JPH058385B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は試料内粒子の複数副次集団（サブポピ
ユレーシヨン）を識別する方法および装置に関す
るものであり、さらに具体的には、螢光色素へ励
起エネルギーを提供するのに利用できる光源の数
よりも多い数の各種螢光色素を一つの細胞集団の
中において識別しかつ定量化する方法および装置
に関するものである。

細胞、粒子、などの最近の細胞（cytometric）
分析は細胞の各種副次集団上の抗原の分布を検討
するために細胞表面標識剤または螢光色素の利用
を強調している。被検細胞はこれらの細胞または
粒子上の抗原決定基に相関させるために各種螢光
色素をもつ免疫螢光色素で識別を与えられる。こ
こで使用する場合、「免疫螢光色素」は一般的に
は別の分子へ物理的に付着した発色団のことを言
い、これはある標的への発色団の付着に対して特
異性を付加するものである。この方法の一つの例
は抗体またはホルモンへの螢光色素の結合であ
る。このタイプの螢光染色は従つて、反応の特異
性が発色団自体によつて付加される既知染色法と
全く異なる。この染色法の一つの例はいくつかの
色素分子のDNAとの反応であり、この場合、細
胞の内部要素がそれらの細胞の特性を評価するた
めに各種色素で染色される。

フローサイトメトリー装置において免疫螢光色
素を使用する際に生ずる困難の一つは一つの試料
中の細胞の上の多様の色素を検出する能力に関す
るものである。粒子、細胞、などを検出するのに
有用な現在入手可能なフロースルーサイトメータ
ーは普通には混合物中で細胞上の二つの独立色素
を検出するために二つのチヤネルを含む。例え
ば、免疫螢光色素のようなそれぞれの螢光チヤネ
ルと関連する二つの細胞表面標識で特異的に標識
した細胞を検出する二つの螢光チヤネルを含む装
置が知られている。これらの既知装置において
は、分析されつつある試料の中の細胞の混合物中
で検出されるべき螢光反応性細胞の各々の種類に
ついて、電気回路機構と螢光検出器を含む一つの
完全な螢光チヤネルが必要とされてきた。それゆ
え、フロースルーサイトメトリーを使用して試料
中の細胞の複数副次集団を検出するためには、同
数の螢光チヤネルが既知の慣用装置を使用して採
用される。唯一の光源例えばレーザーを用いる場
合には、二つの抗原決定基を順次に評価するのに
二重通路方式を使用できる。しかし、単一光源を
二種の螢光色素に対する励起源として使用できる
ことは当業界で知られてきた。例えば、フルオレ
セインとローダミンとの両方で標識した細胞は、
両方の発色団からの発光がそれらの色素の発光ス
ペクトルがたとえ重複するとしても独立に検出さ
れるように分析されてきた。単一波長がこの二つ
の色素の励起に使用された。この成績はローケ
ン、M.R，、パーカー、D.R.およびヘルツエンベ
ルグ、L.A.の「螢光活性化細胞識別器を使用す
る二色免疫螢光」、（The Journal of
Histochemistry and Cytochemistry、25巻、No.
７、899−907頁、1977年）に記載されている。こ
のような単一レーザー光による二種の色素の励起
法は、免疫螢光色素における最近の発展により改
善された。例えばフイコエリトリンとフルオレセ
インとを免疫螢光における色素対として使用する
ことはオーイらにより「細胞および分子分析用の
螢光性フイコビリ蛋白質結合体」、（The Journal
of Cell Biology、93巻、981−986頁、1982年６
月）において記載されている。

しかし、現在利用できるフローサイトメトリー
装置は一般的には二つの区別し得る螢光性標識を
励起するために二つのレーザーを採用している。
被検細胞または粒子上に標識化された各々異なる
種類の免疫螢光色素を励起させるために用いられ
る機構は、一般には別々の光源（例えばレーザ
ー）であるという事実は、上記制約と一致する。
従つて、ある単一試料中で二つの異なる免疫螢光
色素を分析または定量化するためには、著しく離
れている波長において励起エネルギーを提供する
二つのレーザーが通常使用される。二種の免疫螢
光色素を分析するためにそれと同数の二つのレー
ザーを用いる装置は例えば米国特許第3826364号
および第4284412号に記載されている。ある流路
系において二つのレーザーを使用することは、免
疫螢光とは関係はないが、パルス−細胞測光法に
関する第二回国際シンポジウム会議録（編者：ゴ
ールデ、W.、シユーマン、J.バツカー、T.；
European Press.Ghent、1976年、39−45頁）に
おけるストール．M.の「フロー技法における二
重ビームの適用と最近の結果」にも記載されてい
る。

