JPH0157954B2 - - Google Patents
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- JPH0157954B2 JPH0157954B2 JP54103643A JP10364379A JPH0157954B2 JP H0157954 B2 JPH0157954 B2 JP H0157954B2 JP 54103643 A JP54103643 A JP 54103643A JP 10364379 A JP10364379 A JP 10364379A JP H0157954 B2 JPH0157954 B2 JP H0157954B2
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- cultured cells
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- C12N2770/32011—Picornaviridae
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＡ型肝炎ウイルス特にＡ型肝炎ウイル
スを培養細胞中で増殖せしめる方法に関するもの
である。
スを培養細胞中で増殖せしめる方法に関するもの
である。
感受性類人霊長動物例えばキヌザル
（marmoset）、夜行性サル（owl monkey）、ア
フリカみどりサル、アカゲザル、カニクイザルま
たはチンパンジーの肝臓に少なくとも１回継代さ
せることによつて適合させたＡ型肝炎ウイルス
は、有利に培養細胞に継代せしめることができる
ということが判つた。好適には、感受性類人霊長
動物に少なくとも５回継代させる。また少なくと
も２種の類人霊長動物を使用してそしてそれぞれ
の動物に少なくとも２回継代せしめることが好適
である。Ａ型肝炎ウイルスは、このように上述の
種々の類人霊長動物に感染させることができる。
（marmoset）、夜行性サル（owl monkey）、ア
フリカみどりサル、アカゲザル、カニクイザルま
たはチンパンジーの肝臓に少なくとも１回継代さ
せることによつて適合させたＡ型肝炎ウイルス
は、有利に培養細胞に継代せしめることができる
ということが判つた。好適には、感受性類人霊長
動物に少なくとも５回継代させる。また少なくと
も２種の類人霊長動物を使用してそしてそれぞれ
の動物に少なくとも２回継代せしめることが好適
である。Ａ型肝炎ウイルスは、このように上述の
種々の類人霊長動物に感染させることができる。
最終の継代後、感染した肝臓を摘出し、ホモジ
エナイズし、次に濾過若しくは低速で遠心分離し
そして次に培養細胞に接種するために使用する。
エナイズし、次に濾過若しくは低速で遠心分離し
そして次に培養細胞に接種するために使用する。
培養細胞は、初代キヌザル肝臓培養細胞、初代
アフリカみどりサル腎臓培養細胞、初代アカゲザ
ル腎臓培養細胞、初代カニクイザル腎臓培養細
胞、胎児アカゲザル腎臓培養細胞、胎児サーコピ
セカス（cercopithecus）サル腎臓培養細胞、胎
児ルフイベンターキヌザル（rufiventer
marmoset）腎臓培養細胞またはＡ型肝炎ウイル
ス感染に感受性である人間または類人霊長動物か
ら誘導された初代、連続または形質転換した腎臓
または肝臓培養細胞である。培養細胞は、また、
初代にわとり胎児またはあひる胎児細胞または新
しく生まれたにわとりまたはあひるの腎臓から誘
導された細胞からなる。
アフリカみどりサル腎臓培養細胞、初代アカゲザ
ル腎臓培養細胞、初代カニクイザル腎臓培養細
胞、胎児アカゲザル腎臓培養細胞、胎児サーコピ
セカス（cercopithecus）サル腎臓培養細胞、胎
児ルフイベンターキヌザル（rufiventer
marmoset）腎臓培養細胞またはＡ型肝炎ウイル
ス感染に感受性である人間または類人霊長動物か
ら誘導された初代、連続または形質転換した腎臓
または肝臓培養細胞である。培養細胞は、また、
初代にわとり胎児またはあひる胎児細胞または新
しく生まれたにわとりまたはあひるの腎臓から誘
導された細胞からなる。
培養細胞は、Ａ型肝炎ウイルス抗原が細胞シー
トまたは組織培養液中に検出されることができる
まで、約33〜39℃好適には約35〜37℃で培養す
る。普通、検出できるＡ型肝炎ウイルス抗原の現
出に対して、約７〜35日が必要である。抗原は、
普通、細胞シートにおいては蛍光抗体法によつて
そして細胞培養液においては免疫付着凝集試験ま
たは同位元素標識免疫試験によつて検出される。
トまたは組織培養液中に検出されることができる
まで、約33〜39℃好適には約35〜37℃で培養す
る。普通、検出できるＡ型肝炎ウイルス抗原の現
出に対して、約７〜35日が必要である。抗原は、
普通、細胞シートにおいては蛍光抗体法によつて
そして細胞培養液においては免疫付着凝集試験ま
たは同位元素標識免疫試験によつて検出される。
連続インビトロ継代は、無期限に実施できる。
連続的継代を行なつた場合、Ａ型肝炎ウイルス抗
原の急速な出現及び大量のウイルス抗原の生産に
よつて判るように、インビトロ生長に対するウイ
ルスのよりよい適合が得られる。
連続的継代を行なつた場合、Ａ型肝炎ウイルス抗
原の急速な出現及び大量のウイルス抗原の生産に
よつて判るように、インビトロ生長に対するウイ
ルスのよりよい適合が得られる。
前述した細胞型におけるＡ型肝炎ウイルスの５
回またはそれ以上の連続インビトロ継代の後に、
ウイルスは、人間胎児二倍体肺線維芽細胞、胎児
アカゲザル二倍体肺細胞及び胎児サーコピセカス
二倍体肺細胞のような他の細胞型において容易に
培養できるように変性される。これらの細胞型
は、すべて、生きた弱毒化人間ウイルスワクチン
の製造に使用するのに適している。
回またはそれ以上の連続インビトロ継代の後に、
ウイルスは、人間胎児二倍体肺線維芽細胞、胎児
アカゲザル二倍体肺細胞及び胎児サーコピセカス
二倍体肺細胞のような他の細胞型において容易に
培養できるように変性される。これらの細胞型
は、すべて、生きた弱毒化人間ウイルスワクチン
の製造に使用するのに適している。
