JPH0581237B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、１原子酸素添加活性およびそれに必
要なNADPHからの還元力供給能力を同一分子
内に有する新規な酸化酵素、該酸化酵素をコード
する遺伝子、該遺伝子を含む酵母内発現プラスミ
ドおよび該発現プラスミドにより形質転換された
酵母菌株に関する。 更に詳しくはチトクロムP450（以下、P450と称
する）の有する１原子酸素添加活性および
NADPH−チトクロムP450還元酵素（以下、還
元酵素と称する）の有するNADPHAからの還元
力供給能を同一分子内に有する酸化酵素、該感化
酵素をコードする融合酵素遺伝子、該遺伝子を含
む酵母内発現プラスミドおよび該発現プラスミド
により形質転換された酵母菌株並びに該形質転換
酵母菌株を培養することを特徴とする該酸化酵素
を製造方法に関する。 本発明の背景 P450は微生物から哺乳動物にいたるまで広く
生物界に存在するヘム蛋白質であり、広範囲の脂
溶性化合物を基質として、１原子酸素添加反応を
触媒する。P450の示すこうした広範囲な基質特
異性はP450の分子多様性に起因する。すなわち、
P450には多数の分子種が存在し、各々は基質特
異性の幅が広く、しかも重複しており、広範囲の
脂溶性化合物を基質とすることができる。しかし
ながら、多数のP450に電子を供給する系路は共
通でありミクロソームでは主として、フラビンア
デニンジヌクレオチドとフラビンモノヌクレオチ
ドを分子内に補酵素として含有する還元酵素が
NADPHからの電子を基質を結合したP450へ供
給する。従つて、P450は基質と結合し、還元酵
素と共役することによりはじめて１原子酵素添加
反応を発揮する。 本発明者らはすでにラツトの肝に存在する
P450MCおよびラツト還元酵素の遺伝子を単離
し、酵母を宿主としてこれらの遺伝子を発現さ
せ、１原子酸素添加反応を示す酵素蛋白質を生産
させることに成功した（特開61−88878、特開61
−56702、特願62−019085、特願62−104582）。ま
た、さらに研究を進め、P450MCと還元酵素を同
時に酵母細胞内で発現させることを目的とした
P450MCと還元酵素の同時発現酵母菌株の作製
（特開63−104582）やP450MCと還元酵素の両遺
伝子を接続することにより単一の遺伝子とし、単
一分子内で電子伝達と基質の酸化の両機能を有し
た融合酵素を発現する酵母菌株の作製（特開63−
44888）を実施した。 糖質の代謝を支配し、肝にグリコーゲンを沈着
させる作用を有する糖質（グルコ）コルチコイド
は抗炎症、抗アレルギー作用をも有するので医薬
品として広く用いられる。ヒト体内ではプロゲス
テロン、17−ヒドロキシプロゲステロンを経て生
合成される。コルチコイドは医薬品として高価な
ものが多く、現在は全合成法あるいは発酵法によ
る多段階反応によつて製造されている。本発明者
らはすでにウシの副腎に存在するP450₁₇αの遺伝
子を単離し、酵母を宿主としてこの遺伝子を発現
させ、プロゲステロンから17−ヒドロキシプロゲ
ステロンを製造することに成功した（特願62−
204101）。P450₁₇αは本来、哺乳動物の副腎、睾
丸などに存在し、17位水酸化活性およびC_17-20位
側鎖切断活性を有することが既知であり、プロゲ
ステロンから17−ヒドロキシプロゲステロンを経
て、アンドロステンジオン（あるいはプレグネノ
ロンから17−ヒドロキシプレグネノロンを経てデ
ヒドロエピアンドロステンン）を生成する。しか
し、本発明者らが作製したP450₁₇α発現酵母菌株
は、高い17位水酸化活性を示したが、C_17-20位側
