JPH0581569B2 - - Google Patents
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- JPH0581569B2 JPH0581569B2 JP63500179A JP50017988A JPH0581569B2 JP H0581569 B2 JPH0581569 B2 JP H0581569B2 JP 63500179 A JP63500179 A JP 63500179A JP 50017988 A JP50017988 A JP 50017988A JP H0581569 B2 JPH0581569 B2 JP H0581569B2
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- Japan
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- pdgf
- igf
- purified
- bone
- alone
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- A61K38/30—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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Description
請求の範囲
１ 血小板由来生長因子（PDGF）およびインシ
ユリン様生長因子Ｉ（IGF−１）を、重量対重量
比で１：４ないし25：１で含む、傷治癒および骨
再生用組成物。
ユリン様生長因子Ｉ（IGF−１）を、重量対重量
比で１：４ないし25：１で含む、傷治癒および骨
再生用組成物。
２ 比率が１：２ないし10：１である請求項１記
載の組成物。
載の組成物。
３ 比率が１：１ないし２：１である請求項１記
載の組成物。
載の組成物。
４ 血小板由来生長因子（PDGF）およびインシ
ユリン様生長因子Ｉ（IGF−１）を、重量対重量
比で１：４ないし25：１で混合することよりな
る、傷治癒および骨再生用組成物の製造方法。
ユリン様生長因子Ｉ（IGF−１）を、重量対重量
比で１：４ないし25：１で混合することよりな
る、傷治癒および骨再生用組成物の製造方法。
発明の背景
本発明はAntoniadesらの米国特許出願No.
930762号：発明の名称「外傷の治癒（Healing
External Wounds）」：出願日1986年11月14日の
一部継続出願であり、その内容も参照により本明
細書に含まれている。
930762号：発明の名称「外傷の治癒（Healing
External Wounds）」：出願日1986年11月14日の
一部継続出願であり、その内容も参照により本明
細書に含まれている。
本発明は創傷の治癒に関する。
成長因子類は、特定の標的細胞集団を刺激する
ポリペプチドホルモンである。成長因子の例に
は、血小板由来の成長因子（PDGF）、インシユ
リン様成長因子（IGF−Ｉ）、トランフホーミン
グ成長因子（TGF−β）、上皮性成長因子
（EGF）、および繊維芽成長因子（FGF）がある。
PDGFは、血流中の血小板の顆粒中に見出され
る、カチオン性の熱安定性蛋白質であり、繊維芽
細胞のin vitro蛋白質合成およびコラーゲンの生
産を刺激することが知られている。この因子は、
また繊維芽細胞、平滑筋細胞およびグリア細胞の
in vitroでの細胞分裂および化学遊走因子として
の作用も持つことが知られている。
ポリペプチドホルモンである。成長因子の例に
は、血小板由来の成長因子（PDGF）、インシユ
リン様成長因子（IGF−Ｉ）、トランフホーミン
グ成長因子（TGF−β）、上皮性成長因子
（EGF）、および繊維芽成長因子（FGF）がある。
PDGFは、血流中の血小板の顆粒中に見出され
る、カチオン性の熱安定性蛋白質であり、繊維芽
細胞のin vitro蛋白質合成およびコラーゲンの生
産を刺激することが知られている。この因子は、
また繊維芽細胞、平滑筋細胞およびグリア細胞の
in vitroでの細胞分裂および化学遊走因子として
の作用も持つことが知られている。
PDGFをin vivoの創傷治癒に用いることは既
に提案されている。例えば、Grotendorst（1984）
J.Trauma24；549−52には、コラーゲンゲルで
含浸させそしてラツトの背中に移植したHunt−
Schilling金網チヤンバーにPDGFを加えたとこ
ろ、新たに合成されるコラーゲンの量が増加した
ことが記載されている。しかしながら、Leitzel
ら（1985）J.Dermatol.Surg.Oncol.11：617−22
によれば、PDGFを単独またはFGFおよびEGF
と組み合わせて用いたとき、ハムスターの通常の
創傷の治癒を促進することはできなかつた。
に提案されている。例えば、Grotendorst（1984）
J.Trauma24；549−52には、コラーゲンゲルで
含浸させそしてラツトの背中に移植したHunt−
Schilling金網チヤンバーにPDGFを加えたとこ
ろ、新たに合成されるコラーゲンの量が増加した
ことが記載されている。しかしながら、Leitzel
ら（1985）J.Dermatol.Surg.Oncol.11：617−22
によれば、PDGFを単独またはFGFおよびEGF
と組み合わせて用いたとき、ハムスターの通常の
創傷の治癒を促進することはできなかつた。
Michaeliら（1984）は、「柔軟および硬質組織