人間Ａ型肝炎ウイルスは、類人霊長動物の肝臓
における連続継代及び培養細胞における次の連続
インビトロ継代によつて生きた弱毒化人間ウイル
スワクチンを与えるように変性することができ
る。そして更に抗原性、免疫性のウイルスワクチ
ンの製造に対してそしてまた診断目的に対するＡ
型肝炎ウイルス抗原の製造に対して充分なウイル
ス抗原の生産を可能にするように細胞培養で経済
的に充分な量で増殖せしめることができる。
における連続継代及び培養細胞における次の連続
インビトロ継代によつて生きた弱毒化人間ウイル
スワクチンを与えるように変性することができ
る。そして更に抗原性、免疫性のウイルスワクチ
ンの製造に対してそしてまた診断目的に対するＡ
型肝炎ウイルス抗原の製造に対して充分なウイル
ス抗原の生産を可能にするように細胞培養で経済
的に充分な量で増殖せしめることができる。
Ａ型肝炎ウイルス抗原は、Ａ型肝炎ウイルスに
対するワクチンとして使用するために不活性化す
ることができる。感染性の不活性化は、ホルマリ
ンによる処理によつて達成することができる。使
用されるホルマリンの量は、物質がワクチンとし
て有効であるように免疫性を保持しながら、抗原
の感染性を不活化するのに有効な量である。普
通、37％ホルムアルデヒド溶液であるホルマリン
を抗原製剤の約1000〜10000部にうすめそして約
４〜60℃で約２時間乃至30日攪拌する。好適に
は、ホルマリンを約20〜45℃で約２〜６日もつと
も好適には約37℃で３日間ウイルス製剤の約2000
〜6000部にうすめる。
対するワクチンとして使用するために不活性化す
ることができる。感染性の不活性化は、ホルマリ
ンによる処理によつて達成することができる。使
用されるホルマリンの量は、物質がワクチンとし
て有効であるように免疫性を保持しながら、抗原
の感染性を不活化するのに有効な量である。普
通、37％ホルムアルデヒド溶液であるホルマリン
を抗原製剤の約1000〜10000部にうすめそして約
４〜60℃で約２時間乃至30日攪拌する。好適に
は、ホルマリンを約20〜45℃で約２〜６日もつと
も好適には約37℃で３日間ウイルス製剤の約2000
〜6000部にうすめる。
本発明のワクチンは、例えばキヌザル及びチン
パンジーのような感受性哺乳動物のＡ型肝炎ウイ
ルスに対して免疫化するために使用することがで
きる。
パンジーのような感受性哺乳動物のＡ型肝炎ウイ
ルスに対して免疫化するために使用することがで
きる。
以下の例は、本発明を説明するものである。し
かし、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。尚、例２は、感染したキヌザルの肝臓片は
摘出することができ且つ該肝臓片の培養細胞中で
Ａ型肝炎ウイルスが増殖可能なことを示した参考
例である。
かし、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。尚、例２は、感染したキヌザルの肝臓片は
摘出することができ且つ該肝臓片の培養細胞中で
Ａ型肝炎ウイルスが増殖可能なことを示した参考
例である。
例 １
インビトロ培養に適したウイルス株を得るた
めの２種のキヌザル即ちサギナス・ミスタツク
スキヌザル及びサギナス・ラビアタス（ルフイ
ベンター）キヌザルにおけるＡ型肝炎ウイルス
の連続継代 (1) ヒトＡ型肝炎ウイルスCR326株を、マスコリ
ー等の方法〔P.S.E.B.M.142巻276〜282頁
（1973年）〕によつて、急性のヒトＡ型肝炎患者
からの血液の静脈接種によつて、一群の６匹の
サギナス・ミスタツクス（Saguinus mystax）
キヌザルに移す。
めの２種のキヌザル即ちサギナス・ミスタツク
スキヌザル及びサギナス・ラビアタス（ルフイ
ベンター）キヌザルにおけるＡ型肝炎ウイルス
の連続継代 (1) ヒトＡ型肝炎ウイルスCR326株を、マスコリ
ー等の方法〔P.S.E.B.M.142巻276〜282頁
（1973年）〕によつて、急性のヒトＡ型肝炎患者
からの血液の静脈接種によつて、一群の６匹の
サギナス・ミスタツクス（Saguinus mystax）
キヌザルに移す。
(2) これらの接種されたキヌザルは、接種後30〜
50日以内に血清イソクエン酸デヒドロケナーゼ
（ICD）酸素値の上昇並びに肝炎と一致した肝
臓組織学変化を生ずる。
50日以内に血清イソクエン酸デヒドロケナーゼ
（ICD）酸素値の上昇並びに肝炎と一致した肝
臓組織学変化を生ずる。
(3) CR326の第２の継代は、ICDの上昇期間中の
第１の継代の動物からとつた血清を第２の群の
ミスタツクス・キヌザルに静脈接種することに
よつて、ミスタツクス・キヌザルにおいて実施
する。この方法は、前述したようなICD上昇及
び肝臓変化を誘起する。
第１の継代の動物からとつた血清を第２の群の
ミスタツクス・キヌザルに静脈接種することに
よつて、ミスタツクス・キヌザルにおいて実施
する。この方法は、前述したようなICD上昇及
び肝臓変化を誘起する。
(4) マスタツクス・キヌザルにおけるCR326の第
３、第４及び第５の継代を同様に実施する。プ
ロボスト等の方法〔P.S.E.B.M.142巻、1257〜
1267頁（1973年）〕によつて広範囲な血清中和
試験を実施してキヌザル中に繁殖したCR326が
実際にヒトＡ型肝炎ウイルスであることを証明
する。
３、第４及び第５の継代を同様に実施する。プ
ロボスト等の方法〔P.S.E.B.M.142巻、1257〜
1267頁（1973年）〕によつて広範囲な血清中和
試験を実施してキヌザル中に繁殖したCR326が
実際にヒトＡ型肝炎ウイルスであることを証明
する。
(5) 第５の継代において、肝臓組織を、血清ICD
上昇開始時に感染したミスタツクス・キヌザル
からとる。
上昇開始時に感染したミスタツクス・キヌザル
からとる。
(6) ホモジエナイズした肝臓の１：1500稀釈物を
使用して、静脈接種によつてCR326感染物をサ
ギナス・ラビアタス（ルフイベンター）キヌザ
ルに移す。これはキヌザルにおける第６の連続
継代及びルフイベンターキヌザルにおける第１
の継代を構成する。プロボスト等の方法〔P.S.