鎖切断活性は示さず、17−ヒドロキシプロゲステ
ロン（あるいは17−ヒドロキシプレグネノロン）
のみを生成した。これは、ウシの副腎や睾丸など
の細胞と酵母とでは膜の構成成分などの環境因子
が大きく異なりP450₁₇αの存在状態が異なること
によると考えられる。この反応性はプロゲステロ
ンから17−ヒドロキシプロゲステロンを経てグル
ココルチコイドを製造するのに非常に有利であ
る。 発明の構成 今回、本発明者らは、さらに研究を発展させ、
ウシP450₁₇α遺伝子と酵母還元酵素遺伝子（特願
62−325527）を接続させることにより単一の遺伝
子とし、P450の有する１原子酸素添加活性およ
びNADPH−P450還元酵素の有するNADPHか
らの還元力供給能を同一分子内に併せ持つた酸化
酵素をコードする融合酵素遺伝子を構築し、これ
を酵母内発現ベクターに導入し、発現プラスミド
を構築した。 該発現プラスミドを導入した酵母菌株はP450
と酵母還元酵素との融合酵素を産生し、１原子酸
素添加活性を示した。その酸化活性は、P450₁₇α
の単独発現酵母菌株よりも菌体あたりでは約３〜
５倍、P450分子あたりでは約４〜８倍と、酸化
反応プロセスなどへの有用性が高いことが判明し
た。 P450₁₇αのミクロソーム膜への結合、基質の結
合およびヘム結合に関与する領域は、それぞれ、
アミノ末端部分、中央部分およびカルボキシル末
端側のHR2領域であることはすでに推定されて
いる。 一方、酵母還元酵素のミクロソーム膜への結
合、フラビンモノヌクレオチドやフラビンアデニ
ンジヌクレオチド結合およびNADPH結合に関
与する領域はアミノ末端メチオニンを１番とする
とそれぞれ１から50番目まで、50から465番目ま
で、および465から600番目までのアミノ酸である
ことも推定されている。 本発明の融合酵素遺伝子は、P450₁₇α遺伝子の
うち少なくとも基質結合に関与する領域とヘム結
合に関与する領域を含む部分と、酵母還元酵素遺
伝子（特願No.62−325527）のうち少なくともフラ
ビンモノヌクレオチドやフラビンアデニンジヌク
レオチド結合に関与する領域とNADPH結合に
関与する領域を含む部分とをリンカーのより接続
することにより構築することができる。 発現プラスミド構築に用いたP450₁₇αおよび還
元酵素のコーデイング領域に相当するcDNAは、
本発明の技術分野において用いられる常法により
製造することができる。例えば、ウシ副腎P450₁₇
αについて言えば、このcDNAを含むプラスミド
（J.BIOL.CHEM.2612475（1986）；特願62−
204101）から常法によりこの遺伝子を取り出すこ
とができる。また、還元酵素遺伝子についても同
様であり、これを含むプラスミドpgCYR（特願62
−305885）から取り出すことが可能である。 本発明の融合酵素を発現する発現プラスミドは
上述の通り構築した融合遺伝子を適当な発現プラ
スミドに常法により挿入し、構築することができ
る。発現プラスミドとしては公知の発現ベクター
を用いることができる。例えば酵母アルコール脱
水素酵素（ADHI）遺伝子のプロモーターおよび
同ターミネーターを保持する酵母発現ベクター
pAAH5（Washington Research Fundationから
入手可能、Methods in Enzymology，101 part
Cp.192−201，Ammererらの方法により製造でき
る。）などを挙げることができるがPGKプロモー
ター、G3PDHプロモーター、GAL10プロモータ
ーを有する発現ベクターなど、宿主内で効率よく
機能するプロモーター、ターミネーターを有する
ものであればよく、特に限定されるものではな
