JPH0582192B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0582192B2 JPH0582192B2 JP1922586A JP1922586A JPH0582192B2 JP H0582192 B2 JPH0582192 B2 JP H0582192B2 JP 1922586 A JP1922586 A JP 1922586A JP 1922586 A JP1922586 A JP 1922586A JP H0582192 B2 JPH0582192 B2 JP H0582192B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- virus
- porcine parvovirus
- cultured
- strain
- Prior art date
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- Expired - Lifetime
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明は豚パルボウイルスの弱毒株の作出法に
関するものである。 （従来の技術） 豚パルボウイルスはわが国の豚に広く蔓延して
おり、妊娠豚がこのウイルスに感染すると流産、
死産、異常子の娩出などを惹起し、種雄豚が感染
すると精巣炎等により繁殖障害を引き起す。また
感染した豚はウイルスを排出し、豚パルボウイル
ス感染症の感染源となるため、畜主に精神的、経
済的に莫大な打撃を与えている。 従来、生ワクチンの開発にあたり、強毒な豚パ
ルボウイルスの弱毒株の作出法は、豚の細胞で行
なわれている。 （発明が解決しようとする問題点） このような豚由来の培養細胞を用いて生ウイル
スワクチンを作ることは、これらの細胞に既知あ
るいは未知の豚に対する病原性ウイルスの迷入の
危険性があるため、豚以外の培養細胞を用いるこ
とが理想とされている。しかし、豚パルボウイル
スは宿主特異性が強く、他種動物由来の培養細胞
では増殖が極めて悪いことが知られている
（Cartwright et al.，J.Comp.Path，1967，79，
p371−377；Pirtle et al.，Am.J.Vet.Res.1974，
35，p249−250を参照）。 このようなことから、豚パルボウイルスを他種
動物由来の培養細胞で継代培養することは非常に
困難なことであつた。 （問題点を解決するための手段） 本発明はかかる実状に鑑み豚パルボウイルス感
染症に対する生ウイルスワクチンの製造の基礎と
なる弱毒化ウイルス株の作出法を提出するもの
で、強毒な豚パルボウイルスを牛皮膚培養細胞を
用いて低温で順次継代培養して弱毒化することを
特徴とする。 （実施例） 以下、本発明による豚パルボウイルスの弱毒株
の作出法について説明する。 本発明者らは、この豚パルボウイルスに感受性
があり、かつウイルス産生性のある他種動物由来
の培養細胞を調査試験したところ牛皮膚培養細胞
で最も良好に前記ウイルスが増殖し、累代継代が
可能であることを確認した。 該ウイルスとしては、野外より分離した強毒
株、例えば農林水産省家畜衛生試験場より分与を
受けた豚パルボウイルス90HS株（ESK9代、
SK4代継代）を原株ウイルスとした。 ウイルスの継代に使用した牛胎児皮膚（以下
BEDと略称）細胞は牛胎児の皮膚をトリプシン
で処理したのち、子牛血清を10％に添加したイー
グルMEM培地で培養し調製した。 原株ウイルスはESK細胞で継代されているこ
とから、豚コレラウイルスの迷入が疑われるの
で、ウイルス液を60℃30分の加熱処理を行なつ
た。加熱処理後、原株ウイルスを37℃で豚腎細胞
で１代、BED細胞で６代継代したところ明瞭な
細胞変性を伴つた増殖がみられた。引き続いて培
養温度を32℃に下げBED細胞で継代し、低温35
代継代株を得た。 低温35代継代株の増殖性についてBED細胞と
CPK細胞を使用し、32°，37°および40℃で培養し
比較した。その結果、低温35代継代株は、CPK
