JPH0223870A - チトクロムＰ４５０↓１↓７αと酵母ＮＡＤＰＨ‐チトクロムＰ４５０還元酵素の融合酸化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ｌ原子酸素添加活性およびそれに必要なＮＡ
ＤＰＨからの還元力供給能ノｊ壱同−分子内に有する新
規な酸化酵素、該酸化酵素をコードする遺伝子、該遺伝
子を含む酵母的発現プラスミドおよび該発現プラスミド
により形質転換された酵母菌株に関する。

更に詳しくはチトクロムＰ４５０　（以下、Ｐ２Ｓ５と
称する）の有するｌ原子酸素添加活性およびＮＡＤＰＩ
ＩチトクロムＰ４５０還元酵素（以下、還元酵素と称す
る）の有するＮＡＤＰＨからの還元力供給能を同一分子
内に有する酸化酵素、該酸化酵素をコードする融合酵素
遺伝子、該遺伝子を含む酵母内発現プラスミドおよび該
発現プラスミドにより形質転換された酵母菌株並びに該
形質転換酵母菌株を培養することを特徴とする該酸化酵
素を製造方法に関する。

本光奥□□□背景 Ｐ２Ｓ５は微生物から哺乳動物にいたるまで広く生物界
に存在するヘム蛋白質であり、広範囲の脂溶性化合物を
基質として、１原子酸素添加反応を触媒する。　Ｐ２Ｓ
５の示すこうした広範囲な基質特異性はＰ２Ｓ５の分子
多様性に起因する。すなわち、Ｐ２Ｓ５には多数の分子
種が存在し、各々は基質特異性の幅が広く、しかも重複
しており、広範囲の脂溶性化合物を基質とすることがで
きる。しかしながら、多数のＰ２Ｓ５に電子を供給する
糸路は共通でありミクロソームでは主として、フラビン
アデニンジヌクレオチドとフラビンモノヌクレオチドを
分子内に補酵素として含有する還元酵素がＮＡＤＰＨか
らの電子を基質を結合したＰ２Ｓ５へ供給する。従って
、Ｐ２Ｓ５は基質と結合し、還元酵素と共役することに
よりはじめて１原子酵素添加反応を発揮する。

本発明者らはすでにラットの肝に存在するＰ２Ｓ５肛お
よびラント還元酵素の遺伝子を単離し、酵母を宿主とし
てこれらの遺伝子を発現させ、１原子酸素添加反応を示
す酵素蛋白質を生産させることに成功した（時開６１−
８８８７８、時開６１−５６７０２、特別６２−０１９
０８５、特別６２−１０４５８２）、また、さらに研究
を進め、Ｐ４５０ＭＣと還元酵素を同時に酵母細胞内で
発現させることを目的としたＰ４５０ＭＣと還元酵素の
同時発現酵母菌株の作製（時開６３−１０４５８２）や
Ｐ４５０ＭＣと還元酵素の両遺伝子を接続することによ
り単一の遺伝子とし、単一分子内で電子伝達と基質の酸
化の両機能を有した融合酵素を発現する酵母菌株の作製
（時開６３−４４８８８）を実施した。

糖質の代謝を支配し、肝にグリコーゲンを沈着させる作
用を有する糖質（グルコ）コルチコイドは抗炎症、抗ア
レルギー作用をも有するので医薬品として広く用いられ
る。ヒト体内ではプロゲステロン、１７−ヒドロキシプ
ロゲステロンを経て生合成される。コルチコイドは医薬
品として高価なものが多く、現在は全合成法あるいは発
酵法による多段階反応によって製造されている０本発明
者らはすでにウシの副腎に存在するＰ４５０１７αの遺
伝子を単離し、酵母を宿主としてこの遺伝子を発現させ
、プロゲステロンから１７−ヒドロキシプロゲステロン
を製造することに成功した（特ＶＡ６２−２０４１０１
）、　Ｐ４５０＋、αは本来、哺乳動物の副腎、翠丸な
どに存在し、１７位水酸化活性およびＣ＋ｔ−Ｚ。位側
鎖切断活性を有することが既知であり、プロゲステロン
から１７−ヒドロキシプロゲステロンを経て、アンドロ
ステンジオン（あるいはプレグネノロンから１７−ヒド
ロキシプレグネノロンを経てデヒドロエピアンドロステ
ンン）を生成する。しかし、本発明者らが作製したＰ２
Ｓ５１　？α発現酵母菌株は、高い１７位水酸化活性を
示したが、Ｃ＋ｔ−Ｘ。位側鎖切断活性は示さず、１７
−ヒドロキシプロゲステロン（あるいは１７−ヒドロキ
シプレグネノロン）のみを生成した。これは、ウシの副
腎や來丸などの細胞と酵母とでは膜の構成成分などの環
境因子が大きく異なりＰ４５０＋ｖαの存在状態が異な
ることによると考えられる。この反応性はプロゲステロ
ンから１７−ヒドロキシプロゲステロンを経てグルココ
ルチコイドを製造するのに非常に有利である。

