JPH0578538B2

JPH0578538B2 -

Info

Publication number: JPH0578538B2
Application number: JP8227686A
Authority: JP
Inventors: Shiro Kajama; Tadashi Iino; Tokuo Matsuda; Iwao Terao
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1986-04-11
Filing date: 1986-04-11
Publication date: 1993-10-29
Also published as: JPS62240643A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は補酵素Ｑの精製方法に関するものであ
り、さらに詳しくは、互いに直列に接続された複
数の吸着カラムクロマトを使用することにより大
量の粗製補酵素Ｑを精製する新規な方法を提供す
るものである。

補酵素Ｑは生体内では末端呼吸系の電子伝達系
に関与し、重症筋無力症および肺気腫などの各種
の疾病に対して優れた薬理効果を示す有用な物質
である。

〔従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕

補酵素Ｑは合成または微生物菌体もしくは天然
物からの抽出などの方法により得られるが、これ
らの方法により得られた粗製補酵素Ｑは補酵素Ｑ
とともに多くの不純物を含み純度がきわめて低い
ものである。補酵素Ｑを医薬などとして使用する
ときには、この補酵素Ｑは極めて高い純度である
ことが必要とされているが、そのため工業的に優
れた精製方法が要求される。

ここで工業的に優れた精製方法とは精製された
補酵素Ｑ（以下精製補酵素Ｑと記す）の純度が高
く、かつ、単位精製補酵素Ｑ当りの吸着カラムク
ロマトに使用する充填剤使用量（ｇ−充填剤／ｇ
−精製補酵素Ｑ）及び溶媒使用量（−溶媒／ｇ
−精製補酵素Ｑ）が少ない精製方法である。

粗製補酵素Ｑから吸着カラムクロマトグラフイ
により精製補酵素Ｑを得るには、以下に示す様な
多くの方法が知られている。すなわち、充填剤と
して無機吸着担体を用いる方法があり、担体とし
てシリカゲルを使用する方法には、たとえば特開
昭54−52790号、特開昭57−18988号、特開昭59−
33354号、特公昭58−53917号、特公昭59−26273
号、特公昭57−21309号および特開昭56−30941号
などに記載されている方法が知られている。一
方、担体としてフロリジルを使用する方法には、
たとえば、特開昭54−110389号、特公昭58−
12266号および特開昭54−122795号に記載されて
いる方法があり、また、担体としてアルミナを使
用する方法としては、たとえば、特開昭59−
45894号に記載されている方法など極めて多数の
方法がある。

これらの無機吸着担体を用いた精製方法はすべ
て一本のカラムを用いたクロマトグラフイーであ
る。

また無機吸着担体を用いた方法で純度の高い精
製補酵素Ｑを収得しようとする場合には、回収率
（精製補酵素Ｑ／粗製補酵素Ｑ）が極端に低く、
単位精製補酵素Ｑ当りの充填剤使用量及び溶媒使
用量を多量にしなければならないのが一般であ
る。従つて、工業規模での精製のために精製装置
を大規模とする必要があるが、大規模化する場合
にはカラム内での溶媒の局部的な偏流、混合、粗
製補酵素Ｑの拡散問題等があり、吸着カラムクロ
マトグラフイの性質上、大規模が非常に困難であ
る。

また、充填剤として多孔性合成樹脂を用いる方
法がある。すなわち非極性の多孔性合成樹脂を使
い、使用溶媒として極性溶媒を用いる吸着カラム
クロマトとしては、たとえば、特開昭55−39701
号、特開昭56−121490号、特開昭57−2686号、特
公昭57−6910号、特公昭59−50648号などがあり、
また、極性の多孔性合成樹脂および非極性溶媒を
用いる吸着カラムクロマトとしては、たとえば特
公昭57−11302号などが知られているが、前記の
無機吸着単体を使用したときと同様の理由により
工業規模での純度の高い精製補酵素Ｑを収得する
ことが困難であり、そのうえ多孔性合成樹脂を用
いた吸着カラムクロマトグラフイの性質上、純度
の高い精製補酵素Ｑを高回収率で収得するために
は、吸着カラムクロマトグラフイに引続いてさら
に無機吸着担体を用いた吸着カラムクロマトおよ
び再結晶化などの精製が必要である。

本発明の目的は、従来の吸着カラムクロマトグ
ラフイによる粗製補酵素Ｑの精製は大規模化に不
適であることおよびこの精度だけでは通常は満足
すべき程十分に高い純度の補酵素Ｑが得られない
との問題点を解決しうる補酵素Ｑの精製方法を提
供するにある。

〔問題を解決するための手段、作用〕

本発明者らは、吸着カラムクロマトグラフイに
よる方法でありながら、工業規模での精製が可能
であり、さらに後処理をしなくても十分に純度の
高い補酵素Ｑを得るために鋭意研究を重ねた結
果、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、粗製補酵素Ｑを吸着カラ
ムクロマトグラフイで精製するに際し、互いに直
列に接続された複数のカラムを使用し、粗製補酵
素Ｑ溶液を該カラムへ順次通過させて粗製補酵素
Ｑ溶液中の不純物含有量を順次低下させ、最終カ
ラムから主成分主成分が補酵素Ｑである区分を回
収することを特徴とする補酵素Ｑの精製法であ
る。

本発明の粗製補酵素Ｑとは、補酵素Q₄〜Q₁₂の
少なくとも１種とともに、１種あるいは多種類の
不純物を多量に含有する補酵素Ｑ含有物そのも
の、または予め抽出、濃縮およびまたは結晶化な
どのそれ自体公知の精製を経たものである。補酵
素Ｑ含有物は、その製法および由来には特に制限
はなく、具体的には、たとえば、微生物菌体、動
物臓器および血合肉などの生物体からの抽出物な
らびに合成により得られた反応生成物またはその
濃縮物などが挙げられる。