細胞よりもBED細胞で高い増殖性を示した。ま
た、各培養温度での増殖は32℃で最も良く、40℃
では極めて悪かつた。 低温35代継代株の１ml（105.5TCID50／ml）を
豚パルボウイルス抗体陰性の３ケ月齢豚の皮下に
接種した結果、接種豚は臨床的に異常はなくウイ
レミーおよびウイルス排泄も認められなかつた。
また、接種豚では接種１週後にHI抗体価が40〜
80倍、２週後で320〜640倍に達しその抗体価は７
週後まで持続した。ウイルス接種豚に同居させた
豚は、全試験期間を通しHI抗体価は10倍以下で
あり、同居感染は認められなかつた。 牛皮膚培養細胞を用いて32℃で35代順次継代し
て作出した豚パルボウイルス弱毒株は、牛皮膚培
養細胞と豚由来CPK細胞とでの増殖性並びに培
養温度による増殖性において野外株と容易に区別
ができ、ワクチン株としての検定が確実にできる
安定な性状を有し、これが生ウイルスワクチンと
して有効かつ安全であることを見い出し、本発明
を完成するに至つた。 以下、その詳細を更に詳細な実施例によつて説
明する。 実施例 １ 牛皮膚培養細胞の調整法とウイルスの継代法に
ついて述べる。まず、牛胎児の皮膚を無菌的に採
取し、細かく切つて0.25％トリプシン溶液と0.2
％EDTA（エチレンヂアミン四酢酸二ナトリウ
ム・二水塩）溶液の等量混合液に入れて細胞を分
散し、細胞懸濁液を作る。次に、この細胞懸濁液
中の細胞を遠心分離によつて沈澱させ、この沈澱
した細胞をとり出し細胞増殖用培養液で細胞浮遊
液を作る。前記細胞増殖用培養液はイーグル
MEM培地に容量百分率で牛血清10％トリプトー
スフオスフエイトブロス10％さらにカナマイシン
100μg／ml、フアンギゾン1μg／mlを混合したも
のである。次いで前記細胞浮遊液を細胞培養びん
に分注し、37℃で静置で培養する。その結果４〜
７日で培養びんの底に培養細胞の単層が形成され
る。 次いで0.25％トリプシン溶液と0.2％EDTA溶
液の等量混合液を加え細胞を単離させ、これを遠
心沈澱により集め、前記等量混合液を除去して細
胞に前記細胞増殖用培養液を加えて細胞浮遊液を
作る。ついで、この細胞浮遊液を細胞培養びんに
分注し、37℃で静置培養する。その結果24時間以
内で培養細胞の単層が形成される。つぎに培養び
んより前記培養液を取り除き、野外分離親株豚パ
ルボウイルス（90HS株）液を加え、ウイルスを
完全に細胞に吸着させる。ついで接種ウイルス液
を除去し、細胞維持用培養液（前記細胞増殖用培
養液中牛血清のみを５％に減量したもの）を細胞
培養びんに加えて、32℃で培養したところ、４日
間前後で細胞変性効果を伴つたウイルスが増殖し
た。この細胞変性効果の出現した細胞培養液の一
部を前記と同様にして作成した健康な牛皮膚培養
細胞に接種して豚パルボウイルスの継代培養を行
ない、これを繰返して35代継代培養したところ牛
皮膚培養細胞に馴化した豚パルボウイルス弱毒株
が作出された。 比較試験 １ 上記により得た豚パルボウイルス弱毒株と野外
分離親株豚パルボウイルスとを32℃培養で牛皮膚
培養細胞およびCPK細胞でのウイルス増殖性に
ついて比較した。その成績を下記表１に示した。
野外分離親株豚パルボウイルスではCPK細胞で
牛皮膚培養細胞よりも増殖が良く、豚パルボウイ
ルス弱毒株の増殖は、牛皮膚培養細胞でCPK細
胞よりも1000倍以上上まわつた。
関するものである。 （従来の技術） 豚パルボウイルスはわが国の豚に広く蔓延して
おり、妊娠豚がこのウイルスに感染すると流産、
死産、異常子の娩出などを惹起し、種雄豚が感染
すると精巣炎等により繁殖障害を引き起す。また
感染した豚はウイルスを排出し、豚パルボウイル
ス感染症の感染源となるため、畜主に精神的、経
済的に莫大な打撃を与えている。 従来、生ワクチンの開発にあたり、強毒な豚パ
ルボウイルスの弱毒株の作出法は、豚の細胞で行
なわれている。 （発明が解決しようとする問題点） このような豚由来の培養細胞を用いて生ウイル
スワクチンを作ることは、これらの細胞に既知あ
るいは未知の豚に対する病原性ウイルスの迷入の
危険性があるため、豚以外の培養細胞を用いるこ