い。また、発現プラスミドの構造も限定されるも
のでなく、酵母内で安定に保持されるものであれ
ばよい。 本発明の融合酵素の発現には、酵母、例えばサ
ツカロミセス・セレビシエAH22株、サツカロミ
セス・セレビシエSHY3株やサツカロミセス・セ
レビシエNA87−11A株などが宿主として好都合
に使用できる。これらの宿主の上記の本発明の融
合遺伝子を含む発現プラスミドによる形質転換は
アルカリ金属（LiCl）を用いる方法、プロトプラ
スト法など公知の方法により行なうことができ
る。 このようにして得られた形質転換酵母を培養す
ることにより本発明の融合酵素を製造することが
できる。 本発明により得られる形質転換酵母の培養は通
常の培養方法により行なうことができる。 以下、実施例に基づき、本発明を詳細に説明す
るが、本発明は実施例に限られるものではなく、
通常、本発明分野で行われている程度の変更を含
むものである。 実施例１ 発現プラスミドの構築 図１にプラスミドpαLY1′，pαLY1，pαLY2，
pαLY3，pαLY4，の構造をしめした。P450₁₇α
の遺伝子を〓〓で、還元酵素遺伝子を〓〓で、合
成DNAリンカーを〓〓で示した。各プラスミド
の上側の数字は、アミノ末端Metを１番とした場
合のP450₁₇αのアミノ酸の番号であり、下側の数
字は、還元酵素のアミノ酸の番号である。また▼
は、還元酵素が、パパインにより切断される部位
を表す。還元酵素のこの部位よりアミノ末端側
は、ミクロソーム膜への結合に関与することが推
定されている。全プラスミドとも、P450₁₇α部分
は、その全コーデイング領域を含む。一方、還元
酵素部分は、pαLY4が最も短くパパインによる
切断部位を含まない。このpαLY4のP450₁₇αと
還元酵素との接続部分に合成リンカーを挿入し、
両ドメインが衝突しやすくなることにより、いつ
そう効率よく電子伝達が行われることを目的とし
てpαLY1′，pαLY1，pαLY2，pαLY3，を構築し
た。pαLY3は９アミノ酸分、pαLY1′および
pαLY2は16アミノ酸分、pαLY1′およびpαLY1は
27アミノ酸分pαLY4より長い。以下に、各発現
プラスミドの製造を詳細に説明する。 実施例１−１ 発現プラスミドpαLY4の構築 図２にプラスミドpαLY4構築の概要を示した。 〔ステツプ１〕プラスミドpUR（ｓ）の構築 P450₁₇αcDNAのアミノ末端部分を含むプラス
ミドpαNR（Ｈ）（特願62−204101）を制限酵素
HphとEcoRで同時に切断した。反応混液を
低融点アガロース電気泳動に供し、P450₁₇αアミ
ノ末端コーデイング領域に相当する約250kbの断
片を回収した。 この断片と合成リンカー： 5′−AGCTTAAAAAAATGTGGCTGCTCCTGGCTGTC ATTTTTTTACACCGACGAGGACCGACA−5′ （左右両端にそれぞれHind、Hphを有す
る。以下、合成DNAは全てアプライド・バイオ
システム社製380A型シンセサイザーを用いて合
成した。）とをプラスミドpUC19のHind−
EcoR部位に挿入し、目的とするプラスミド
pαN（Ｈ）２を得た。こうして得られたプラスミ
ドpαN（Ｈ）２と、P450₁₇αのカルボキシル末端
コーデイング領域を含むプラスミドpαC（Ｈ）（特
願62−204101）とを制限酵素HindとEcoRで
同時に切断した。反応混液を低融点アガロース電
気泳動に供し、P450₁₇αアミノ末端およびカルボ
キシル末端コーデイング領域に相当するそれぞれ
約285bp，1400bpの断片を回収した。これらの両
断片を酵母発現ベクターpAAHのHind部位に