本発明において粗製補酵素Ｑは溶液となして互
いに直列に接続された複数のカラムを順次通過さ
せることにより、その中の不純物の含有量は順次
低下させられるが、そのための手段として、(イ)各
カラムの塔底から不純物を順次排出するとともに
他の不純物をそれぞれのカラムに順次滞留させる
手段、(ロ)各カラムに不純物をカラムに順次滞留さ
せる手段、などがある。前者(イ)が好ましい。

本発明を図面によつて具体的に説明する。この
説明に使用される粗製補酵素Ｑは第１図に示した
ような溶出パターンを有するものとする。すなわ
ち、この粗製補酵素Ｑの主成分は補酵素Ｑであ
り、補酵素Ｑよりも早く時間の経過に伴つて順次
溶出される不純物x₁、x₂およびx₃と、補酵素Ｑよ
りも遅く時間の経過に伴つて順次溶出される不純
物x₄、x₅およびx₆を含有している。しかして補酵
素Ｑと各不純物とは、いずれもその曲線は長く裾
をひき、各成分は載然と区分されることはなく常
に少量乃至微量の他の成分を互いに含有する。

本発明のために使用される精製装置のフローシ
ートの例を第２図に示す。すなわち、この装置は
第１カラム１、第２カラム２および第３カラム３
の３本のカラムを有している。各カラムの塔頂に
はそれぞれ第１塔頂管４、第２塔頂管５および第
３塔頂管６がある。これらの塔頂管は第１塔頂管
４から分岐した塔頂連絡管７によつて互いに接続
されている。また、これらの塔頂管にはそれぞれ
第１塔頂弁８、第２塔頂弁９および第３塔頂弁１
０が設けられている。また、各カラムの塔底には
それぞれ第１塔底管１１、第２塔底管１２および
第３塔底管１３がある。各塔底管にはそれぞれ第
１塔底弁１４、第２塔底弁１５および第３塔底弁
１６が設けられている。また、各塔底管にはそれ
ぞれ各カラムの塔底と各塔底弁との間にそれぞれ
第１検出器１７、第２検出器１８および第３検出
器１９が設けられている。第１塔底管１１の第１
塔底弁１４と第１検出器１７との間の部分と、第
２塔頂管５の第２のカラム２の塔頂と第２等頂弁
９との間の部分とは第１連絡管２０で連絡され、
以つて第１カラム１と第２カラム２とは互いに直
列に接続される。これと同様に第２カラム２と第
３カラム３とは第２連絡管２１で互いに直列に接
続されている。各連絡管にはそれぞれ第１連絡弁
２２および第２連絡弁２３が設けられている。第
１カラム１の塔頂には供給管２４が設けられてい
る。なお各カラムの塔底の検出器としては、たと
えば紫外線吸収測定器（UVモニター）および赤
外線吸収測定器などをそれぞれ使用することがで
きる。またこれらの測定器にかえて、予め実験的
に求められたタイムスケジユールによつて弁を開
閉させることもできる。

この装置を使用して、粗製補酵素Ｑ中の不純物
を各カラムの塔底から順次排出させるとともに他
の不純物をそれぞれのカラムに残留させて除去す
るための操作(イ)についてまず説明する。すなわ
ち、溶媒に粗製補酵素Ｑを溶解させた溶液を供給
管２４ら第１カラム１に供給し、各成分を展開さ
せ第１カラム１内の充填剤に吸着させる。次い
で、第１等底弁１４から液を系外へ排出させなが
ら第１塔頂管４から溶液を注下して、主成分が不
純物x₁である区分を第１カラム１から第１塔底弁
１４を経て系外に排出させる。

第１カラム１からのこの排出液の補酵素Ｑが第
１検出器１７で検出された時点でたヾちに第１塔
底弁１４を閉め第１連絡弁２２を開け第１カラム
１からの排出液を第１連絡管２０を経由して第２
カラム２へ移行させる。この際、第１検出器１７
で不純物x₆が検出されはじめた時に速やかに第１
連絡弁２２を閉めて第２カラム２に移行しないう
ちに主成分が不純物x₆である区分を第１カラム１
に残留させる。第２カラム２では、前記第１カラ
ム１におけると同様に各成分は展開せしめられる
吸着され、ついで、第２塔頂弁９を開け第２塔頂
管５から溶媒を注下して主成分が不純物x₂である
区分を第２塔底弁１５から系外に排出させる。

第２検出器１８で第２カラム２からの排出液中
の補酵素Ｑが検出された時点で前記のようにこの
排出液を第３カラム３に移行させ、一方、主成分
が不純物x₅である区分は第２カラム２に残留せし
められる。第３カラム３でも第１カラム１および
第２カラム２におけると同様に、各成分の展開、
分離および溶出が行われ、第３カラム３の第３塔
底弁１６から不純物x₃、補酵素Ｑおよび不純物x₄
のそれぞれを主成分とする各区分が順次排出され
る。この排出液中の補酵素Ｑを第３検出器１９に
よつて検出し、主成分が補酵素Ｑである区分を回
収する。各カラムに残留せしめられた主成分が不
純物である区分を溶媒で洗い出し各カラムの充填
剤は再生され、各カラムは再度、吸着カラムクロ
マトグラフイに供される。各カラムでの各成分の
展開吸着、溶出および不純物の洗い出しの時間を
適宜組合わせる−たとえば第１カラム１での不純
物の洗い出しと併行して、第２カラム２では各成
分の展開、吸着、第３カラム３では少量の残存不
純物の洗い出しを行なう−ことにより各カラムの
遊び時間を削減し各カラムを有効に利用すること
ができる。