E.B.M.155巻283〜286頁（1977年）〕によつて
肝臓組織をICD上昇開始時においてとる。
使用して、静脈接種によつてCR326感染物をサ
ギナス・ラビアタス（ルフイベンター）キヌザ
ルに移す。これはキヌザルにおける第６の連続
継代及びルフイベンターキヌザルにおける第１
の継代を構成する。プロボスト等の方法〔P.S.
E.B.M.155巻283〜286頁（1977年）〕によつて
肝臓組織をICD上昇開始時においてとる。
(7) ホモジエナイズした肝臓の１：100稀釈物を
使用して、１群の24匹のルフイベンターキヌザ
ルにおいて、CR326の第２の連続継代を実施す
る。これらの動物の肝臓を上述したようにして
とる。
使用して、１群の24匹のルフイベンターキヌザ
ルにおいて、CR326の第２の連続継代を実施す
る。これらの動物の肝臓を上述したようにして
とる。
(8) 肝臓収穫、ホモジエナイズ、稀釈及び静脈注
射によつてルフイベンターキヌザルにおいて総
計26回のCR326の連続継代を実施する。
射によつてルフイベンターキヌザルにおいて総
計26回のCR326の連続継代を実施する。
(9) このように、工程１〜８に説明したように、
全体でCR326は、ミスタツクスキヌザルで連続
的に５回そしてルフイベンターマーモセツトで
更に26回継代させた。
全体でCR326は、ミスタツクスキヌザルで連続
的に５回そしてルフイベンターマーモセツトで
更に26回継代させた。
(10) 第24〜第31のキヌザル継代における感染した
ルフイベンターキヌザルからの肝臓組織をホモ
ジエナイズしそして濾過若しくは低速で遠心分
離する。このホモジエナイズしそして濾過若し
くは低速で遠心分離した肝臓組織は、Ａ型肝炎
ウイルスのインビトロ培養に対する接種体とし
て役立つものである。夜行性サル、アカゲザ
ル、アフリカみどりサル、カニクイザル又はチ
ンパンジーにも、上述のキヌザルに対すると同
様にＡ型肝炎ウイルスを継代させ、Ａ型肝炎ウ
イルスのインビトロ培養に対する接種体を得る
ことができる。
ルフイベンターキヌザルからの肝臓組織をホモ
ジエナイズしそして濾過若しくは低速で遠心分
離する。このホモジエナイズしそして濾過若し
くは低速で遠心分離した肝臓組織は、Ａ型肝炎
ウイルスのインビトロ培養に対する接種体とし
て役立つものである。夜行性サル、アカゲザ
ル、アフリカみどりサル、カニクイザル又はチ
ンパンジーにも、上述のキヌザルに対すると同
様にＡ型肝炎ウイルスを継代させ、Ａ型肝炎ウ
イルスのインビトロ培養に対する接種体を得る
ことができる。
例 ２
キヌザル肝臓培養細胞におけるＡ型肝炎ウイ
ルスの増殖 (1) 例１におけるようにして製造した水性抽出液
の形態のホモジエナイズした、濾過若しくは低
速で遠心分離した、感染した肝臓組織の１：
100稀釈物１mlをルフイベンター・キヌザルに
静脈的に接種する。
ルスの増殖 (1) 例１におけるようにして製造した水性抽出液
の形態のホモジエナイズした、濾過若しくは低
速で遠心分離した、感染した肝臓組織の１：
100稀釈物１mlをルフイベンター・キヌザルに
静脈的に接種する。
(2) 接種後24〜48時間において、発病の前に動物
の肝臓の一部を外科手術的に摘出する。
の肝臓の一部を外科手術的に摘出する。
(3) 肝臓組織を単一のかみそり刃を有するプラス
チツク表面上で切り刻むことによつて細かく切
り刻む。この片を20％の胎児牛血清を含有する
細胞培養培地で充分に洗滌する。洗滌した片を
プラスチツクまたはガラスの培養容器に入れそ
して１週間当り３回ウイリアムス培地Ｅ＋20％
正常キヌザル血清＋10-6モルグルカゴン＋グル
タミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを
含有する培養培地を普通使用される量で加え
る。デキサメサゾン、９−フルオロ−11β，
17，21−トリヒドロキシ−16α−メチルプレグ
ナ−１，４−ジエン−３，20−ジオン及びイン
シユリンを約10-6モルの濃度で随時存在せしめ
得る。培地は、うすい相例えば25cm3当り２mlの
培養フラスコで使用される。培養は、最高の通
気を与えるロツカープラツトフオーム
（rocker platform）上35℃で行われる。ガス
雰囲気は、空気中５％の二酸化炭素からなる。
チツク表面上で切り刻むことによつて細かく切
り刻む。この片を20％の胎児牛血清を含有する
細胞培養培地で充分に洗滌する。洗滌した片を
プラスチツクまたはガラスの培養容器に入れそ
して１週間当り３回ウイリアムス培地Ｅ＋20％
正常キヌザル血清＋10-6モルグルカゴン＋グル
タミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを
含有する培養培地を普通使用される量で加え
る。デキサメサゾン、９−フルオロ−11β，
17，21−トリヒドロキシ−16α−メチルプレグ
ナ−１，４−ジエン−３，20−ジオン及びイン
シユリンを約10-6モルの濃度で随時存在せしめ
得る。培地は、うすい相例えば25cm3当り２mlの
培養フラスコで使用される。培養は、最高の通
気を与えるロツカープラツトフオーム
（rocker platform）上35℃で行われる。ガス
雰囲気は、空気中５％の二酸化炭素からなる。
(4) ７日以内に、肝細胞様の上皮細胞のはげしい
増殖がはじまる。この組織片からの肝細胞様細
胞の大きな島状のものの増殖は、徐々に数週間
にわたつてつづく。培養は、更に多週間維持す
ることができる。肝細胞の機能はアルブメン生
産及びチロシンアミノ酸トランスフエラーゼの
生産の検出によつて確認される。
増殖がはじまる。この組織片からの肝細胞様細
胞の大きな島状のものの増殖は、徐々に数週間
にわたつてつづく。培養は、更に多週間維持す
ることができる。肝細胞の機能はアルブメン生
産及びチロシンアミノ酸トランスフエラーゼの
生産の検出によつて確認される。
(5) Ａ型肝炎ウイルス抗原は、接種後約７日目で
ウイルス接種した動物から製造した培養物にお
いて検出される。このような検出はＡ型肝炎の
回復期にある人間の血清から製造したフルオレ
セイン標識ヒトグロブリンをアセトン固定カバ
ーグラス培養物に加えることによつてできる。
これらの標本は63×プラナポクロマト対物レン
ズ及び10×対眼レンズを有する直立蛍光ツワイ
ス顕微鏡で検査される。
ウイルス接種した動物から製造した培養物にお
いて検出される。このような検出はＡ型肝炎の
回復期にある人間の血清から製造したフルオレ
セイン標識ヒトグロブリンをアセトン固定カバ
ーグラス培養物に加えることによつてできる。
これらの標本は63×プラナポクロマト対物レン
ズ及び10×対眼レンズを有する直立蛍光ツワイ
ス顕微鏡で検査される。
(6) Ａ型肝炎ウイルス抗原は、肝細胞様の細胞の
細胞質に位置する輝きのある蛍光顆粒として検
出される。顆粒の数及びその大きさは、接種後
約10週間の期間増大する。抗原は、接種後少な
くとも16週間持続される。
細胞質に位置する輝きのある蛍光顆粒として検
出される。顆粒の数及びその大きさは、接種後
約10週間の期間増大する。抗原は、接種後少な
くとも16週間持続される。
(7) Ａ型肝炎ウイルスに対する顆粒の関係は(a)正
常なキヌザルから製造されたそしてウイルスに
さらさない肝臓培養物は決して顆粒蛍光を示さ
ない事実及び(b)顆粒状蛍光は固定標本に対する
回復期にあるヒトＡ型肝炎血清のプレ−アプリ
ケーシヨンによつてはブロツクされるが同じ患
者からの病気前の血清によつてはブロツクされ
ないという事実によつて証明される。
常なキヌザルから製造されたそしてウイルスに
さらさない肝臓培養物は決して顆粒蛍光を示さ
ない事実及び(b)顆粒状蛍光は固定標本に対する
回復期にあるヒトＡ型肝炎血清のプレ−アプリ
ケーシヨンによつてはブロツクされるが同じ患
者からの病気前の血清によつてはブロツクされ
ないという事実によつて証明される。
(8) これらの肝臓培養がＡ型肝炎ウイルスのイン
ビトロ増殖を与えるということは、また、(a)培
養の確立後４週間で、上澄液及び培養細胞抽出
液はルフイベンターキヌザルに対する静脈接種
によつてＡ型肝炎感染を生ずる(b)３週間及びそ
の後の期間において、プロボスト等〔P.S.E.B.
M.148巻532〜593頁（1975年）〕によつて説明
されてい性質を有するＡ型肝炎ウイルス粒子が
免疫電子顕微鏡によつて培養抽出液中に実証さ
れる及び(c)３週間及びその後の期間において、
Ａ型肝炎ウイルス抗原が、ミラー等〔P.S.E.B.
M.149巻254〜261頁（1975年）〕の方法によつ
て免疫付着凝集培養抽出液によつて検出できる
ということによつて示される。
ビトロ増殖を与えるということは、また、(a)培
養の確立後４週間で、上澄液及び培養細胞抽出
液はルフイベンターキヌザルに対する静脈接種
によつてＡ型肝炎感染を生ずる(b)３週間及びそ
の後の期間において、プロボスト等〔P.S.E.B.
M.148巻532〜593頁（1975年）〕によつて説明
されてい性質を有するＡ型肝炎ウイルス粒子が
免疫電子顕微鏡によつて培養抽出液中に実証さ
れる及び(c)３週間及びその後の期間において、
Ａ型肝炎ウイルス抗原が、ミラー等〔P.S.E.B.