挿入し、P450₁₇αの単独発現プラスミドpAα2を
得た。得られたプラスミドpAα2を制限酵素Hha
で切断した。反応混液を低融点アガロース電気
泳動に供し、P450₁₇αカルボキシル末端コーデイ
ング領域に相当する約240bpのDNA断片を回収
した。このHha−Hha断片にあらかじめ5′−
末端をリン酸化し、アニーリングを行つた合成リ
ンカーSL1： 5′−CCAGGCCTGGAAGGAAGCCCAGGCTGAGGGG GCGGTCCGGACCTTCCTTCGGGTCCGACTCCCCAGCT−5
′ （左右両端に、それぞれHha，Sal認識部
位を有する。）を加え、T4 DNAリガーゼにより
反応を行なつた。ついで制限酵素PstとSalで
同時に切断し、反応液にNaClおよびエタノール
を加え、エタノール沈澱を行つた。回収した
P450₁₇αカルボキシル末端コーデイング領域に相
当する約140bpのPst−Sal切断をプラスミド
pUC18のPst，Sal部位にサブクローニング
し、プラスミドpUα−PSを得た。次にプラスミ
ドpAα2を制限酵素HindとPstで同時に切断
し、反応混液を低融点アガロースゲル電気泳動に
供し、P450₁₇αアミノ末端コーデイング領域に相
当する約185bpの断片を回収した。一方、上記プ
ラスミドpUα−PSを制限酵素HindとPstで
同時に切断し、同様の方法で約2.8kbの断片を回
収した。この断片と前述のP450₁₇αアミノ末端コ
ーデイング領域に相当する約185bpの断片とのリ
ガーゼ反応を行なつた。このようにしてプラスミ
ドpUΔαを得た。さらにプラスミドpAα2を制限
酵素Pstで切断し、反応混液を低融点アガロー
スゲル電気泳動に供し、P450₁₇αの中央コーデイ
ング領域に相当する約1200bpの断片を回収した。
この断片を上記プラスミドpUΔαのPst部位に
挿入し、目的とするプラスミドpUα（ｓ）を得た。 〔ステツプ２〕プラスミドpUYR717（Ｂ）の構
築 酵母還元酵素cDNAインサートを含むプラスミ
ドpgCYR（特願62−325527）を制限酵素EcoR
で切断した。反応混液を低融点アガロースゲル電
気泳動に供し、還元酵素アミノ末端側コーデイン
グ領域、カルボキシル末端側コーデイング領域に
相当するそれぞれ約410bp，1690bpの断片を回収
した。それぞれの断片をプラスミドpUC19の
EcoR部位にサブクローニングし、アミノ末端
側断片が、挿入されたプラスミドpUYR7とカル
ボキシル末端側断片が挿入されたプラスミド
pUYR17を得た。プラスミドpUYR17を制限酵素
EcoRで部分切断し、市販のHindリンカーを
挿入しプラスミドpUYR17（Ｈ）を得た。一方、
上記プラスミドpUYR7を制限酵素EcoRで切断
し、反応混液を低融点アガロースゲル電気泳動に
供し、還元酵素アミノ末端側コーデイング領域に
相当する約410bpの断片を回収した。この断片を
上記プラスミドpUYR17（Ｈ）のEcoR部位に挿
入し、プラスミドpUYR717（Ｈ）を得た。このプ
ラスミドpUYR717（Ｈ）を制限酵素Pvuと
Hindで同時消化した。反応混液を低融点アガ
ロースゲル電気泳動に供し、還元酵素cDNAの約
2.0kb断片を回収した。こうして得られた約2.0kb
のPvu−Hind断片と合成リンカーSL2−１： 5′−GATCCCCCGTCGACCCCAG GGGGCAGCTGGGGTC−5′ （左右両端にそれぞれBamH，Pvu認識部
位をもち、内にSal認識部位を有する。）をプラ
スミドpUC18のBamH−Hind部位に挿入し、
目的とするプラスミドpUYR717（Ｂ）を得た。 〔ステツプ３〕発現プラスミドpαLY4の構築 ステツプ２で得られたプラスミドpUYR717