次に、この装置を使用して粗製補酵素Ｑ中の不
純物を各カラムに残留させて除去するための操作
(ロ)について説明する。すなわち、溶媒に粗製補酵
素Ｑを溶解させた溶液を供給管２４から第１カラ
ム１に供給する。ついで第１塔頂管４から溶媒を
供給し、第１塔頂弁８、第１連絡弁２２、第２連
絡弁２３および第３塔底弁１３をそれぞれ開け他
の弁を閉め、前記の溶媒を第１カラム１、第１連
絡管２０、第２カラム２、第２連絡管２１および
第３カラム３を順次通過させ、これに伴つて粗製
補酵素Ｑの各成分も移動し、各成分は各カラム内
に展開せしめられ吸着される。第１カラム１から
の排出液中の補酵素Ｑの殆ど全量が第１カラム１
から排出され、第１検出器１７で第１カラム１か
らの排出液中の補酵素Ｑがほとんど検出されなく
なり、かつ、不純物x₆が検出されはじめた時に第
１連絡弁２２を閉めて、第１カラム１内に主成分
が不純物x₆である区分を残留させ、一方、第２塔
頂弁９を開け第２塔頂管５から溶媒を注下する。
この溶媒は粗製補酵素Ｑの各成分を伴つて第３カ
ラム３に移行せしめられる。第２検出器１８で第
２カラム２からの排出液中の補酵素Ｑがほとんど
検出されなくなり、かつ、不純物x₅が検出されは
じめた時に第２連絡弁２３を閉めて、第２カラム
２内に主成分が不純物５である区分を残留させ、
一方、第３塔頂弁１０を開け第３塔頂管６から溶
媒を注下し、第３塔底弁１６を開けて第３カラム
３から排出液を系外に流出させる。この排出液に
は不純物x₁，x₂，x₃、補酵素Ｑおよび不純物x₄を
それぞれ主成分とする区分が、この順序で逐次排
出され、第３検出器１９で主成分が補酵素Ｑであ
る区分を検出し、回収する。第１カラム１および
第２カラム２のそれぞれに残留せしめられた不純
物x₆および不純物x₅のそれぞれを主成分とする区
分および第３カラム３に残留した少量の不純物x₄
を主成分とする区分は、各カラムに溶媒を流下さ
せて充填剤を洗浄することにより除去され、各カ
ラム内の充填剤は再生され、各カラムは再度、吸
着カラムクロマトグラフイに供され、また、各カ
ラムの操作を適宜組合わせることにより各カラム
を遊ばせることなく有効に利用することができる
のは前記の操作(イ)におけると同様である。

本発明で使用される充填剤には特に制限はな
く、従来、一般に使用されている充填剤が使用可
能であるが、代表例を挙げれば次の如くである。

すなわち、無機充填剤としてはシリカゲル、ア
ルミナ、フロリジル、活性炭、ヒドロキシアバタ
ナイトなどがある。また、シリカゲルの市販品の
例を挙げると、ワコーゲルＣ−200およびワコー
ゲルＣ−300（いずれも和光純薬製）、シリカゲル
アート（Art）9385およびシリカゲルアート7734
（いずれもメルク社製）、ならびにシリカゲルKT
−3063およびシリカゲル4B（いずれもフジゲル社
製）などがある。

また、有機充填剤としては一般に多孔性合成樹
脂が使用されるが、この代表例として非極性合成
樹脂としてたとえばアンバーライトXAD−２（ロ
ーム・アンド・ハース社製）、アンバーライト
XAD−４（ローム・アンド・ハース社製）および
ハイポーラスポリマーHP（三菱化成工業株式会
社製）のようなスチレン−ジビニル共重合体など
があり、極性合成樹脂として、たとえばアンバー
ライトXAD−７（ローム・アンド・ハース社製）
およびアンバーライトXAD−８（ローム・アン
ド・ハース社製）などのポリアクリルエステル、
アンバーライトXAD−９（ローム・アンド・ハー
ス社製）のようなスルホキシド、およびアンバー
ライトXAD−11（ローム・アンド・ハース社製）
のような極性合成樹脂があげられる。

各カラムに充填される充填剤は互いに同じであ
つてもよく、また異なつてもよい。同じであるこ
とが好ましい。同じ種類の無機充填剤であること
が特に好ましい。

本発明において粗製補酵素Ｑを溶解するための
溶媒および各カラムに注加される溶媒は粗製補酵
素を溶解しうる溶媒であればよく、単一溶媒およ
び混合溶媒のいずれをも使用しうる。

通常は、無機充填剤を用いる場合において、単
一溶媒としては非極性溶媒が好ましく、たとえ
ば、ｎ−ヘキサン、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘプタ
ン、イソオクタン、シクロヘキサンおよびこれら
の混合物、石油エーテルなどの炭化水素が実用上
特に好ましい。混合溶媒としては、前記の非極性
溶媒にエチルエーテルなどのエーテル系、酢酸エ
チル、酢酸ブチルなどのエステル系、あるはアセ
トン、メチルエチルケトンなどケトン系の有機溶
媒を加えた混合溶媒が特に好ましい。また充填剤
として多孔性合成樹脂を用いる場合において、非
極性多孔性合成樹脂を使用する場合にはメタノー
ル、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパ
ノール、アセトン、メチルエチルケトン、イソプ
ロピルエーテル、テトラヒドロフラ、ジオキサ
ン、メチルセロソルブ、ジメチルホルムアミド、
アセトニトリルおよび水などの極性溶媒を単独ま
たは相互の混合物として使用することができ、混
合溶媒が好ましい。メタノールと水、メタノール
とアセトン、メタノールとｎ−ヘキサン、アセト
ンと水などの混合溶媒が特に好適に使用される。
一方、極性多孔性樹脂を使用する場合には、ベン
ゼン、トルエン、ｎ−ヘキサン、石油エーテル、
石油ベンゼン、イソペンタン、四塩化炭素および
クロロホルムなどの非極性の溶媒を単独または相
互の混合物として使用することができる。また、
これらの溶媒にアセトン、エーテルおよび酢酸エ
チルのそれぞれを混合した混合溶媒も使用しう
る。一般に混合溶媒が好ましい。ｎ−ヘキサン
と、アセトン、エーテルおよび酢酸エチルのそれ
ぞれとの混合溶媒が特に好ましい。

