JPH0583236B2

JPH0583236B2 -

Info

Publication number: JPH0583236B2
Application number: JP7773385A
Authority: JP
Inventors: Nobumasa Tanaka; Kazuo Sasaoka
Original assignee: Nippon Starch Chemical Co Ltd
Current assignee: Nippon Starch Chemical Co Ltd
Priority date: 1985-04-12
Filing date: 1985-04-12
Publication date: 1993-11-25
Also published as: JPS61234782A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）酵素および／または菌体を利用して、有用な反
応を行わしめ、医薬、食品その他の生産を目的と
する酵素工業は近年、ますますその重要性を増
し、発展を遂げつつある。本発明は、酵素およ
び／または菌体の固定化方法に関するものであ
る。

（従来の技術）従来の酵素利用は一般に反応液中に酵素を溶解
するため、酵素の利用効率は極めて低かつた。こ
の欠点を解決するため近年、酵素および／または
菌体を固定化する方法が種々提案されている。こ
のような従来の方法を概括的に示しても次の通り
各種のものがある。(イ)担体結合法、これは水不溶
性の担体に酵素を結合させる方法である。(ロ)架橋
法、これは官能基を２個有する試薬を作用させて
酵素分子同士を架橋することにより不溶化させる
方法である。(ハ)包括法、これはポリアクリルアミ
ドゲルのようなゲル中の酵素を包み込むか酵素を
微孔性フイルムで被覆し、マイクロカプセル化す
る方法である。（例えば、千畑一郎「ライフサイ
エンスをになう増補最近の微生物工業」（昭
57.6.1）(株)化学工業社、P68〜P91）（発明が解決しようとする問題点）上記の種々の固定化方法には、下記するような
欠点を有することが多く、現在のところ、すべて
の酵素の固定化に適用できる理想的な方法はな
い。即ち、(イ)担体結合法においては、吸着や、イ
オン結合では、担体への酵素の結合力が弱く、酵
素反応時に酵素が担体から脱離する。共有結合で
は、反応条件の設定が難しく、反応時に酵素タン
パクの活性点の破壊が生じ易い。(ロ)架橋法におい
ては、先に述べた共有結合の場合と同様に、反応
条件の設定が難しく、反応時に酵素タンパクの活
性点の破壊が生じ易い。(ハ)包括法においては、ゲ
ルを形成するポリマーの選択が難しく、ポリマー
の種類によつては、安定で適当な強度を有するゲ
ルが得られず、また、酵素が酵素反応時にゲルか
ら流出したり、酵素反応に関与できない状態でゲ
ル中に封じ込められたりする。また、マイクロカ
プセル化の技術が複雑で、微孔性フイルムの材質
や孔径によつては、酵素が酵素反応時に微孔性フ
イルムから流出したり、酵素反応に関与できない
状態で微孔性フイルム中に封じ込められたりす
る。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、上記問題点を解決すべく種々研
究の結果、グルコース、マンノースおよびマンニ
ユロン酸で構成され、そのモル比がグルコース：
マンノース：マンニユロン酸＝１：0.4〜0.7：４
〜17でアセチル化度約０〜1.0でアセチル化され
ており、3.5−ジニトロサリチル酸法による分子
量が10³〜10⁵である多糖類（以下、本発明の多糖
類と称す）の水溶液を多価金属イオンと接触させ
ることにより得られるゲル化物中に、酵素を保持
させたときは、ゲル化物中の酵素が効率よく酵素
反応に関与するだけでなく、ゲル化物中への酵素
の保持も温和な条件で容易且つ確実になしうるこ
とを見い出し、本発明を完成するに至つた。本発
明の多糖類は、例えば、特公昭58−39441号公報
に示されているように、次のような方法によつて
製造することができる。

アゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter
vinelandii）IFO12018（財団法人醗酵研究所（大
阪市淀川区）より入手）を一般に使用されている
炭素源（例えば、グルコース、澱粉分解物、シヨ
糖等）のほか、無機塩類（リン酸１カリ、リン酸
２カリ、塩化ナトリウム、硫酸カルシウム、硫酸
マグネシウム、酢酸ナトリウム等）微量金属（モ
リブデン酸ナトリウム、硫酸第１鉄等）を水道水
に加えてなる培地に接種し、常法により好気的条
件下で窒素または窒素を含むガスを通気しなが
ら、培養することによつて多糖類を蓄積する培養
終了後、培養液中の菌体等の固形分は、使用目的
に不都合な場合には、遠心分離、ろ過等の操作に
より培養液より除去し、蓄積された多糖類は、硫
酸等を培養液に添加し、酸性とし、沈澱させ、メ
タノール、エタノール、イソプロピルアルコール
等の水溶性溶媒中でカセイソーダ等で中和し、乾
燥させる。