（Ｂ）を制限酵素BstEで部分切断し、さらに制
限酵素Pvuで切断した。このpUYR717（Ｂ）の
BstE−Pvu部位に市販のClaリンカーを挿
入しプラスミドpUYR4を得た。ステツプ１で得
られたプラスミドpUα（ｓ）と、上記プラスミド
pUYR4を制限酵素HindとSalで同時に消化
した。反応混液を低融点アガロースゲル電気泳動
に供し、P450₁₇αあるいは還元酵素コーデイング
領域に相当するそれぞれ約1540bp，2020bpの断
片を回収した。得られた両断片を酵母発現ベクタ
ーpAAH5のHind部位に挿入し、目的とするプ
ラスミドpαLY4を得た。 実施例１−２ 発現プラスミドpαLY3の構築 図−３に、発現プラスミドpαLY3の概要を示
した。実施例１−１、ステツプ２で得られたプラ
スミドpUα（ｓ）ステツプ２で得られたプラスミ
ドpUYR717（Ｂ）を制限酵素HindとSalで同
時に切断した。反応混液を低融点アガロースゲル
電気泳動に供し、P450₁₇αあるいは還元酵素コー
デイング領域に相当するそれぞれ約1540bp，
2050bpの断片を回収した。得られた両断片を酵
母発現ベクターpAAH5のHind部位に挿入し目
的とするプラスミドpαLY3を得た。 実施例１−３ 発現プラスミドpαLY2の構築 図４にプラスミドpαLY2の構築の概要を示し
た。実施例１−１、ステツプ２で得られたプラス
ミドpUYR717（Ｈ）を制限酵素PvuとHind
で同時に切断した。反応混液を低融点アガロース
ゲル電気泳動に供し、還元酵素cDNAの約2.0kb
断片を回収した。こうして得られた約2.0kbの
Pvu−Hind断片と合成リンカーSL2−２： 5′−TCGACCCCATCCGATGACGGAGATATCACAG GGGGTAGGCTACTGCCTCTATAGTGTC−5′ （左右両端にそれぞれSal，Pvu認識部位
を有する。）をプラスミドpUC18のSal−Hind
部位に挿入し、目的とするプラスミド
pUYR717（ｓ）を得た。実施例１−１、ステツプ
１で得られたプラスミドpUα（ｓ）、及び上記プラ
スミドpUYR717（ｓ）を制限酵素HindとSal
で同時に切断した。反応混合液を低融点アガロー
スゲル電気泳動に供し、P450₁₇αあるいは還元酵
素コーデイング領域に相当する、それぞれ約
1540bp，2070bpの断片を回収した。得られた両
断片を酵母発現ベクターpAAH5のHind部位に
挿入し、目的とするプラスミドpαLY2を得た。 実施例１−４ 発現プラスミドpαLY1′，pαLY1
の構築 図５にプラスミドpαLY1′，pαLY1構築の概要
を示した。実施例１−１、ステツプ２で得られた
プラスミドpUYR717（Ｂ）のPvu部位に合成リ
ンカーSL3： 5′−CTGTGATATCTCCGTCATCGGACAGTAGCACGGCAAGCA GACACTATAGAGGCAGTAGCCTGTCATCGTGCCGTTCGT CTAGCCCCGCCAGGA GATCGGGGCGGTCCT−5′ あるいは合成リンカーSL4： 5′−TAAAGAGAAACTCCATCAAGGAACTGCTGATGTCCGAT ATTTCTCTTTGAGGTAGTTCCTTGACGACTACAGGCTA GACGGAGATATCACAG CTGCCTCTATAGTGTC−5′ を挿入しプラスミドpUYR1′あるいはpUYR1を
得た実施例１−１、ステツプ１で得たプラスミド
pUα（ｓ）と上記プラスミドpUYR1′あるいは
pUYR1を制現酵素HindとSalで同時消化し
た。反応混液を低融点アガロースゲル電気泳動に