各カラムの塔頂から注入される溶媒は、各カラ
ムに充填されている充填剤の種類、粗製補酵素Ｑ
に含有されている不純物の種類、数および量なら
びに処理温度などに応じてそれぞれのカラムの条
件に適した溶媒を使用することが一般であるが、
各カラムで共通な溶媒を使用することもできる。
また、各カラムの塔頂から供給される溶媒は供給
の途中で別の溶媒に変更してもよい。

なお、各カラムとも無機充填剤が充填されてい
る場合および極性多孔性樹脂が充填されている場
合には後のカラムほど溶媒の極性を大きくするこ
とが好ましい。反面、各カラムとも非極性多孔性
樹脂が充填されている場合には後のカラムほど溶
媒の極性を小さくすることが好ましい。なお、溶
媒の極性を調節するためには、常法の如く極性の
異る複数の溶媒を混合すればよい。

たとえば、ヘキサン／アセトン（容量比）を
100／０、98／２、95／５、の比率で混合すれば
その極性はこの順で大きくなる。また、メタノー
ル／アセトン（容量比）を７／３、５／５、３／
７で混合すればその極性はこの順で小さくなる。

カラムの温度、カラムに供給される粗製補酵素
Ｑ溶液の温度、供給速度、各カラムに注下される
溶媒量および供給速度などは、使用される充填剤
の種類、粗製補酵素Ｑ中の不純物の数、種類およ
び量ならびに溶媒の種類などによつて異なり一概
に特定しえない。これらの条件は、各カラムで、
各カラムに適した条件を選択すればよいが、各カ
ラムの条件を同じくすることもできる。しかして
実用上、通常はつぎのような条件が採用される。
すなわち、たとえば、カラムに供給される粗製補
酵素Ｑ溶液の温度およびカラムの温度はそれぞれ
充填剤が吸着能を失なわず、粗製補酵素Ｑ中の補
酵素Ｑが溶剤に溶解し、溶媒の沸点より低い温度
であればよく、通常は15〜50℃、好ましくは室温
乃至常温であり、特に加熱、冷却の必要はない
が、加熱、冷却することを妨げない。なおカラム
の温度は後のカラムほど高くすることが好まし
い。

粗製補酵素Ｑ溶液の供給量は、無機充填剤を用
いた場合には、通常は各カラムで使用した充填剤
合計重量（ｇ）の50重量パーセント以下とされ、
実用上30重量パーセント以下とすることが好まし
い。

また、充填剤として多孔性合成樹脂を用いた場
合には、通常は各カラムで使用した充填剤合計容
積（ml）の50重量パーセント（ｇ−粗製補酵素
Ｑ／ml−充填剤合計容積）以下とされ、実用上、
35重量パーセント以下とすることが好ましい。な
お、ここで充填剤合計容積（ml）とは見掛の容積
ではなく実容積である。

粗製補酵素Ｑを溶解する溶媒の量は、特に制限
はないが、通常は粗製補酵素Q1ｇに対して0.5〜
５mlの割合とされ、1.3〜2.5mlの割合が好まし
い。

本発明で使用する各カラム間の充填剤重量
（ｇ）の割合には、特に制限はないが、最大充填
量（重量）と最小充填量（重量）との比は実用
上、通常は0.1〜１とされる。

本発明で各カラムに注下される溶媒の見掛けの
カラム空筒速度〔単位時間当りの溶媒供給量
ml／sec／カラム断面積（cm²）＝cm／sec〕には、特に制限はないが、実用上、通常0.001〜0.3cm／sec、
好ましくは0.01〜0.1cm／secである。さらにカラ
ム内上部圧力は分離上好ましい供給溶媒の見掛け
の空筒速度が維持されれば常圧でも加圧下または
減圧下でもよい。

〔実施例〕

次に実施例により本発明をさらに具体的に説明
する。しかしながら本発明はこれらの実施例によ
つて限定されるものではない。

実施例１２本のカラム（第２図における、互いに直列に
接続された第１カラム１および第２カラム２に相
当−従つて第３カラム３および第２連結管２１は
使用しない）（直径22mm、長さ450mmの円筒）に、
ｎ−ヘキサンに懸濁させた充填剤ワコーゲルＣ−
300 140ｇを二等分し、70ｇずつ２本のカラムに
充填した。

25℃のｎ−ヘキサン54mlに、微生物菌体から得
られた粗製補酵素Q₁₀27ｇ（補酵素Q₁₀含量18.9
ｇ）を溶解した溶液を第１カラム１上部に供給し
た。

ついで、第１カラム１の塔底から液を抜出し
つゝ塔頂から溶媒（アセトン含有率0.5容量％
のアセトンとヘキサンとの混合溶媒以下同様）
を注下した。この時の溶媒の供給速度を684
ml／hr、見掛けのカラム空筒速度を0.05cm／sec
とし、第１カラム１の温度を25℃に保つた。

この操作により第１カラム１の第１塔底弁１４
から不純物の溶液260mlを系外に取り出したとき
に、第１検出器１７（UVモニター波長254nｍ以
下同様）で補酵素Q₁₀が検出された。この時に第
１塔底弁１４を閉め、第１連絡弁２２および第２
塔底弁１５を開け、補酵素Q₁₀を含有する区分を
第２カラム２へ移行させた。これと同時に第２塔
頂弁９を開け、溶媒（アセトン含有率８容量％
のアセトンとｎ−ヘキサンとの混合溶媒以下同
様）を注下した。このときの溶媒の供給速度を
80ml／hrとした。