の修復（Soft and Hard Tissue Repair）」
（Hunt，T.K.ら編集）、Praeger Publishers，ニ
ユーヨーク，380〜394頁）において、血小板リツ
チプラズマから得た部分精製PDGF調製物を家兎
の角膜に移植したとき、脈管形成を刺激したこと
を報告している。PDGFは脈管形成性成長因子で
はないから、上記報告者らは、彼らの部分精製
PDGF調製物中の未知因子がこの脈管形成効果に
関与したものと示唆している。
の修復（Soft and Hard Tissue Repair）」
（Hunt，T.K.ら編集）、Praeger Publishers，ニ
ユーヨーク，380〜394頁）において、血小板リツ
チプラズマから得た部分精製PDGF調製物を家兎
の角膜に移植したとき、脈管形成を刺激したこと
を報告している。PDGFは脈管形成性成長因子で
はないから、上記報告者らは、彼らの部分精製
PDGF調製物中の未知因子がこの脈管形成効果に
関与したものと示唆している。
発明の要約
一般に、本発明は、その一態様において、創傷
に有効量の精製PDGFおよび精製IGF−Ｉを含む
組成物を適用して、哺乳類、例えばヒト患者の外
傷を治癒する技術に関する。この組成物は、少な
くともその一部において、上皮組織および結合組
織の増殖および全蛋白質およびコラーゲンの合成
を刺激することにより、創傷の治癒に寄与する。
本発明の組成物を用いた創傷の治癒は、そのよう
な治療を行わないとき（即ち、外部からの薬剤を
用いない時）または純粋なPDGFのみまたは純粋
なIGF−Ｉのみを用いたときに比べて、一層効果
的である。
に有効量の精製PDGFおよび精製IGF−Ｉを含む
組成物を適用して、哺乳類、例えばヒト患者の外
傷を治癒する技術に関する。この組成物は、少な
くともその一部において、上皮組織および結合組
織の増殖および全蛋白質およびコラーゲンの合成
を刺激することにより、創傷の治癒に寄与する。
本発明の組成物を用いた創傷の治癒は、そのよう
な治療を行わないとき（即ち、外部からの薬剤を
用いない時）または純粋なPDGFのみまたは純粋
なIGF−Ｉのみを用いたときに比べて、一層効果
的である。
他の態様において、本発明は患者の傷ついた若
しくは折れた骨の区域に、純化PDGFおよび純化
IGF−Ｉを含む本発明の組成物の有効量を塗布す
ることにより適用して、哺乳類、例えばヒト患者
の骨を再生する技術に関する。この組成物は、少
なくともその一部において、結合組織、骨および
セメント質の増殖および全蛋白質およびコラーゲ
ンの合成を刺激することにより、創傷の治癒に寄
与する。本発明の組成物を用いた骨の再生は、そ
のような治療を行わないとき（即ち、外部からの
薬剤を用いない時）または純粋なPDGFのみまた
は純粋なIGF−Ｉのみを用いたときに比べて、一
層効果的である。
しくは折れた骨の区域に、純化PDGFおよび純化
IGF−Ｉを含む本発明の組成物の有効量を塗布す
ることにより適用して、哺乳類、例えばヒト患者
の骨を再生する技術に関する。この組成物は、少
なくともその一部において、結合組織、骨および
セメント質の増殖および全蛋白質およびコラーゲ
ンの合成を刺激することにより、創傷の治癒に寄
与する。本発明の組成物を用いた骨の再生は、そ
のような治療を行わないとき（即ち、外部からの
薬剤を用いない時）または純粋なPDGFのみまた
は純粋なIGF−Ｉのみを用いたときに比べて、一
層効果的である。
上記両態様の何れにおいても、本発明の好まし
い態様では、組成物は薬学的に許容される担体物
質、例えば市販の不活性ゲルまたは溶液（例え
ば、アルブミンまたはメチルセルロースを添加し
た塩類液）中で、精製PDGFおよび精製IGF−Ｉ
（両者ともに市販品として入手可能である）を混
合して、製造される。最も好ましくは、精製
PDGFおよび精製IGF−Ｉは、重量対重量比で、
１：４ないし25：１、好ましくは１：２ないし
10：１、そしてより好ましくは１：１または２：
１で混合される。精製PDGFおよび精製IGF−Ｉ
はヒト血小板から、または組換えDNA技術でえ
られるであろう。従つて、PDGFおよびIGF−Ｉ
の用語は、哺乳類、好ましくは霊長類の血小板ま
たは遺伝子組換え材料から由来した両方を意味
し、最も好ましくは、霊長類は人類であるがチン
パンジーまたは他の霊長類であつてもよい。組換
えPDGFは、培養原核または真核細胞に両サブユ
ニツトをコードするDNA配列を挿入し、次いで
翻訳されたサブユニツトを細胞で処理してえられ
たヘテロダイマーでもよく、あるいは、サブユニ
ツトの一方のみ（好ましくはベータもしくは
「２」チエーン）をコードするDNAを細胞に挿入
し、これを培養してホモダイマーのPDGF（
PDGF−１もしくはPDGF−２ホモダイマー）を
製造してもよい。
い態様では、組成物は薬学的に許容される担体物
質、例えば市販の不活性ゲルまたは溶液（例え
ば、アルブミンまたはメチルセルロースを添加し
た塩類液）中で、精製PDGFおよび精製IGF−Ｉ
（両者ともに市販品として入手可能である）を混
合して、製造される。最も好ましくは、精製
PDGFおよび精製IGF−Ｉは、重量対重量比で、
１：４ないし25：１、好ましくは１：２ないし
10：１、そしてより好ましくは１：１または２：
１で混合される。精製PDGFおよび精製IGF−Ｉ
はヒト血小板から、または組換えDNA技術でえ
られるであろう。従つて、PDGFおよびIGF−Ｉ
の用語は、哺乳類、好ましくは霊長類の血小板ま
たは遺伝子組換え材料から由来した両方を意味
し、最も好ましくは、霊長類は人類であるがチン