供し、P450₁₇αあるいは還元酵素コーデイング領
域に相当するそれぞれ約1540bp，2050bp，ある
いは2100bpの断片を回収した。得られた両断片
を酵母発現ベクターpAAH5のHind部位に挿入
し、目的とするプラスミドpαLY1′あるいは
pαLY1を得た。 実施例２ 構築したプラスミドによる酵母の形質
転換 サツカロミセス・セレビシエー
（Saccharomyces cerevisiae）AH22株
〔ATCC38626〕を５mlのYPD培地（１％酵母エ
キス、２％ポリペプトン、２％グリコース）中で
30℃で18時間培養したのち、１mlの酵母培養液を
遠心し、集菌した。得られた菌体を0.2M LiCl溶
液１mlで洗浄した後、1M LiCl溶液20μに懸濁
した。これに70％ポリエチレングリコール4000溶
液30μ、プラスミドpαLY1′，pαLY1，pαLY2，
pαLY3あるいはpαLY4溶液10μ（約1μg相当）
を添加して、十分に混合したのち30℃１時間でイ
ンキユベートした。ついで、140μの水を加え、
よく攪拌したのち、この溶液をSD合成培地プレ
ート（２％グルコース、0.67％アミノ酸不含酵母
窒素源、20μg／mlヒスチジン、２％寒天）上に
まき、30℃でインキユベートすることにより、プ
ラスミドpαLY1′，pαLY1，pαLY2，pαLY3およ
びpαLY4を保有する形転換体AH22（pαLY1′），
AH22（pαLY1），AH22（pαLY2），AH22
（pαLY3）およびAH22（pαLY4）をそれぞれ得
た。 実施例３ P450₁₇αと還元酵素の融合蛋白質発現
量の定量 実施例２で得た、AH22（pαLY1′），AH22
（pαLY1），AH22（pαLY2），AH22（pαLY3）お
よびAH22（pαLY4）をSD合成培地（２％グルコ
ース、0.67％アミノ酸不含酵母窒素源、20μg／ml
ヒスチジン）でそれぞれ約２×10⁷細胞／mlまで
培養し、集菌して100mMリ酸カリウムPH7.0で洗
浄したのち100mリン酸カリウムPH7.0、２mlに懸
濁した。２本のキユベツトに菌懸濁液を１mlずつ
分注し、サンプル側キユベツトに一酸化炭素をふ
き込んだのち、両キユベツトにジチオナイト５〜
10mgを添加した。よく、攪拌したのち400〜
500nmの差スペクトルを測定し、Δε＝91mM^-1cm
^−１という値をもとにして、ヘム含有P450量を算
出した。その結果、表１に示すようにAH22
（pαLY1′）株、AH22（pαLY1）株、AH22
（pαLY2）株、AH22（pαLY3）株およびAH22
（pαLY4）株は それぞれ菌体あたり約0.7×10⁵
分子、0.4×10⁵分子、0.9×10⁵分子、0.7×10⁵分
子、および0.9×10⁵分子のヘム含有P450蛋白質を
産生することが判明した。 実施例４ 形質転換酵母菌株のプロゲステロン17
位水酸化による17−ヒドロキシプロゲステロン
生成量の測定 SD合成培地で約0.7×10⁷細胞／mlまで培養し
た形質転換酵母AH22（pαLY1′）株、AH22
（pαLY1）株、AH22（pαLY2）株、AH22
（pαLY3）、AH22（pαLY4）株およびAH22
（pAAH5）株とP450₁₇αのみを産生したAH22
（pAα1）株（特願62−204101）の培養液中にそれ
ぞれ3μCiの〔³H〕−プロゲステロンを含む1mM
プロゲステロン−エタノール溶液を基質濃度が最
終的に10μMとなるように添加した。30℃で振盪
培養し、０，１，２，６時間後に１mlずつ分取し
遠心分離して得た上清0.8mlに２mlジクロロメタ
ンを添加し、激しく攪拌した。遠心分離後、ジク
