5 リットル）で順次溶出を
行い、スタフィロコッカスアウレウス 209P （Staphy
lococcus aurens 209P) 菌を試験菌として抗菌活性を示
す画分（0.25 M 食塩水フラクション）を集め、活性炭
を用いて脱塩を行った。即ち、活性炭（100 ml）をカラ
ムに充填し、抗菌活性のあった 0.25 M 食塩水画分を付
した。水洗（1 リットル）後、アセトン：0.1 N −アン
モニア水（1 ：1 v/v ）500 ml で溶出した。溶出液は
減圧下ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液は最
終的に凍結乾燥に付すと 600mg の黄色の粗粉末が得ら
れた。

【００３５】さらにこの粗粉末から B-1015 化合物の純
品を得るためダイアイオン CHP-20Pカラムに付した。即
ち、粗粉末 600mg を少量（約 10 ml）の水に溶解し、
水で充填したダイアイオン CHP-20P（500 ml）カラムに
付した。水で展開を行い、15ml づつ分画を行い抗菌活
性を示すフラクション 33 −45 を集めロータリーエバ
ポレーターで濃縮後、凍結乾燥に付すと、200 mg のB-
1015化合物が黄色粉末として得られた。

【００３６】試験例１． B-1015 化合物の抗菌作用一般グラム陽性および陰性細菌に対する B-1015 化合物
の最小阻止濃度（MIC）は、ミューラーヒントンブ
ロース（muller hinton broth 、Difco 社製）を用いた
寒天平板希釈法によって測定した。結果を表１に示す。

【００３７】

【表１】

【００３８】

【発明の効果】以上から、本発明の B-1015 化合物は抗
菌作用を示し、各種細菌に対する抗菌剤として有用であ
る。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年６月２６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００６

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００６】２）物質の性状：酸性黄色粉末３）分子式：Ｃ₇ Ｈ₈ Ｎ₂ Ｏ₅ Ｓ（高分解能ネガティブ
FAB-MSにより測定）４）分子量： 232 （高分解能ネガティブFAB-MSにより
測定）５）元素分析値：（％）Ｃ₇ Ｈ₈ Ｎ₂ Ｏ₅ Ｓ・１水
和物・１アンモニウム塩として計算値Ｃ 31.46 、Ｈ 4.90、Ｎ 15.72 、Ｓ
11.99 実測値Ｃ 36.22 、Ｈ 5.01、Ｎ 16.73 、Ｓ
9.73 ６）赤外線吸収スペクトル：ν_max cm^-1 臭化カリウム（KBr)錠剤法で測定した赤外線吸収スペク
トルは、次に示す通りである。 3190、1656、1615、1589、1495、1401、1309、1214、11
15、1047、888、827 、 635 ７）紫外線吸収スペクトル：λ_max nm（ε）水溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、次に示す
通りである。中性水中： 245(4800)、345(13400) 酸性水中： 238(4800)、320(9300) 、345(Sh) アルカリ性水中： 260(400) 、350(10200)、390(9900)
、420(Sh) ８）高速液体クロマトグラフィー：分離カラム；センシュウパック ODS H-2151 （カラムサ
イズφ 6×150 mm、センシュウ科学（株）製）溶媒； 16 ％アセトニトリル−0.5 ％ Pic A （ウォー
ターズ社製）含有の水流速； 1.5ml／分波長； 220〜350 nm（フォトダイオードアレイによる検
出）保持時間； 8.1 分９） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：（δ：ppm) 重水中、外部基準にテトラメチルシランを使用して測定
した核磁気共鳴スペクトル（270 MHz)は、次に示す通り
である。 7.49(H,d,J=8.8 Hz)、6.92(H,d,J=2.9Hz)、6.75(H,dd,J
₁=8.8 Hz,J₂=2.9Hz)、4.82(2H,s) １０）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：（δ：ppm) 重メタノール中、内部基準にテトラメチルシランを使用
して測定した核磁気共鳴スペクトル（100 MHz)は、次に
示す通りである。 162.0(s)、144.0(s)、140.4(s)、119.4(d)、115.9(d)、
115.3(d)、59.5(t) １１）溶解性：水、メタノール、ジメチルスルホキシ
ド、ジメチルホルムアミドに可溶、酢酸エチル、アセト
ン、クロロホルム、ヘキサンに不溶。１２）呈色反応：ヨードに陽性。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者高橋秀次東京都品川区広町１丁目２番58号三共株式会社内 (72)発明者春山英幸東京都品川区広町１丁目２番58号三共株式会社内 (72)発明者小玉健太郎茨城県つくば市御幸ケ丘33 三共株式会社内 (72)発明者境田義陽福島県いわき市泉町下川字大剱389−４三共株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）【化１】を有する B-1015 化合物。
【請求項２】アルカリジェネス属に属する B-1015 化
合物生産菌を培養し、その培養物より B-1015 化合物を
採取することからなる B-1015 化合物の製法。
【請求項３】［請求項２］において、アルカリジェネ
ス属に属する B-1015 化合物生産菌がアルカリジェネス
フェカリス SANK 74291 株（微工研条寄第 3551
号）である製法。