発明の溝底 今回、本発明者らは、さらに研究を発展させ、ウシＰ４
５０ｒｖα遺伝子と酵母還元酵素遺伝子（特別６２−３
２５５２７）を接続させることにより単一の遺伝子とし
、Ｐ２Ｓ５の有する１原子酸素添加活性およびＮＡＤＰ
ＩＩ−Ｐ４５０還元酵素の有するＮＡＤＰＩＩからの還
元力供給能を同一分子内に併せ持った酸化酵素をコード
する融合酵素遺伝子を構築し、これを酵母内発現ヘクタ
ーに導入し、発現プラスミドを構築した。

該発現プラスミドを導入した酵母菌株はＰ２Ｓ５と酵母
還元酵素との融合酵素を産生し、ｌ原子酸素添加活性を
示した。その酸化活性は、Ｐ４５０Ｉ、αの単独発現酵
母菌株よりも菌体あたりでは約３〜５倍、１４５０分子
あたりでは約４〜８倍と、酸化反応プロセスなどへの有
用性が高いことが判明した。

Ｐ２Ｓ５　＋　ｑαのミクロソーム膜への結合、基質の
結合およびヘム結合に関与する領域は、それぞれ、アミ
ノ末端部分、中央部分およびカルボキシル末端側のＨＲ
２ＧＷ域であることはすでに推定されている。

一方、酵母還元酵素のミクロソーム膜への結合、フラビ
ンモノヌクレオチドやフラビンアデニンジヌクレオチド
結合およびＮＡＤＰＨ結合に関与する領域はアミノ末端
メチオニンを１番とするとそれぞれｌから５０番目まで
、５０から４６５番目まで、および４６５から６００番
目までのアミノ酸であることも推定されている。

本発明の融合酵素遺伝子は、Ｐ４５０１７α遺伝子のう
ち少な（とも基質結合に関与する領域とヘム結合に関与
する領域を含む部分と、酵母還元酵素遺伝子（特ＩＨＮ
ｏ、６２−３２５５２７）のうち少なくともフラビンモ
ノヌクレオチドやフラビンアデニンジヌクレオチド結合
に関与する領域とＮＡＤＰＨ結合に関与する領域を含む
部分とをリンカ−のより接続することにより構築するこ
とができる。

発現プラスミド構築に用いたＰ４５０１？αおよび還元
酵素のコーディング領域に相当する。ＤＮＡは、本発明
の技術分野において用いられる常法により製造すること
ができる６例えば、ウシ副腎Ｐ４５０　＋　ｑαについ
て雪えば、このｃＤＮ＾を含むプラスミド（Ｊ、Ｂ　Ｉ
ＯＬ、　　ＣＨＥＭ、　２６１．２４７５　（１９８６
）；時間６２−２０４１０１）から常法によりこの遺伝
子を取り出すことができる。また、還元酵素遺伝子につ
いても同様であり、これを含むプラスミドｐｇＣＹＲ（
時間６２３０５８８５）から取り出すことが可能である
。

本発明の融合酵素を発現する発現プラスミドは上述の通
り横築した融合遺伝子を適当な発現プラスミドに常法に
より挿入し、構築することができる０発現プラスミドと
しては公知の発現ベクターを用いることができる０例え
ば酵母アルコール脱水素酵素（ＭＤＩｌｌ）遺伝子のプ
ロモーターおよび同ターミネータ−を保持する酵母発現
ベクターｐＡＡＨ５（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　Ｆｕｎｄａｔｉｏｎから入手可能、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏｇｙ＋　１０１　ｐ
ａｒｔ　Ｃｐ、　１ｌ９２−２０１Ａ＋ｗｅｒｅｒらの
方法により製造できる。）などを挙げることができるが
Ｆ’ｌＪプロモーター、Ｃ３ＰＩ）＋１ブｏモーｙ−２
ＧＡＬＩＯプロモーターを有する発現ベクターなど、宿
主内で効率よく機能するプロモーター、ターミネークー
を有するものであればよく、特に限定されるものではな
い、また、発現プラスミドの構造も限定されるものでな
く、酵母内で安定に保持されるものであればよい。

本発明の融合酵素の発現には、酵母、例えばサツカロミ
セス・セレビンエ＾Ｈ２２株、サツカロミセス・セレビ
シェ５ＨＹＳ株やサツカロミセス・セレビシェＮＡ３７
−１１Ａ株などが宿主として好都合に使用できる。これ
らの宿主の上記の本発明の融合遺伝子を含む発現プラス
ミドによる形質転換はアルカリ金属（ＬｉＣＩ）を用い
る方法、プロトプラスト法など公知の方法により行なう
ことができる。