ロロメタン層１mlを乾燥させ、残渣を0.5mMプ
ロゲステロン、0.5mM17−ヒドロキシプロゲス
テロン、0.5mMアンドロステンジオンを含むエ
タノール−酢酸エチル等容量溶液20μに溶解
し、10μを薄層プレートにアプライした。25％
酢酸エチルを含むクロロホルム溶液により、室温
で50分間展開した後、紫外線を照射し、プロゲス
テロン、17−ヒドロキシプロゲステロン、アンド
ロステンジオンの位置に相当する薄層ゲル部分を
かきとり、液体シンチレーシヨンカウンターによ
り放射活性を測定した。 その結果、形質転換酵母AH22（pαLY1′）株、
AH22（pαLY1）株、AH22（pαLY2）株、AH22
（pαLY3）株およびAH22（pαLY4）株で６時間
後に、それぞれ88％，86％，89％，90％および89
％のプロゲステロンが17−ヒドロキシプロゲステ
ロンに変換したことがわかつた（図６）。一方、
コントロールに用いたAH22（pAAH5）株では活
性は認められなかつた。またC_17-20位側鎖切断活
性によるアンドロステンジオンの生成は全ての株
で認められなかつた。 基質添加後１時間での17−ヒドロキシプロゲス
テロンへの変換率をもとに各種形質転換株の菌体
当たりの17−ヒドロキシプロゲステロン生産量を
算出した。P450₁₇αのみを生産しているAH22
（pAα1）株（特願62204101）を１とした場合、融
合酵素を産生しているAH22（pαLY1′）株、
AH22（pαLY1）株、AH22（pαLY2）株、AH22
（pαLY3）株およびAH22（pαLY4）株では、そ
れぞれ4.7，3.2，5.0，4.7，および3.2と増加して
いた。 なお、本発明の融合酵素系における水酸化活性
と従来の単なる混合酵素系における水酸化活性の
比較のために用いた菌体は、P450₁₇αのみを生産
しているAH22（pAα1）株であり、該酵母株には
内在性の酵母還元酵素がもともと存在している。
その量は0.3X10⁵分子／細胞である。すなわち、
AH22（pAα1）株は、1.0X10⁵分子／細胞の割合
でP450₁₇αと0.3X10⁵分子／細胞の割合で還元酵
素を単なる混合状態で有する形質転換酵母株であ
る。 以上の結果から、P450₁₇αと還元酵素の融合酵
素を用いる酵素融合系はP450₁₇αと還元酵素の単
なる酵素混合系の場合に比べてより効率よく電子
伝達系を構成し、高い１原子酸素添加の反応を示
すことが明らかになつた。 さらに、代謝回転速度（表１記載のヘム含有
P450蛋白質含量あたりの17位水酸化活性）に関
して、表１のデータに基づき計算すると、AH22
（pαLY1′），AH22（pαLY1），AH22（pαLY2），
AH22（pαLY3）は各々6.7，8.0，5.6，6.7であり、
その値が比較のための単なる酵素混合系の値1.0
に比べて極めて高いことが明確になる。また、上
記の試験と同様に、代謝回転速度に関して本発明
の融合酵素系における水酸化活性と他の混合酵素
系（非融合のままの状態で、P450₁₇αと外来の酵
母還元酵素を独立して存在する単なる酵素混合
系）の比較においてもすぐれた効果を示した。従
つて、これらの融合酵素は非常に高い能力を有す
ることが明らかとなつた。 発明の効果 本発明によつて得られた形質転換酵母菌株はヘ
ムを含有し、１原子酸素添加活性を有する、
P450₁₇αと還元酵素との融合酵素を産生した。本
発明の酵母菌株はその培養液中にプロゲステロン
を添加し、インキユベートすることによつて17−
ヒドロキシプロゲステロンを生産した。この際、
基質転換後６時間後転換率は、約90％と非常に高
く生成物である17−ヒドロキシプロゲステロンの