M.149巻254〜261頁（1975年）〕の方法によつ
て免疫付着凝集培養抽出液によつて検出できる
ということによつて示される。
例 ３
インビトロで接種したキヌザル肝臓培養細胞
中のＡ型肝炎ウイルスの増殖及び連続継代 (1) 正常なルフイベンターキヌザルから外科手術
的に摘出した肝臓組織を切り刻みそして例２に
おいて感染した肝臓組織に対して使用したよう
な方法によつて細胞培養基をつくる。
中のＡ型肝炎ウイルスの増殖及び連続継代 (1) 正常なルフイベンターキヌザルから外科手術
的に摘出した肝臓組織を切り刻みそして例２に
おいて感染した肝臓組織に対して使用したよう
な方法によつて細胞培養基をつくる。
(2) 肝細胞の増殖がはじまるとき接種後約７日
に、25cm3フラスコ中の培養基に、例１における
ようにして誘導された感染されたキヌザル肝臓
の４％水性抽出液0.1mlの形態のＡ型肝炎ウイ
ルスを接種する。
に、25cm3フラスコ中の培養基に、例１における
ようにして誘導された感染されたキヌザル肝臓
の４％水性抽出液0.1mlの形態のＡ型肝炎ウイ
ルスを接種する。
(3) ウイルスを接種した肝臓細胞培養基並びに比
較対照の未接種培養基を35℃で培養しそして例
２におけるような培養培地を１週間毎に３回補
給する。
較対照の未接種培養基を35℃で培養しそして例
２におけるような培養培地を１週間毎に３回補
給する。
(4) カバーガラスを除去し、アセトン−固定し、
フルオレセイン標識Ａ型肝炎抗体含有グロブリ
ンで染色し次に例２に示したように蛍光顕微鏡
で検査する。
フルオレセイン標識Ａ型肝炎抗体含有グロブリ
ンで染色し次に例２に示したように蛍光顕微鏡
で検査する。
(5) Ａ型肝炎ウイルス抗原は、ウイルス接種培養
物においては検出されるが、比較対照培養物に
おいては検出されない。そしてこの検出は接種
後約７日ではじまり３週間から28日間にわたつ
て増大する。例２におけるように、抗原は、か
がやきのあるみどり色の蛍光細胞質顆粒として
みられる。特異性は例２におけるように証明さ
れる。
物においては検出されるが、比較対照培養物に
おいては検出されない。そしてこの検出は接種
後約７日ではじまり３週間から28日間にわたつ
て増大する。例２におけるように、抗原は、か
がやきのあるみどり色の蛍光細胞質顆粒として
みられる。特異性は例２におけるように証明さ
れる。
(6) 培養物を３回凍結及び溶解することによつ
て、比較対照及びウイルス−接種培養物からの
細胞及び液を、接種後３〜４週間でとる。破か
いされた細胞及び培養液の混合物を低速度遠心
処理によつて清浄化する。
て、比較対照及びウイルス−接種培養物からの
細胞及び液を、接種後３〜４週間でとる。破か
いされた細胞及び培養液の混合物を低速度遠心
処理によつて清浄化する。
(7) このような培養収穫物は、例２におけるよう
な(a)キヌザルの静脈接種及び感染(b)電子顕微鏡
及び(c)免疫付着凝集によつてＡ型肝炎ウイルス
を含有していることが判る。すべての場合にお
いて、比較対照培養の収穫物は、Ａ型肝炎ウイ
ルス活性に対して陰性である。
な(a)キヌザルの静脈接種及び感染(b)電子顕微鏡
及び(c)免疫付着凝集によつてＡ型肝炎ウイルス
を含有していることが判る。すべての場合にお
いて、比較対照培養の収穫物は、Ａ型肝炎ウイ
ルス活性に対して陰性である。
(8) 継代１（前記工程６）からの収穫物0.2mlを、
正常なキヌザル肝臓から製造した25cm3フラスコ
中の新しい細胞培養物に接種することによつて
肝臓培養細胞における第２のインビトロ継代を
行う。ウイルス増殖及び検出のパターンは工程
５〜７に述べたものと同様になる。
正常なキヌザル肝臓から製造した25cm3フラスコ
中の新しい細胞培養物に接種することによつて
肝臓培養細胞における第２のインビトロ継代を
行う。ウイルス増殖及び検出のパターンは工程
５〜７に述べたものと同様になる。
(9) このようなキヌザル肝臓培養におけるウイル
スの連続インビトロ継代を５回実施する。これ
は無限に実施することができる。継代を増大す
ると、インビトロ増殖に対するウイルスのより
よい適合の得られることが、大量の細胞質の蛍
光顆粒の急速な出現によつて判る。
スの連続インビトロ継代を５回実施する。これ
は無限に実施することができる。継代を増大す
ると、インビトロ増殖に対するウイルスのより
よい適合の得られることが、大量の細胞質の蛍
光顆粒の急速な出現によつて判る。
(10) 他の検査基準も、また、この培養細胞系にお
いて繁殖されたウイルスが実際にヒトＡ型肝炎
ウイルスであることを証明するのに使用し得
る。第４の連続継代からの収穫物を、培養細胞
の接種前にヒトＡ型肝炎患者の病気前及び回復
期にある血清と反応させる。すべての場合にお
いて、ウイルスは回復期にある血清によつては
中和される（すなわち培養細胞に感染を伝達し
ない）が、病気前の血清によつては中和されな
い。
いて繁殖されたウイルスが実際にヒトＡ型肝炎
ウイルスであることを証明するのに使用し得
る。第４の連続継代からの収穫物を、培養細胞
の接種前にヒトＡ型肝炎患者の病気前及び回復
期にある血清と反応させる。すべての場合にお
いて、ウイルスは回復期にある血清によつては
中和される（すなわち培養細胞に感染を伝達し
ない）が、病気前の血清によつては中和されな
い。
例 ４
初代アフリカみどりサル腎臓培養細胞におけ
るＡ型肝炎ウイルスの増殖及び連続継代 (1) 腎臓を、Ａ型肝炎抗体を有していないアフリ
カみどりサルから外科手術的に摘出する。標準
技術によつて、腎臓を切り刻み、トリプシン処
理し次に一相細胞培養基を製造する。
るＡ型肝炎ウイルスの増殖及び連続継代 (1) 腎臓を、Ａ型肝炎抗体を有していないアフリ
カみどりサルから外科手術的に摘出する。標準
技術によつて、腎臓を切り刻み、トリプシン処
理し次に一相細胞培養基を製造する。
(2) 細胞培養基を、10％胎児牛血清を含有するエ
ーゲル基礎培地からなる培地上で５〜７日間だ
いたいコンフルエントになるまで増殖させる。
ーゲル基礎培地からなる培地上で５〜７日間だ
いたいコンフルエントになるまで増殖させる。
(3) だいたいコンフルエントになつたら、培養培