このようにして得られた形質転換酵母を培養することに
より本発明の融合酵素を製造することができる。

本発明により得られる形質転換酵母の培養は通常の培養
方法により行なうことができる。

以下、実施例に基づき５本発明の詳細な説明するが、本
発明は実施例に限られるものではなく、通常、本発明分
野で行われている程度の変更を含むも”のである。

実施例１．−　　プラスミドの１築 図１にプラスミドｐαＬＹ１’、ｐαＬＹ１．　ｐαＬ
Ｙ２．　＋１αＬＹ３．ραＬＹ４．の構造をしめした
。Ｐ２Ｓ５．７αの遺伝子をｍで、還元酵素遺伝子をロ
コで、合成りＮＡリンカ−を■で示した。各プラスミド
の上側の数字は、アミン末端Ｍｅｔを１番とした場合の
Ｐ２Ｓ５１　ｆｆαのアミノ酸の番号であり、下側の数
字は、還元酵素のアミノ酸の番号である。またマは、還
元酵素が、パパインにより切断される部位を表す。還元
酵素のこの部位よりアミノ末端側は、ミクロソーム膜へ
の結合に関与することが推定されている。全プラスミド
とも、Ｐ４５０１７α部分は、その全コーディング頭載
を含む。一方、還元酵素部分は、ｐαＬＹ４が最も短く
パパインによる切断部位を含まない。このｐαＬＹ４の
Ｐ４５０＋ｙαと還元酵素との接続部分に合成リンカを
挿入し、両ドメインが衝突しやすくなることにより、い
っそう効率よく電子伝達が行われることを目的としてｐ
αＬＹＩ”、ｐαＬＹＩ、　ｐαＬＹ２．　ｐαＬＹ３
．を構築した。ｐαＬＹ３は９アミノ酸分、ｐαＬＹＩ
°およびｐαＬＹ２は１６アミノ酸分、ραＬＹＩ’お
よびｐα１．Ｙｌは２７アミノ酸分ｐｃｘＬＹ　４より
長い。以下に、各発現プラスミドの製造を詳細に説明す
る。

実施例１−１．　　　プラスミド　αＬＹ４の　築図２
にプラスミドｐαＬＹ４構築の概要を示した。

〔ステップ１〕プラスミドｐＵＲ（ｓ）の構築Ｐ４５０
１？α、ＤＮ＾のアミノ末端部分を含むプラスミドｐα
ＮＲ（Ｈ）　（特Ｉ！１１６２−２０４１０１）を制限
酵素１１ｐｈ■とＥｃｏＲＩで同時に切断した０反応混
液を低融点アガロース電気泳動に供し、Ｐ４５０１７α
アミノ末端コーディング領域に相当する約２５０Ｋｂの
断片を回収した。

この断片と合成リンカ ５′−＾ＧＣＴＴＡＡＡＡ＾＾＾ＴＧＴＧＧＣＴＧＣＴ
ＣＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴＴＴＴＡＣＡＣＣＧＡ
ＣＧＡＧＧＡＣＣＧＡＣＡ　−５’（左右両端にそれぞ
れＨｉｎｄｎｌ、Ｈｐｈ　ｒを有する。以下、合成りＮ
Ａは全てアプライド・バイオシステム社製３８０Ａ型シ
ンセサイザーを用いて合成した。）とをプラスミドｐＨ
ｃ１９の旧ｎｄ　［１−ＥｃｏＲ１部位に挿入し、目的
とするプラスミドｐαＮ（１１）２を得た。こうして得
られたプラスミドｐαＮ（１１）２と、Ｐ４５０＋、α
のカルボキシル末端コーディング領域を含むプラスミド
ｐαＣ（Ｉｔ）（特訓６２−２０４１０１）とを制限酵
素旧ｎｄｌ［［とＥｃｏＲＩで同時に切断した。