パンジーまたは他の霊長類であつてもよい。組換
えPDGFは、培養原核または真核細胞に両サブユ
ニツトをコードするDNA配列を挿入し、次いで
翻訳されたサブユニツトを細胞で処理してえられ
たヘテロダイマーでもよく、あるいは、サブユニ
ツトの一方のみ（好ましくはベータもしくは
「２」チエーン）をコードするDNAを細胞に挿入
し、これを培養してホモダイマーのPDGF（
PDGF−１もしくはPDGF−２ホモダイマー）を
製造してもよい。
本発明において精製という用語は、他の成分と
混合する前に重量で95％以上がPDGFまたはIGF
−Ｉであり、即ち天然に付随する他の蛋白質、脂
質および炭水化物が実質的に存在しないことを意
味する。
混合する前に重量で95％以上がPDGFまたはIGF
−Ｉであり、即ち天然に付随する他の蛋白質、脂
質および炭水化物が実質的に存在しないことを意
味する。
精製蛋白質調製物は、一般にポリアクリルアミ
ドゲル上でPDGFまたはIGF−Ｉの各サブユニツ
トに対して一本のみの主要バンドを与える。最も
好ましくは、本発明の組成物中に用いられる精製
PDGFまたはIGF−Ｉはアミノ末端アミノ酸配列
分析で判定したとき、純粋なものである。
ドゲル上でPDGFまたはIGF−Ｉの各サブユニツ
トに対して一本のみの主要バンドを与える。最も
好ましくは、本発明の組成物中に用いられる精製
PDGFまたはIGF−Ｉはアミノ末端アミノ酸配列
分析で判定したとき、純粋なものである。
本発明の組成物は、哺乳類の外傷、例えば褥
瘡、裂傷および火傷の治癒のための、迅速且つ有
効な方法を提供する。この組成物は、自然治癒
（即ち外から薬剤を与えないとき）または純粋な
PDGFまたはIGF−Ｉのみに比較して結合組織の
形成を増強する。純粋PDGFのみと異なり、この
組成物は新たな結合組織を約250％増大し、上皮
組織の増殖を約95％増大する。得られる上皮層は
自然治癒に比べて厚いだけでなく、それを新たな
結合組織と結合するための上皮突起（epithelial
projection）をより多く含み、従つて一層しつか
り結合し、創傷の防護効果も大きい。さらに傷の
発生のおそれも少ない。
瘡、裂傷および火傷の治癒のための、迅速且つ有
効な方法を提供する。この組成物は、自然治癒
（即ち外から薬剤を与えないとき）または純粋な
PDGFまたはIGF−Ｉのみに比較して結合組織の
形成を増強する。純粋PDGFのみと異なり、この
組成物は新たな結合組織を約250％増大し、上皮
組織の増殖を約95％増大する。得られる上皮層は
自然治癒に比べて厚いだけでなく、それを新たな
結合組織と結合するための上皮突起（epithelial
projection）をより多く含み、従つて一層しつか
り結合し、創傷の防護効果も大きい。さらに傷の
発生のおそれも少ない。
本発明の組成物は、哺乳類例えば歯根膜病の経
歴のあるヒトの結合組織および骨の再生のため
の、迅速且つ有効な方法を提供する。この組成物
は自然治癒（即ち外から薬剤を与えないとき）ま
たは純粋なPDGFまたはIGF−Ｉのみに比較して
結合組織および骨の形成を増強する。
歴のあるヒトの結合組織および骨の再生のため
の、迅速且つ有効な方法を提供する。この組成物
は自然治癒（即ち外から薬剤を与えないとき）ま
たは純粋なPDGFまたはIGF−Ｉのみに比較して
結合組織および骨の形成を増強する。
本発明の他の態様および利点は、好ましい態様
に基づく以下の記載および請求の範囲から明らか
にされる。
に基づく以下の記載および請求の範囲から明らか
にされる。
好ましい態様の記載
好ましい態様について、説明する。
本発明によれば精製PDGFおよびIGF−Ｉの組
合せで製造されたPDGF／IGF−Ｉ混合物を用い
て、外傷、例えば褥瘡および火傷が治療され、そ
して骨および結合組織が再生される。IGF−Ｉは
Amgen社（サウザンド オースク、カリホルニ
ア）およびKabi社（スウエーデン）から市販さ
れている。精製組換えPDGFおよびヒト血小板か
ら由来する精製PDGFは、PDGF社（ボストン、
マサチユセツツ）、Collaborative Research社
（ウオルサム、マサチユセツツ）およびAmgen社
（サウザンド オースク、カリホルニア）から市
販されている。精製PDGFは次のようにして調製
することも可能である： 洗浄したヒト血小板ペレツト500ないし1000単
位を1M NaCl（血小板単位あたり２ml）に懸濁
し、100℃で15分間加熱する。上清を遠心分離で
分離し、沈澱を1M NaClで抽出する。
合せで製造されたPDGF／IGF−Ｉ混合物を用い
て、外傷、例えば褥瘡および火傷が治療され、そ
して骨および結合組織が再生される。IGF−Ｉは
Amgen社（サウザンド オースク、カリホルニ
ア）およびKabi社（スウエーデン）から市販さ
れている。精製組換えPDGFおよびヒト血小板か
ら由来する精製PDGFは、PDGF社（ボストン、
マサチユセツツ）、Collaborative Research社
（ウオルサム、マサチユセツツ）およびAmgen社
（サウザンド オースク、カリホルニア）から市
販されている。精製PDGFは次のようにして調製
することも可能である： 洗浄したヒト血小板ペレツト500ないし1000単
位を1M NaCl（血小板単位あたり２ml）に懸濁
し、100℃で15分間加熱する。上清を遠心分離で
分離し、沈澱を1M NaClで抽出する。
抽出物を合わせ、0.08M NaCl−0.01Mリン酸
ナトリウムバツフアー（PH7.4）に対して透析し、
このバツフアーで平衡化したCM−セフアデツク