具体的にいえば、二つのレーザーをフローサイ
トメトリー装置において使用する場合には、でき
るならば、十分に離れた励起および発行のスペク
トルをもつ色素、並びに十分に離れた一次放射を
もつレーザーが選ばれるべきである。細胞へ結合
させるために使用してもよくそして二色二レーザ
ー式フローサイトメトリ分析によく適している免
疫螢光色素はフルオレセインとテキサスレツドで
ある。免疫螢光色素フルオレセインとテキサスヘ
ツドである。免疫螢光色素としてのテキサスレツ
ドの使用はタイタス、J.Aにより「デユアル パ
ラメーターフロー マイクロ螢光測定研究および
螢光顕微鏡研究におけるフルオレセイン併用のた
めの親水性赤色発行螢光団、テキサスレツド」、
（Journal of Immnological Methods、50
（1982）、193−204）に記載されている。

励起エネルギーのより良好な適合性を得るため
のレーザー利用法の完全は、第二螢光色素の励起
スペクトルにかかつていると報告されて来た。二
重レーザーフロー系における第二レーザーとして
の色素レーザーの使用は第三螢光色素を励起する
発光を提供するこのような系はアルント−ジヨバ
ンD.J.らにより、“Ａ Dual Laser Flow Sorter
Utilizing ａ CW Pumped Dye Laser”
〔Cytometry 、第１巻、No.2127−131頁、1980
年〕に記載されている。

しかし、不均質細胞集団についてより多くの研
究がなされるにつれ、フローサイトメーター中の
一回通過において３種、４種、さらにはそれ以上
の抗原決定基を研究する必要性が望ましい一つの
目標となつてきている。

三レーザーフローサイトメーターも報告されて
おり、その場合には、異なる励起スペクトルをも
つ三種の螢光色素（DNA染色タイプのもの）が
細胞上で検出された。シユタインカンプJ.A.らの
「三つのレーザー波長において励起された単一細
胞についての三色螢光測定」（Cytometry、第２
巻、No.４、226−231頁、1982年）。多重光源の使
用に関するもつ一つの記載はシヤピロH.M.らの
「サイトマツト−Ｒ：コンピユーター制御による
多重レーザー源多重パラメーター フロー細胞測
光器系」（Journal of Histochemistry and
Cytochemistry、第25巻、No.７、836−844頁、
1977年）に見出される。しかし、上に言及したよ
うに、要請されることは、励起エネルギーを与え
るのに必要とする光源数を最少化し、一方、細胞
の多様集団を分析することができることである。
この目的に対して、各々の光源は一種以上の螢光
標識を励起することが望ましい。しかし、二つの
光源を用いるときには、使用された免疫螢光色素
のスペクトル間隙に関して問題がおこる。検討下
の各抗原決定基について新しい光源を付加するこ
との出費と煩雑さと複雑さを避けるためには、複
数の免疫螢光色素を励起する光源を使用すること
が最も有利である。

ある試料混合物から細胞の複数副次集団を、分
析が行なわれる領域中を通る細胞の一回通過で検
出し得ることが望ましい場合が多く存在する。こ
のような分析において検討下において細胞パラメ
ータの重複が存在する領域における副次集団の評
価も可能とすることが望ましい。例えば、血液に
ついてのいくつかの試験を実施する場合には、フ
ロースルーサイトメーター中を通る細胞の一回通
過においてＴ細胞、Ｂ細胞および単球の割合を検
定または定量化することが望ましい。同様に、白
血球その他の複数サブクラスの検定および定量化
も望まれるかもしれない。明らかに、このことは
重大な課題を生じた。試料混合物から細胞の複数
副次集団を検出しかつまた定量化し得ることは望
ましいけれども、レーザーのような光源の数およ
びその関連回路機構の数を最少化することがさら
に望ましい。このことを念頭において、本発明
は、一つの試料混合物から細胞の複数の標識化副
次集団の測定に望まれる要請を、螢光信号のいず
れをもほとんど損なうことなく満たしながら、前
記諸問題を解決することに向けられている。

一つの試料中の粒子の複数副次集団を識別する
方法は一つの試料中の粒子に選択的に複数の異な
る表面標識剤で標識することから成る。各標識剤
は識別できる定量化可能の標識特性をもつてい
る。標識を付与した粒子を一回に実質上１個づ
つ、複数の検出領域中に順次通し、各々の検出領
域中の粒子上の一種または一種より多くの異なる
標識剤の特性を検出する。粒子が通過する検出領
域の数より多くの標識剤が検出される。本発明の
方法は上記標識剤の検出される定量化可能の特性
に基づいて粒子間の相異を識別することを含む。

本発明のこの面の一つの好ましい具体化におい
ては、一つの試料中の細胞を少くとも三種の異な
る免疫螢光色素で選択的に標識することを含む。
各々の色素としては予め決められた実質上離れた
発光スペクトルをもつものを用いる。これらの標
識細胞を一回に実質上一個づつ、焦点に集められ
た光学的刺戟の中に通し、励起エネルギーを与え
て一つまたは一つ以上の各種色素を励起する。標
識細胞を次に、一回に実質上一個づつ、焦点に集
めた光学的刺戟の少くとも一つの他の領域中に通
し励起エネルギーを与えて各々の他領域において
一つまたは一つ以上の異なる色素を励起し、少く
とも三種の異なる色素が上記第一領域と他の刺戟
領域の通過によつて励起されるようにする。異な
る励起色素によつて放射される螢光が検出され、
次に細胞の副次集団はそれらの検出螢光特性と関
連づけて識別される。