反応混液を低融点アガロース電気泳動に供し、Ｐ４５０
１、αアミノ末端およびカルボキシル末端コーディング
領域に相当するそれぞれ約２８５ｂｐ　、　１４００ｂ
ｐの断片を回収した。これらの両断片を酵母発現ヘクタ
ーｐＡＡ＋１のｌｌｉｎｄｌｌｌ部位に挿入し、Ｐ４５
０＋、ｃｒの単独発現プラスミドｐ＾α２を得た。得ら
れたプラスミドｐａα２を制限酵素１１ｈａｌで切断し
た０反応混液を低融点アガロース電気泳動に供し、Ｐ４
５０１７αカルボキシル末端コーディング領域に相当す
る約２４０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＨｈａｌ
−Ｈｈａｌ断片にあらかじめ５゛−末端をリン酸化し、
アニーリングを行った合成リンカ−５ＬＩ： ５’　−ＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＣＡ
ＧＧＣＴＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＴＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣ
ＣＴＴＣＧＧＧＴＣＣＧＡＣＴＣＣＣＣＡＧＣＴ−５（
左右両端に、それぞれＨｈａｌ、５ａｌｌ認識部位を有
する。）を加え、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼにより反応を行
なった。ついで制限酵素Ｐｓｔｌと５ａｌｌで同時に切
断し、反応液にＮａＣｌおよびエタノールを加え、エタ
ノール沈澱を行った０回収したｌ”４５０　＋　’ｒα
カルボキシル末端コーディング領域に相当する約１４０
ｂｐのＰｓｔｌ−５ａ１１切断をプラスミドｐＵｃ１８
のＰｓＬｌ、　５ａｌｌ部位にサブクローニングし、プ
ラスミドｐＵα−Ｐｓを得た０次にプラスミドｐＡα２
を制限酵素旧ｎｄｌ［ｌとＰｓｔｌで同時に切断し、反
応混液を低融点アガロースゲル電気泳動に供し、Ｐ４５
０１ｔαアミノ末端コーディング領域に相当する約１８
５ｂｐの断片を回収した。一方、上記プラスミドｐｕα
−Ｐｓを制限酵素旧ｎｄＤＩとＰｓｔｌで同時に切断し
、同様の方法で約２゜８ｋｂの断片を回収した。この断
片と前述のＰ４５０１７αアミノ末端コーディング領域
に相当する約１８５ｂｐの断片とのりガーゼ反応を行な
った。このようにしてプラスミドｐｔｌΔαを得た。さ
らにプラスミドｐＡα２を制限酵素Ｐｓｔｌで切断し、
反応混液を低融点アガロースゲル電気泳動に供し、Ｐ４
５０１？αの中央コーディング領域に相当する約１２０
０ｂｐの断片を回収した。この断片を上記プラスミドｐ
ｕΔαのＰｓｔ１部位に挿入し、目的とするプラスミド
ｐＵα（ｓ）を得た。

〔ステップ２］プラスミドｐＵＹＲ７１７（Ｂ）　（７
）構築酵母還元酵素ｃＤＮ＾インサートを含むプラスミ
ドｐｇＣＹＲ（特訓６２−３２５５２７）を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで切断した。反応混液を低融点アガロースゲル
電気泳動に供し、還元酵素アミノ末端側コーディング領
域、カルボキシル末端側コーディング領域に相当するそ
れぞれ約４１０ｂｐ、　１６９０ｂｐの断片を回収した
。それぞれの断片をプラスミドｐＵｃ１９のＥｃｏＲ１
部位にサブクローニングし、アミノ末端側断片が、挿入
されたプラスミドρＵＹＲ７とカルボキシル末端側断片
が挿入されたプラスミドｐＵＹＲ１７を得た。プラスミ
ドｐＵＹＲ１７を制限酵素ＥｃｏＲＩで部分切断し、市
販の１１ｉｎｄ［［［リンカ−を挿入しプラスミドｐＵ
ＹＲ１７（Ｉｔ）を得た。一方、上記プラスミドｐＵＹ
Ｒ７を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、反応混液を低融点
アガロースゲル電気泳動に供し、還元酵素アミノ末端側
コーディング領域に相当する約４１０ｂｐの断片を回収
した。

この断片を上記プラスミドｐＵＹＲ１７（Ｈ）のＥｃｏ
Ｒ１部位に挿入し、プラスミドｐＵＹＲ７１７（Ｈ）を
得た。このプラスミドｐＵＹＲ７１７０ｆ）を制限酵素
Ｐｖｕ　ＩＩと旧ｎｄｌ［Ｉで同時消化した０反応混液
を低融点アガロースゲル電気泳動に供し、還元酵素ｃＤ
ＮＡの約２．０ｋｂ断片を回収した。こうして得られた
約２．０ｋｂのＰｖｕ　ＩＩ−Ｈｉｎｄｌ［ｌ断片と合
成リンカ−５Ｌ２−１：５’　−ＧＡＴＣＣＣＣＣＧＴ
ＣＧＡＣＣＣＣＡＧＧＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＧＧＴＣ−
５”（左右両端にそれぞれＢａｇ旧、ＰνｕＩｌ認識部
位をもち、内にＳａｌ＋認識部位を有する。）をプラス
ミドｐ１１ｃ１８のＢａｍＨＩ−１１ｉｎｄＩ［１部位
に挿入し、目的とするプラスミドｐＵＹＲ７１７（Ｂ）
を得た。