この時、第１カラム１に供給される溶媒の供
給量を684ml／hrから604ml／hrに変更した。第２
カラム２のカラム温度を35℃とした。また第１カ
ラム１および第２カラム２のそれぞれの塔頂圧力
はそれぞれ0.3Kg／cm²Ｇおよび0.1Kg／cm²−Ｇであ
つた。

ここで第１カラム１および第２カラム２での溶
媒の見掛けの空筒速度はそれぞれ0.044cm／secお
よび0.05cm／secであつた。

吸着カラムクロマイトグラフイ開始から溶出液
合計量2000ml（第１カラム１塔底から260ml、第
２カラム２塔底から1740ml）となつた時に、第１
検出器１７で補酵素Q₁₀が検出終了され、第１塔
頂弁８、第１塔底弁１４および第１連絡弁２２を
閉じた。この時、第２カラム２では溶媒から溶
媒（アセトン含有率1.0容量％のアセトンとｎ
−ヘキサンとの混合溶媒以下同様）に変更しそ
の供給速度を684ml／hrとした。ここで第２カラ
ム２での溶媒の見掛けの空筒速度は0.05cm／
secである。第２カラム２での温度は35℃のまま
とした。第２カラム２の第２塔底弁１５より溶出
液を不純物だけを含む溶出区分、不純物と補酵素
Q₁₀とを含む区分、おもに補酵素Q₁₀だけを含む
区分、および不純物と補酵素Q₁₀とを含む区分の
４つの区分として溶出順に分取した。それぞれの
溶出液量は、1520ml、365ml、1335mlおよび125ml
であつた。

各カラム塔頂から注下された溶媒使用合計量は
3605mlであつた。おもに補酵素Q₁₀だけを含む区
分1335mlから溶媒を除去して15.12ｇの補酵素Q₁₀
を得た。この補酵素Q₁₀の融点は48℃で、逆相お
よび順相高速液体クロマトグラフイー、マススペ
クトルならびに赤外線吸収スペクトルより純度
100％の補酵素Q₁₀であることが確認された。

収得した精製補酵素Q₁₀回収率は80％に相当す
る。収得精製補酵素Q₁₀1ｇ当りの溶媒使用合計
量および充填剤使用合計量はそれぞれ239ｇおよ
び9.3ｇであつた。

なお第１カラム１には多量の不純物が残留して
いた。

比較例１第２カラム２の塔頂から溶媒を注下することな
く、第１カラム１の塔頂からのみ溶媒を注下し、
かつ、第１カラム１の塔底から排出液を系外へ抜
き出さなかつたほかは実施例１に準じて行なつ
た。

すなわち、第１カラム１に注加される溶媒は、
アセトン含有率0.5溶量％のアセトンとｎ−ヘキ
サンとの混合溶媒であり、供給速度684ml／hr、
見掛けの空筒速度0.05cm／secとし、その供給全
量を2000mlとした。また、各カラムの温度を25℃
に保つた。

次にこの溶媒をアセトン含有率１溶量％のアセ
トンとｎ−ヘキサンとの混合溶媒に変更し、供給
速度、見掛けの空筒速度は変更しなかつた。なお
この溶媒の供給全量を1670mlとした。

また、各カラムの温度を35℃に変更した。各カ
ラムの塔頂圧力はそれぞれ0.3Kg／cm²−Ｇおよび
0.1Kg／cm²−Ｇであつた。

第２塔底弁１５からの溶出液を、不純物だけを
含む溶出区分、不純物と補酵素Q₁₀とを含む区
分、おもに補酵素Q₁₀だけを含む区分および不純
物と補酵素Q₁₀とを含む区分４区分として溶出順
に分取した。溶出液量はそれぞれ1580ml、775ml、
920mlおよび395mlで合計量は3670mlであつた。

おもに補酵素Q₁₀だけを含む区分920mlから溶
媒を除去して、純度99％の補酵素Q₁₀10.5ｇを得
た。収得した精製補酵素Q₁₀の回収率は55％に相
当し、収得精製補酵素Q₁₀（純度99％）１ｇ当り
の溶媒使用合計量および充填剤使用合計量はそれ
ぞれ353mlおよび13.3ｇであつた。

ここで得られた回収率は実施例１に比して著し
く劣り、収得精製補酵素Q₁₀純度も実施例１に比
して劣つていた。また、精製補酵素Q₁₀1ｇ当り
の溶媒使用合計量および充填剤使用合計量は実施
例１に比して極めて多かつた。

実施例２微生物菌体から得られた粗精製補酵素54ｇ（補
酵素Q₁₀含量37.8ｇ）を、第２図に示した装置を
用いて精製した。カラム３本（すべて径22mm、長
さ450mm）の円筒のそれぞれに、ｎ−ヘキサンに
懸濁させたワコーゲルＣ−300 210ｇを70ｇずつ
各ワラムに充填した。

25℃のｎ−ヘキサン 108mlに、前記の粗製補
酵素54ｇを溶解した溶液を第１カラム１上部に供
給した。

ついで第１カラム１の塔底から液を系外へ抜き
出しつゝ、塔頂から溶媒を注下した。溶媒の
供給速度を684ml／hr、見掛けのカラム空筒速度
を0.05cm／secとしてカラム温度を25℃に保つた。

この操作により第１カラム１の第１塔底弁１４
から不純物の溶液170mlを系外に取り出したとき
に第１検出器１７（UVモニター）で補酵素Ｑが
検出された。この時に第１塔底弁１４を閉め、第
１連絡弁２２および第２塔底弁１５を開け、補酵
素Q₁₀1を含有する区分を第２カラム２へ移行さ
せた。これと同時に第２塔頂弁９を開け溶媒を
注下した。このときの溶媒の供給速度を80ml／
hrとした。

