JPH0585532B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗腫瘍剤に関する。 ガンのマーカーとして、αーフエトプロテイン
（AFP）及び胎児性抗原（CEA）が、よく知られ
ている。CEAは、消化器系のガン細胞の膜表面
に存在するとされている。他方、AFPは、多く
の肝ガン及びセルラインで産生することが認めら
れているが、細胞質に存在することが確かめられ
ているにすぎず、膜表面に存在するか否かは必ず
しも明らかではない。 本発明者らは、モノクローナル抗体に制ガン剤
や毒素を結合させる、いわゆる“ミサイル療法”
に適したヒト由来のAFPに対するモノクローナ
ル抗体を見出すべく、種々検討を行ない、ヒト由
来の膜表面に存在するAFP及びそれを認識する
モノクローナル抗体を見出し、本発明に到達し
た。 すなわち、本発明の要旨は腫瘍細胞に対する毒
素又は制ガン剤をリポソームに封入し、かかるリ
ポソーム表面にヒト由来のα−フエトプロテイン
（AFP）を認識するモノクローナル抗体を結合さ
せてなる抗腫瘍剤にある。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明において使用されるモノクロナール抗体
は、ヒト由来のAFPを認識するモノクローナル
抗体であればよいが、特に好適にはヒト由来の細
胞膜表面に存在するAFPを認識するモノクロー
ナル抗体が用いられる。かかるモノクローナル抗
体は次のような方法で得られる。 すなわち、まず、ヒト胎盤由来のAFPを、た
とえばBALB／Ｃマウス等に免疫した後、脾臓
を摘出し、ポリエチレングリコールを用い、P3
−U1等のマウスミエローマ細胞と融合し、常法
によりハイブリドーマを得る。そしてハイブリド
ーマ上清よりモノクローナル抗体を得る。 つぎに、常法により得られたこれらの抗体を用
いて、肝ガンセルライン（たとえば、PLC，
KN，NuE）を免疫組織化学的に染色し、陽性を
示す抗体を選択する。この検出は、アビオシン：
ビオチン化ワサビペルオキシダーゼコンプレツク
ス（ABC）キツトを用い、ホースラデイシユ・
ペルオキシダーゼの酵素活性により、ジアミノベ
ンジジンを基質として用いて行なわれる。 陽性を示す抗体を大量に入手するには、この選
択された抗体を産生するハイブリドーマを
BALB／Ｃマウス腹腔内に注射し、増殖させ、
腹水を採取することにより行なうことができる。
また、上記ハイブリドーマを培養タンクで大量培
養する方法によることもできる。 このようにして得られるモノクローナル抗体は
次のような性質を有する。 ｉ ¹⁴Cラベル化した本抗体を用いて、胎盤由来
AFPがPLC肝ガンセルラインの膜に対する結
合を阻害するか否かをみると、AFPが抗体と
セルライン膜との結合を競合的に阻害すること
がわかる。 PLCセルラインを¹⁴Ｃ−ロイシンでラベル
し、その膜成分を“トリトンＸ”で可溶化し、
本抗体との結合をみると、明らかな結合性が認
められる。 また、培養上清中の分泌蛋白にも結合性が確
認される。 PLCセルラインの可溶化膜成分ならびに培
養上清中の抗体反応物を、オフアレル
（O′Farrel）らの方法に準じて二次元電気泳動
を行なうと、膜由来、培養上清由来のいずれの
結合物もAFPの性質（等電点、分子量）を有
することがわかる。 PLCセルラインの膜分画をトリプシン、プ
ロテアーゼ、チモトリプシン等の蛋白質分解酵
素で消化すると、本抗体との結合性は低下又は
低下傾向を示す。 また、“トリトンＸ”処理で低下傾向を示し、
リパーゼ処理により、その結合性は増加する。 本発明に係わる抗腫瘍剤は、腫瘍細胞に対する
毒素又は制ガン剤をリポソームに封入し、かかる
リポソーム表面にヒト由来のα−フエトプロテイ
ン（AFP）を認識するモノクローナル抗体、好
ましくは上記のような、ヒと由来の膜表面に存在
するAFPを認識する抗体を結合させてなる。 この毒素としては、リシン、アブリン等の植物
種子毒素及びジフテリア毒素等の細菌毒素などが
挙げられる。 これらの毒素は、細胞結合にあずかるＢ鎖と、
細胞内に入り毒性を示すＡ鎖とが、ジスルフイド
（Ｓ−Ｓ）結合によつて連結されている。このＳ
−Ｓ結合を還元し、−SH基を有するＡ鎖を分離し
て用いられる。 その他、補体活性化因子として知られているコ
ブラ毒などの動物毒素も用いることができる。 また、上記制ガン剤としては、特に制限されな
いが、たとえば、アドリアマイシン
（adriamycin）、アクチノマイシン
（actinomycin）、ダウノマイシン
（daunomycin）、ノガラマイシン
（nogalamycin）、ブレオマイシン（bleomycin）、
クロモマイシン（chromomycin）、ミスラマイシ
ン（mithramycin）等が挙げられる。 モノクローナル抗体との結合は、毒素または制
ガン剤の種類により、その官能基に応じてジアゾ
化、カルボジイミド化等の反応を利用する方法、
デキストランを用いる方法等が採用される。 本発明においては、リポソーム（脂質膜小胞）
にこれを封入（組み込み）させ、このリポソーム
の表面にモノクローナル抗体を結合するのが、薬
剤の細胞への取り込み、徐放化、毒性の軽減等の
観点から好適である。 主としてリン脂質からなる二重の脂質層からな
るリポソームとしては、（）多重層、（）小さ
な一枚膜、（）大きな一枚膜、のいずれも使用
することができる。 脂質としてはホスフアチジルコリン（レシチ
ン）、リゾレシチン、ホスフアチジルエタノール
アミン、コレステロール等が用いられる。 調製は常法に従い、通常20nm〜数μm程度のも
のを得る。 この場合、毒素または制ガン剤の封入組み込み
は通常、リポソーム調製時に薬剤を溶液中に含有
させることにより行なわれる。これにより、親水
性のものは、リポソーム内に封入され、疎水性の
ものはリポソーム膜に組み込まれる。封入（組み
込み）量は、薬剤の種類に応じて適宜決定し得る
が、通常の投与法に比し、高濃度化することがで
きる。 このリポソーム表面上にモノクローナル抗体を
結合させる際には、抗体に疎水性の物質をつける
ことでリポソームに挿入させる方法、ホスフアチ
ジルエタノールアミンと抗体をグルタールで架橋
させる方法等が用いられるが、好適には次のよう
な方法が用いられる。 (a) ホスフアチジルエタノールアミンに−SH基
と反応する試薬を共有結合させたものを合成
し、リポソームに組み込んでおく。これに抗体
をSH化したもの、又は抗体間のＳ−Ｓ結合を
はずしてSH化したものを結合させる。上記共
有結合にはSPDP，MBS等が用いられる。又
は、 (b) リポソーム内に糖脂質を組み込んでおき、過
ヨウ素酸処理で生じたアルデヒド基と抗体を反
応させる。糖脂質としてガングリオシド等を用
い、過ヨウ素酸塩で処理してリポソーム表面を
アルデヒド化する。ついでNaBH₃CNの存在
下で抗体をリポソーム結合させる。 本発明に係る抗腫瘍剤の投与は常法によること
ができる。 本発明に係る抗腫瘍剤は、毒素又は制ガン剤
を、ガン細胞へ選択的に輸送することができるの
で、高い治療効果が得られる。 以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明
する。 参考例 (1) マウスモノクローナル抗体の作製： ヒトAFPとして、胎盤より精製された純度99
％以上で、免疫化学的にヒトアルブミン（HSA）
と反応しないもの（(株)森永生科研製）を用いた。 このヒトAFPを、BALB／Ｃマウスに10μg、
１回、フロイントの完全アジユバントとともに感
作し、最終免疫は静脈より注射し、３日後に脾臓
を摘出し、ポリエチレングリコール＃400を用い
P3−U1マウスミエローマと融合し、常法により
ハイブリドーマを作製した。クローニングは限界
希釈法を用い、同法を４回以上行なつた。なお、
大量の抗体は、BALB／Ｃマウス腹水系により
採取した。 抗AFP抗体を産生するハイブリドーマは、６
回の融合により、約400クローンが選別された。
そのうち、11クローンの培養上清の抗体価IgG量
を表１に示す（上清を10倍濃縮した後、測定。）。

【表】 (2) 抗体の選択 ａ セルラインは、一週間以上、イーグルMEM
を基本とした倍地に代えて培養後、リン酸緩衝
液で４回洗浄し、）直ちにハイブリドーマ培
養上清と反応させる方法、及び、）４％パラ
ホルムアルデヒド固定後、メタノール、H₂O₂
溶液で、内因性酵素を不活化し、抗体と反応さ
せる方法、を用いた。抗体の検出はベクタスタ
イン（vectastain）社のABCキツトを用い、
ホースラデイツシユ・ペルオキシダーゼの酵素
活性により、基質としてジアミノベンジジンを
用いて行なつた。 ｂ セルラインと維持 ヒト肝ガンのセルラインとしては、KN，
PLC、また、胎児性肝細胞由来のガン細胞株
NuEを、その他コントロールとして、ヒト胃
ガン培養株KATO，MKN45、大腸ガンＣ−
１の各細胞株を用いた。なお、培養細胞は、20
％牛胎児血清含有RPMI1640の培養液で37.0
℃、５％CO₂、95％Airの条件で維持、増殖さ
せた。 ｃ 上記(1)の抗AFPモノクロナール抗体を含む
培養上清及びその希釈物（2⁸倍まで）を肝ガン
セルラインPLC，KNならびに胎児肝細胞NuE
と免疫組織化学的に反応させたところ、19F12
に強い反応を認めた。この反応は無固定標本で
も、固定、メタノール、H₂O₂処理法のいずれ
でも同様であつた。 また、コントロールとして市販の抗AFPモ
ノクローナル抗体（ハイブリテツク社製）を、
抗体価として10³にあわせて反応させたが、他
のハイブリドーマクローンと同様に陽性反応は
認められなかつた。 19F12は表１に示すように抗体価が特に強い
ものでもなく、またIgG量が多いというもので
もないが、上記のように、他と異なり陽性を示
した。 一方、AFPの産生が認められないセルライ
ンMKN45，KATO，C1にはこの19F12は反
応しなかつた。 実施例 １ (1) 方法と材料 (a) セルライン： 上記参考例で述べた（(2)^b）PLC，NuE，
Ｃ−１及びKATOとLic（ヒト肝ガン）を
用いた。 (b) 培養法： 上記参考例の方法による。 (c) モノクローナル抗体： 上記参考例で得られた抗体（19F12）を用
いた。 (d) ³H−チミジン（Thymidine）のとり込
み： 96穴（well）培養板に細胞を培養し、培養
液中に、2μCi／well（制ガン剤のとき）又
は、5μCi／ml（毒素のとき）の³H−チミジ
ンを添加し、培養後に細胞を洗浄、細胞中の
放射能を液体シンチレーシヨンカウンターで
測定した。 (e) 毒素： リシンＡを用い、その精製と抗体との結合
は、それぞれ、Olsnessらの方法
（Biochemistry Vol12，No.16，1973）及び
Rasoらの方法（Cancer Research 42，457
−464，1982）によつた。 (f) 制ガン剤： アドリアマイシンを使用した。 (g) リポソーム： 作成と抗体の結合は次の方法による。 (i) 抗ヒトAFPマウスモノクローナル抗体
（19F12）１mlとSPDP（0.2mM）を室温で
30分間反応させて、ついで酢酸緩衝液（PH
4.5）を用いて、“セフアデツクスＧ−50”
に付し、蛋白画分を溶出させ、これをジチ
オスレイトール（DTT）50mMを用いて
40分間室温で反応させ、Ｓ−Ｓ結合を切断
し、次いでさらに“セフアデツクスＧ−
50”に付し、蛋白画分１mlを得る。 (ii) 一方、リポソームとして、卵黄ホスフア
チジルコリン4μmole、コレステロール
2μmole，DTP−DPPE0.006μmoleを使用
して、アドリアマイシンを添加して洗浄
し、酢酸緩衝液１ml中に懸濁させる。 (iii) ついで、上記（）、（）の生成物を混
合し、PH8.0に調製し、24時間インキユベ
ートして、目的とするアドリアマイシン封
入リポソーム−モノクロナール抗体結合体
を得る。 (2) リシンＡ−モノクローナル抗体結合体の
PLCに対する効果（in vitro） リシン全分子は10^-9Ｍでも強い細胞毒性を示し
たが、リシンＡ鎖については、その毒性（³H−
チミジンの取り込み抑制）は10^-8Ｍオーダーでは
ほとんどみとめられなかつた。 一方、モノクローナル抗体に結合されたリシン
Ａは10^-8Ｍのオーダーでも³H−チミジンの取り
込みを抑制し、濃度に依存していた。 また、コントロールとして用いた抗HSAモノ
クローナル抗体に結合されたリシンＡは５×10^-7
Ｍで³H−チミジンの取り込みが抑制されたが、
それ以下の濃度10^-8Ｍでは、全く効果がなかつ
た。 (3) アドリアマイシン封入リポソーム−モノクロ
ーナル抗体結合体の効果（in vitro） 細胞を２時間、薬剤に接触させた後、洗浄し、
前記の³Ｈ−チミジンの取り込みを行なつた。 結果を図１〜５に示す。 制ガン剤アドリアマイシンがin vitroで、腫瘍
の増殖の抑制、³Ｈ−チミジンの取り込みの低下を
導くことは当然の結果であるが、アドリアマイシ
ン封入リポソームとこれにモノクローナル抗体を
さらに結合したものを比較すると、PLC（図１）、
LiC（図２）、NuE（図３）のAFP産生腫瘍肝ガン
セルラインでは、常にモノクローナル結合型に強
い抗腫瘍効果が現われており、特にNuEにおい
ては、アドリアマイシン単独より強い作用が出現
した。 一方、肝ガン以外の腫瘍Ｃ−１，KATOで
はモノクローナル抗体の結合の有無にかかわら
ず、差異がみとめられなかつた。 (4) ヌードマウス可移植性肝ガンセルラインLi7
に対する効果 バツテル・コロンブス ラボラトリーズのプロ
トコールに準じて、長径（Ｌ）と短径（Ｗ）を週
２回、スラデイングキヤリパーによりmm単位で測
定した。（W²×Ｌ）／２より推定腫瘍重量を算出
し、腫瘍重量が100〜300mgの時期に治療を開始
し、４日毎に３回行なつた。 アドリアマイシン封入リポソーム、モノクロー
ナル抗体を結合したアドリアマイシン封入リポソ
ーム、アドリアマイシン単独についての結果は図
６のとおりであつた。 すなわち、コントロール群（無治療）より明ら
かにアドリアマイシン単独が、さらにそれよりリ
ポソーム結合体が効果を有し、モノクローナル抗
体を結合したリポソーム（アドリアマイシン封
入）が最も強く、in vivoで治療効果を生じてい
る。

【図面の簡単な説明】

図１〜５は、本発明に係る抗腫瘍剤のin vitro
での試験結果を示し、図６はin vivoでの試験結
果を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 腫瘍細胞に対する毒素又は制ガン剤をリポソ
   ームに封入し、かかるリポソーム表面にヒト由来
   のα−フエトプロテイン（AFP）を認識するモ
   ノクローナル抗体を結合させてなる抗腫瘍剤。