地を0.5％胎児牛血清である以外は同じ培地で
置換する。培地５mlを含有する25cm3フラスコ培
養基のそれぞれに例１におけるようにして誘導
されたキヌザル肝臓の４％水性抽出液0.2mlを
接種する。
地を0.5％胎児牛血清である以外は同じ培地で
置換する。培地５mlを含有する25cm3フラスコ培
養基のそれぞれに例１におけるようにして誘導
されたキヌザル肝臓の４％水性抽出液0.2mlを
接種する。
(4) 培養基を25℃で培養しそして１週当り１回再
供給する。カバーガラスを除去し、固定し次に
例２におけるように免疫蛍光法によつて検査す
る。
供給する。カバーガラスを除去し、固定し次に
例２におけるように免疫蛍光法によつて検査す
る。
(5) このようにして、接種後約７日ではじまり３
週間から28日間にわたつて増大するＡ型肝炎ウ
イルス抗原は、ウイルス接種培養物においては
検出されるが、未接種比較対照培養物において
は検出されない。例２及び３におけるように、
抗原はかがやきのあるみどりの蛍光細胞質顆粒
としてみられる。特異性は例２及び３における
ように証明される。
週間から28日間にわたつて増大するＡ型肝炎ウ
イルス抗原は、ウイルス接種培養物においては
検出されるが、未接種比較対照培養物において
は検出されない。例２及び３におけるように、
抗原はかがやきのあるみどりの蛍光細胞質顆粒
としてみられる。特異性は例２及び３における
ように証明される。
(6) 細胞培養物は例３におけるように収穫され
る。
る。
(7) Ａ型肝炎ウイルスの存在は、例２及び３にお
けるように、(a)キヌザルの静脈接種及び感染、
(b)免疫電子顕微鏡及び(c)免疫付着凝集によつ
て、細胞培養収穫物中に存在していることが判
る。すべての場合において、未接種比較対照培
養物から得られる収穫物は、Ａ型肝炎ウイルス
を含有していない。
けるように、(a)キヌザルの静脈接種及び感染、
(b)免疫電子顕微鏡及び(c)免疫付着凝集によつ
て、細胞培養収穫物中に存在していることが判
る。すべての場合において、未接種比較対照培
養物から得られる収穫物は、Ａ型肝炎ウイルス
を含有していない。
(8) 初代みどりサル腎臓培養細胞におけるＡ型肝
炎ウイルスの連続インビトロ継代は、例３にお
いてキヌザル肝臓培養物に対して説明したと同
じ方法で実施される。このような連続継代は、
無期限に実施することができる。
炎ウイルスの連続インビトロ継代は、例３にお
いてキヌザル肝臓培養物に対して説明したと同
じ方法で実施される。このような連続継代は、
無期限に実施することができる。
例 ５
他の培養細胞におけるＡ型肝炎ウイルスの増
殖及び連続継代 (1) 例４におけるような方法を使用して、Ａ型肝
炎ウイルスは、また、次の型の培養細胞で増殖
させそして連続的に継代せしめ得ることが判つ
た。(a)胎児アカゲザル腎臓細胞系（FRhK−
６）、(b)初代にわとり胎児培養細胞及び(c)胎児
ルフイベンター・キヌザル腎臓細胞系。すべて
のこれらの培養物における成功は、例１におけ
るようにして誘導されたＡ型肝炎ウイルスで培
養基に接種することに基づく。
殖及び連続継代 (1) 例４におけるような方法を使用して、Ａ型肝
炎ウイルスは、また、次の型の培養細胞で増殖
させそして連続的に継代せしめ得ることが判つ
た。(a)胎児アカゲザル腎臓細胞系（FRhK−
６）、(b)初代にわとり胎児培養細胞及び(c)胎児
ルフイベンター・キヌザル腎臓細胞系。すべて
のこれらの培養物における成功は、例１におけ
るようにして誘導されたＡ型肝炎ウイルスで培
養基に接種することに基づく。
(2) Ａ型肝炎ウイルスは、前述したFRhK−６細
胞系においては連続的に５回継代させる。第５
の継代において得られたウイルス収穫物は、例
２、３及び４におけるような検査基準を基にし
て、人間二倍体肺線維芽細胞培養基に有利に感
染することが判つた。Ａ型肝炎ウイルス感染
は、人間二倍体系に連続的に継代できる。
胞系においては連続的に５回継代させる。第５
の継代において得られたウイルス収穫物は、例
２、３及び４におけるような検査基準を基にし
て、人間二倍体肺線維芽細胞培養基に有利に感
染することが判つた。Ａ型肝炎ウイルス感染
は、人間二倍体系に連続的に継代できる。
(3) Ａ型肝炎ウイルスは、(1)におけるような
FRhK−６細胞系においては、連続的に５回継
代される。第５の継代において得られるウイル
ス収穫物は、例２、３及び４におけるような検
査基準を基にして、胎児二倍体アカゲザル肺
（FRhL−２）細胞培養基に有利に感染される
ことが判つた。Ａ型肝炎ウイルスは、アカゲザ
ル二倍体系に連続的に継代せしめることができ
る。
FRhK−６細胞系においては、連続的に５回継
代される。第５の継代において得られるウイル
ス収穫物は、例２、３及び４におけるような検
査基準を基にして、胎児二倍体アカゲザル肺
（FRhL−２）細胞培養基に有利に感染される
ことが判つた。Ａ型肝炎ウイルスは、アカゲザ
ル二倍体系に連続的に継代せしめることができ
る。
例 ６
組織培養−増殖した生きた弱毒化Ａ型肝炎ウ
イルスワクチンの製造 例１におけるようにして誘導したＡ型肝炎ウイ
ルスを、例４に示したように、初代アフリカみど
りサル腎臓培養細胞に連続的にインビトロ継代さ
せる。第５及びそれ以上の継代におけるウイルス
の細胞培養収穫物は、生理的塩類溶液中の収穫物
の稀釈により製造した、組織培養のうち50％が感
染する最小量の1000倍量のレベルで、ルフイベン
ターキヌザルに静脈接種するとＡ型肝炎抗体を誘
起するが、血清イソクエン酸デヒドロゲナーゼ値
（1500シグマ単位を超えない）及び肝臓組織病理
学（最小の変化のみがみられる）によつて測定さ
れるようにその動物に明白な病気を生じないこと
が判つた。
イルスワクチンの製造 例１におけるようにして誘導したＡ型肝炎ウイ
ルスを、例４に示したように、初代アフリカみど
りサル腎臓培養細胞に連続的にインビトロ継代さ
せる。第５及びそれ以上の継代におけるウイルス
の細胞培養収穫物は、生理的塩類溶液中の収穫物
の稀釈により製造した、組織培養のうち50％が感
染する最小量の1000倍量のレベルで、ルフイベン