〔ステップ３〕発現プラスミドｐαＬＹ４の構築ステッ
プ２で得られたプラスミドｐＵＹＲ７１７（Ｂ）を制限
酵素ＢｓｔＥＩＩで部分切断し、さらに制限酵素Ｐｖｕ
ｌで切断した。このｐＨＹＲ７１７（Ｂ）のＢｓ　ｔＥ
　ＩＩ　−Ｐｖｕ　１１部位に市販のＣ１ａｒリンカ−
を挿入しプラスミドｐＨＹＲ４を得た。ステップｌで得
られたプラスミドρＵα（ｓ）と、上記プラスミドｐＵ
Ｙ１１４を制限酵素Ｈｉｎｄｌ［Ｉと５ａｌｌで同時に
消化した０反応混液を低融点アガロースゲル電気泳動に
供し、Ｐ４５０＋ｙαあるいは還元酵素コーディング領
域に相当するそれぞれ約１５４０ｂρ、　２０２０ｂｐ
の断片を回収した。得られた両断片を酵母発現ベクター
ｐＡＡＨ５のＨｉｎｄｌ［［部位に挿入し、目的とする
プラスミドｐαＬＹ４を得た。

１−２．　　　プラスミド　αＬＹ３の図−３に、発現
プラスミドｐαＬＹ３の概要を示した。実施例１−１、
ステップ２で得られたプラスミドｐｕα（ｓ）ステップ
２で得られたプラスミドρＵＹＲ７１７（Ｂ）を制限酵
素Ｈｉｎｄｌ［Ｉと５ａ１１で同時に切断した。反応混
液を低融点アガロースゲル電気泳動に供し、Ｐ４５０１
７αあるいは還元酵素コーディング領域に相当するそれ
ぞれ約１５４０ｂｐ、　２０５０ｂｐの断片を回収した
。得られた両断片を酵母発現ベクターｐＡＡＨ５のＨｉ
ｎｄｌ１部位に挿入し目的とするプラスミドｐαＬＹ３
を得た。

施　１−３　　　プラスミド　αＬＹ２の　集菌４にプ
ラスミドｐαＬＹ２の構築の概要を示した。実施例１−
１、ステップ２で得られたプラスミドｐｔｌＹＲ７１７
（Ｈ）を制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩとＨｉｎｄｎｌで同時に
切断した０反応混液を低融点アガロースゲル電気泳動に
供し、還元酵素ｃＤＮＡの約２．０ｋｂ断片を回収した
。こうして得られた約２．　ＯｋｂのＰｖｕ■−Ｈｌｎ
ｄｌｌ［断片と合成リンカ−３Ｌ２−２：５’　−ＴＣ
ＧＡＣＣＣＣＡＴＣＣＧＡＴＧＡＣＧＧＡＧＡＴＡＴＣ
ＡＣＡＧＧＧＧＧＴＡＧＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＴＡＴ
ＡＧＴＧＴＣ−５（左右両端にそれぞれ５ａｌｌ、Ｐｖ
ｕＵ認識部位を有する。）をプラスミドｐＨｃ１Ｂの５
ａｌｌ−１（ｉｎｄｌ１１部位に挿入し、目的とするプ
ラスミドｐＨＹＲ７１７（ｓ）を得た。実施例１−１．
ステップ１で得られたプラスミドｐυα（Ｓ）、及び上
記プラスミドｐＵＹＲ７１７（ｓ）を制限酵素旧ｎｄｌ
ｌｒと５ａｌｌで同時に切断した０反応混液を低融点ア
ガロースゲル電気泳動に供し、Ｐ４５０３．αあるいは
還元酵素コーディング領域に相当する、それぞれ約１５
４０ｂｐ、　２０７０ｂｐの断片を回収した。

得られた両断片を酵母発現ベクターｐＡＡＩ（５のｌ１
ｉｎｄ■部位に挿入し、目的とするプラスミドｐαＬＹ
２を得た。

実施例１−４、　現プラスミド　αｔｙｔ’、ｐαＬＹ
Ｌ９構東 図５にプラスミドｐαＬＹＩ’、　　ｐαＬＹＩ構築の
概要を示した。実施例１−１．ステップ２で得られたプ
ラスミドｐＵＹＲ７１７（Ｂ）のｐｖｕ　Ｉｆ部位に合
成リンカ−５Ｌ３： ５’　−ＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＧ
ＡＣＡＧＴＡＧＣＡＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＣＡＣＴＡ
ＴＡＧＡＧＧＣＡＧＴＡＧＣＣＴＧＴＣＡＴＣＧＴＧＣ
ＣＧＴＴＣＧＴＣＴＡＧＣＣＣＣＧＣＣＡＧＧＡ ＧＡＴＣＧＧＧＧＣＧＧＴＣＣＴ−５’あるいは合成リ
ンカ−３Ｌ４： ５’　−ＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＡＧＧ
ＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＣＣＧＡＴＡＴＴＴＣＴＣＴ
ＴＴＧＡＧ［：ＴＡＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧＡＣＴＡＣ
ＡＧＧＣＴ＾ＧＡＣＧＧＡＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧ ＣＴＧＣＣＴＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣ−５’を挿入しプラ
スミドｐＵＹＲ１’あるいはｐＨＹＲ１を得た実施例１
−１．ステップｌで得たプラスミドｐＵα（ｓ）と上記
プラスミドｐＵＹＲ１°あるいはｐＵＹＩ？１を制現酵
素Ｈ４ｎｄＴｌｌと５ａＸｌで同時消化した０反応混液
を低融点アガロースゲル電気泳動に供し、Ｐ４５０１７
αあるいは還元酵素コーディング領域に相当するそれぞ
れ約１５４０ｂｐ、　２０５０ｂｐ、あるいは２１００
ｂｐの断片を回収した。得られた両断片を酵母発現ベク
ターｐＡＡＨ５の旧ｎｄｌ１１部位に挿入し、目的とす
るプラスミドｐαＬＹＩ’あるいはｐαＬＹＩを得た。