ス Ｃ−50と４℃で一夜混合する。次いでこの混
合物をカラム（５×100cm）に注入し、0.08M
NaCl−0.01Mリン酸ナトリウムバツフアー（PH
7.4）で充分に洗浄し、1M NaClで溶出しそして
10mlフラクシヨンずつに回収する。
ナトリウムバツフアー（PH7.4）に対して透析し、
このバツフアーで平衡化したCM−セフアデツク
ス Ｃ−50と４℃で一夜混合する。次いでこの混
合物をカラム（５×100cm）に注入し、0.08M
NaCl−0.01Mリン酸ナトリウムバツフアー（PH
7.4）で充分に洗浄し、1M NaClで溶出しそして
10mlフラクシヨンずつに回収する。
活性フラクシヨンをプールし、0.3M NaCl−
0.01Mリン酸ナトリウムバツフアー（PH7.4）に
対して透析し、遠心分離し、0.3M NaCl−0.01M
リン酸ナトリウムバツフアー（PH7.4）で平衡化
した2.5×25cmのブルーセフアロース
（Pharmacia社）に４℃で通過させる。このカラ
ムを同バツフアーで洗浄し、部分精製された
PDGF1M NaClおよびエチレングリコールの
１：１溶液で溶出する。
0.01Mリン酸ナトリウムバツフアー（PH7.4）に
対して透析し、遠心分離し、0.3M NaCl−0.01M
リン酸ナトリウムバツフアー（PH7.4）で平衡化
した2.5×25cmのブルーセフアロース
（Pharmacia社）に４℃で通過させる。このカラ
ムを同バツフアーで洗浄し、部分精製された
PDGF1M NaClおよびエチレングリコールの
１：１溶液で溶出する。
この部分精製PDGFフラクシヨンを1M NaCl
で１：１希釈し、1M酢酸で透析し、そして凍結
乾燥する。凍結乾燥サンプルは0.8M NaCl−
0.01Mリン酸ナトリウムバツフアー（PH7.4）に
溶解しそして同バツフアーで平衡化した1.2×40
cmのCM−セフアデツクス Ｃ−50カラムに通過
させる。次いでPDGFをNaCl勾配（0.08ないし
1M）で溶出する。
で１：１希釈し、1M酢酸で透析し、そして凍結
乾燥する。凍結乾燥サンプルは0.8M NaCl−
0.01Mリン酸ナトリウムバツフアー（PH7.4）に
溶解しそして同バツフアーで平衡化した1.2×40
cmのCM−セフアデツクス Ｃ−50カラムに通過
させる。次いでPDGFをNaCl勾配（0.08ないし
1M）で溶出する。
活性フラクシヨンを合わせ、1M酢酸に対して
透析し、凍結乾燥し、そして少量の1M酢酸に溶
解する。その0.5ml分を1M酢酸で平衡化した1.2
×100cmのバイオゲル Ｐ−150（100ないし200メ
ツシユ）のカラムにのせる。次いでPDGFを1M
酢酸で溶出し、２mlずつのフラクシヨンにして回
収する。
透析し、凍結乾燥し、そして少量の1M酢酸に溶
解する。その0.5ml分を1M酢酸で平衡化した1.2
×100cmのバイオゲル Ｐ−150（100ないし200メ
ツシユ）のカラムにのせる。次いでPDGFを1M
酢酸で溶出し、２mlずつのフラクシヨンにして回
収する。
100ないし200mgの蛋白質を含む各活性フラクシ
ヨンを凍結乾燥し、100mlの0.4％トリフルオロ酢
酸に溶解し、フエニルボンダパツクカラム
（Waters社）による逆相高性能液体クロマトグラ
フイーに付する。アセトニトリルの直線勾配（０
ないし60％）により精製PDGFが得られる。
ヨンを凍結乾燥し、100mlの0.4％トリフルオロ酢
酸に溶解し、フエニルボンダパツクカラム
（Waters社）による逆相高性能液体クロマトグラ
フイーに付する。アセトニトリルの直線勾配（０
ないし60％）により精製PDGFが得られる。
組換えDNA技術でのPDGFは、次のようにし
て調製される： ヒト血小板から得られる血小板由来成長因子
（PDGF）は二種のポリペプチド配列（PDGF−
１およびPDGF−２ポリペプチド）を含む
（Antoniades，H.N.およびHunkapiller，M.
（1983）Science，220：963−965）。PDGF−１は
クロモゾーム７中に存在する遺伝子によりコード
され（Betsholtz，C.ら、Nature，320：695−
699）、そしてPDGF−２はクロモゾーム22（Dalla
−Favera，R.（1982）Science，218：686−688）
中に存在するsisオンコジーン（Doolittle，R.ら
（1983）Science221：275−277）によつてコード
される。sis遺伝子はサル肉腫ウイルス（Simian
Sarcoma Virus：以下SSVという）の形質転換
蛋白質をコードしており、この蛋白質はPDGF−
２ポリペプチドに密接に関係している。ヒト細胞
ｃ−sisもまたPDGF−２鎖をコードする（Rao，
C.D.ら（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：
2392−2396）。これら二種のPDGFのポリペプチ
ド鎖は、別のクロモゾームに存在する異なる遺伝
子によりコードされるので、ヒトPDGFはPDGF
−１およびPDGF−２のジスルフイド結合したヘ
テロダイマーからなるか、まやは二種のホモダイ
マー（PDGF−１のホモダイマーおよびPDGF−
２のホモダイマー）の混合物からなるか、または
上記ヘテロダイマーと二種のホモダイマーの混合
物よりなる可能性がある。
て調製される： ヒト血小板から得られる血小板由来成長因子
（PDGF）は二種のポリペプチド配列（PDGF−
１およびPDGF−２ポリペプチド）を含む
（Antoniades，H.N.およびHunkapiller，M.