ターキヌザルに静脈接種するとＡ型肝炎抗体を誘
起するが、血清イソクエン酸デヒドロゲナーゼ値
（1500シグマ単位を超えない）及び肝臓組織病理
学（最小の変化のみがみられる）によつて測定さ
れるようにその動物に明白な病気を生じないこと
が判つた。
Ａ型肝炎抗体が組織培養中で増殖したウイルス
によつて誘起された動物は静脈的に注射されたＡ
型肝炎ウイルスのキヌザル群のうち50％が感染す
る最小量の1000倍量の感染攻撃に対して抵抗性で
ある。このように、培養組織継代Ａ型肝炎ウイル
スは、生きた弱毒化Ａ型肝炎ウイルスワクチンを
構成できるように、実施例６に示された方法にお
いて変性される。
によつて誘起された動物は静脈的に注射されたＡ
型肝炎ウイルスのキヌザル群のうち50％が感染す
る最小量の1000倍量の感染攻撃に対して抵抗性で
ある。このように、培養組織継代Ａ型肝炎ウイル
スは、生きた弱毒化Ａ型肝炎ウイルスワクチンを
構成できるように、実施例６に示された方法にお
いて変性される。
(2) 胎児アカゲザル腎臓細胞（FRhK−６）また
は胎児アカゲザル二倍体肺細胞（FRhL−２）
または初代にわとり胎児細胞または人間二倍体
肺線維細胞（MRC−５、WI−38）または胎児
ルフイベンターキヌザル腎臓細胞系の培養に同
様に継代せしめたＡ型肝炎ウイルスは、５回ま
たはそれ以上の継代後に比較できる程に弱毒化
され、生きた弱毒化ワクチンとして使用でき
る。
は胎児アカゲザル二倍体肺細胞（FRhL−２）
または初代にわとり胎児細胞または人間二倍体
肺線維細胞（MRC−５、WI−38）または胎児
ルフイベンターキヌザル腎臓細胞系の培養に同
様に継代せしめたＡ型肝炎ウイルスは、５回ま
たはそれ以上の継代後に比較できる程に弱毒化
され、生きた弱毒化ワクチンとして使用でき
る。
例 ７
組織培養において増殖し、ホルマリン不活性
化したＡ型肝炎ウイルスワクチンの製造 (1) 例１におけるようにして誘導されたＡ型肝炎
ウイルスを、例４及び５におけるように初代サ
ル腎臓細胞の５回の連続インビトロ培養細胞継
代を実施する。
化したＡ型肝炎ウイルスワクチンの製造 (1) 例１におけるようにして誘導されたＡ型肝炎
ウイルスを、例４及び５におけるように初代サ
ル腎臓細胞の５回の連続インビトロ培養細胞継
代を実施する。
(2) ５回の継代またはそれ以上の継代において、
35℃で３週間の培養後においてまたはホモジエ
ナイズした培養物のＡ型肝炎ウイルス抗原含量
が免疫付着凝集によつて測定して８単位以上に
達するような時間において、細胞培養物を得
る。ここで１単位は、参照肝炎ウイルス抗原陽
性血漿希釈物に対して２＋陽性反応を与えるこ
とができる最も稀薄な肝炎抗体希釈物を用いて
免疫付着凝集試験を行なつたときの試験結果で
定義される。
35℃で３週間の培養後においてまたはホモジエ
ナイズした培養物のＡ型肝炎ウイルス抗原含量
が免疫付着凝集によつて測定して８単位以上に
達するような時間において、細胞培養物を得
る。ここで１単位は、参照肝炎ウイルス抗原陽
性血漿希釈物に対して２＋陽性反応を与えるこ
とができる最も稀薄な肝炎抗体希釈物を用いて
免疫付着凝集試験を行なつたときの試験結果で
定義される。
(3) 全体の培養物を２回凍結−溶解し、細胞シー
トを細胞液中に泥状化し、次に高強度の音波処
理にさらすことによつて全体の混合物をホモジ
エナイズすることによつて、細胞培養収穫物を
得る。
トを細胞液中に泥状化し、次に高強度の音波処
理にさらすことによつて全体の混合物をホモジ
エナイズすることによつて、細胞培養収穫物を
得る。
(4) 生成物を低速遠心処理によつて清浄化し60℃
で30分加熱し次に低速で再遠心処理して液体を
更に清浄化する。
で30分加熱し次に低速で再遠心処理して液体を
更に清浄化する。
(5) 次に、液体を0.45ミクロンビールインフユー
ジヨン−処理ミリボアーフイルターを通して濾
過する。この生成物を連続的に攪拌しながら35
℃で４日間１：4000ホルマリンで処理する。ホ
ルマリンは、この処理の終りに重亜硫酸ナトリ
ウムで部分的に中和して生成物１ml当り10μｇ
の残留ホルマリン含量にする。
ジヨン−処理ミリボアーフイルターを通して濾
過する。この生成物を連続的に攪拌しながら35
℃で４日間１：4000ホルマリンで処理する。ホ
ルマリンは、この処理の終りに重亜硫酸ナトリ
ウムで部分的に中和して生成物１ml当り10μｇ
の残留ホルマリン含量にする。
(6) 生成物をフオスフエート緩衝塩水で調整して
１ml当り1010個の27nｍＡ型肝炎ウイルス粒子
を含有するようにする。
１ml当り1010個の27nｍＡ型肝炎ウイルス粒子
を含有するようにする。
(7) 生成物は、ルフイベンターキヌザルにおける
静脈内接種によつて試験した場合、感染性のＡ
型肝炎ウイルスを含有していない。
静脈内接種によつて試験した場合、感染性のＡ
型肝炎ウイルスを含有していない。
(8) 生成物は、Ａ型肝炎ウイルスワクチンとして
強力であつて、ルフイベンターキヌザルにおけ
る１回またはそれ以上の１mlの皮下注射は、検
出できるＡ型肝炎抗体の生産を誘起しそして動
物にＡ型肝炎ウイルスのキヌザル群のうち50％
が感染する最小量の1000倍量による攻撃に対し
て抵抗性をあたえる。
強力であつて、ルフイベンターキヌザルにおけ
る１回またはそれ以上の１mlの皮下注射は、検
出できるＡ型肝炎抗体の生産を誘起しそして動
物にＡ型肝炎ウイルスのキヌザル群のうち50％
が感染する最小量の1000倍量による攻撃に対し
て抵抗性をあたえる。
(9) 胎児アカゲザル腎臓細胞体（FRhK−６）ま
たは初代にわとり胎児細胞または人間二倍体肺
線維細胞（MRC−５、WI−38）または胎児ア
カゲザル二倍体肺線維細胞（FRhL−２）にお
ける工程１の５回の連続インビトロ培養細胞継
代を実施する以外同様に処理したＡ型肝炎ウイ
ルスは、感染性Ａ型肝炎ウイルスを含有してい
ないが、Ａ型肝炎ウイルスワクチンとして強力
な同様な生成物を与える。
たは初代にわとり胎児細胞または人間二倍体肺
線維細胞（MRC−５、WI−38）または胎児ア
カゲザル二倍体肺線維細胞（FRhL−２）にお