２、　　したプラスミドによる酵母の 転換 サツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌ２２株（ＡＴＣＣ３
８６２６）を５ＩＩＩｌのｖｐ。

培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グリコ
ース）中で３０゛Ｃで１８時間培養したのち、１ｒｓｌ
の酵母培養液を遠心し、集菌した。得られた菌体を０．
２Ｍ　ＬｉＣｌ溶液１４で洗浄した後、ＩＭ　ＬｉＣ１
溶液２０μｌに懸濁した。これに７０％ポリエチレング
リコール４０００溶液３０μ１１プラスミドｐαＬＹＩ
’、ｐ　ａ　ＬＹＩ、ｐｃｒＬＹ２、ｐαＬＹ３あるい
はｐ　ａ　ＬＹ４溶液ｌＯμｉ（約１μｇ相当）を添加
して、十分に混合したのち３０°Ｃ１時間でインキエベ
ートした。ついで、１４０μｌの水を加え、よく撹拌し
たのち、この溶液をＳＤ合成培地プレート（２％グルコ
ース、０．６７％アミノ酸不合酵母窒素源、２０μｇ／
ｒｄｔヒスチジン、２％寒天）上にまき、３０℃でイン
キエベートすることにより、プラスミドｐαＬＹＩ°、
ｐαＬＹ１、ｐαＬＹ２、ｐαＩＪ３およびｐαＬＹ４
を保有する形転換体ａｌ１２２（ｐαＬＹＩ’）、ＡＩ
（２２（＋）αＬＹＩ）、Ａｔ１２２（ｐαＬＹ２）、
Ａｌ２２（ｐαＬＹ３）およびＡｌ２２（ｐαＬＹ４）
をそれぞれ得た。

実施例２で得た、Ａｌ２２（ｐαＩＪＩ’）、Ａｌ１２
２（ｐαＬＹＩ）、Ａ１１２２（ｐαＬＹ２）、Ａ）１
２２（ｐαＬＹ３）およびＡｌ２２　（ｐαＬＹ４）を
ＳＤ合成培地（２％グルコース、０．６７％アミノ酸不
合酵母窒素源、２０μｇ７ｄｌヒスチジン）でそれぞれ
約２Ｘ１０’細胞／ｄまで培養し、集菌して１００ｍＭ
り酸カリウムＰＨ７，０で洗浄したのち１００ｓ’Ｊン
酸カリウムｐｏ７．ｏ、２Ｉ１１に懸濁した。２本のキ
ュベツトに菌懸濁液を１ｍずつ分注し、サンプル側キュ
ベツトに一酸化炭素をふき込んだのち、両キュベツトに
ジチオナイト５〜１軸ｇを添加した。よく、撹拌したの
ち４００〜５００ｎｍの差スペクトルを測定し、Δε＝
　９１ｍＭ−’ｃｍ−’という値をもとにして、ヘム含
有Ｐ４５０１ｉを算出した。その結果、表１に示すよう
にＡｌ２２（ｐαＬＹＩ’）株、ＡＩ＋２２（ραＬＹ
Ｉ）株、Ａｌ１２２（ｐαＬＹ２）株、Ａｌ２２　　（
ｐαＬＹ３）株およびＡｌ２２　（ｐαＬＹ４）株は　
それぞれ菌体あたり約０．７　ＸＩＯ’分子、０．４　
ＸＩＯ’分子、０．９　ＸＩＯ’分子、０．７　ＸＩＯ
’分子、および０．９　ＸＩＯ’分子のヘム含有Ｐ４５
０蛋白質を産生ずることが判明した。