とが理想とされている。しかし、豚パルボウイル
スは宿主特異性が強く、他種動物由来の培養細胞
では増殖が極めて悪いことが知られている
（Cartwright et al.，J.Comp.Path，1967，79，
p371−377；Pirtle et al.，Am.J.Vet.Res.1974，
35，p249−250を参照）。 このようなことから、豚パルボウイルスを他種
動物由来の培養細胞で継代培養することは非常に
困難なことであつた。 （問題点を解決するための手段） 本発明はかかる実状に鑑み豚パルボウイルス感
染症に対する生ウイルスワクチンの製造の基礎と
なる弱毒化ウイルス株の作出法を提出するもの
で、強毒な豚パルボウイルスを牛皮膚培養細胞を
用いて低温で順次継代培養して弱毒化することを
特徴とする。 （実施例） 以下、本発明による豚パルボウイルスの弱毒株
の作出法について説明する。 本発明者らは、この豚パルボウイルスに感受性
があり、かつウイルス産生性のある他種動物由来
の培養細胞を調査試験したところ牛皮膚培養細胞
で最も良好に前記ウイルスが増殖し、累代継代が
可能であることを確認した。 該ウイルスとしては、野外より分離した強毒
株、例えば農林水産省家畜衛生試験場より分与を
受けた豚パルボウイルス90HS株（ESK9代、
SK4代継代）を原株ウイルスとした。 ウイルスの継代に使用した牛胎児皮膚（以下
BEDと略称）細胞は牛胎児の皮膚をトリプシン
で処理したのち、子牛血清を10％に添加したイー
グルMEM培地で培養し調製した。 原株ウイルスはESK細胞で継代されているこ
とから、豚コレラウイルスの迷入が疑われるの
で、ウイルス液を60℃30分の加熱処理を行なつ
た。加熱処理後、原株ウイルスを37℃で豚腎細胞
で１代、BED細胞で６代継代したところ明瞭な
細胞変性を伴つた増殖がみられた。引き続いて培
養温度を32℃に下げBED細胞で継代し、低温35
代継代株を得た。 低温35代継代株の増殖性についてBED細胞と
CPK細胞を使用し、32°，37°および40℃で培養し
比較した。その結果、低温35代継代株は、CPK
細胞よりもBED細胞で高い増殖性を示した。ま
た、各培養温度での増殖は32℃で最も良く、40℃
では極めて悪かつた。 低温35代継代株の１ml（105.5TCID50／ml）を
豚パルボウイルス抗体陰性の３ケ月齢豚の皮下に
接種した結果、接種豚は臨床的に異常はなくウイ
レミーおよびウイルス排泄も認められなかつた。
また、接種豚では接種１週後にHI抗体価が40〜
80倍、２週後で320〜640倍に達しその抗体価は７
週後まで持続した。ウイルス接種豚に同居させた
豚は、全試験期間を通しHI抗体価は10倍以下で
あり、同居感染は認められなかつた。 牛皮膚培養細胞を用いて32℃で35代順次継代し
て作出した豚パルボウイルス弱毒株は、牛皮膚培
養細胞と豚由来CPK細胞とでの増殖性並びに培
養温度による増殖性において野外株と容易に区別
ができ、ワクチン株としての検定が確実にできる
安定な性状を有し、これが生ウイルスワクチンと
して有効かつ安全であることを見い出し、本発明
を完成するに至つた。 以下、その詳細を更に詳細な実施例によつて説
明する。 実施例 １ 牛皮膚培養細胞の調整法とウイルスの継代法に
ついて述べる。まず、牛胎児の皮膚を無菌的に採
取し、細かく切つて0.25％トリプシン溶液と0.2
％EDTA（エチレンヂアミン四酢酸二ナトリウ
ム・二水塩）溶液の等量混合液に入れて細胞を分
散し、細胞懸濁液を作る。次に、この細胞懸濁液
中の細胞を遠心分離によつて沈澱させ、この沈澱
した細胞をとり出し細胞増殖用培養液で細胞浮遊
液を作る。前記細胞増殖用培養液はイーグル
MEM培地に容量百分率で牛血清10％トリプトー
スフオスフエイトブロス10％さらにカナマイシン
100μg／ml、フアンギゾン1μg／mlを混合したも
のである。次いで前記細胞浮遊液を細胞培養びん
に分注し、37℃で静置で培養する。その結果４〜
７日で培養びんの底に培養細胞の単層が形成され
る。 次いで0.25％トリプシン溶液と0.2％EDTA溶
液の等量混合液を加え細胞を単離させ、これを遠