本発明のもう一つの面はある試料中の粒子の複
数副次集団を識別する装置である。これらの粒子
は刺戟されることが可能であり、かつ識別および
定量可能の特性をもつ各種の表面識別剤で選択的
に標識されている。この装置は標識粒子を一回に
実質上一個づつ、流路中を移動させる手段を有す
る。この流路中を移動する粒子上の標識剤を刺戟
するために複数個の手段が提供される。各刺戟手
段は標識粒子上の一種より多くの異なる標識剤の
特性を刺戟することができる。刺戟された標識剤
によつて示される特性を検出する手段、および刺
戟された標識剤の検出された異なる定量可能特性
に関連させて粒子間の差異を識別する手段、も存
在する。

本発明のこの面の一つの好ましい具体化におい
ては、この装置は、各々予めきめられた実質上互
いに離れた発光スペクトルをもつ各種の免疫螢光
色素で選択的に標識された細胞の複数副次集団を
識別する。この好ましい装置は標識された細胞を
一回に実質上一個づつ、流路中を移動させる手段
を有する。第一の手段は流路に沿つた光学的刺戟
の第一領域の中で一種または一種より多くの螢光
色素を励起する。第二の手段はこの流路に沿つた
光学的刺戟の第二領域中で一種または一種より多
くの異なる色素を励起する。各々の細胞に結合し
ている各種の励起された免疫螢光色素によつて放
出される螢光の量を検出する手段、および、検出
された螢光特性に基づいて細胞の副次集団を識別
する手段が設けられている。

本発明の原理によると、数多くの利点と目的が
達成される。第一に、本発明はレーザーのような
採用する光源の数より多い多種類の粒子または細
胞の複数副次集団の検出と定量を可能にする。こ
のようにして、非常に多くの細胞副次集団をフロ
ーサイトメーターを通る一回の通過で測定するこ
とができる。なぜならば、本発明はレーザーのよ
うな単一光源が一種より多くの免疫螢光色素等を
励起することができるという構成を採つているか
らである。識別される特性が提供されるよう励起
波長が十分に離れているけれども単一光源によつ
て励起されるべきスペクトル範囲は十分に近接し
ている螢光性表面標識を選択することによつて、
２つのレーザーで励起させる機構に匹敵する二色
免疫螢光結果を得ることができる。この方法を採
用するときには、単一の細胞集団における少くと
も３個の異なる免疫螢光色素を僅か２個のレーザ
ーを使用することによつて同時に定量化すること
が可能であり、この試みを４個または４個より多
くの細胞免疫螢光色素の検出へ拡張することが可
能である。

第１図は粒子の複数副次集団に関連する螢光な
らびに流路中を流れる粒子の光散乱パラメーター
の測定に特に有用なフローサイトメトリ装置の光
学的要素と光路の一つの好ましい具体化の概念図
であり； 第２図は本発明の原理に従つて二つのレーザー
を組入れたフローサイトメーターを通る一回通過
によつて測定された、試料中の三つの副次集団の
白血球の検出と定量化のグラフであり、そして、 第３−５図は各々検出された細胞の各螢光パラ
メーターの相関をプロツトしたグラフである。

本発明は多くの異なる形態の具体化によつて満
足されるが、本発明の好ましい具体化が詳細に図
示されかつ本明細書において記載される。ただ
し、この開示は本発明の原理の例示として考える
べきものであり、本発明を解説した具体例を限定
する積りのものではない。本発明の範囲は特許請
求の範囲およびそれらと均等のものによつて判断
されるものである。

図面、特に第１図に言及すると、フローサイト
メトリー装置１０の光学的要素と粒子の流路要素
が描かれている。第１図の光学的要素と流通要素
は、粒子をその特定的特性について分析するため
に粒子を一つの液体流として一回に実質上一個づ
つ流すため、フローサイトメトリ装置の主要構成
分を表わしている。例えば、第１図の装置の諸要
素は、カリホルニア州サニベールのベクトン・デ
イツキンソン・アンド・カンパニーのFACSシス
テムズ部門によつて製造および販売されている
FACS螢光活性化識別器の中に含まれるであろ
う。FACS細胞識別器は広範囲の研究所の応用に
おいて光散乱と螢光を基礎として細胞集団を分析
および分離する。本明細書においてより特定的に
詳細に記載されかつFACS細胞識別器のような器
具において具体化されるかもしれない光学的要素
およびフロー要素のほかに、本発明に関連して有
用である細胞識別装置のその他の詳細が米国特許
第3826364号に記載されている。本発明は、ある
試料中の粒子の副次集団の固定または定量化のた
めに光散乱、粒子容積、螢光あるいは何か他の光
学的パラメーターのいずれを測定するに拘らず、
多くの異なるタイプのフローサイトメトリー装置
において有用であることが理解される。本発明の
光学的要素は特に、前述特許に記載されているよ
うなフローサイトメトリー装置における改良の本
質を表わしている。

第１図に描く通り、光エネルギーは二つのレー
ザー１２および１４によつて本発明のフローサイ
トメトリー装置に供給される。説明するこの具体
化においては、異なる螢光特性をもつ複数の異な
るタイプの粒子を検出および定量化することが可
能であるように、二つの光源がフローサイトメト
リー装置１０の中に提供されている。しかし、第
１図に描く具体化において２個のレーザーを含め
ていることは、単に好ましいだけであり、かつ説
明しつつある本発明のタイプにおいて１個より多
い光エネルギー源と分析要素を採用する例示的具
体化としての役割を果しているにすぎない。

本発明において、レーザー１２および１４はス
ペクトル範囲が相互に分離されている特定波長に
おいてコヒーレントな一次放射を生成するように
選ばれる。例えば、レーザー１２は青／緑のスペ
クトル領域において作動するように選ぶことが好
ましく、それにより、ある波長の光学的刺戟によ
つて照射されるときに螢光を発する、レーザー１
２によつて発生する光の中を通過する粒子へ結合
した、螢光色素が励起されるに至る。本発明に有
用である一つのこのようなレーザーは488ナノメ
ーター（nm）において一次放射をもつアルゴン
イオンレーザーである。レーザー１４はレーザー
１２とは別の離れた波長において作動するように
選ぶのが好ましい。レーザー１４の波長の光学的
刺戟によつて照射されるときに螢光を発する螢光
色素を自らの上に有する粒子はこれらの粒子がレ
ーザー１４によつて発生される光の中を通過する
ときに励起されるに至る。レーザー１４の作動は
レーザー１２のスペクトル領域と波長において実
質的に分離されるように可視スペクトルの黄／赤
領域にわたるものであつてよい。この要請を満た
す一つのこの種のレーザーはローダミン６−Ｇ色
素レーザーであり、これは600nmにおいて一次放
射をもつている。アルゴンイオンレーザーと十分
に離れた一次放射（633nm）をもちかつ本発明に
おける第二レーザーとして役立つもう一つのレー
ザーはヘリウム−ネオンレーザーである。ここに
記載した規準の下で利用し得る場合にはその他の
レーザーも選ぶことができる。二つのレーザーの
波長差は、各々のレーザーで励起されるべき少く
とも二種の免疫螢光色素の励起および発光スペク
トルの範囲の外側にあるよう実質的に十分である
ことが望ましい。75から100nmあるいはそれ以上
の二つのレーザー間の波長差は今述べた望ましい
結果を可能にすることが発見された。もちろん、
免疫螢光色素あるいは他の定量可能の表面標識剤
の選択は、二つまたはそれより多くの免疫螢光色
素が各々のレーザーによつて与えられる光エネル
ギーによつて励起され得るよう、本発明において
使用するレーザーと適合し得るものでなければな
らない。

レーザー１２および１４から出ると、各々のビ
ーム１６および１８はそれぞれ、各ビームをその
平行特性を保持しながら広げる模式的に示される
ビーム・エキスパンダー２０および２２の中を通
つてよい。各ビームがビーム・エキスパンダーか
ら出るときには（このエキスパンダーは本発明の
操作にとつて好ましいものではあるが必要なもの
ではないのであるが）、各ビームは通常はフロー
サイトメトリー装置を小型化する要請に基づいて
その方向を変えられねばならない。この目的のた
めに、ビーム１６はプリズム２４と２５によつて
反射され、一方、ビーム１８はプリズム２６と２
８によつて反射される。これらのプリズムはすべ
て操作中に適切にビームを並べるよう調節可能に
させてよい。ビーム１６と１８はプリズムを通過
したのち、粒子の流れの上に焦点を結ばせるため
にレンズ３０および３２へ向けられる。レンズ３
０と３２とは採用する場合にはフローサイトメト
リー装置のタイプに従つて選ばれるが、これらの
レンズは本願と同一出願人による1982年３月25日
付米国特許出願第361672号における記載に従つて
選択してよい。

レーザービームがレンズ３０と３２を通過する
と、それらは粒子流３８上へ向けられる。本発明
のフローサイトメトリー装置内に組込まれたノズ
ル４０は粒子４１が流体流３８内を流れるのを助
ける。このタイプのノズルの利用は良く知られて
おり、例えば米国特許第1826364号に記載されて
いる。説明しつつあるこの装置においては、二つ
のレーザービーム・粒子流の交点は約250マイク
ロメートル離れている。第１図においてさらに詳
しく見られる通り、レーザービーム１６は一つの
光散乱チヤネルの光学軸上にあり粒子の散乱光検
出に用いられる。しかし、ここで述べる光散乱の
要素は、光散乱に依存して光ビーム中を通過する
粒子から情報を得る代表的なフローサイトメトリ
ー装置の姿を完成するために含まれているにすぎ
ない。

このように、光ビーム１６はノズル４０から出
る流れ３８の中で流れる粒子と出会う最初のビー
ムである。その後、ビーム１６は光散乱チヤネル
の光学軸上で光散乱遮蔽（obscuration）バー４
２と衝突する。散乱された光は、レンズ４４によ
つて集められて第一の絞り４５の中を通り、これ
は集められた散乱光の最大角度を決定する。第一
絞りに続いてビームスプリツター鏡４６があり、
これは入射光のある割合を散乱検出器４８の方へ
反射し、入射光の残りを光吸収体（図示せず）の
上へ送る。第二の絞り４９はレーザービーム１６
と流れ３８との交点から来る散乱光のみを通過さ
せる視野絞りとして機能する。フイルター５０を
通過後、散乱光は検出器４８において検出され
る。この検出器は周知の技法に従つて流体流中で
流れる粒子の寸法を評価するよう電気的に機能す
る。

第１図に示す本発明の具体例において、レーザ
ービーム１８はまた流れている流れ３８に向けら
れるが、しかしその流れの垂直軸に沿つてレーザ
ービーム１６から垂直方向に離れている。粒子に
よつて散乱されたビーム１８からの光も光散乱−
チヤネル光学系に入るが、しかし光散乱チヤネル
中に置いた遮蔽フイルター（dielectric filter）
によつて検出器４８から閉め出されるのが好まし
い。

螢光チヤネルに関しては、レーザーの異なる波
長による照明が、予め定めた実質上分離された発
光スペクトルをもつ螢光色素の連続式励起に用い
られる。異なる発光スペクトルをもつ少くとも一
つの、しかし好ましくは二つまたはそれより多く
の免疫螢光色素は各レーザーの光エネルギーによ
つて提供される励起エネルギーによつて励起され
る。第１図において見られるように、二つの独立
のレーザービームは一つの粒子がまずレーザービ
ーム１６と交差し次いでレーザービーム１８と交
差するよう垂直方向に離れた点において流れ３８
と交差する。従つて、二つの光学的信号が粒子が
光ビーム中を通過することによつて発生される。
信号のこれらの対は粒子が第一のビーム交点から
第二のビーム交点へ移動するのに要する時間だけ
時間的に離れていることが好ましい。この時間間
隔は信号の対が別々に分析されることを可能に
し、二つの異なる励起波長において励起されると
きの粒子の螢光発光に比例する信号を与える。粒
子から放射される螢光信号は入射ビーム（分離さ
けたビームからなる）の屈折光を阻止するための
遮蔽バー（obscuration bar）の周りへ向けられ
る。螢光信号はすべてレンズ５５により好ましく
は特定波長の光のみを通過させる第一フイルター
５６を通して焦点を結ばされる。

光ビーム１６によつて励起された粒子から放射
される螢光は、フイルター５６を通過したのち、
二色性ミラー５８と出会う。二色性ミラー５８の
目的は螢光通路に沿つて移動する二つの異なる色
を分離してそれらを別々に分析することができる
ようにすることである。例えば、二色性ミラー５
８は例えばレーザー１２によつてのみ生成される
光ビーム１６によつて励起された粒子の異なる色
の波長を分離するために選ばれる。例えば、緑領
域における波長は二色性ミラー５８によつて透過
され次いで唯一色の領域、本例の場合は緑の波長
を透過するよう設計されたバリヤー・フイルター
５９を通る。緑の光は次に螢光検出器６０に入
る。

二色性ミラーと出会う橙色領域の光は二色性ミ
ラーによつて反射され、唯一色の領域、本例の場
合には、橙色、の波長を透過するバリヤー・フイ
ルター６１に送られる。螢光検出器６２は次いで
この橙色光を受ける。

光ビーム１８もまた光ビーム１６によつて励起
されるものとは異なる２個までの螢光色素を励起
するのに十分な単一波長において励起エネルギー
を提供する。光ビーム１８によつて励起された粒
子によつて放射される螢光がレンズ５５と第一フ
イルター５６を通過したのち、この光は別の二色
性ミラー６４と出会う。前記二色性ミラー５８に
関する記述と同じく、第二の二色性ミラー６４は
色スペクトルの二つの異なる領域の波長を分離す
るために選ばれる。レーザー１４から送られる光
ビーム１８によつて与えられる単一励起源の結果
として例えば、赤および遠赤外の信号を発生させ
てもよい。この赤色領域における波長は二色性ミ
ラー６４を通過しかつ次に赤色領域のみの波長を
透過するよう設計されたバリヤー・フイルター６
５を通過する。この光は次に螢光検出器６６へ向
けられる。遠赤外領域にある波長は二色性ミラー
により反射されてバリヤー・フイルータ６８を通
過し、そして螢光検出器６９に入る。従つて、二
つのレーザーからの光は、各々その波長において
二つまたは二つより多くの異なる螢光色素を励起
することができるものであり、記載したようなフ
ローサイトメトリー装置において試料の唯一回の
通過の間にその試料中の粒子の検出と定量化を可
能にする。

螢光検出器６０，６２，６６および６９はそれ
ぞれ四つの分離された緑、橙、赤および遠赤外の
光路を好ましくは受けるように提供されている。
これらの螢光検出器は光学的信号を電気的信号へ
変換する低ノイズ光電子倍増管などであつてよ
い。第１図には示されていないけれども、これら
の電気信号は次にフローサイトメトリー装置のエ
ロクトロニクスに電気的に送られ、ここで分析ま
たは他の目的のために処理される。各種のデイス
プレー、情報の提示、蓄積または記録化をこのフ
ローサイトメトリー装置の中に準備してよい。同
様に、特異的な特性をもつ粒子は米国特許第
3826364号が教示する技法に従つて分離され識別
されてよい。

本発明の操作をここで単に説明の目的のために
以下の例と関連して述べる。この例はある試料中
の粒子の複数の副次集団を検出し、区別し、そし
て／あるいは定量化する技法を例示するものであ
るが、ただし発明範囲を制限するものではない。

本実施例においては、ヒトから得られる単核白
血球が既知の方式で調製され、三つの異なる免疫
螢光色素を自らの標識したアンチ・リユー２
（anti−leu2）、アンチ・リユー７（anti−leu7、お
よびアンチ・リユー11（anti−leu11）と命名した
三種の単クローン性抗体と反応せしめられる。こ
れらの三つの免疫螢光色素は各々、光学的刺戟に
対してある予めきめられた螢光応答をもつ。特
に、アンチ・リユー２はフイコエリトリン（PE）
と複合して一つの免疫螢光色素を形成し、これ
は、刺戟されるときに橙色領域の色スペクトルま
たはその近傍における約575nmの波長の螢光を発
する。ビオチンと結合しかつ間接的標識法により
テキサスレツド複合アビジン（モレキユラープロ
ーブ社の商標名、プラノ、テキサス）と反応せし
められたアンチ・リユー７は、刺戟されるときに
約620nmの波長における螢光を出し、これは赤領
域の色スペクトルまたはその近傍にある。アン
チ・リユー11はフルオレセイン（FITC）として
知られている螢光色素と結合して一つの免疫螢光
染色素を施し、これは励起されたときに約530nm
の波長における螢光を発し、色スペクトルの緑領
域にある。

アンチ・リユー２（PE）、アンチ・リユー11
（FITC）、およびアンチ・リユー７（ビオチンと
アビジン・テキサスレツド）で順次標識処理した
これらの単核白血球を試料液媒体の中に置き、そ
の試料を二重レーザーのFACS螢光活性化細胞識
別フローサイトメトリー装置（カリホルニア州、
サニベールのベクトン・デイツキンソンFACSシ
ステムズ）の中に通した。第１図に描くような配
置で二つのレーザーを用いた。これらのレーザー
の一つは488nmに一次放射をもつアルゴンイオン
レーザーであつた。もう一方のレーザーは600nm
に一次放射をもつローダミン６−Ｇ色素レーザー
であつた。第１図に示すような配置を用い、標識
した白血球細胞を一回に実質上一個づつ、光学的
励起の二つの領域中を連続的に通し、一つのこの
種の領域はアルゴンイオンレーザーからの光によ
つて励起され、もう一方の領域はローダミン６−
Ｇ色素レーザーからの光によつて刺戟された。ア
ンチ・リユー11とアンチ・リュー２の上にそれぞ
れ標識されたFITCとPEはともにアルゴンイオン
レーザーからの光によつて励起され、これらの染
色によつて発せられる螢光をそれぞれ螢光検出器
６０と６２によつて検出した。ローダミン６−Ｇ
色素レーザーからの光はアンチ・リユー７上に担
持されたテキサスレツドを刺戟した。それによつ
て発せられる螢光は螢光検出器６６によつて検出
した。

螢光検出器６０，６２および６６へ提供された
光学的信号並びに光ビーム中を通過する粒子の光
散乱信号はFACS装置の分析コントロール部へ送
られ、結果を表示し解釈できるように四種パラメ
ーターのリストとして気憶させた。第２図に示す
ように、４個のヒストグラムはフローサイトメト
リー装置中の一回通路において三つの異なる抗体
で標識をつけた白血球の複数サブクラスを区別す
るためこの実験の結果を示すゲート制御されてい
ないデータを表示するものである。第一欄７５は
488nmの光ビーム中を通過する粒子の前方散乱結
果を示し、単球からリンパ球をそれらの大きさを
基準にして区別するのに用いることができる。第
二欄７６においてはアンチ・リユー11染色のヒス
トグラムがそれによつて発生される螢光信号から
表示されている。同様に、第三欄７８は細胞のア
ンチ・リユー７標識のヒストグラムを表示してい
る。第四欄７９においては、細胞のアンチ・リユ
ー２標識のヒストグラムが螢光特性の関数として
表示された。

二つの細胞表面標識リユー７（leu−７）とリユ
ー11との相関プロツトが第３図に描かれている。
この図に関しては、第２図におけるリンパ球とし
て同定し得る光散乱信号をもつ細胞が表示され
た。リユー２の追加パラメーターを基にして同じ
データを再分析すると第４図と第５図が得られ
た。リユー２抗原である細胞（第２図のゲーテツ
ド・エリア８０）のアンチ・リユー７とアンチ・
リユー11の染色の相関は第４図に示す。アンチ・
リユー２抗体を結合しなかつた細胞（第２図のゲ
ーテツド・エリア８１）の類似の相関プロツトは
第５図に描かれている。

従つて、白血球細胞に対する三つの異なる抗体
の反応性は、各細胞上で標識された免疫螢光色素
の検出される異なる特性に基づいて、各細胞が装
置中を通過するときに検出され、区別されそして
定量化された。三つの異なる抗体は三つの異なる
螢光色素剤と関連して検出されたが、これらの結
果を得るためにただ二つのコヒーレント光が用い
られた。

本発明に関連して四つの異なる免疫螢光色素を
定量する場合には、テキサスレツドと区別し得る
がしかしローダミン６−Ｇ色素レーザーあるいは
その他の適当なレーザーによつて励起可能である
第二の螢光色素を採用することができる。具体的
にいえば、白血球の第四副次集団に、結合剤とし
てアロ・フイコシアニンとして知られる螢光色素
（これは励起されたときに約680nmの波長の螢光
を出して色スペクトルの遠赤外領域にある）をも
つ別の免疫螢光色素で標識する場合には、四つの
異なる免疫螢光色素を本発明によつて定量化する
ことができる。テキサスレツドの代りに、Ｒ−フ
イコシアニンとして知られている螢光色素を用い
てもよく、結果はテキサスレツドを用いて得られ
る結果と類似である。粒子または細胞の複数副次
集団の分析をひろげるためにさらに他の螢光色素
を用いてよい。

二つのレーザーを使うだけで白血球細胞の三つ
の副次集団を識別し、あるいはその修正法として
細胞の四つの副次集団を識別する上記の例は、使
用した四つの免疫螢光色素を特異的に同定してい
るけれども、本発明は記述のような色素の組合せ
のみに制限されるものでない。

その上、フローサイトメトリー装置が適切な分
解能とデーター蓄積能をもつ場合には、２個のレ
ーザーと３個の区別可能免疫螢光色素との使用は
粒子または細胞の８種までの異なる部分集合体の
同定を可能にするであろう。同様に幾何数列的計
算により二つのレーザーを４個またはそれより多
くの区別可能免疫螢光色素と一緒に利用すること
によつて、多数種の部分集合体が粒子または細胞
の分析において同定され得る。

このように、本発明は試料中の粒子の複数の副
次集団を検出し識別する方法と装置を提供する。
有利には、本発明において用いる螢光励起源の数
より多くの、試料内粒子の副次集団がフローサイ
トメトリー装置中を通る粒子の一回通過において
識別される。この特徴は明らかに、細胞あるいは
類似粒子の複数副次集団を検出し、定量化し、識
別するフローサイトメトリー技法の使用効率を増
す。

【図面の簡単な説明】

第１図は粒子の複数副次集団に関係する螢光と
一つの流路中を流れる粒子の光散乱パラメーター
を測定するのに特に有用なフローサイトメトリー
装置の光学的要素と光路に関する一つの好ましい
具体化の概念図であり、第２図は本発明の原理に
従つて二つのレーザーを組み入れたフローサイト
メーター中を通る一回通過によつて測定された試
料における、白血球の三つの副次集団の検出と定
量化のグラフであり、第３−５図は各々検出され
た細胞の各螢光パラメーターの相関をプロツトし
たグラフである。 １……フローサイトメトリー、１２，１４……
レーザー、２４，２５……プリズム、３０，３２
……レンズ、３８……粒子流、４２……光散乱遮
蔽バー、４４……レンズ、４５，４９……絞り、
４６……ビームスプリツター鏡、４８……散乱光
検出器、５０……フイルター、５５……レンズ、
５６……第一フイルター、５８，６４……二色性
ミラー、５９，６１，６５，６８……バリヤー・
フイルター、６０，６２，６６，６９……螢光検
出器。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試料中の細胞の表面抗原に、各々予め決めら
   れた実質的に異なる発光スペクトルを有する少な
   くとも三つの異なる免疫蛍光色素で選択的に標識
   を付け； この標識された細胞の表面抗原を、一回に実質
   的に一個ずつ、焦点に集められた光学的刺激の第
   １領域の中に通して励起エネルギーを与えること
   により上記の異なる色素の一つ又はそれ以上を励
   起させ； この標識された細胞の表面抗原を、一回に実質
   的に一個ずつ、焦点に集められた光学的刺激の第
   ２の領域の中に通して第１の励起エネルギーとは
   異なる第２の励起エネルギーを与えることによ
   り、該第２の領域において上記の異なる色素の一
   つ又はそれ以上を励起させ、この光学的刺激の二
   つの領域を通過させることによつて少なくとも三
   つの異なる色素を励起させ；該領域のそれぞれに
   おける光学的刺激は異なる波長の光を該領域のそ
   れぞれに施すことによつて得られるものであり、
   この光学的刺激の領域の一つに施される光は、こ
   の一つの光学的刺激の領域を通つて通過する細胞
   表面抗原上の上記異なる色素を励起せしめるもの
   であるが、光学的刺激の他の領域に与えられる波
   長とは十分にスペクトル的に離れているものであ
   り、かかる刺激の他の領域において励起される色
   素の励起及び放射のスペクトル範囲の実質的に外
   側であり； それぞれ異なる励起色素によつて放射される蛍
   光を検出し、該検出は、色素放射を識別可能な波
   長に分離する工程を含み、また、蛍光信号を放射
   させるために色素を励起する間に行われ； かかる細胞表面抗原をその検出された蛍光特性
   に関連して識別する； ことを特徴とする試料中の異なる細胞表面抗原を
   同時に相関的に検出するための方法。 ２ 三つの異なる蛍光色素がフルオレセイン、フ
   イコエリトリン及びテキサスレツドである特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３ 三つの異なる蛍光色素がフルオレセイン、フ
   イコエリトリン及びアロ・フイコシアニンである
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 三つの異なる蛍光色素がフルオレセイン、フ
   イコエリトリン及びＲ−フイコシアニンである特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 細胞の表面抗原を四つの異なる免疫蛍光色素
   で標識し、かつ焦点に集められた光学的刺激の領
   域が二つ存在する特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ６ 四つの異なる蛍光色素がフルオレセイン、フ
   イコエリトリン、テキサスレツド及びアロ・フイ
   コシアニンである特許請求の範囲第５項記載の方
   法。 ７ 四つの異なる蛍光色素がフルオレセイン、フ
   イコエリトリン、Ｒ−フイコシアニン及びアロ・
   フイコシアニンである特許請求の範囲第５項記載
   の方法。 ８ 各々予め決められた実質的に異なる発光スペ
   クトルを有する少なくとも三つの異なる免疫蛍光
   色素で選択的に標識を付けた試料中の細胞の表面
   抗原を同時に相関的に検出するための装置であつ
   て； 標識された細胞の表面抗原を、一回に実質的に
   一個ずつ、流路の中を移動させる手段； この流路に沿つた焦点に集められた光学的刺激
   の第１領域において励起エネルギーを与えること
   により上記の異なる色素の一つ又はそれ以上を励
   起させる第１の手段； この流路に沿つた焦点に集められた光学的刺激
   の第２の領域において、第１の励起エネルギーと
   は異なる第２の励起エネルギーを与えることによ
   り、該第２の領域において上記の異なる色素の一
   つ又はそれ以上を励起させ、この光学的刺激の二
   つの領域を通過させることによつて少なくとも三
   つの異なる色素を励起させる第２の手段； を含み； 該領域のそれぞれにおける光学的刺激は異なる
   波長の光を該領域のそれぞれに施すことによつて
   得られるものであり、この光学的刺激の領域の一
   つに施される光は、この一つの光学的刺激の領域
   を通つて通過する細胞表面抗原上の上記異なる色
   素を励起せしめるものであるが、光学的刺激の他
   の領域に与えられる波長とは十分にスペクトル的
   に離れているものであり、かかる刺激の他の領域
   において励起される色素の励起及び放射のスペク
   トル範囲の実質的に外側であり； それぞれ異なる励起色素によつて放射される蛍
   光を検出する手段； を含み； 該検出は、色素放射を識別可能な波長に分離す
   る工程を含み、また、蛍光信号を放射させるため
   に色素を励起する間に行われ； かかる細胞表面抗原をその検出された蛍光特性
   に関連して識別する手段； を含む装置。 ９ 第１の光学的刺激の領域の光源がアルゴンイ
   オンレーザーであり、第２の光学的刺激の領域の
   光源がローダミン６−Ｇ色素レーザーである特許
   請求の範囲第８項記載の装置。 １０ 第１の光学的刺激の領域の光源がアルゴン
   イオンレーザーであり、第２の光学的刺激の領域
   の光源がヘリウム−ネオンレーザーである特許請
   求の範囲第８項記載の装置。 １１ 検出用手段が励起用の第１及び第２の手段
   の各々の対して２個までの光検出装置を含み、上
   記各々の光検出装置が特性された色領域における
   光を検出することができる特許請求の範囲第８項
   記載の装置。 １２ 識別するための手段が細胞の表面抗原を示
   すための表示手段を更に含む特許請求の範囲第８
   項記載の装置。 １３ 各々の表面抗原中で検出される細胞の概数
   を測定する手段を更に含む特許請求の範囲第８項
   記載の装置。