ける工程１の５回の連続インビトロ培養細胞継
代を実施する以外同様に処理したＡ型肝炎ウイ
ルスは、感染性Ａ型肝炎ウイルスを含有してい
ないが、Ａ型肝炎ウイルスワクチンとして強力
な同様な生成物を与える。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 感受性の類人霊長動物に馴化したＡ型肝炎ウ
イルスに感染した感受性の類人霊長動物の肝臓を
摘出し、感染した肝臓をインビトロ培養細胞に接
種し、Ａ型肝炎ウイルス抗原が培養細胞又は液中
に検出されるまで培養細胞を培養しそして培養細
胞で増殖したウイルスを少なくとも５代以上イン
ビトロ継代培養してウイルスを変性させることか
らなる変性したＡ型肝炎ウイルスを製造する方
法。 ２ 類人霊長動物がキヌザル、夜行性サル、アカ
ゲザル、アフリカみどりサル、カニクイザル又は
チンパンジーである特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ３ キヌザルがサギナス・ミスタツクス又はサギ
ナス・ラビアタス（ルフイベンター）である特許
請求の範囲第２項記載の方法。 ４ ウイルスを、２つの異なつた種の感受性の類
人霊長動物の夫々において少なくとも２代以上継
代させる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 培養細胞が、霊長動物の肝臓又は腎臓由来の
初代培養細胞、連続継代培養細胞又は形質転換細
胞からなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ Ａ型肝炎ウイルスを、人間二倍体肺線維芽細
胞、初代アフリカミドリサル腎臓細胞、初代にわ
とり胎児線維芽細胞又は胎児アカゲザル二倍体肺
細胞から選択された培養細胞に少なくとも５代以
上継代させる特許請求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/934,293 US4164566A (en) | 1978-08-17 | 1978-08-17 | Hepatitis a virus cell culture in vitro |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5548389A JPS5548389A (en) | 1980-04-07 |
| JPH0157954B2 true JPH0157954B2 (ja) | 1989-12-08 |
Family
ID=25465313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10364379A Granted JPS5548389A (en) | 1978-08-17 | 1979-08-16 | In vitro cell culturing of hepatitis a virus |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4164566A (ja) |
| EP (1) | EP0008559B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5548389A (ja) |
| AT (1) | ATE2014T1 (ja) |
| CA (1) | CA1135621A (ja) |
| DE (1) | DE2964276D1 (ja) |
| DK (1) | DK158743C (ja) |
| IE (1) | IE48399B1 (ja) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6270955B1 (en) | 1978-12-22 | 2001-08-07 | Biogen, Inc. | Pharmaceutical compositions and methods for producing antibodies to hepatitis b virus and kits and methods for detecting antibodies to hepatitis b virus |
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| CA1164799A (en) | 1979-09-04 | 1984-04-03 | Paula A. Giesa | Cell culture of hepatitis a virus |
| US5514376A (en) * | 1979-09-04 | 1996-05-07 | Merck & Co., Inc. | Cell culture of hepatitis A virus |
| US4301250A (en) * | 1979-11-02 | 1981-11-17 | Merck & Co., Inc. | Method of producing hepatitis B surface antigen |
| PT72015B (en) * | 1979-11-13 | 1982-06-20 | Merck & Co Inc | Process for preparing "invitro" cultures of hepatitis b virus |
| US4382076A (en) * | 1979-11-26 | 1983-05-03 | Merck & Co., Inc. | Hepatitis A antibody assay |
| US4393133A (en) * | 1980-06-12 | 1983-07-12 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Human hepatoma derived cell line, process for preparation thereof, and uses therefor |
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