心沈澱により集め、前記等量混合液を除去して細
胞に前記細胞増殖用培養液を加えて細胞浮遊液を
作る。ついで、この細胞浮遊液を細胞培養びんに
分注し、37℃で静置培養する。その結果24時間以
内で培養細胞の単層が形成される。つぎに培養び
んより前記培養液を取り除き、野外分離親株豚パ
ルボウイルス（90HS株）液を加え、ウイルスを
完全に細胞に吸着させる。ついで接種ウイルス液
を除去し、細胞維持用培養液（前記細胞増殖用培
養液中牛血清のみを５％に減量したもの）を細胞
培養びんに加えて、32℃で培養したところ、４日
間前後で細胞変性効果を伴つたウイルスが増殖し
た。この細胞変性効果の出現した細胞培養液の一
部を前記と同様にして作成した健康な牛皮膚培養
細胞に接種して豚パルボウイルスの継代培養を行
ない、これを繰返して35代継代培養したところ牛
皮膚培養細胞に馴化した豚パルボウイルス弱毒株
が作出された。 比較試験 １ 上記により得た豚パルボウイルス弱毒株と野外
分離親株豚パルボウイルスとを32℃培養で牛皮膚
培養細胞およびCPK細胞でのウイルス増殖性に
ついて比較した。その成績を下記表１に示した。
野外分離親株豚パルボウイルスではCPK細胞で
牛皮膚培養細胞よりも増殖が良く、豚パルボウイ
ルス弱毒株の増殖は、牛皮膚培養細胞でCPK細
胞よりも1000倍以上上まわつた。
【表】
【表】
比較試験 ２
上記の豚パルボウイルス弱毒株と野外分離親株
豚パルボウイルスとを牛皮膚培養細胞を用いて培
養温度によるウイルス増殖性の差を調べた。その
結果は、下記表２で示すように、野外分離親株豚
パルボウイルスでは培養温度によるウイルス増殖
性の差が認められないが、豚パルボウイルス弱毒
株では32℃培養でウイルス増殖性が最も良く37℃
及び40℃培養のそれよりも1000倍以上上まわつ
た。
豚パルボウイルスとを牛皮膚培養細胞を用いて培
養温度によるウイルス増殖性の差を調べた。その
結果は、下記表２で示すように、野外分離親株豚
パルボウイルスでは培養温度によるウイルス増殖
性の差が認められないが、豚パルボウイルス弱毒
株では32℃培養でウイルス増殖性が最も良く37℃
及び40℃培養のそれよりも1000倍以上上まわつ
た。
【表】
以上の比較試験例１，２の成績から豚パルボウ
イルス弱毒株は牛皮膚培養細胞で豚由来のCPK
細胞よりもウイルス増殖性が上まわり、32℃培養
で37℃および40℃培養に上まわるウイルス増殖性
を示し、野外分離親株豚パルボウイルスと区別で
きる性状を有する事が証明された。 次に、上記豚パルボウイルス弱毒株の安全性と
有効性を調べるため、豚パルボウイルス弱毒株か
らなるワクチンを感受性ある２頭の豚に皮下接種
して観察した。２頭の豚は発熱その他臨床上の異
常は全く認められず、下記表３に示すようにウイ
ルス血症、ウイルスの排出が認められず、又第１
図に示すようにワクチン接種後１週目より本ウイ
ルスに対する赤血球凝集阻止抗体の産生が確認さ
れた。さらに、ワクチン接種後28日目に実施した
野外分離親株豚パルボウイルスの攻撃に対して、
豚は無症状で耐過し、ウイルス血症、ウイルスの
排出が認められずワクチンを接種した２頭の豚が
豚パルボウイルスに対し完全に免疫していたこと
が証明された。
イルス弱毒株は牛皮膚培養細胞で豚由来のCPK
細胞よりもウイルス増殖性が上まわり、32℃培養
で37℃および40℃培養に上まわるウイルス増殖性
を示し、野外分離親株豚パルボウイルスと区別で
きる性状を有する事が証明された。 次に、上記豚パルボウイルス弱毒株の安全性と
有効性を調べるため、豚パルボウイルス弱毒株か
らなるワクチンを感受性ある２頭の豚に皮下接種
して観察した。２頭の豚は発熱その他臨床上の異
常は全く認められず、下記表３に示すようにウイ
ルス血症、ウイルスの排出が認められず、又第１
図に示すようにワクチン接種後１週目より本ウイ
ルスに対する赤血球凝集阻止抗体の産生が確認さ
れた。さらに、ワクチン接種後28日目に実施した
野外分離親株豚パルボウイルスの攻撃に対して、
豚は無症状で耐過し、ウイルス血症、ウイルスの
排出が認められずワクチンを接種した２頭の豚が
豚パルボウイルスに対し完全に免疫していたこと