この時、第カラム１に供給される溶媒の供給
速度を684ml／hrから604ml／hrに変更した。

第２カラム２の温度も25℃とした。また、第１
カラム１および第２カラム２のそれぞれの塔頂圧
力はそれぞれ0.3Kg／cm²−Ｇおよび0.1Kg／cm²−Ｇ
であつた。

第２カラム２の第２塔底弁１５からの溶出液を
第２検出器１８で検出して不純物だけを含む溶出
区分570mlおよび不純物と補酵素Q₁₀とを含む区
分200mlの２つの区分として溶出順に分取し系外
に取り出した。

次に第２塔底弁１５を閉め、第２連絡弁２３お
よび第３塔底弁１６を開け、多量の補酵素Q₁₀を
含有する区分を第３カラム３に移行させた。これ
と同時に第３塔順弁１０を開け溶媒を80ml／hr
の供給速度で注下した。

第３カラム３での溶媒の見掛けの空筒速度は
0.056cm／secとなつた。

第１カラム１および第２カラム２の温度はそれ
ぞれ変更せず、第３カラム３の温度を35℃とし
た。

各カラムの塔頂圧力はそれぞれ0.4Kg／cm²−Ｇ、
0.2Kg／cm²−Ｇおよび0.1Kg／cm²−Ｇであつた。

吸着カラムクロマイトグラフイ開始から溶出液
合計2050ml（第１カラム１塔底から170ml、第２
カラム２塔底から770ml、第３カラム３塔底から
1110ml）に達した時に、第１検出器１７で補酵素
Q₁₀がほとんど検出されなくなり、第１塔頂弁８
および第１連絡弁２２を閉じ、補酵素Q₁₀を含有
する区分を第１カラム１から第２カラム２への移
行と第１カラム１への溶媒の注下を終了した。

なお、第３カラム３では、補酵素Q₁₀を含有す
る区分を第２カラム２から第３カラム３への移行
および溶媒の注下は継続中である。

この時に、第２カラム２に注下された溶媒を
溶媒に、また、供給速度を80ml／hrから604
ml／hrに変更した。

ここで第２カラム２での溶媒の見掛けの空筒
速度は0.044ml／hrとなつた。

また、第２カラム２および第３カラム３の塔頂
圧力はそれぞれ0.3Kg／cm²−Ｇおよび0.1Kg／cm²−
Ｇであつた。

吸着カラムクロマトグラフイ開始から溶出液合
計量が4010ml（第１カラム１塔底から、170ml、
第２カラム塔底から770ml、第３カラム３塔底か
ら3070ml）となつた時に、第２検出器１８で補酵
素Q₁₀がほとんど検出されなくなり、第２連絡弁
２３および第２塔頂弁９を閉め、第２カラム２へ
の溶媒を注下および補酵素Q₁₀を含有する区分の
第２カラム２から第３カラム３への移行を終了し
た。なお、第３カラム３における不純物溶出は継
続中である。

また、この時、第３カラム３へ注下されていた
溶媒を溶媒（アセトン含有率1.5容量％のア
セトンとｎ−ヘキサンとの混合用媒以下同様）
に、供給速度を80ml／hrから684ml／hrに変更し
た。

ここで第３カラム３での見掛けの空筒速度は
0.05cm／secとなる。

次いで第３カラム３の第３塔底弁１６からの溶
出液を不純物だけを含む溶出区分、不純物と補酵
素Q₁₀とを含む区分、おもに補酵素Q₁₀だけを含
む区分および不純物と補酵素Q₁₀とを含む区分の
４つの区分として溶出順に分取した。これらの溶
出液量はそれぞれ2400ml、600ml、1800mlおよび
400mlであつた。また、吸着カラムクロマトグラ
フイ開始からの溶媒使用合計量は6140ml（第１カ
ラム１塔底から170ml、第２カラム２塔底から770
ml、第３カラム３の塔底から5200ml）であつた。

おもに補酵素Q₁₀だけを含む区分1800mlから溶
媒を除去して28.35ｇの補酵素Q₁₀を得た。この補
酵素Q₁₀の融点は48℃で、逆相および順相高速液
体クロマトグラフイーならびにマススペクトル、
赤外線吸収スペクトルによる純度100％の補酵素
Q₁₀であることが確認された。

収得した精製補酵素Q₁₀の回収率は75％、であ
り、収得精製補酵素Q₁₀1ｇ当りの溶媒使用合計
量および充填剤使用合計量はそれぞれ217mlおよ
び7.4ｇであつた。

なお、第１カラム１および第２カラム２には多
量の不純物が残留していた。

比較例２第２カラム２および第３カラム３へは溶媒を注
下せずに第１カラム１のみに溶媒を注下し、第１
カラム１および第２カラム２のそれぞれの塔底か
ら系外へ液を排出しなかつたほかは実施例２に準
じて行なつた。すなわち、25℃のｎ−ヘキサン
108mlに実施例２と同様の粗製補酵素Q₁₀54ｇを
溶解した溶媒を第１カラム１に供給した。第３塔
底弁１３を開け、前記の粗製補酵素Q₁₀を各カラ
ムを順次通過させて各成分を展開、吸着させた。

第１カラム１の塔頂から溶媒を、供給速度を
684ml／hr、見掛けの空筒速度を0.05cm／secと
し、3000ml注下した。

各カラムの温度をそれぞれ25℃に保つた。

ついで溶媒から溶媒に変更し、供給速度を
変更しないで、溶媒3170mlを注下した。

また、各カラムの温度をそれぞれ35℃に変更し
た。第１カラム１、第２カラム２および第３カラ
ム３の塔頂圧力はそれぞれ0.4Kg／cm²−Ｇ、0.2
Kg／cm²−Ｇおよび0.1Kg／cm²−Ｇであつた。