（1983）Science，220：963−965）。PDGF−１は
クロモゾーム７中に存在する遺伝子によりコード
され（Betsholtz，C.ら、Nature，320：695−
699）、そしてPDGF−２はクロモゾーム22（Dalla
−Favera，R.（1982）Science，218：686−688）
中に存在するsisオンコジーン（Doolittle，R.ら
（1983）Science221：275−277）によつてコード
される。sis遺伝子はサル肉腫ウイルス（Simian
Sarcoma Virus：以下SSVという）の形質転換
蛋白質をコードしており、この蛋白質はPDGF−
２ポリペプチドに密接に関係している。ヒト細胞
ｃ−sisもまたPDGF−２鎖をコードする（Rao，
C.D.ら（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：
2392−2396）。これら二種のPDGFのポリペプチ
ド鎖は、別のクロモゾームに存在する異なる遺伝
子によりコードされるので、ヒトPDGFはPDGF
−１およびPDGF−２のジスルフイド結合したヘ
テロダイマーからなるか、まやは二種のホモダイ
マー（PDGF−１のホモダイマーおよびPDGF−
２のホモダイマー）の混合物からなるか、または
上記ヘテロダイマーと二種のホモダイマーの混合
物よりなる可能性がある。
PDGF−２鎖をコードする遺伝子を含むSSVで
感染した培養中の哺乳類細胞は、PDGF−２ポリ
ペプチドを合成しそしてそれをジスルフイド結合
したホモダイマーに加工することが知られている
（Robbins，K.ら（1983）Nature，305：605−
608）。さらに、PDGF−２ホモダイマーは、ヒト
PDGFに対して調製した抗血清と反応する。さら
にまた、分泌されたPDGF−ホモダイマーの機能
的性質は、培養中の繊維芽細胞のDNA合成を刺
激する点、185kdの細胞膜蛋白質のチロシン残基
でのホスホリル化を誘発する点および特異的細胞
表面PDGFリセプターとの結合に関してヒト
（125I）−PDGFと競合する能力を有する点で、血
小板由来PDGFのそれと類似している（Owen，
A.ら（1984）Science，225：54−56）。同様な性
質は、培養正常ヒト細胞（例えばヒト動脈内皮細
胞）からのsis／PDGF−２遺伝子生成物につい
て、またはsis／PDGF−２発現ヒト悪性細胞か
らの生成物についても示されている
（Antoniades，H.ら（1985）、Cancer Cells，
３：145−151）。
感染した培養中の哺乳類細胞は、PDGF−２ポリ
ペプチドを合成しそしてそれをジスルフイド結合
したホモダイマーに加工することが知られている
（Robbins，K.ら（1983）Nature，305：605−
608）。さらに、PDGF−２ホモダイマーは、ヒト
PDGFに対して調製した抗血清と反応する。さら
にまた、分泌されたPDGF−ホモダイマーの機能
的性質は、培養中の繊維芽細胞のDNA合成を刺
激する点、185kdの細胞膜蛋白質のチロシン残基
でのホスホリル化を誘発する点および特異的細胞
表面PDGFリセプターとの結合に関してヒト
（125I）−PDGFと競合する能力を有する点で、血
小板由来PDGFのそれと類似している（Owen，
A.ら（1984）Science，225：54−56）。同様な性
質は、培養正常ヒト細胞（例えばヒト動脈内皮細
胞）からのsis／PDGF−２遺伝子生成物につい
て、またはsis／PDGF−２発現ヒト悪性細胞か
らの生成物についても示されている
（Antoniades，H.ら（1985）、Cancer Cells，
３：145−151）。
組換えPDGF−２ホモダイマーは、ｃ−sis／
PDGF−２遺伝子のクローンを発現ベクターを用
いてマウス細胞に導入して得ることができる。こ
の発現に用いるｃ−sis／PDGF−２クローンは、
正常ヒト培養上皮細胞からえられる（Collins，
T.ら（1985），Nature，216：748−750）。
PDGF−２遺伝子のクローンを発現ベクターを用
いてマウス細胞に導入して得ることができる。こ
の発現に用いるｃ−sis／PDGF−２クローンは、
正常ヒト培養上皮細胞からえられる（Collins，
T.ら（1985），Nature，216：748−750）。
創傷の治癒
創傷の治癒を促進するために、PDGF／IGF−
Ｉ混合物の有効性を調べるため、次の実験を行つ
た。
Ｉ混合物の有効性を調べるため、次の実験を行つ
た。
体重10ないし15Kgの幼若白色ヨークシヤー種の
豚（Parson′s Farm，ハドレイ，マサチユセツ
ツ）を手術前に少なくとも６時間絶食させ、次い
で麻酔した。睡眠条件下で背中および首の部分を
刈り、剃り、そして穏やかな石鹸および水で洗浄
した。次いで、外傷を付する部分を70％アルコー
ルで消毒した。
豚（Parson′s Farm，ハドレイ，マサチユセツ
ツ）を手術前に少なくとも６時間絶食させ、次い
で麻酔した。睡眠条件下で背中および首の部分を
刈り、剃り、そして穏やかな石鹸および水で洗浄
した。次いで、外傷を付する部分を70％アルコー
ルで消毒した。
１cm×２cmの大きさの傷を深さ0.5mmに作るた
め、改良カストロビーヨエレクトロケラトーム
（Castroviejo electrokeratome）（Storz製、セン
トルイス、ミズーリをBrownells，Inc.で改良し
たもの）を用いた。この創傷は上皮の完全な除去
およびその下層の真皮の部分的除去をもたらした
（第２度の火傷に相当する）。各創傷は少なくとも
15mmの健全皮膚により隔てた。同一の治療を受け
る創傷はグループにまとめ、他のグループから少
なくとも３cm隔てた。成長因子での治療を受けな
い創傷は、治療を受けるグループから少なくとも
10cm隔てた。
め、改良カストロビーヨエレクトロケラトーム
（Castroviejo electrokeratome）（Storz製、セン
トルイス、ミズーリをBrownells，Inc.で改良し
たもの）を用いた。この創傷は上皮の完全な除去
およびその下層の真皮の部分的除去をもたらした
（第２度の火傷に相当する）。各創傷は少なくとも