生成量の測定 ＳＤ合成培地で約０．７　Ｘ　１０’細胞／ｄまで培養
した形質転換酵母ＡＨ２２（ｐαＬＹＩ’）株、Ａｌ２
２　（ｐαＬＹＩ）株、Ａ）１２２（ｐαＬＹ２）株、
Ａｌ２２　（ｐαＬＹ３）、Ａｌ２２（ｐαＬＹ４）株
およびＡｌ１２２　（ｐＡＡＨ５）株とＰ４５０１７α
のみを産生じた八〇２２（ｐＡα１）株（特１！１６２
−２０４１０１）の培養液中にそれぞれ３μＣｉの〔３
■〕−プロゲステロンを含む１ｍＭプロゲステロン−エ
タノール溶液を基質濃度が最終的に１０μＨとなるよう
に添加した。３０°Ｃで振盪培養し、０，１，２．６時
間後にｌｊｄずつ分取し遠心分離して得た上清０．８ｄ
に２１ｄジクロロメタンを添加し、激しく撹拌した。遠
心分離後、ジクロロメタン層１１ｄを乾燥させ、残渣を
０．５鵬Ｈプロゲステロン、０．５−Ａ１７−ヒドロキ
シプロゲステロン、０．５ｍＭアンドロステンジオンを
含むエタノール−酢酸エチル等容量溶液２０μｌに溶解
し、１０μ２を薄層プレートにアプライした。２５％酢
酸エチルヲ含むクロロホルム溶液により、室温で５０分
間展開した後、紫外線を照射し、プロゲステロン、１７
−ヒドロキシプロゲステロン、アンドロステンジオンの
位置に相当する薄層ゲル部分をかきとり、液体シンナレ
ーションカウンターにより放射活性を測定した。

その結果、形質転換酵母ＡＨ２２（ｐαＬＹＩ’）株、
Ａｌ２２（ｐαＬＹ１）株、Ａｌ１２２　（ｐ　αＬＹ
２）株、Ａｌ１２２（ｐαＬＹ３）株およびＡｌ２２　
（ｐαＬＹ４）株で６時間後に、それぞれ８８％、８６
％、８９％、９０％および８９％のプロゲステロンが１
７−ヒドロキシプロゲステロンに変換したことがわかっ
た（図６）。一方、コントロールに用いたＡｌ２２　（
ｐＡ＾ｌｌ５）株では活性は認められなかった。またＣ
１７４゜位側鎖切断活性によるアンドロステンジオンの
生成は全ての株で認められなかった。

基質添加後１時間での１７−ヒドロキシプロゲステロン
への変換率をもとに各種形質転換株の菌体当たりの１７
−ヒドロキシプロゲステロン生産量を算出した。Ｐ４５
０１？αのみを生産しているＡｌ１２２（ρ＾αｌ）株
（特１１６２２０４１０１）を１とした場合、融合酵素
を産生しているＡｌＩ２２（ｐαＬＹＩ’）株、Ａｌ１
２２（＋１αＬＹ１）株、Ａｌ２２（ｐαＬＹ２）株、
Ａｌ１２２（ｐαＬＹ３）株およびＡｌ１２２（ραＬ
Ｙ４）株では、それぞれ４．７．３．２．５．０．４．
７゜および３．２と増加していた。

以上の結果からＰ４５０１７αと還元酵素の融合酵素は
Ｐ４５０＋、α単独発現の場合に比べてより効率よく電
子伝達系を構成し、高いｌ原子酸素添加の反応を示すこ
とが明らかになった。

又吸９効果 本発明によって得られた形質転換酵母菌株はヘムを含有
し、ｌ原子酸素添加活性を有する、Ｐ２Ｓ５．１αと還
元酵素との融合酵素を産生した０本発明の酵母菌株はそ
の培養液中にプロゲステロンを添加し、インキエベート
することによって１７−ヒドロキシプロゲステロンを生
産した。この際、基質転換後６時間後転損率は、約９０
％と非常に高く生成物である１７−ヒドロキシプロゲス
テロンのほとんどが培地中に分泌される。従って、遠心
分離や濾過、適当な吸着剤などを使用することにより容
易に１７−ヒドロキシプロゲステロンを回収することが
可能である。一方、酵母菌体は再使用が可能である。さ
らに本発明の酵母菌株は自、−２゜位側鎖切断活性は持
ち合わせていないので、医薬品として高価なグルココル
チコイドを製造するのに非常に好都合である。従って本
発明の酵母菌株を医薬品として有用である前述ステロイ
ド類合成のためのパイオリアククーとして用いれば、現
在行われている、発酵と合成を組み合わせた多段階反応
による製造をより単純化することが可能となる。

Ａｌ２２（ｐαＬＹ４）　　　　０．９　　　　　　　
　３．２４、図の簡単な説明 図＝１は、本発明のプラスミドの構造とプラスミドがコ
ードする融合酵素のアミノ酸数をしめす。