第３塔底弁１６からの溶出液を、不純物だけを
含む溶出区分、不純物と補酵素Q₁₀とを含む区
分、おもに補酵素Q₁₀だけを含む区分および不純
物と補酵素Q₁₀とを含む区分の４つの区分とし
て、溶出順に分取した。それぞれの溶出液量は
3140ml、1200ml、1080mlおよび750mlであつた。
おもに補酵素Q₁₀だけを含む区分1080mlから溶媒
を除去して、純度99％の補酵素Q₁₀17.01ｇを得
た。

収得した精製補酵素Q₁₀の回収率は45％、収得
精製補酵素Q₁₀（純度99％）１ｇ当りの溶媒使用
合計量および充填剤使用合計量はぞれぞれ363ml
および12.3ｇであつた。この比較例２で得られた
回収率は実施例２に比して著しく劣り、また精製
補酵素Q₁₀純度は実施例２に比して劣つていた。

また、精製補酵素１ｇ当りの溶媒使用合計量お
よび充填使用合計量はいずれも実施例２に比して
極めて多かつた。

実施例３実施例１と同様にして得られた粗製補酵素
Q₁₀10ｇ（補酵素Q₁₀含量7.0ｇ）を、充填剤とし
てハイポーラスポリマー粉HP−20（三菱化成工
業株式会社製）120mlを60mlずつ２等分し、カラ
ムに充填しアセトン・メタノール（容積比４：６
以下同様）で満たしたほかは実施例１に準じて精
製した。

すなわち、25℃のアセトン・メタノール（４：
６）の混合溶媒に前記の粗製補酵素Q₁₀10ｇを溶
解した溶液を第１カラム上部に供給した。

次いで第１カラム１の塔底から液を抜出し
つゝ、塔頂から溶媒（アセトン：メタノール＝
４：６の混合溶媒以下同様）を注下した。

この時の溶媒の供給速度を684ml／hr、見掛
けの空筒速度を0.05cm／secとし、第１カラム１
の温度を25℃に保つた。第１カラム１の塔頂圧力
は常圧であつた。

次に第１カラム１へ注下されていた溶剤の供
給量が600mlになつた時に溶媒を溶媒（アセ
トン：メタノール＝５：５以下同様）に変更し
た。

この操作により第１カラム１の第１等底弁１４
から不純物を含む溶液720mlを系外に取り出した
ときに第１検出器１７で補酵素Q₁₀が検出され
た。この時に第１塔底弁１４を閉め、第１連絡弁
２２および第２塔底弁１５を開け、補酵素Q₁₀を
含有する区分を第２カラム２へ移行させた。これ
と同時に第２塔頂弁９を開け、溶媒（アセト
ン：メタノール＝９：１の混合溶媒以下同様）
を注下した。

この時の溶媒の供給速度を80ml／hrとした。

第１カラム１および第２カラム２においてカラ
ム温度をそれぞれ25℃および35℃とし、また塔頂
圧力は常圧であつた。ここで第２カラム２での溶
媒の見掛けの空筒速度は0.056cm／secである。

吸着カラムクロマトグラフイ開始から溶出液合
計量1020ml（第１カラム１塔底から720ml、第２
カラム２塔底から300ml）となつた時に第１検出
器１７で補酵素Q₁₀が検出されなくなり、第１塔
頂弁８、第１塔底弁１４および第１連絡弁２２を
閉じた。

この時、第２カラム２では、溶媒から溶媒
（アセトン：メタノール＝６：４以下同様）に
変更し、その供給速度も684ml／hrに変更した。
ここで第２カラム２での溶媒の見掛けの空筒速
度は0.05cm／secである。

第２カラム２での温度は35℃のまゝとした。

第２カラム２の第２塔底弁１５からの溶出液
を、不純物だけを含む溶出区分、不純物と補酵素
Q₁₀とを含む区分、おもに補酵素Q₁₀だけを含む
区分および不純物と補酵素Q₁₀とを含む区分の４
つの区分として溶出順に分取した。それぞれの溶
出液量は120ml、50ml、545mlおよび50mlであつ
た。

各カラム塔頂から注下された溶媒使用合計量は
1485mlであつた。おもに、補酵素Q₁₀だけを含む
区分545mlから溶媒を除去して5.9ｇの補酵素Q₁₀
を得た。この補酵素Q₁₀は逆相および順相高速液
体クロマトグラフイ、マススペクトルならびに赤
外線吸収スペクトルにより純度99.1％の補酵素
Q₁₀であることが確認された。

収得した精製補酵素Q₁₀回収率は85％に相当す
る。

収得精製補酵素Q₁₀1ｇ当りの溶媒使用合計量
および充填剤使用合計量はそれぞれ252mlおよび
20.3mlであつた。

なお、第１カラム１には多量の不純物が残留し
ていた。

比較例３第２カラムの塔頂からは溶媒を注下することな
く、第１カラム１の塔頂からのみ溶媒を注下し、
かつ、第１カラム１の塔底から排出液を抜き出さ
なかつたほかは実施例３に準じて行なつた。

すなわち、第１カラム１に注下する溶媒として
順次溶媒650ml、溶媒300mlおよび溶媒420
mlを使用した。どの溶媒も、供給速度を684ml／
hr、見掛けの空筒速度を0.05cm／secとした。ま
た、各カラムの温度を25℃に保つた。各カラムの
塔頂圧力はいずれも常圧であつた。

第２塔底弁１５からの溶出液を、不純物だけを
含む溶出区分、不純物と補酵素Q₁₀とを含む区
分、おもに補酵素Q₁₀だけを含む区分および不純
物と補酵素Q₁₀とを含む区分の４つの区分として
溶出順に分取した。それぞれの溶出液量はそれぞ
れ720ml、200ml、400mlおよび50mmであつた。