15mmの健全皮膚により隔てた。同一の治療を受け
る創傷はグループにまとめ、他のグループから少
なくとも３cm隔てた。成長因子での治療を受けな
い創傷は、治療を受けるグループから少なくとも
10cm隔てた。
創傷は、生物学上許容されるゲルに分散した次
の成長因子での一回の塗布により、直接処置し
た：１）500ng純粋ヒトPDGF（高性能液体クロマ
トグラフイーで精製したもの）または組換え
PDGFのみ：２）各々次のものと組み合わせた
500ngの純粋PDGF：(a)500ngのEGF；(b)500ngの
EGF＋500ngのIGF−Ｉ；(c)500ngのIGF−Ｉ。
の成長因子での一回の塗布により、直接処置し
た：１）500ng純粋ヒトPDGF（高性能液体クロマ
トグラフイーで精製したもの）または組換え
PDGFのみ：２）各々次のものと組み合わせた
500ngの純粋PDGF：(a)500ngのEGF；(b)500ngの
EGF＋500ngのIGF−Ｉ；(c)500ngのIGF−Ｉ。
創傷の付与に続いて、３日目から10日目にかけ
て、生検標本を採取した。組織学的評価のための
生検標本は、深さ約３mmの楔状で採取し、10％ホ
ルマリンに保存した。生物化学的分析およびオー
トラジオグラフイーのための標本は、エレクトロ
ケラトームを用いて採取した。標本の最終寸法は
1.5mm×10mm×1.5mmであつた。生物化学的分析用
には創傷当たり３つの標本を採取し、オートラジ
オグラフイー用には創傷当たり２つの標本を採取
した。標本は採取した後、冷却したイーグル修正
基本培地（EMEM）に10％仔牛血清を添加した
培地に保存した。生検標本は、次のように分析し
た。
て、生検標本を採取した。組織学的評価のための
生検標本は、深さ約３mmの楔状で採取し、10％ホ
ルマリンに保存した。生物化学的分析およびオー
トラジオグラフイーのための標本は、エレクトロ
ケラトームを用いて採取した。標本の最終寸法は
1.5mm×10mm×1.5mmであつた。生物化学的分析用
には創傷当たり３つの標本を採取し、オートラジ
オグラフイー用には創傷当たり２つの標本を採取
した。標本は採取した後、冷却したイーグル修正
基本培地（EMEM）に10％仔牛血清を添加した
培地に保存した。生検標本は、次のように分析し
た。
オートラジオグラフイー
生検標本を15μCi／mlの3H−チミジンを含む
0.3mlのイーグル修正基本培地（EMEM）＋10％
牛胎児血清で１時間インキユベートし、その標本
を次いで10％ホルマリンで２回洗浄した。標準的
パラフイン含浸および包埋技術を用いて、標本か
ら４ミクロンの切片を切り出した。これを次に脱
パラフインして、ヌクレア・トラクト・エマルジ
ヨン（Nuclear Tract emulsion）NTB−２（コ
ダツク社）に浸漬し、２週間暴露した。続いてこ
れを現像しヘマトキシリンおよびエオシンで染色
した。
0.3mlのイーグル修正基本培地（EMEM）＋10％
牛胎児血清で１時間インキユベートし、その標本
を次いで10％ホルマリンで２回洗浄した。標準的
パラフイン含浸および包埋技術を用いて、標本か
ら４ミクロンの切片を切り出した。これを次に脱
パラフインして、ヌクレア・トラクト・エマルジ
ヨン（Nuclear Tract emulsion）NTB−２（コ
ダツク社）に浸漬し、２週間暴露した。続いてこ
れを現像しヘマトキシリンおよびエオシンで染色
した。
染色標本のオートラジオグラムを記録し、標識
された（細胞当たり５以上の粒）細胞の全数を等
しく分布する点で数えることにより点数付けし
た。
された（細胞当たり５以上の粒）細胞の全数を等
しく分布する点で数えることにより点数付けし
た。
組織学的評価
組織学的検討の標本は標準的パラフイン含浸お
よび包埋技術を用いて調製した。４ミクロンの切
片を作り、予め濾過したハリス・ヘマトキシリン
およびアルコール性エオシンで染色し、その後顕
微鏡で観察した。全ての標本において、２人の観
察者が切片の均一分布点で別個に点数をつけた。
上皮組織層および結合組織層の幅は、顕微鏡の接
眼レンズ内に置いたグリツドを用いて測定し、そ
の結果を同じ条件で観察したミクロメーターの結
果と比較して、mmに換算した。
よび包埋技術を用いて調製した。４ミクロンの切
片を作り、予め濾過したハリス・ヘマトキシリン
およびアルコール性エオシンで染色し、その後顕
微鏡で観察した。全ての標本において、２人の観
察者が切片の均一分布点で別個に点数をつけた。
上皮組織層および結合組織層の幅は、顕微鏡の接
眼レンズ内に置いたグリツドを用いて測定し、そ
の結果を同じ条件で観察したミクロメーターの結
果と比較して、mmに換算した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの代謝標識
生検標本を、0.3mlのEMEM＋10％牛胎児血
清、15μCi／mlの3H−チミジンおよび5μCi／mlの
14C−ロイシンを含む個別の試験管へ移し、37℃
で１時間インキユベートした。インキユベート時
間の終了後、培地を除去し、0.5mlの冷５％過塩
素酸を加えて組織の代謝を停止させた。次に、こ
の標本を細かく砕き３回洗浄し、得られた沈澱を
0.5mlの14.8M水酸化アンモニウムに再懸濁し、
超音波で破砕した。超音波処理の後、標本を密閉
試験管内で45℃で16ないし24時間インキユベート
し、再度超音波処理し、クロスチヤンネルカウン
テイングでの標準的液体シンチレーシヨン法を用
いて、放射活性を測定した。
清、15μCi／mlの3H−チミジンおよび5μCi／mlの
14C−ロイシンを含む個別の試験管へ移し、37℃
で１時間インキユベートした。インキユベート時
間の終了後、培地を除去し、0.5mlの冷５％過塩
素酸を加えて組織の代謝を停止させた。次に、こ
の標本を細かく砕き３回洗浄し、得られた沈澱を
0.5mlの14.8M水酸化アンモニウムに再懸濁し、
超音波で破砕した。超音波処理の後、標本を密閉
試験管内で45℃で16ないし24時間インキユベート
し、再度超音波処理し、クロスチヤンネルカウン
テイングでの標準的液体シンチレーシヨン法を用
いて、放射活性を測定した。
ＤＮＡおよび蛋白質の測定
DNAの測定は、Labarcaら（1980）Anal.