ほとんどが培地中に分泌される。従つて、遠心分
離や濾過、適当な吸着剤などを使用することによ
り、容易に17−ヒドロキシプロゲステロンを回収
することが可能である。一方、酵母菌体は再使用
が可能である。さらに本発明の酵母菌株はC_17-20
位側鎖切断活性は持ち合わせていないので、医薬
品として高価なグルココルチコイドを製造するの
に非常に好都合である。従つて本発明の酵母菌株
を医薬品として有用である前述ステロイド類合成
のためのバイオリアクターとして用いれば、現在
行われている、発酵と合成を組み合わせた多段階
反応による製造をより単純化することが可能とな
る。 【表】

【図面の簡単な説明】

図−１は、本発明のプラスミドの構造とプラス
ミドがコードする融合酵素のアミノ酸数をしめ
す。〓〓はP450₁₇αコーデイング領域、〓〓は還
元酵素コーデイング領域、〓〓、〓〓は合成リン
カーを示す。▼は還元酵素がパパインにより切断
される部位を表す。各プラスミド上側の数字はア
ミノ末端Metを１番とした場合のP450₁₇αのアミ
ノ酸の番号であり、下側の数字は還元酵素のアミ
ノ酸の番号である。また、図の右端に融合酵素の
アミノ酸数をP450₁₇α由来と、合成リンカー由来
とに分けて記載した。図−２は本発明のプラスミ
ドpαLY4の構築工程示す。図−３は本発明のプ
ラスミドpαLY3の構築工程示す。図−４は本発
明のプラスミドpαLY2の構築工程示す。図−５
は本発明のプラスミドpαLY1′，pαLY1の構築工
程示す。図２，３，４，５全てにおいて、Hd，
Hh，Ps，Hp，Sa，Ec，Pv，Bm，Bs，Clはそ
れぞれ制限酵素Hind，Hha，Pst，Hph
，Sal，EcoR，Pvu，BamH，BstE
，Claの認識部位を示す。〓〓はP450₁₇αコ
ーデイング領域、〓〓は還元酵素コーデイング領
域、〓〓、〓〓は合成リンカーを示す。図−６は
各種形質転換株のプロゲステロン17位水酸化活性
を示す。縦軸は、17−ヒドロキシプロゲステロン
への変換率を、横軸は、培養時間を示す。×−×
はAH22（pAAH5）株、●−●はAH22（pαLY1′）
株、○−○はAH22（pαLY1）株、□−□は
AH22（pαLY2）株、■−■はAH22（pαLY3）
株、△−△はAH22（pαLY4）株、▲−▲は
AH22（pAα1）を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ウシ副腎チトクロムP450₁₇αをコードする遺
   伝子と酵母NADPH−チトクロムP450還元酵素
   をコードする遺伝子が融合した融合酵素遺伝子。 ２ 請求項１に記載の遺伝子を含み、該酸化酵素
   を発現する酵母発現プラスミド。 ３ 酵母発現プラスミドpαLY1′，pαLY1，
   pαLY2，pαLY3或いはpαLY4として特定される
   請求項２記載のプラスミド。 ４ 請求項２記載の酵母発現プラスミドを保持す
   る形質転換酵母菌株。 ５ サツカロミセス セレビシエ−AH22
   （pαLY1′）株、AH22（pαLY1）株、AH22
   （pαLY2）株、AH22（pαLY3）株あるいはAH22
   （pαLY4）株として特定される請求項４記載の形
   質転換酵母菌株。 ６ ウシ副腎チトクロムP450₁₇αと酵母NADPH
   −チトクロムP450還元酵素との融合酵素。 ７ 請求項４記載の形質転換酵母菌株を培養する
   ことを特徴とする該酸化酵素の製造方法。 ８ 請求項４記載の形質転換酵母菌株によりプロ
   ゲステロンおよびプレグネノロン水酸化を特徴と
   する17−ヒドロキシプロゲステロン、17−ヒドロ
   キシプレグネノロンの製造方法。