口はＰ４５０＋、αコーディング領域、口＝コは還元酵
素コーディング領域、■、　　　は合成リンカ−を示す
。マは還元酵素がパパインにより切断される部位を表す
。各プラスミド上側の数字はアミノ末端Ｍｅｔを１番と
した場合のＰ４５ｏｌ、αのアミノ酸の番号であり、下
側の数字は還元酵素のアミノ酸の番号である。また、図
の右端に融合酵素のアミノ酸数をＰ２Ｓ５　＋　ｔα由
来と、合成リンカ−由来とに分けて記載した。

図−２は本発明のプラスミドｐαＬＹ４の構築工程示す
。

図−３は本発明のプラスミドｐαＬＹ３の構築工程示す
。

図−４は本発明のプラスミドｐαＬＹ２の構築工程示す
。

図−５は本発明のプラスミドｐｃｔＬＹ１”、ｐαＬ’
／１の構築工程示す。図２．　３．　４．　５全てにお
いて、１１ｄ、　ｌｌｈ、　Ｐｓ、　ｔｉｐ、　Ｓａ、
　Ｅｃ、　Ｐｖ、　Ｂｍ、　Ｂｓ、　ＣＩはそれぞれ制
限酵素旧ｎｄｌ［ｌ、Ｈｈａｌ、Ｐｓｔｌ、Ｈｐｈｌ、
　Ｓａ！　　Ｉ、ＥｃｏＲＩＰｖｕ■、Ｂａｍ１ｌ　Ｉ
　、ＢｓｔＥ　ｎ　、Ｃ１ａ　ｌの認識部位を示す。

ａはＰ４５０＋、αコーディング領域、口＝］は還元酵
素コーディング領域、■、　　　は合成リンカ−を示す
０図−６は各種形質転換株のプロゲステロン１７位水酸
化活性を示す、縦軸は、１７−ヒドロキシプロゲステロ
ンへの変換率を、横軸は、培養時間を示す。　　×□×
はＡｔ１２２　（ｐＡＡＩＩ５）株、・□・はＡｌ２２
　（ｐαＬＹＩ°）株、○□ＯはＡｌＩ２２（ｐαＬＹ
Ｉ）株、口□口はＡｌ２２　（ｐαＬＹ２）株、■□■
はＡＨ２２（ｐαＬＹ３）株、Δ□ΔはＡＨ２２（ｐα
ＬＹ４）株、ム ムはＡＨ２２（ρ ＾αｌ）株を示す。

１ＥｃｏＲ１，ＨｉｎｄＩ［１ ｌＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ　ｍ 第２図 （その１） ｐｕα＋Ｓ＋ 第２図（その２） １）Ｕ’ｎ ｐＵ”ｌ’Ｒ７１Ｌ　ａ。

第２図 （その４） ｃ ｃ ｃ ｐ〆■Ｒ ｐＵＹＲ７＋７［Ｈ］ ｐＵＹＲ７１７１Ｂ＋ 第２図（その３） ｐｌＪｌＩｔｓ＋ ｐＵＹＲ７１７１Ｂ＋ 第 図 ↓５ａ１１．市ｍ１ ｐＵＹＲ７１７凹 ↓Ｓ１１．　Ｈ＋ｎｄ　ｍ ＬＩａｌｓ ｐＬＩＹＲ７１７ｔＢｌ ↓Ｐｖｕ［１ ｐＵＹＲ＋’　（又はｐｔＪＹＲＩ）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）ウシ副腎チトクロムＰ４５０＿１＿７αの有する
   １原子酸素添加活性と酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４
   ５０還元酵素の有する還元力供給能を併せ持つ酸化酵素
   をコードする融合酵素遺伝子
2. （２）請求項１に記載の遺伝子を含み、該酸化酵素を発
   現する酵母発現プラスミド
3. （３）酵母発現プラスミドｐαＬＹ１’、ｐαＬＹ１、
   ｐαＬＹ２、ｐαＬＹ３或いは、ｐαＬＹ４として特定
   される請求項２記載のプラスミド
4. （４）請求項２記載の酵母発現プラスミドを保持する形
   質転換酵母菌株
5. （５）サッカロミセスセレビシェーＡＨ２２（ｐαＬＹ
   １’）株、ＡＨ２２（ｐαＬＹ１）株、ＡＨ２２（ｐα
   ＬＹ２）株、ＡＨ２２（ｐαＬＹ３）株あるいはＡＨ２
   ２（ｐαＬＹ４）株として特定される求項４記載の形質
   転換酵母菌株
6. （６）ウシ肝臓チトクロムＰ４５０＿１＿７αの有する
   １原子酸素添加活性と酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４
   ５０還元酵素の有する還元力供給能を併せ持つ酸化酵素
7. （７）請求項４記載の形質転換酵母菌株を培養すること
   を特徴とする該酸化酵素の製造方法
8. （８）請求項４記載の形質転換酵母菌株によりプロゲス
   テロンおよびプレグネノロン水酸化を特徴とする１７−
   ヒドロキシプロゲステロン、１７−ヒドロキシプレグネ
   ノロンの製造方法