Biochem.120：344−52の方法を修正した方法で
行つた。濃厚水酸化アンモニウム中の組織抽出物
の50μlを、1Mのリン酸ナトリウムおよび2Mの塩
化ナトリウムを含む400μlのバツフアー溶液（PH
7.0）に加え、生じた溶液のPHをHClで7.4に調整
した。その後、PHを7.4に保存したままで最終溶
液量を500μlとした。次にこの溶液を、ヘキスト
色素（Hoechst dye）（1.14mg／ml）を含むバツ
フアー溶液（0.05Mリン酸ナトリウム、2M塩化
ナトリウム、PH＝7.4）2.5mlに添加した。励起波
長352nmで蛍光を誘発し、454nmで発光の強さを
測定した。標準曲線を得るためには、同様の処理
を施した仔牛胸腺DNAを用いた。
Biochem.120：344−52の方法を修正した方法で
行つた。濃厚水酸化アンモニウム中の組織抽出物
の50μlを、1Mのリン酸ナトリウムおよび2Mの塩
化ナトリウムを含む400μlのバツフアー溶液（PH
7.0）に加え、生じた溶液のPHをHClで7.4に調整
した。その後、PHを7.4に保存したままで最終溶
液量を500μlとした。次にこの溶液を、ヘキスト
色素（Hoechst dye）（1.14mg／ml）を含むバツ
フアー溶液（0.05Mリン酸ナトリウム、2M塩化
ナトリウム、PH＝7.4）2.5mlに添加した。励起波
長352nmで蛍光を誘発し、454nmで発光の強さを
測定した。標準曲線を得るためには、同様の処理
を施した仔牛胸腺DNAを用いた。
濃厚水酸化アンモニウム中の組織抽出物の蛋白
質含量は、ブラツドフオード法（Bradford
（1976）Anal.Biochem.72：248−54）によりウシ
血清アルブミンを標準物として測定した。
質含量は、ブラツドフオード法（Bradford
（1976）Anal.Biochem.72：248−54）によりウシ
血清アルブミンを標準物として測定した。
結果
組織学的評価からの結果は、精製ヒトPDGFま
たは組換えPDGFとIGF−Ｉとの組合せて処置さ
れた創傷は、治療をうけなかつた創傷、純粋IGF
−Ｉ、純粋PDGFによる治療を受けた創傷、また
は他の成長因子と組み合わせたPDGFによる治療
を受けた創傷に比べて、結合組織および上皮層が
厚く、且つより多くの上皮突起がこれらの層を結
合していることを示した。処置の後６週間目ま
で、傷の発生の兆候は認められなかつた。オート
ラジオグラフイーによれば、PDGF／IGF−Ｉで
処置した創傷において、無処置、PDGFのみまた
はIGF−Ｉのみの処置の創傷よりも3H−チミジ
ン標識細胞の比率の増加が見られた。代謝標識の
結果は、3H−チミジンおよび14C−ロイシンの取
込みは、精製PDGF／IGF−Ｉ調製物で処置した
創傷において、無処置の創傷よりも大きいことを
示し、同様にPDGF／IGF−Ｉ処置創傷はDNA
および蛋白質含有量も多かつた。
たは組換えPDGFとIGF−Ｉとの組合せて処置さ
れた創傷は、治療をうけなかつた創傷、純粋IGF
−Ｉ、純粋PDGFによる治療を受けた創傷、また
は他の成長因子と組み合わせたPDGFによる治療
を受けた創傷に比べて、結合組織および上皮層が
厚く、且つより多くの上皮突起がこれらの層を結
合していることを示した。処置の後６週間目ま
で、傷の発生の兆候は認められなかつた。オート
ラジオグラフイーによれば、PDGF／IGF−Ｉで
処置した創傷において、無処置、PDGFのみまた
はIGF−Ｉのみの処置の創傷よりも3H−チミジ
ン標識細胞の比率の増加が見られた。代謝標識の
結果は、3H−チミジンおよび14C−ロイシンの取
込みは、精製PDGF／IGF−Ｉ調製物で処置した
創傷において、無処置の創傷よりも大きいことを
示し、同様にPDGF／IGF−Ｉ処置創傷はDNA
および蛋白質含有量も多かつた。
前記の様にして調製した組換え精製PDGF−２
ホモダイマーも、単独またはIGF−Ｉと組み合わ
せて、部分厚さの皮膚創傷に試験した。６日目の
創傷の組織学的分析によれば、PDGF−２または
IGF−Ｉのみの投与は、結合組織の形態または上
皮の形態に関して対照との有意な相違が無かつ
た。しかしながら、PDGF−２をIGF−Ｉと組み
合わせると、手術の６日後に新たな結合組織層の
幅の2.0倍の増加および上皮の厚さの20％の増加
をもたらした。９日目には、PDGF−２のみでは
新たな結合組織および上皮厚さのいずれにも22％
の増加をもたらした。IGF−Ｉと組み合わせた
PDGF−２は、新結合組織および上皮層の両者に
75％の増加をもたらした。PDGF−２／IGF−Ｉ
処置の創傷は明確な光の偏光領域を有し、このこ
とから、この創傷がPDGF−２単独措置または治
療無しの創傷に比して一層成熟した結合組織を有
することが示された。
ホモダイマーも、単独またはIGF−Ｉと組み合わ
せて、部分厚さの皮膚創傷に試験した。６日目の
創傷の組織学的分析によれば、PDGF−２または
IGF−Ｉのみの投与は、結合組織の形態または上
皮の形態に関して対照との有意な相違が無かつ
た。しかしながら、PDGF−２をIGF−Ｉと組み
合わせると、手術の６日後に新たな結合組織層の
幅の2.0倍の増加および上皮の厚さの20％の増加
をもたらした。９日目には、PDGF−２のみでは
新たな結合組織および上皮厚さのいずれにも22％
の増加をもたらした。IGF−Ｉと組み合わせた
PDGF−２は、新結合組織および上皮層の両者に
75％の増加をもたらした。PDGF−２／IGF−Ｉ
処置の創傷は明確な光の偏光領域を有し、このこ
とから、この創傷がPDGF−２単独措置または治
療無しの創傷に比して一層成熟した結合組織を有
することが示された。
従つて、上記の動物モデルを用いた組換え
PDGF−２の創傷への適用は、精製ヒトPDGFを
組換えIGF−Ｉと組み合わせたときと同様の結果
を与えた。組換えPDGF−２およびIGF−Ｉとの
組み合わせは、新たな繊維芽細胞の数およびコラ
ーゲン合成速度の劇的な増加をもたらし、治療を
行わなかつた動物または組換えPDGF−２または
IGF−Ｉ単独処置に比べて、真皮および表皮の増
生（2.5倍の総増加）を伴つた。
PDGF−２の創傷への適用は、精製ヒトPDGFを
組換えIGF−Ｉと組み合わせたときと同様の結果