本発明の多糖類を、適当な固形分濃度の水溶液
とし、次いでこの水溶液に多価金属イオンを含む
水溶液を噴霧するか、多価金属イオンを含む水溶
液中に本発明の多糖類の水溶液を浸漬することに
よつてゲル化物を生成できる。上記ゲル化物に酵
素および／または菌体を保持させるには、次の方
法により、行なえる。本発明の多糖類の水溶液と
酵素の水溶液および／または菌体の水中分散液を
混合した混合液に、多価金属イオンを含む水溶液
を噴霧するか、多価金属イオンを含む水溶液中に
上記混合液を浸漬することによつて酵素および／
または菌体を保持するゲル化物を形成できる。上
記混合液を多価金属イオンを含む水溶液中に滴下
することによつてビーズ状のゲル化物を形成でき
る。また、フイルム状、繊維状等の任意形態に本
発明の多糖類の水溶液をロール成型、押し出し成
型し、その後、ゲル化することにより、各種形状
のゲル化物を形成できる。本発明に使用できる多
価金属イオンとしては、カルシウムイオン、マグ
ネシウムイオン、アルミニウムイオン、鉄イオン
等が挙げられる。多価金属イオンを含む水溶液
は、水溶性の多価金属塩、例えば塩化カルシウ
ム、塩化マグネシウム、塩化アルミニウム、塩化
鉄、酢酸マグネシウム等または水酸化カルシウム
等のアルカリを水に溶解させ得られる。また形成
されたゲル化物は適当量のグリタルアルデヒドま
たはタンニンを加えることによつて更に硬化させ
ることができる。また上記混合液にパルプ、綿な
どのセルロース質繊維を混合することによつてゲ
ル化物の強度を向上させることもできる。

上記混合液中の本発明の多糖類の濃度は１〜20
％が適当であり、この濃度より低いとゲル化物の
強度が弱くなり、この濃度よりも高いと粘度が高
くなり、取扱いが難しくなる。

多価金属イオンの水溶液の濃度は0.05M〜10M
が適当であり、この濃度が低すぎると、ゲル化速
度が小さくなりすぎ、この濃度よりも高いとゲル
化が局所的に起こる。

本発明により種々の酵素および／または菌体を
固定化することができるが、本発明を適用するに
好適な酵素の例としては、ウレアーゼ、アルコー
ル脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素
酵素、チアーゼ酵母、グルコースオキシダーゼ、
グルコースオキサダーゼカタラーゼ、Ｏ−アミノ
酸オキシダーゼ、ウレアーゼ、ジアミソオキシダ
ーゼ、カタラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、
リボキシゲナーゼ、ウリカーゼ、リボヌクレアー
ゼ、ヘキソキナーゼ、リパーゼ、アルカリ性ホス
フアターゼ、酸性ホスフアターゼ、ヌクレオエダ
ーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、αアミラー
ゼ、βアミラーゼ、グリコアミラーゼ、グリコー
スイソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、
β−グリコシダーゼ、インペルターゼ、アントミ
アナーゼ、ナリンジナーゼ、ヘスペリジナーゼ、
β−グルクロニターゼ、ヒアルロニダーゼ、アル
カリ性プロテアーゼ、セミアルカリプロテアー
ゼ、酸性プロテアーゼ、サーモライシン、コラゲ
ナーゼ、ペプシン−ペプシノーゲン、アミノペプ
チダーゼ、レニン、トリプシン、トリプシン−ト
リプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、エラス
ターゼ、エンテロキナーゼ、アシラーゼ、アルギ
ナーゼ、Ｌ−グルタミン酸脱炭酸酵素、Ｌ−リジ
ン脱炭酸酵素、パパイン、また本発明に用いられ
る好適な菌体の例として上記各酵素の菌体、アエ
ロバクターアエロゲネス、バチルスズブチリス、
エツシエリチアコリ、ストレプトマイセス・フエ
オクロモゲネスなどの細菌菌体等を挙げることが
できる。

（作用）本発明は以上のように構成されているので固定
化の方法が簡単で、かつあらゆる種類の酵素およ
び／または菌体の固定化に適用できる。固定化の
反応がおだやかな条件のため、酵素タンパクの活
性点の破壊が生じず、かつ酵素および／または菌
体が酵素反応時に流出せず、固定化の効率が高
い。ゲル化物の形状をビーズ状、フイルム状、繊
維状等に容易に形成できる。

（実施例）実施例１ 0.067Nリン酸ナトリウム緩衝液（PH7.2）20ml
にウレアーゼ（フアルマシア・ジヤパン株式会社
製、ナタ豆製）400mgを溶解した液と本発明の多
糖類（グルコース：マンノース：マンニユロン酸
＝１：0.5：14、アセチル化度0.8分子量３×10⁴）
５％の水溶液40mlを混合する。この混合液を
0.1M塩化カルシウム水溶液に滴下し、ビーズ状
のゲルを得る。このゲル化物を0.1M塩化カルシ
ウム水溶液で洗浄し、ウレアーゼを包含固定化し
たゲル化物50ｇ（湿重量）が得られる。上記ゲル
３ｇを30％尿素を含む0.05M塩化カルシウム水溶
液100mlに入れ、スターラーで攪拌しながら20℃
15分間保持したのち、その酵素活性を試験し、ウ
レアーゼ標品と比較した。添加酵素の53％に相当
する活性を有しており、活性維持力の極めて高い
ことが認められた。

（発明の効果）本発明は以上のように構成されているので、簡
単に酵素および／または菌体を固定化できる。ま
たあらゆる種類の酵素および／または菌体の固定
化に適用でき、固定化される酵素および／または
菌体の活性維持が非常に高い。このため、酵素反
応と酵素の分離操作を容易にし、酵素反応の連続
化を可能にでき、酵素を利用効率を高め、酵素反
応の経済コストを非常に低くすることができる。

Claims

【特許請求の範囲】

１グルコース、マンノースおよびマンニユロン
酸で構成され、そのモル比がグルコース：マンノ
ース：マンニユロン酸＝１：0.4〜0.7：４〜17で
アセチル化度約０〜1.0でアセチル化されており、
3.5−ジニトロサリチル酸法による分子量が10³〜
10⁵の多糖類の水溶液と酵素の水溶液および／ま
たは菌体の水中分散液を混合した混合液を、多価
金属イオンを含む水溶液と接触させゲル化させる
ことを特徴とする酵素および／または菌体の固定
化方法。