おもに補酵素Q₁₀だけを含む区分400mlから溶
媒を除去して、純度99％の補酵素Q₁₀4.3ｇを得
た。収得した精製補酵素Q₁₀の回収率は55％、収
得精製補酵素Q₁₀（純度99％）１ｇ重量当りの溶
媒使用合計量および充填剤使用合計量はそれぞれ
319mlおよび22.6mlであつた。

ここで得られた回収率は実施例３に比して著し
く劣り、精製補酵素Q₁₀純度も実施例３に比して
劣つた。また、精製補酵素Q₁₀1ｇ当りの溶媒使
用合計量および充填剤使用合計量は実施例３に比
して極めて多かつた。

実施例４微生物菌体から得られた粗製補酵素54ｇ（補酵
素Q₁₀含量37.8ｇ）を、第２図に示した装置を用
いて精製した。カラム３本（すべて径22mm、長さ
450mmの円筒）のそれぞれにｎ−ヘキサンに懸濁
させたワコーゲルＣ−300 210ｇを70ｇずつ各カ
ラムに充填した。25℃のｎ−ヘキサン 108mlに
前記の粗製補酵素54ｇを溶解した溶液を第１カラ
ム１上部に供給した。ついで第１連絡弁２２、第
２連絡弁２３を開け第３カラム３の塔底から液を
抜き出しつつ第１カラム１の塔頂から溶媒を注
下した。溶媒の供給速度を684ml／hr、見掛け
の各カラム空筒速度を0.05cm／secとして各カラ
ム温度を25℃に保つた。各カラムの塔頂圧力はそ
れぞれ0.9Kg／cm²Ｇ、0.4Kg／cm²Ｇおよび0.1Kg／cm²
Ｇであつた。

吸着クロマトグラフイー開始から溶出液合計量
が2200mmに達した時に、第１検出器１７では補酵
素Q₁₀がほとんど検出されなくなり、第１塔頂弁
８および第１連絡弁２２を閉じ、第１カラム１へ
の溶媒の注下を終了した。これと同時に第２塔頂
弁９を開け第２塔頂管５から溶媒を注下した。
溶媒の供給速度を684ml／hr、見掛け空筒速度
を0.05cm／secとして第２カラム２および第３カ
ラム３の温度をそれぞれ35℃に保つた。第２カラ
ム２および第３カラム３の塔頂圧力はそれぞれ
0.4Kg／cm²Ｇおよび0.1Kg／cm²Ｇであつた。

吸着カラムクロマトグラフイ開始から溶出液合
計量が4500mlとなつた時に第２出器１８で補酵素
Q₁₀がほとんど検出されなくなり、第２連絡弁２
３および第２塔頂弁９を閉め、第２カラム２への
溶媒の注下を終了した。これと同時に第３塔頂弁
１０を開け溶媒を注下した。

溶媒の第３カラム３への供給速度を684ml／
hr、見掛けの空筒速度を0.05cm／secとして、各
カラムの温度を35℃に保つた。第３カラム３の塔
頂圧力は0.1Kg／cm²Ｇであつた。

次いで第３カラム３の第３塔底弁１６からの溶
出液を、不純物だけを含む溶出区分、不純物と補
酵素Q₁₀とを含む区分、おもに補酵素Q₁₀だけを
含む区分および不純物と補酵素Q₁₀とを含む区分
の４つの区分として溶出順に分取した。これらの
溶出液量はそれぞれ3520ml、650ml、1800mlおよ
び830mlであつた。また、吸着カラムクロマトグ
ラフイ開始からの溶媒使用合計量は6800mlであつ
た。おもに補酵素Q₁₀だけを含む区分1800mlから
の溶媒を除去して、純度99.5％の補酵素Q₁₀22.45
ｇを得た。

収得した精製補酵素Q₁₀の回収率は59.4％であ
り収得精製補酵素Q₁₀1ｇ当りの溶媒使用合計量
および充填剤使用合計量はそれぞれ303mlおよび
9.4ｇであつた。

〔発明の効果〕

本発明において補酵素Ｑの回収率は著しく向上
し、また精製補酵素単位重量当りの充填剤使用量
および溶剤使用量が大きく節減される。従つて、
本発明は吸着カラムクロマトグラフイによる方法
でありながら、補酵素Ｑの工業規模での精製が可
能となる。しかも本発明によつて得られた補酵素
Ｑの純度は高い。

【図面の簡単な説明】

第１図は粗製補酵素Ｑの溶出パターンの一例を
示し、第２図は本発明のために使用される精製装
置のフローシートの一例を示す。なお、図面にお
いて１……第１カラム、２……第２カラム、３……
第３カラム、４……第１塔頂管、５……第２塔頂
管、６……第３塔頂管、７……塔頂連絡管、８…
…第１塔頂弁、９……第２塔頂弁、１０……第３
塔頂弁、１１……第１塔底管、１２……第２塔底
管、１３……第３塔底管、１４……第１塔底弁、
１５……第２塔底弁、１６……第３塔底弁、１７
……第１検出器、１８……第２検出器、１９……
第３検出器、２０……第１連絡管、２１……第２
連絡管、２２……第１連絡弁、２３……第２連絡
弁、および２４……供給管。

Claims

【特許請求の範囲】

１粗製補酵素Ｑを吸着カラムクロマトグラフイ
で精製するに際し、互いに直列に接続された複数
のカラムを使用し、粗製補酵素Ｑ溶液を該カラム
へ順次通過させて粗製補酵素Ｑ溶液中の不純物含
有量を順次低下させ、最終カラムから主成分が補
酵素Ｑである区分を回収することを特徴とする補
酵素Ｑの精製法。