を与えた。組換えPDGF−２およびIGF−Ｉとの
組み合わせは、新たな繊維芽細胞の数およびコラ
ーゲン合成速度の劇的な増加をもたらし、治療を
行わなかつた動物または組換えPDGF−２または
IGF−Ｉ単独処置に比べて、真皮および表皮の増
生（2.5倍の総増加）を伴つた。
これらの結果は、組換えPDGF−２ホモダイマ
ーおよび天然精製ヒトPDGFの両者は、IGF−Ｉ
とともに創傷に局所投与したとき、相乗的に相互
作用することを示唆する。
ーおよび天然精製ヒトPDGFの両者は、IGF−Ｉ
とともに創傷に局所投与したとき、相乗的に相互
作用することを示唆する。
用量
精製PDGFの適当な用量を決定するため、上記
実験を繰り返したが、創傷の１mm2あたり、生物学
的に許容されるゲル30μl中に分散した2.5ng、
5.0ng、および10ngのPDGF（精製PDGFに換算し
て）で創傷を治療した。その結果、最適効果は
PDGF含量が5.0ng／mm2またはそれ以上のときに
得られた。
実験を繰り返したが、創傷の１mm2あたり、生物学
的に許容されるゲル30μl中に分散した2.5ng、
5.0ng、および10ngのPDGF（精製PDGFに換算し
て）で創傷を治療した。その結果、最適効果は
PDGF含量が5.0ng／mm2またはそれ以上のときに
得られた。
精製PDGF＋IGF−Ｉの適当な用量を決定する
ため、PDGFとIGF−Ｉの重量対重量比が、１：
10ないし25：１の範囲の組み合わせを上記のよう
にして評価した。最適の結果は、比率が１：１お
よび２：１のときに得られた。
ため、PDGFとIGF−Ｉの重量対重量比が、１：
10ないし25：１の範囲の組み合わせを上記のよう
にして評価した。最適の結果は、比率が１：１お
よび２：１のときに得られた。
骨の再生
PDGF／IGF−Ｉ調製物が歯根膜および／また
は骨の増殖を促進する効果を調べるため、次の実
験を行つた。
は骨の増殖を促進する効果を調べるため、次の実
験を行つた。
先ず最初に、自然に歯根膜の病気を生じたビー
グル犬を、放射線写真検査で選別した。30％ない
し80％の骨の消失を認めたものにつき、最初に超
音波装置で歯石を取り除いた。外科的皮膚弁およ
び根面平滑化処置を施し、そしてこの実験歯を、
薬学的に許容される担体物質、例えば市販の不活
性ゲル、例えばメチルセルロース中に精製PDGF
およびIGF−Ｉを含有する組成物で治療した。４
分の１の歯には、コントロールゲルのみまたは精
製PDGFのみまたはIGF−Ｉのみを適用した。歯
および骨のブロツク生検標本は、手術後２週間で
採取し、標準的な脱鉱物質および処理法を用いて
組織学的検討を行う準備をした。
グル犬を、放射線写真検査で選別した。30％ない
し80％の骨の消失を認めたものにつき、最初に超
音波装置で歯石を取り除いた。外科的皮膚弁およ
び根面平滑化処置を施し、そしてこの実験歯を、
薬学的に許容される担体物質、例えば市販の不活
性ゲル、例えばメチルセルロース中に精製PDGF
およびIGF−Ｉを含有する組成物で治療した。４
分の１の歯には、コントロールゲルのみまたは精
製PDGFのみまたはIGF−Ｉのみを適用した。歯
および骨のブロツク生検標本は、手術後２週間で
採取し、標準的な脱鉱物質および処理法を用いて
組織学的検討を行う準備をした。
結果
歯根膜および骨標本の組織学的分析の結果は、
実験標本（即ち、PDGF／IGF−Ｉの組み合わせ
で処置したもの）の歯根表面に隣接して、新たな
骨形成の明確な領域が存在しており、そしてこの
新生骨に隣接する歯根表面上にセメント質に類似
する沈着物が存在した。新生骨は標本の骨膜表面
にも存在し、靱帯の根尖延長部分に歯強直の領域
が生じた。骨芽様細胞の厚い層および結合組織が
新たに生成されたセメント質の中に入るコラーゲ
ン繊維とともに新生骨の裏を覆つていた。
実験標本（即ち、PDGF／IGF−Ｉの組み合わせ
で処置したもの）の歯根表面に隣接して、新たな
骨形成の明確な領域が存在しており、そしてこの
新生骨に隣接する歯根表面上にセメント質に類似
する沈着物が存在した。新生骨は標本の骨膜表面
にも存在し、靱帯の根尖延長部分に歯強直の領域
が生じた。骨芽様細胞の厚い層および結合組織が
新たに生成されたセメント質の中に入るコラーゲ
ン繊維とともに新生骨の裏を覆つていた。
コントロール標本においては、新たな骨の生成
の証拠は認められず、新規セメント質様沈着物は
存在せず、結合組織は骨の表面に垂直に並び、元
の骨を覆うキヤツプを形成するように見えた。従
つて、この結果は本発明のPDGF／IGF−Ｉ組成
物は骨形成および結合組織応答を増強することを
示した。
の証拠は認められず、新規セメント質様沈着物は
存在せず、結合組織は骨の表面に垂直に並び、元
の骨を覆うキヤツプを形成するように見えた。従
つて、この結果は本発明のPDGF／IGF−Ｉ組成
物は骨形成および結合組織応答を増強することを
示した。
他の態様は、請求の範囲内である。
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|---|---|---|---|
| US93076286A | 1986-11-14 | 1986-11-14 | |
| US930,762 | 1986-11-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01500199A JPH01500199A (ja) | 1989-01-26 |
| JPH0581569B2 true JPH0581569B2 (ja) | 1993-11-15 |
Family
ID=25459724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63500179A Granted JPH01500199A (ja) | 1986-11-14 | 1987-11-13 | 創傷の治癒および骨の再生 |
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| JP (1) | JPH01500199A (ja) |
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