が証明された。
【表】
供試豚：１ケ月齢
上記比較試験は、牛皮膚培養細胞を用いて32℃
で35代継代して作出した豚パルボウイルス弱毒株
について示したが、当実施例は、あらかじめ牛皮
膚培養細胞を用いて37℃で６代継代したウイルス
を32℃で35代継代して作出した豚パルボウイルス
弱毒株についての成績である下記表４，５，６お
よび第２図に示すように当実施例により作出した
弱毒株ウイルスの継代を１代より32℃で培養して
作出した弱毒株との成績と同等のものであつた。
で35代継代して作出した豚パルボウイルス弱毒株
について示したが、当実施例は、あらかじめ牛皮
膚培養細胞を用いて37℃で６代継代したウイルス
を32℃で35代継代して作出した豚パルボウイルス
弱毒株についての成績である下記表４，５，６お
よび第２図に示すように当実施例により作出した
弱毒株ウイルスの継代を１代より32℃で培養して
作出した弱毒株との成績と同等のものであつた。
【表】
【表】
【表】
供試豚：３ケ月齢
（発明の効果）
以上の実施例等で判るように本発明による豚パ
ルボウイルスの弱毒法は強毒な豚パルボウイルス
を牛皮膚培養細胞を用いて低温で順次継代培養す
ることにより、前記ウイルスの免疫産生を失わせ
ることなく病原性を減弱することができるので、
豚パルボウイルス感染症予防のための安全有効且
つ、省力的、経済的な生ウイルスワクチンの製造
の基礎となる該ウイルス弱毒株を作出できる効果
を有する。
ルボウイルスの弱毒法は強毒な豚パルボウイルス
を牛皮膚培養細胞を用いて低温で順次継代培養す
ることにより、前記ウイルスの免疫産生を失わせ
ることなく病原性を減弱することができるので、
豚パルボウイルス感染症予防のための安全有効且
つ、省力的、経済的な生ウイルスワクチンの製造
の基礎となる該ウイルス弱毒株を作出できる効果
を有する。
第１図及び第２図は夫々本発明のPPV低温継
代ウイルス接種豚における抗体の消長を示すグラ
フである。 No.１〜No.６……供試豚番号。
代ウイルス接種豚における抗体の消長を示すグラ
フである。 No.１〜No.６……供試豚番号。
Claims (1)
- １ 強毒な豚パルボウイルスを牛皮膚培養細胞を
用いて低温で順次継代培養して弱毒化することを
特徴とする豚パルボウイルスの弱毒株の作出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1922586A JPS62179385A (ja) | 1986-01-31 | 1986-01-31 | 豚パルボウイルスの弱毒株の作出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1922586A JPS62179385A (ja) | 1986-01-31 | 1986-01-31 | 豚パルボウイルスの弱毒株の作出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62179385A JPS62179385A (ja) | 1987-08-06 |
| JPH0582192B2 true JPH0582192B2 (ja) | 1993-11-17 |
Family
ID=11993429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1922586A Granted JPS62179385A (ja) | 1986-01-31 | 1986-01-31 | 豚パルボウイルスの弱毒株の作出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62179385A (ja) |
-
1986
- 1986-01-31 JP JP1922586A patent/JPS62179385A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62179385A (ja) | 1987-08-06 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |