JPH0581562B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0581562B2 JPH0581562B2 JP10576988A JP10576988A JPH0581562B2 JP H0581562 B2 JPH0581562 B2 JP H0581562B2 JP 10576988 A JP10576988 A JP 10576988A JP 10576988 A JP10576988 A JP 10576988A JP H0581562 B2 JPH0581562 B2 JP H0581562B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- marigolds
- hairy roots
- medium
- mol
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
産業上の利用分野
この発明はマリーゴールドに含まれるα−ター
チエニルを主たる有効成分とする殺線虫剤の製造
法に関するものである。 従来の技術 農作物に対する線虫の被害対策として、一般的
に使用されているものは、合成された薬剤であ
り、残留毒性による環境汚染や人畜に対する悪影
響が指摘され、また薬効の持続性が乏しいなどの
問題点があつて、満足しうるものは見当たらな
い。 キク科の植物であるマリーゴールドには、殺線
虫力を備えた下式
チエニルを主たる有効成分とする殺線虫剤の製造
法に関するものである。 従来の技術 農作物に対する線虫の被害対策として、一般的
に使用されているものは、合成された薬剤であ
り、残留毒性による環境汚染や人畜に対する悪影
響が指摘され、また薬効の持続性が乏しいなどの
問題点があつて、満足しうるものは見当たらな
い。 キク科の植物であるマリーゴールドには、殺線
虫力を備えた下式
【化】
で示されるα−ターチエニル及びその類縁物質を
含有することが知られている。〔例えばレキユレ
エ デス トラバツクス キミーク デス ペイ
ズ−バス（Recueille des Traveaux Chimique
des Pays−Bas）第77巻 1004頁ないし1009頁
（1958）及び同第79巻 382頁ないし390頁
（1959）〕 また、α−ターチエニル化を化学的に製造する
典型的な方法としては、２−アセチルチオフエン
とトリメチルシランからチオフエンシリルエノー
ルエーテル誘導体を経て合成する方法（特開昭52
−118461号公報、同52−118462号公報）が知られ
ているが、未だ実用化されるには至つていない。 発明が解決しようとする課題 マリーゴールドを直かに田畑に植えて土壌中の
線虫密度を低減させる方法は広く知られており、
化学薬品に較べて残留毒性の心配がなく且つ効果
が長時間持続するなどのメリツトを備えている
が、反面マリーゴールドを植えた田畑では同時に
野菜類を栽培し難いので、その間休耕あるいは減
産を余儀なくされていた。 本発明は、マリーゴールドの培養方法を改善
し、その培養物を抽出して得られる殺線虫剤を量
産する方法について、検討を加えたものである。 課題を解決するための手段 本発明者等は、このような事情に鑑みマリーゴ
ールドを組織培養によつて量産する方法につい
て、種々の試験研究を重ねた結果、アグロバクテ
リウム・リゾゲネス菌（Agrobacterium
rhizogenes）を感染させたマリーゴールドから生
じる形質転換された毛状根が、良好な増殖性を有
することを知見し、またこのように処理さたマリ
ーゴールドの毛状根を植物ホルモンとしてジベレ
リンのみを含む培地あるいは全く含まない培地で
培養し、有機溶媒で抽出することによつて、ネグ
サレ線虫に対し特に優れた殺線虫作用を示す成分
が得られることを見い出した。 本発明方法の実施に適する代表的なマリーゴー
ルド（Tagetes属）は、フレンチマリーゴールド
（Tagetes patula）、アフリカンマリーゴールド
（Tagetes erecta）、メキシカンマリーゴールド
（Tagetes tenuifolia）等である。 また、マリーゴールドにアグロバクテリウム・
リゾゲネス菌を感染させる方法としては、無菌化
したマリーゴールドの植物体に菌を付着させた針
を用いて接種する方法、植物体に傷をつけたのち
菌を塗布する方法、植物体の一部を菌含有の液体
培地中に侵漬する方法、あるいは植物体の細胞か
ら得られるプロトプラストと菌を共存培養する方
法等が可能である。 前記のいずれかの方法によつて感染させたマリ
ーゴールドからは、数週間後にアグロバクテリウ
ム・リゾゲネス菌の持つRiプラスミドの一部が
植物の核DNAの中に組み込まれた毛状根を生じ、
前記毛状根を、クラホランあるいはカルベニシリ
ン等の抗生物質を0.1〜1.0g／程度含む培地に
移植して除菌を行う。 その際培地としては、ムラシゲ・スクーグの培
地、リンスマイヤー・スクーグの培地、ガルボル
グの培地あるいはニツチエの培地等の一般的な植
物組織培養に使用されている培地が好適である。 毛状根を前記培地のいずれかを用いて数週間培
養したのち、伸長した毛状根の先端部を１〜２cm
程度の大きさ切り取つたものを、再度同一組成の
培地に継代する。通常このような２回の除菌培養
操作により、アグロバクテリウム・リゾゲネス菌
を完全に除いた毛状根が得られる。なお、毛状根
の一部をすりつぶしたものをバクテリア用培地に
置床し、バクテリアの繁殖のないことを確認する
ことが望ましい。この際バクテリアの繁殖が認め
られた場合には、前記除菌操作を繰り返す必要が
ある。 このようにして得られる除菌された毛状根を、
通常の植物組織培養の液体培地を用いて増殖させ
る。この際植物ホルモンについては、特に無添加
の培地あるいはジベレリンのみを10-4〜10-7モ
ル／の割合で添加した培地を用いた場合に、殺
線虫作用を示す成分が多く含まれている。なお、
本発明方法における培養条件は、温度は15〜35℃
好ましくは20〜30℃であり、光は暗条件で行うこ
とが望ましい。 培養されたマリーゴールドの毛状根は、乾燥し
たのち、ｎ−ヘキサン、アセトン、アセトニトリ
ル等の有機溶媒を用いて抽出する。 例えば乾燥した毛状根を軽く粉砕し、これを10
〜100倍量のｎ−ヘキサンに浸漬し、30分なしい
数時間攪拌を行い、固形物を濾別すれば良い。 本発明方法によつて得られる殺線虫剤の使用に
当つては、散布時に有機溶媒を気化逸散させても
良いが、予め抽出液から有機溶媒を除去し、これ
に公知の増量剤を加えて固形剤とし、あるいは
水、乳化剤等を加えて水溶液ないし乳濁液とする
ことができる。 以下本発明方法を実施例及び比較例によつて具
体的に説明する。 実施例１ないし２及び比較例１ないし２ フレンチマリーゴールド（品種名：ボレロ）の
種子を殺菌したのち、ムラシゲ・スクーグの培地
に置床して発芽させ、無菌苗を得た。予めアグロ
バクテリウム・リゾゲネスATCC 15834株を
YEB培地を用いて培養しておき、この菌を滅菌
した針の先に付けて前記の無菌苗に突き刺して感
染させた。約２週間後に接種部の近傍より毛状根
が生じてきたので、これらを切り取り、クラホラ
ン0.1g／を含むムラシゲ・スクーグの培地に置
床し、25℃で除菌培養を行つた。３週間培養した
のち伸長した毛状根の先端部約１〜２cmを前記と
同一組成の培地に置床し、更に３週間同一の培養
条件で除菌培養した。その後培養した毛状根の先
端部約２cmをムラシゲ・スクーグの培地（PH5.0）
に移し、残りの部分はすりつぶし、YEB培地に
置床して菌の繁殖状態より除菌が十分か否かを確
認した。培養は回転震盪培養器を用い、回転数
110rpm、温度25℃で暗所にて行つた。２週間培
養したのち、実施例１においては、毛状根の一部
を植物ホルモンを含まないムラシゲ・スクーグ培
地に継代し、また実施例２においては、同じ毛状
根の一部をジベレリン（GA3）３×10-6モル／
含むムラシゲ・スクーグ培地に継代して、更に３
週間、前記と同一条件で培養した。増殖率は、い
ずれも乾重量比で植物ホルモンを含まない場合で
100倍、またジベレリンを含む場合で90倍であつ
た。 次に、これらの毛状根を無菌下で乾燥し、軽く
粉砕したのち、乾燥毛状根1g当りｎ−ヘキサン
を50mlの割合で混合し、30分間抽出を行つたの
ち、固形物を濾別して抽出液を得た。 また、比較例１として種子から天然栽培法によ
つて育てたフレンチマリーゴールド（品種名：ボ
レロ）の根より前記と同様にして抽出液を得た。 抽出液の主有効成分であるα−ターチエニルの
分析は、フルカ社製のα−ターチエニルを標準と
して、高速液体クロマトグラフイーにより行つ
た。その結果は、表１に示すとおりであつた。
含有することが知られている。〔例えばレキユレ
エ デス トラバツクス キミーク デス ペイ
ズ−バス（Recueille des Traveaux Chimique
des Pays−Bas）第77巻 1004頁ないし1009頁
（1958）及び同第79巻 382頁ないし390頁
（1959）〕 また、α−ターチエニル化を化学的に製造する
典型的な方法としては、２−アセチルチオフエン
とトリメチルシランからチオフエンシリルエノー
ルエーテル誘導体を経て合成する方法（特開昭52
−118461号公報、同52−118462号公報）が知られ
ているが、未だ実用化されるには至つていない。 発明が解決しようとする課題 マリーゴールドを直かに田畑に植えて土壌中の
線虫密度を低減させる方法は広く知られており、
化学薬品に較べて残留毒性の心配がなく且つ効果
が長時間持続するなどのメリツトを備えている
が、反面マリーゴールドを植えた田畑では同時に
野菜類を栽培し難いので、その間休耕あるいは減
産を余儀なくされていた。 本発明は、マリーゴールドの培養方法を改善
し、その培養物を抽出して得られる殺線虫剤を量
産する方法について、検討を加えたものである。 課題を解決するための手段 本発明者等は、このような事情に鑑みマリーゴ
ールドを組織培養によつて量産する方法につい
て、種々の試験研究を重ねた結果、アグロバクテ
リウム・リゾゲネス菌（Agrobacterium
rhizogenes）を感染させたマリーゴールドから生
じる形質転換された毛状根が、良好な増殖性を有
することを知見し、またこのように処理さたマリ
ーゴールドの毛状根を植物ホルモンとしてジベレ
リンのみを含む培地あるいは全く含まない培地で
培養し、有機溶媒で抽出することによつて、ネグ
サレ線虫に対し特に優れた殺線虫作用を示す成分
が得られることを見い出した。 本発明方法の実施に適する代表的なマリーゴー
ルド（Tagetes属）は、フレンチマリーゴールド
（Tagetes patula）、アフリカンマリーゴールド
（Tagetes erecta）、メキシカンマリーゴールド
（Tagetes tenuifolia）等である。 また、マリーゴールドにアグロバクテリウム・
リゾゲネス菌を感染させる方法としては、無菌化
したマリーゴールドの植物体に菌を付着させた針
を用いて接種する方法、植物体に傷をつけたのち
菌を塗布する方法、植物体の一部を菌含有の液体
培地中に侵漬する方法、あるいは植物体の細胞か
ら得られるプロトプラストと菌を共存培養する方
法等が可能である。 前記のいずれかの方法によつて感染させたマリ
ーゴールドからは、数週間後にアグロバクテリウ
ム・リゾゲネス菌の持つRiプラスミドの一部が
植物の核DNAの中に組み込まれた毛状根を生じ、
前記毛状根を、クラホランあるいはカルベニシリ
ン等の抗生物質を0.1〜1.0g／程度含む培地に
移植して除菌を行う。 その際培地としては、ムラシゲ・スクーグの培
地、リンスマイヤー・スクーグの培地、ガルボル
グの培地あるいはニツチエの培地等の一般的な植
物組織培養に使用されている培地が好適である。 毛状根を前記培地のいずれかを用いて数週間培
養したのち、伸長した毛状根の先端部を１〜２cm
程度の大きさ切り取つたものを、再度同一組成の
培地に継代する。通常このような２回の除菌培養
操作により、アグロバクテリウム・リゾゲネス菌
を完全に除いた毛状根が得られる。なお、毛状根
の一部をすりつぶしたものをバクテリア用培地に
置床し、バクテリアの繁殖のないことを確認する
ことが望ましい。この際バクテリアの繁殖が認め
られた場合には、前記除菌操作を繰り返す必要が
ある。 このようにして得られる除菌された毛状根を、
通常の植物組織培養の液体培地を用いて増殖させ
る。この際植物ホルモンについては、特に無添加
の培地あるいはジベレリンのみを10-4〜10-7モ
ル／の割合で添加した培地を用いた場合に、殺
線虫作用を示す成分が多く含まれている。なお、
本発明方法における培養条件は、温度は15〜35℃
好ましくは20〜30℃であり、光は暗条件で行うこ
とが望ましい。 培養されたマリーゴールドの毛状根は、乾燥し
たのち、ｎ−ヘキサン、アセトン、アセトニトリ
ル等の有機溶媒を用いて抽出する。 例えば乾燥した毛状根を軽く粉砕し、これを10
〜100倍量のｎ−ヘキサンに浸漬し、30分なしい
数時間攪拌を行い、固形物を濾別すれば良い。 本発明方法によつて得られる殺線虫剤の使用に
当つては、散布時に有機溶媒を気化逸散させても
良いが、予め抽出液から有機溶媒を除去し、これ
に公知の増量剤を加えて固形剤とし、あるいは
水、乳化剤等を加えて水溶液ないし乳濁液とする
ことができる。 以下本発明方法を実施例及び比較例によつて具
体的に説明する。 実施例１ないし２及び比較例１ないし２ フレンチマリーゴールド（品種名：ボレロ）の
種子を殺菌したのち、ムラシゲ・スクーグの培地
に置床して発芽させ、無菌苗を得た。予めアグロ
バクテリウム・リゾゲネスATCC 15834株を
YEB培地を用いて培養しておき、この菌を滅菌
した針の先に付けて前記の無菌苗に突き刺して感
染させた。約２週間後に接種部の近傍より毛状根
が生じてきたので、これらを切り取り、クラホラ
ン0.1g／を含むムラシゲ・スクーグの培地に置
床し、25℃で除菌培養を行つた。３週間培養した
のち伸長した毛状根の先端部約１〜２cmを前記と
同一組成の培地に置床し、更に３週間同一の培養
条件で除菌培養した。その後培養した毛状根の先
端部約２cmをムラシゲ・スクーグの培地（PH5.0）
に移し、残りの部分はすりつぶし、YEB培地に
置床して菌の繁殖状態より除菌が十分か否かを確
認した。培養は回転震盪培養器を用い、回転数
110rpm、温度25℃で暗所にて行つた。２週間培
養したのち、実施例１においては、毛状根の一部
を植物ホルモンを含まないムラシゲ・スクーグ培
地に継代し、また実施例２においては、同じ毛状
根の一部をジベレリン（GA3）３×10-6モル／
含むムラシゲ・スクーグ培地に継代して、更に３
週間、前記と同一条件で培養した。増殖率は、い
ずれも乾重量比で植物ホルモンを含まない場合で
100倍、またジベレリンを含む場合で90倍であつ
た。 次に、これらの毛状根を無菌下で乾燥し、軽く
粉砕したのち、乾燥毛状根1g当りｎ−ヘキサン
を50mlの割合で混合し、30分間抽出を行つたの
ち、固形物を濾別して抽出液を得た。 また、比較例１として種子から天然栽培法によ
つて育てたフレンチマリーゴールド（品種名：ボ
レロ）の根より前記と同様にして抽出液を得た。 抽出液の主有効成分であるα−ターチエニルの
分析は、フルカ社製のα−ターチエニルを標準と
して、高速液体クロマトグラフイーにより行つ
た。その結果は、表１に示すとおりであつた。
【表】
次に前記の方法で得た抽出液を用いて殺線虫試
験を実施した。 線虫として、キタネグサレ線虫
（Pratylenchus penetrans）及びセノルハブデイ
テス エレガンス（Caenorhabditis elegans以下
C.elegansと略記する）の２種を用いた。 キタネダサレ線虫（Pratylenchus penetrans）
を用いた試験は以下の通りである。すなわち、抽
出液及びその希釈液並びにコントロールとして純
ｎ−ヘキサンを夫々50μずつ別個のスライドグ
ラス上に落として風乾させ、予めルーサンカルス
にて培養したキタネグサレ線虫（Pratylenchus
penetrans）をベルマン法によつて脱イオン水中
に集めた液を造つておき、この溶液を各々50μ
（この中に線虫は20〜40匹いる。）前記のスライド
グラス上に落とし、そのスライドグラスを湿室に
したシヤーレの中に置き、25℃の照明付インキユ
ベーター中に８時間静置した後、顕微鏡観察を行
い、線虫の生死を判定した。 C.elegansを用いた試験も概ね同様であり、抽
出物及びその希釈液並びにコントロールとして純
ｎ−ヘキサンを各々20μずつ別のスライドグラ
ス上に落として風乾し、その上に、NG培地にて
大腸菌を餌として培養したC.elegansを20〜100匹
移し、この上にNG培地を30μ加え、そのスラ
ツドグラスを湿室にしたシヤーレの中に置き、25
℃の照明付インキユベーター中で８時間静置した
のち、顕微鏡観察を行い、線虫の生死を判定し
た。 なお、前記の比較例１の抽出液及び比較例２と
してフルカ社製のα−ターチエニルを用い、実施
例１と同様のｎ−ヘキサン溶液濃度に調製して、
前記と同様の方法で殺線虫試験を行つた。 これらの殺線虫試験の結果は表２に示すとおり
であつた。
験を実施した。 線虫として、キタネグサレ線虫
（Pratylenchus penetrans）及びセノルハブデイ
テス エレガンス（Caenorhabditis elegans以下
C.elegansと略記する）の２種を用いた。 キタネダサレ線虫（Pratylenchus penetrans）
を用いた試験は以下の通りである。すなわち、抽
出液及びその希釈液並びにコントロールとして純
ｎ−ヘキサンを夫々50μずつ別個のスライドグ
ラス上に落として風乾させ、予めルーサンカルス
にて培養したキタネグサレ線虫（Pratylenchus
penetrans）をベルマン法によつて脱イオン水中
に集めた液を造つておき、この溶液を各々50μ
（この中に線虫は20〜40匹いる。）前記のスライド
グラス上に落とし、そのスライドグラスを湿室に
したシヤーレの中に置き、25℃の照明付インキユ
ベーター中に８時間静置した後、顕微鏡観察を行
い、線虫の生死を判定した。 C.elegansを用いた試験も概ね同様であり、抽
出物及びその希釈液並びにコントロールとして純
ｎ−ヘキサンを各々20μずつ別のスライドグラ
ス上に落として風乾し、その上に、NG培地にて
大腸菌を餌として培養したC.elegansを20〜100匹
移し、この上にNG培地を30μ加え、そのスラ
ツドグラスを湿室にしたシヤーレの中に置き、25
℃の照明付インキユベーター中で８時間静置した
のち、顕微鏡観察を行い、線虫の生死を判定し
た。 なお、前記の比較例１の抽出液及び比較例２と
してフルカ社製のα−ターチエニルを用い、実施
例１と同様のｎ−ヘキサン溶液濃度に調製して、
前記と同様の方法で殺線虫試験を行つた。 これらの殺線虫試験の結果は表２に示すとおり
であつた。
【表】
【表】
発明の効果
本発明方法によつて得られるマリーゴールドの
毛状根は、天然栽培のものに比べてα−ターチエ
ニルを!?かに多く含み且つ高い殺線虫活性を有
し、さらに量産に適するなど実施上の効果が多大
である。
毛状根は、天然栽培のものに比べてα−ターチエ
ニルを!?かに多く含み且つ高い殺線虫活性を有
し、さらに量産に適するなど実施上の効果が多大
である。
Claims (1)
- １ マリーゴールドにアグロバクテリウム・リゾ
ゲネス菌（Agrobacterium rhizogenes）を感染
させる工程、前記処理されたマリーゴールドの毛
状根を培養する工程及びこのようにして得た培養
物を有機溶媒によつて抽出する工程からなる殺線
虫剤の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10576988A JPH01275505A (ja) | 1988-04-27 | 1988-04-27 | 殺線虫剤の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10576988A JPH01275505A (ja) | 1988-04-27 | 1988-04-27 | 殺線虫剤の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01275505A JPH01275505A (ja) | 1989-11-06 |
| JPH0581562B2 true JPH0581562B2 (ja) | 1993-11-15 |
Family
ID=14416378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10576988A Granted JPH01275505A (ja) | 1988-04-27 | 1988-04-27 | 殺線虫剤の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01275505A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100399896C (zh) * | 2005-05-10 | 2008-07-09 | 赵昕 | α-三噻吩用于防治松材线虫病的应用 |
-
1988
- 1988-04-27 JP JP10576988A patent/JPH01275505A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01275505A (ja) | 1989-11-06 |
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